Artykuł metodologiczny

Środki ostrożności i procedury operacyjne w laboratorium (a)BSL-4: 3. Aerobiologia

14.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53602

⸱

3 października 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Integrated Research Facility at Frederick, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID), National Institutes of Health (NIH)

W tym artykule

Podsumowanie

Ponieważ patogeny o wysokich konsekwencjach mogą potencjalnie infekować podmioty poprzez cząsteczki unoszące się w powietrzu, aerobiologia jest coraz częściej stosowana w badaniach nad patogenezą i rozwoju medycznych środków zaradczych. Przedstawiamy szczegółową wizualną demonstrację procedur aerobiologicznych podczas wyzwania aerozolowego u naczelnych innych niż ludzie w środowisku bezpieczeństwa biologicznego zwierząt na poziomie maksymalnego 4 poziomu hermetyczności.

Streszczenie

Badania aerozolowe lub inhalacyjne patogenów o wysokich konsekwencjach ostatnio rosną ze względu na postrzegane zagrożenie celowym uwolnieniem aerozoli lub nieoczekiwaną naturalną transmisją aerozolu. Specjalne laboratoria przeznaczone do przeprowadzania tych eksperymentów wymagają ogromnych środków kontroli inżynieryjnej, aby zapewnić bezpieczne środowisko pracy i ciągłą konserwację systemów w celu utrzymania funkcjonalności. Szafy bezpieczeństwa biologicznego klasy III, zwane również komorami rękawicowymi, są gazoszczelnymi obudowami z nieotwieranymi oknami. Szafy te są utrzymywane pod podciśnieniem przez podwójnie wysokowydajne systemy wydechowe filtrowane przez powietrze o wysokiej wydajności (HEPA) i są idealnym głównym zabezpieczeniem do umieszczania urządzeń aerozolowych. Dobrze zaplanowany przepływ pracy między członkami personelu w obrębie wysokiego poziomu hermetyczności, na przykład od laboratorium kombinezonu bezpieczeństwa biologicznego zwierząt na poziomie 4 (ABSL-4) do laboratorium gabinetowego ABSL-4, jest kluczowym elementem udanych eksperymentów. Aby zapewnić sprawną realizację badania, ustanowienie sieci komunikacyjnej, przemieszczanie sprzętu i uczestników oraz ustawianie i umieszczanie sprzętu wymaga od personelu skrupulatnego zaplanowania procedur przed rozpoczęciem badania. Poniżej przedstawiamy przegląd i wizualną reprezentację tego, jak badania aerobiologiczne są prowadzone w National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases Integrated Research Facility w Fort Detrick, Maryland, USA, w środowisku ABSL-4.

Wprowadzenie

Przenoszenie wirusów zazwyczaj odbywa się przez bezpośredni lub fizyczny kontakt, ale wiele ważnych chorób wirusowych (np. odra, ospa wietrzna, grypa) jest wywoływanych przez patogeny, które są przenoszone przez aerozol lub kropelki oddechowe. Takie patogeny mogą potencjalnie wywołać pandemię o skutkach od powszechnej łagodnej choroby związanej z utratą pracy (np. przeziębienie) po rzadszą poważną chorobę o wysokiej śmiertelności (np. ospa prawdziwa). Patogeny o wysokich konsekwencjach, które rozprzestrzeniają się naturalnie przez aerozol lub przez celowe uwalnianie aerozolu (broń biologiczna), są szczególnie interesujące dla aerobiologii1. Ludzie mogą szybko zarazić się niektórymi z tych patogenów przez duże kropelki oddechowe lub jądra małych cząstek i łatwo przenosić te patogeny na inne poprzez wydzielinę śliny, kaszel i kichanie2. W amerykańskiej społeczności zajmującej się obroną biologiczną patogeny o wysokich konsekwencjach (np. filowirusy lub inne patogeny priorytetowe kategorii A-C NIAID i czynniki bioterrorystyczne CDC) są przedmiotem programów badawczych nad aerozolami ze względu na wysoką śmiertelność związanych z nimi infekcji3,4. W ciągu ostatniej dekady poczyniono znaczące postępy naukowe w dziedzinie aerobiologii dzięki postępowi technologicznemu w zakresie urządzeń aerozolowych i obiektów o wysokim stopniu hermetyczności5,6. Badania w National Institutes of Health, National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIH/NIAID), Integrated Research Facility w Fort Detrick z siedzibą w Frederick, MD, USA (IRF-Frederick) koncentrują się na pojawiających się patogenach o wysokich konsekwencjach, które wymagają ograniczenia na poziomie bezpieczeństwa biologicznego zwierząt 4 (ABSL-4). Ogólną misją IRF-Frederick jest ocena i ułatwianie rozwoju potencjalnych szczepionek i środków terapeutycznych (medycznych środków przeciwdziałania).

Badania nad patogenami o poważnych konsekwencjach w IRF-Frederick podlegają rygorystycznym wymogom bezpieczeństwa biologicznego oraz pielęgnacji i użytkowania zwierząt. Wymagania te są określone w podręczniku7 dotyczącym bezpieczeństwa biologicznego w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych (BMBL) oraz w federalnych przepisach dotyczących dobrostanu zwierząt. Te niezbędne wymagania mogą ograniczać rodzaj badań, które mogą być wykonywane, i wpływać na ogólny projekt badania. Jak już wcześniej opisaliśmy w tym czasopiśmie, wszystkie badania prowadzone w środowisku ABSL-4 wymagają szczególnej ostrożności, wysoce specjalistycznego szkolenia oraz solidnej i redundantnej infrastruktury obiektowej8,9.

Wejście do laboratorium kombinezonów IRF-Frederick ABSL-4 wymaga założenia skafandra nadciśnieniowego8. Skafandry hermetyzujące nadciśnienie nie są wymagane do wejścia do laboratorium szafy ABSL-4. Zakładanie kombinezonu szorującego, rękawic gumowych lub nitrylowych i butów z zakrytymi palcami jest odpowiednie podczas manipulowania materiałem zakaźnym grupy ryzyka 4 w certyfikowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy III (BSC) w laboratorium w szafie ABSL-47.

W IRF-Frederick, urządzenia aerozolowe są projektowane, montowane i utrzymywane w dwóch hermetycznie zamkniętych, hermetycznych BSC klasy podciśnieniowej ze stali nierdzewnej, Rysunek 1. IRF-Frederick Aerobiology Core wykorzystuje zautomatyzowaną platformę zarządzania aerozolami (AAMP) do kontrolowania i monitorowania eksperymentów z aerozolami w tych BSC, rysunek 2. W poprzedniej publikacji przedstawiono konkretne funkcje BSC klasy III w IRF-Frederick oraz połączenie z laboratorium skafandrów za pośrednictwem portu przelotowego5. Procedura przygotowania BSC klasy III przed eksperymentami jest specyficzna dla IRF. Inne BSC klasy III używane w innych instytucjach funkcjonują podobnie do BSC klasy III używanych w IRF, ale mogą mieć inne mechanizmy transportu, dostępu lub dokowania.

Aby lepiej zrozumieć, w jaki sposób patogeny o wysokich konsekwencjach pozostają zakaźne i rozprzestrzeniają się poprzez transmisję aerozolową, należy przeprowadzić bezpieczne eksperymenty aerobiologiczne w tych BSC klasy III zgodnie z określoną procedurą przepływu pracy. Badacze zostali starannie i gruntownie przeszkoleni, aby zapewnić, że ten przepływ pracy jest przestrzegany w bezpieczny i spójny sposób. Przed prowokacją aerozolem u naczelnych (NHP) przeprowadza się kilka prób charakterystyki aerozolu lub pozorowanych prób aerozolowych w celu przetestowania stabilności i żywotności środka w postaci aerozolu. Proces charakterystyki aerozolu naśladuje rzeczywiste wyzwanie aerozolowe, a badacz ocenia zmienne związane z badaniami aerozolu.

Inną częścią przepływu pracy jest zapisywanie fizycznych manipulacji, podawania, znieczulania lub innych środków, lub rutynowych procedur na wykresach dla każdego NHP. Te wykresy tematyczne są dokładnie analizowane w celu zapewnienia spójności proceduralnej i standaryzacji. Badani są znieczuleni przed ekspozycją na aerozol. Przykładowe środki znieczulające obejmują tiletaminę/zolazepam, ketaminę/acepromazynę i ketaminę. Środki znieczulające są wybierane w oparciu o minimalizację tłumienia oddechu i promowanie kontrolowanego oddychania w stanie ustalonym. Dodatkowe materiały anestezjologiczne są przechowywane w salach zabiegowych dla zwierząt i transportowane na wózku transferowym z NHP do laboratorium gabinetowego aerobiologii ABSL-4.

W laboratorium skafandra ABSL-4, NHP przechodzą pletyzmografię za pomocą jednej z dwóch metod (tj. pletyzmografia head-out, pletyzmografia indukcyjna oddechowa [RIP]) w celu określenia objętości oddechowej wdechu i zmian częstości oddechów10-12. Te uzyskane parametry są wykorzystywane do dokładnego obliczenia szacowanej dawki wziewnej patogenu bezpośrednio przed lub w trakcie ekspozycji na aerozol. Pletyzmografia typu head-out wykorzystuje długą, cylindryczną komorę, w której mieści się NHP13. Spadek ciśnienia powstający, gdy zwierzę znajduje się w cylindrze, jest rejestrowany przez pneumotachograf, przekazywany do wzmacniacza, przetwarzany przez przetwornik prądu przemiennego/prądu stałego i integrowany z oprogramowaniem w celu wyprowadzenia powyższych parametrów płucnych. RIP wykorzystuje czujniki wykonane z indukcyjnie zwijanych drutów miedzianych, które są osadzone w elastycznych taśmach wokół klatki piersiowej i brzucha badanego11,12. Kondensator indukcyjny wytwarza pole magnetyczne w czujniku. Oddychanie zmienia pole magnetyczne, a wynikające z tego zmiany napięcia są przekazywane z nadajnika obok elastycznej opaski do odbiornika w komputerze za pośrednictwem fal radiowych o bardzo wysokiej częstotliwości o krótkiej długości fali. Dedykowane oprogramowanie określa częstość oddechów i objętość oddechową na podstawie całkowitego przemieszczenia klatki piersiowej.

Objętość minutowa (MV) uzyskana za pomocą pletyzmografii jest używana do obliczenia szacowanej dawki wziewnej (D). Podczas wytwarzania i pobierania próbek aerozolu stężenie aerozolu (AC) oblicza się, mnożąc stężenie biopróbnika (BC) przez objętość pożywki (V) i dzieląc przez wynik pomnożenia natężenia przepływu biosamplera (FL) przez czas ekspozycji (T). Uproszczony wzór jest reprezentowany jako AC = BC x V ÷ FL x T. Z kolei dla rzeczywistego prowokacji aerozolowej w NHP, D oblicza się, mnożąc AC przez MV i czas trwania ekspozycji (czas = T). Uproszczony wzór jest przedstawiony jako D = AC x MV x T.

Celem tego artykułu jest wizualne pokazanie całej procedury prowokacji aerozolowej przy użyciu NHP z dwóch punktów widzenia, od strony laboratoryjnej skafandra ABSL-4 i strony laboratoryjnej ABSL-4. Chociaż procedury te mogą mieć charakter ogólny dla kilku wymienionych praktyk, są one specyficzne dla IRF-Frederick Aerobiology Core i reprezentują rzeczywiste praktyki stosowane w tej instytucji. Ten artykuł koncentruje się na procedurach bezpieczeństwa biologicznego potrzebnych do bezpiecznego wykonania wyzwania aerozolowego, a nie na samym wyzwaniu aerozolowym. W tych procedurach używamy manekina, aby pokazać praktyki bezpieczeństwa biologicznego, ze względu na ryzyko związane ze znieczuleniem NHP. Jednak proces wykonywania prowokacji aerozolowej jest napisany w sposób ogólny, ponieważ procedura jest taka sama, niezależnie od użytego patogenu o wysokich konsekwencjach. Naszym celem jest poszerzenie wiedzy i zrozumienia naukowców na temat rygorów prowadzenia badań aerozoli patogenów o poważnych konsekwencjach w maksymalnych warunkach hermetyzacji.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół jest zgodny z poniższymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami. Zwierzęta były trzymane w placówce akredytowanej przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International. Wszystkie procedury eksperymentalne zostały zatwierdzone przez Narodowy Instytut Alergii i Chorób Zakaźnych, Zakład Badań Klinicznych, Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt i były zgodne z przepisami ustawy o dobrostanie zwierząt, polityką Publicznej Służby Zdrowia oraz zaleceniami Przewodnika dotyczącego opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych.

1. Aerobiologia: Laboratorium Kombinezonów Poziomu Bezpieczeństwa Biologicznego Zwierząt 4 (ABSL-4)

  1. Przygotowanie laboratoryjne
    1. Wypełnij procedury wejścia do laboratorium skafandra ABSL-4 (szczegółowo opisane w punkcie 8).
    2. Przetestuj funkcjonalność wszystkich urządzeń (np. sprzętu do pletyzmografii, laptopa, koszy na śmieci stwarzających zagrożenie biologiczne, pojemników na ostre przedmioty niebezpieczne biologicznie, urządzeń do monitorowania obiektu) biorących udział w procedurach aerobiologicznych zachodzących w laboratorium skafandra ABSL-4 zgodnie z protokołem producenta.
    3. Upewnij się, że wózek transferowy jest biologicznie czysty przed przetestowaniem działania portu szybkiego transferu (RTP), który łączy wózek transportowy przez ścianę z BSC klasy III).
    4. Z patogenem należy obchodzić się i rozcieńczać go tylko w obrębie certyfikowanych BSC. Przygotować patogen w odpowiednim składzie w BSC klasy II, który zawiera odpowiednie środki dezynfekujące. Patogen należy przewozić w hermetycznym pojemniku wtórnym oznaczonym symbolem zagrożenia biologicznego na mokrym lodzie w wózku transportowym. Przepuścić patogen przez RTP do BSC klasy III w laboratorium szafowym ABSL-4, rysunek 1.

2. Pletyzmografia: Laboratorium Kombinezonów Poziomu Bezpieczeństwa Biologicznego Zwierząt 4 (ABSL-4)

  1. Konfiguracja i kalibracja pletyzmografii
    1. Określ, która metoda akwizycji pletyzmografii (pletysmografia head-out lub pletysmografia indukcyjności oddechowej [RIP]) zostanie zastosowana i połącz ze sobą elementy sprzętu.
    2. Skalibruj pletyzmograf przed eksperymentem zgodnie z protokołem producenta.
  2. Akwizycja pletyzmografii
    1. Podczas pracy z NHP należy założyć zewnętrzną parę rękawic lateksowych lub nitrylowych na rękawice kombinezonowe, aby zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu i promować bezpieczne praktyki. Po zakończeniu obchodzenia się z NHP zdejmij te dodatkowe rękawice i wyrzuć do biologicznego kosza na śmieci w pomieszczeniu.
    2. Jeśli korzystasz z pletyzmografii typu head-out, przymocuj nową gumę/koferdam z przodu cylindra. Wytnij mały otwór w tamie, aby głowica NHP zmieściła się w górnej części cylindra. Po umieszczeniu tama tworzy uszczelnienie wokół szyi NHP.
    3. Jeśli używasz RIP, sprawdź, czy opaski RIP są prawidłowo dopasowane do klatki piersiowej i brzucha NHP, a połączenia elektroniczne są mocno zatrzaśnięte.
    4. Wyślij wszystkie dane uzyskane z procedury pletyzmografii do badaczy w laboratorium gabinetowym ABSL-4. Eksportuj dane dotyczące objętości oddechowej i minutowej objętości dla każdego zwierzęcia za pomocą kompatybilnego programu do wykorzystania podczas procesu aerozolowego.

3. Transport i postępowanie z naczelnymi innymi niż ludzie: Laboratorium Kombinezonu Bezpieczeństwa Biologicznego Zwierząt Poziom 4

  1. Postępowanie z NHP
    1. Monitoruj i rejestruj wszelkie fizyczne manipulacje, administracje lub rutynowe procedury na wykresach dla każdego NHP.
    2. Po zakończeniu wyzwania aerozolowego umieść NHP w pojemniku transportowym i włóż NHP z powrotem do klatki domowej znajdującej się w pomieszczeniu do przetrzymywania zwierząt.
    3. Podczas obchodzenia się z żywym zwierzęciem należy przestrzegać obowiązkowej zasady, która wymaga obecności 2 członków personelu.
  2. NHP Transport
    1. Określ rodzaj znieczulenia, czas trwania znieczulenia (obejmuje transport, akwizycję pletyzmografii i prowokację aerozolem) i odpowiednią dawkę znieczulenia przed podaniem. W pełni znieczulić NHP w oparciu o proces wybrany przez personel medycyny porównawczej. Jeśli wymagane jest dodatkowe znieczulenie, upewnij się, że wszystkie igły, ostre przedmioty, strzykawki i nakrętki zostały wyrzucone do pojemnika na ostre przedmioty znajdującego się w dowolnej sali zabiegowej dla zwierząt. Nie należy ponownie nakręcać igieł po użyciu.
    2. Znieczulone NHP należy transportować w przezroczystych pojemnikach, które są zabezpieczone zatrzaskiem na pokrywie skrzyni transportowej.
    3. Załaduj kontenery transportowe na mobilny wózek, aby umożliwić w pełni wyposażonym naukowcom swobodne poruszanie się za pomocą przewodów powietrza do oddychania i przez drzwi odporne na ciśnienie powietrza (APR), rysunek 1.
    4. Ponieważ do kontenera transportowego nie jest dostarczane dodatkowe powietrze do oddychania NHP, należy zminimalizować czas transportu.

4. Aerobiologia: Laboratorium Gabinetowe ABSL-4

  1. Konfiguracja BSC klasy III
    1. Równolegle z preparatyką dla zwierząt wykonywaną przez personel Medycyny Porównawczej, należy przygotować BSC klasy III. Sprawdź wzrokowo, czy podciśnienie w BSC klasy III jest utrzymywane w określonym zakresie (125 Pa lub minimum -0.5 cala wskazówki (wg); zalecane 250 Pa lub -1.0 cala wg). Sprawdź BSC klasy III pod kątem potencjalnych wycieków lub pęknięć (patrz rysunek 1).
    2. Fizycznie i wzrokowo sprawdź rękawice z kauczuku syntetycznego klasy III i pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym przymocowane do BSC klasy III pod kątem słabych punktów, rozdarć, rozdarć lub suchej zgnilizny. Uszkodzone rękawice z kauczuku syntetycznego klasy III i/lub pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym należy wymienić bezpośrednio przed użyciem. W tym momencie BSC klasy III nie jest zanieczyszczony.
    3. Jeśli wyciek nastąpi, gdy BSC klasy III jest skażony, należy zidentyfikować miejsce naruszenia i powiadomić kierownictwo obiektu oraz personel zajmujący się bezpieczeństwem biologicznym. W przypadku rozdarcia lub naruszenia rękawicy zintegrowanej BSC klasy III, należy natychmiast wymienić uszkodzoną rękawicę, postępując zgodnie z odpowiednio przeszkoloną techniką i wewnętrzną standardową procedurą operacyjną BSC klasy III.
    4. Aby wymienić zintegrowaną rękawicę, w której widoczne jest małe rozdarcie lub pęknięcie podczas narażenia, należy najpierw nadmiernie spryskać rozdarcie lub pęknięcie środkiem dezynfekującym o odpowiednim stężeniu podwójnego czwartorzędowego środka dezynfekującego amoniowego (chlorek n-alkilodimetylobenzyloamoniowy, chlorek n-alkilodimetyloetylobenzyloamoniowy). W tym czasie nie wykonuj nadmiernych ruchów, które powodują wzrost przepływu powietrza.
    5. Ostrożnie zdejmij zewnętrzne pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym (2 z nich), pozostawiając uszkodzoną zintegrowaną rękawicę nadal przymocowaną do BSC klasy III. Nieznacznie odsuń uszkodzony zintegrowany mankiet rękawicy od portu, upewniając się, że zintegrowane uszczelnienie rękawicy pozostaje nienaruszone. Jeśli plomba zostanie naruszona, rozlegnie się alarm wskazujący, że procedura nie została wykonana prawidłowo. Zintegrowany mankiet rękawicowy powinien pozostać przymocowany do portu po zdjęciu drugiego pierścienia uszczelniającego o przekroju okrągłym z BSC klasy III.
    6. Umieść nową rękawicę z kauczuku syntetycznego BSC klasy III na starej rękawicy w tej samej orientacji. Umieść tę nową rękawicę całkowicie na porcie, podobnie jak inne porty rękawic BSC klasy III.
    7. Załóż pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym znajdujący się najbliżej BSC klasy III na nową zintegrowaną rękawicę. Korzystając z sąsiedniego zintegrowanego portu na rękawice, ostrożnie wciągnij uszkodzoną rękawicę z kauczuku syntetycznego klasy III do środka BSC klasy III. Nowa rękawica z kauczuku syntetycznego klasy III będzie działać jako bariera utrzymująca hermetyczność. Po zdjęciu (wciągnięciu do wewnątrz) drugiej uszkodzonej rękawicy z kauczuku syntetycznego klasy III, wymień drugi zewnętrzny pierścień uszczelniający o przekroju okrągłym i kontynuuj pracę.
    8. Należy zapisać wszystkie szczegóły dotyczące rozdarcia/złamania rękawicy w specjalnym dzienniku pokładowym BSC klasy III. Jeśli uszkodzona zintegrowana rękawica zostanie usunięta lub dojdzie do naruszenia zabezpieczeń, uszkodzona zintegrowana rękawica/port nadal utrzymuje przepływ powietrza do wewnątrz na poziomie 0,47m3/s. Ten przepływ powietrza do wewnątrz jest tym samym przepływem powietrza, który jest używany w przypadku BSC klasy II, zachowując w ten sposób spójność między BSC klasy II i III.
    9. Sprawdź zbiornik do namaczania i sprawdź, czy zbiornik do namaczania jest napełniony środkiem dezynfekującym do oznaczonego poziomu wewnątrz zbiornika do zanurzania, Rysunek 1. Sprawdź, czy stężenie środka dezynfekującego w zbiorniku do zanurzania wynosi co najmniej 3 500 μS za pomocą miernika przewodności. Przewodność ta odpowiada 5% stężeniu środka dezynfekującego.
    10. Upewnij się, że autoklaw BSC klasy III jest funkcjonalny i sprawny, aby wszystkie zanieczyszczone odpady i sprzęt można było sterylizować w autoklawie, rysunek 1. Autoklaw tylko sprzęt, o którym wiadomo, że wytrzymuje rygory procesu sterylizacji.
    11. Zbadaj funkcjonalność innych urządzeń aerobiologicznych (np. komponentów AAMP, laptopa) oraz przewodów powietrznych i próżniowych biorących udział w eksperymencie, rysunek 2.
    12. Umieść znaki na BSC klasy III wskazujące aktualny stan zanieczyszczenia urządzenia.
  2. Montaż i konfiguracja systemu komory naświetlania NHP tylko dla głowy
    1. Zamontuj 16-litrową komorę ekspozycyjną NHP tylko z głowicą, wkładając przewody tłoczne i wydechowe ze stali nierdzewnej, Rysunek 2. Skonfiguruj komorę w dynamicznej konfiguracji push/pull, podłączając odpowiednie przewody powietrzne, próżniowe i ciśnieniowe do AAMP. Podłącz AAMP do źródła zasilania w BSC klasy III i laptopa przez hermetycznie zamknięty port znajdujący się na górze BSC klasy III (Rysunek 1).
    2. Sprawdź zmontowaną komorę naświetlania NHP tylko z głowicą pod kątem wycieków lub pęknięć i upewnij się, że komora jest prawidłowo zmontowana.
    3. Podłącz generator aerozolu i aerodynamiczny przyrząd do odczytu wielkości cząstek do komory naświetlania NHP tylko dla głowy.
    4. Otwórz źródło powietrza i podciśnienia do AAMP.
    5. Uruchom oprogramowanie protokołu aerozolowego na laptopie. Wprowadź do menu oprogramowania odpowiednią komorę naświetlania NHP tylko dla głowicy, generator aerozoli i natężenie przepływu biosamplera oraz informacje administracyjne.
    6. Obliczyć czas prowokacji aerozolem na podstawie danych uzyskanych podczas procedury pletyzmografii, krok 2.2.4. W przypadku korzystania z pletyzmografii head-out, należy obliczyć dawkę przed ekspozycją na aerozol. W przypadku stosowania RIP należy obliczyć dawkę jednocześnie podczas ekspozycji na aerozol.
    7. Napełnij generator aerozolu patogenem.
    8. Za pomocą oprogramowania aerozolowego włącz generator aerozolu i spryskaj wnętrze komory naświetlania NHP tylko dla głowy materiałem prowokacyjnym przez 10 minut.
    9. Wyłącz generator aerozolu, opróżnij materiał prowokacyjny i wyrzuć materiał prowokacyjny do worka na śmieci znajdującego się wewnątrz BSC klasy III.
  3. NHP Narażenie tylko na głowę
    1. Podłącz próbnik biologiczny do komory naświetlania NHP tylko dla głowy, napełnij biosampler pożywką i podłącz odpowiednią linię próżniową do biosamplera.
    2. Sprawdź głębokość znieczulenia NHP. Jeśli głębokość znieczulenia zostanie uznana za odpowiednią (np. brak reakcji na bodźce zewnętrzne, napięcie mięśniowe, stabilne częstości oddechów i serca), przepuść znieczulony NHP przez port szybkiego transferu (RTP) do BSC klasy III. Jeśli głębokość znieczulenia jest niewystarczająca, podaj dodatkowe znieczulenie za pomocą kroplówki, bezpośredniego wstrzyknięcia lub przez pompę anestezjologiczną przed przepuszczeniem NHP przez RTP (personel medycyny porównawczej w laboratorium kombinezonów). Przepuść dodatkowe środki znieczulające przez RTP.
    3. Umieść NHP w pozycji leżącej na rampie narażenia NHP.
    4. Delikatnie przełóż głowę NHP przez gumę/koferdam przymocowany do portalu głowy komory naświetlania NHP tylko dla głowy. Koferdam gumowy/dentystyczny zapewnia uszczelnienie wokół szyi NHP podczas ekspozycji na aerozol.
    5. Sprawdź, czy parametry życiowe NHP są stabilne wizualnie i za pomocą przenośnego monitora pacjenta.
    6. Wprowadź czas próby aerozolowej obliczony na podstawie kroku 4.2.6 oraz niezbędne identyfikatory sprzętu odnoszące się do każdego aerozolu, uruchom je w oprogramowaniu aerozolowym i rozpocznij próbę prowokacyjną
      7. .
    7. Sprawdzaj dane dotyczące wielkości cząstek podczas każdego cyklu aerozolowego za pomocą analizatora wielkości cząstek aerozolu, aby upewnić się, że osiągnięto pożądany rozkład wielkości cząstek. Weryfikację tę należy przeprowadzać w sposób ciągły lub przerywany przez cały czas trwania ekspozycji.
    8. Po zakończeniu wyzwania aerozolowego wyjmij NHP z komory ekspozycyjnej tylko dla głowy i wytrzyj twarz/głowę NHP odpowiednim środkiem dezynfekującym, aby zmniejszyć potencjalne zanieczyszczenie personelu laboratoryjnego.
    9. Oczyść komorę aerozolową lub płucz powietrzem pozostałe i opóźnione cząstki przez 5 minut, przepuszczając powietrze i odkurzając komorę. Ta procedura "oczyści" i usunie resztki cząstek z komory ekspozycji aerozolowej w celu późniejszej ekspozycji na aerozol NHP.
    10. Przekaż NHP z powrotem przez RTP do badaczy znajdujących się w laboratorium kombinezonu aerobiologicznego ABSL-4.
    11. Wyrzuć wszystkie ostre przedmioty używane w BSC klasy III do wyznaczonego pojemnika na ostre przedmioty, który pozostaje w BSC. Gdy pojemnik na ostre przedmioty jest wypełniony w 3/4, umieść go w worku na śmieci o zagrożeniu biologicznym.
    12. Opróżnij generator aerozolu i wszelkie pozostałe materiały prowokacyjne do niebezpiecznego biologicznie worka na śmieci zawierającego śmieci, sprzęt jednorazowego użytku i/lub pojemnik na ostre przedmioty wypełniony w 3/4, jeśli dotyczy.
    13. Opróżnij pożywkę z biosamplera aerozolowego do odpowiednio oznakowanych probówek zbiorczych i umieść na mokrym lodzie.
    14. Powtarzaj kroki od 4.3.1 do 4.3.13, aż wszyscy zaplanowani uczestnicy testu zostaną zakwestionowani.
    15. Przekaż wszystkie próbki z biosamplera aerozolowego przez RTP do badaczy w celu ilościowego określenia i ponownego miareczkowania dawki aerozolu.
    16. Umieść śmieci i sprzęt z prowokacji aerozolowej w autoklawie przelotowym podłączonym do BSC klasy III i wybierz odpowiedni cykl sterylizacji (rysunek 3).
    17. Zdemontować komorę tylko głowicy NHP i odkazić komorę tylko głowicy oraz BSC klasy III za pomocą cyklu gazowego paraformaldehydu zwalidowanego za pomocą wskaźników biologicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Komora bezpieczeństwa biologicznego (BSC) klasy III to szczelna szafa ze stali nierdzewnej, w której panują warunki ABSL-4 pod podciśnieniem, znajdująca się w laboratorium z komorami ABSL-4 (Rysunek 1). Materiały mogą być wprowadzane do BSC przez personel pracujący w laboratorium z komorami ABSL-4 poprzez zamontowany pod komorą zbiornik ze stali nierdzewnej (często nazywany w środowiskach ABSL-4 lub BSL-4 „zbiornikiem do zanurzania”), zawierający 5% roztwór dezynfekcyjny ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiamy procedury aerobiologiczne stosowane w IRF-Frederick do pracy z wysoce niebezpiecznymi (grupa ryzyka 4) patogenami. Jednym z celów wizualizacji procedur bioaerozolowych jest podkreślenie bezpieczeństwa personelu podczas korzystania z BSC klasy III podczas eksperymentów z takimi patogenami, aby uniknąć infekcji nabytych w laboratorium. BSC klasy III utrzymują kierunkowy przepływ powietrza do wewnątrz, który jest odprowadzany do podwójnych filtrów HEPA, aby zapewnić, że patogeny są zawarte w laboratorium (

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Treść tej publikacji niekoniecznie odzwierciedla poglądy lub politykę Departamentu Zdrowia i Opieki Społecznej Stanów Zjednoczonych (DHHS) lub instytucji i firm powiązanych z autorami. Prace te zostały częściowo sfinansowane z głównego kontraktu Battelle Memorial Institute z amerykańskim Narodowym Instytutem Alergii i Chorób Zakaźnych (NIAID) na podstawie umowy nr 1. HHSN272200700016I. J.K.B., K.J., M.R.H., D.P., L.B. i J.W. wykonywali tę pracę jako pracownicy Battelle Memorial Institute. Podwykonawcami Battelle Memorial Institute, którzy wykonali te prace, są: J.H.K., pracownik Tunnell Government Services, Inc.; oraz M.G.L., pracownik Instytutu Badań nad Układem Oddechowym Lovelace

.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Micro-Chem PlusKrajowe Laboratoria Chemiczne255
Etanol Rybacy 
ParaformaldehydSigma-Aldrich441244
klasa III BSCGermb-10
Zintegrowane rękawice BSCPiercan10UY2032-9
Platforma zarządzania aerozolami (AeroMP)Biaera TechnologiesNA
Czołowa pletysmografiaBuxco/Data Sciences InternationalNA
Respriatory indukcyjne pletyzmografiaData Sciences InternationalNA
Generator aerozoli styczny o wyśrodkowanym przepływie (CenTAG)CH TechnologiesNA
Nebulizator CollisonBGI Inc. Autoklaw CN25
GetingeGEB 2404 AMB-2
Kombinezon nadciśnieniowy SperianProdukty bezpieczeństwa HoneywellBSL 4-2
Rękawice do kombinezonów zewnętrznych (lateks, Ansell Canners and Handlers)Fisher19-019-601
Rękawice do skafandra zewnętrznego (nitryl/guma, MAPA)Fisher2MYU1
ScrubsCintas60975/60976
SkarpetyCintas944
Taśma klejącaPack-N-Tape51131069695
RęcznikiCintas2720
O-ringiMagazyn O-ringówAS568-343
Ochraniacze na butyAmazonB0034KZE22
Smar do zamkówbłyskawicznych AmazonB000GKBEJA
BP2818500

Bibliografia

  1. Alibek, K., Handelman, S. The chilling true story of the largest covert biological weapons program in the world-told from inside by the man who ran it. , Random House. New York, NY. (1999).
  2. Roy, C. J., Pitt, L. M. Infectious disease aerobiology: aerosol challenge methods. Biodefense: research methodology and animal models. Swearingen, J. R. , Taylor & Francis. Boca Raton, FL. 61-76 (2006).
  3. National Institute of Allergy and Infectious Diseases. NIAID Category A, B, and C Priority Pathogens. , National Institutes of Health. Bethesda, MD, USA. Available from: http://www.niaid.nih.gov/topics/biodefenserelated/biodefense/pages/cata.aspx (2014).
  4. National Center for Environmental Health. Bioterrorism agents/diseases by category. , Centers for Disease Control and Prevention. Atlanta, GA, USA. Available from: http://emergency.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp (2014).
  5. Lackemeyer, M. G., et al. ABSL-4 aerobiology biosafety and technology at the NIH/NIAID integrated research facility at Fort Detrick. Viruses. 6 (1), 137-150 (2014).
  6. Bohannon, J. K., et al. Generation and characterization of large-particle aerosols using a center flow tangential aerosol generator with a non-human-primate, head-only aerosol chamber. Inhal Toxicol. , (2015).
  7. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Chosewood, L. C., Wilson, D. E., eds, , 5th edn, U.S. Dept. of Health and Human Services. Washington, D.C.. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/ (2009).
  8. Janosko, K., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 1. Biosafety level 4 suit laboratory suite entry and exit procedures. J Vis Exp. , (2015).
  9. Mazur, S., et al. Safety Precautions and Operating Procedures in an (A)BSL4 Laboratory: 2. General Practices. J Vis Exp. , (2015).
  10. Mortola, J. P., Frappell, P. B. On the barometric method for measurements of ventilation, and its use in small animals. Can J Physiol Pharmacol. 76 (10-11), 937-944 (1998).
  11. Zhang, Z., et al. Development of a respiratory inductive plethysmography module supporting multiple sensors for wearable systems. Sensors (Basel). 12 (10), 13167-13184 (2012).
  12. Ingram-Ross, J. L., et al. Cardiorespiratory safety evaluation in non-human primates. J Pharmacol Toxicol Meth. 66 (2), 114-124 (2012).
  13. Besch, T. K., Ruble, D. L., Gibbs, P. H., Pitt, M. L. Steady-state minute volume determination by body-only plethysmography in juvenile rhesus monkeys. Lab Anim Sci. 46 (5), 539-544 (1996).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Laboratorium ABSL 4komora bezpiecze stwa biologicznego klasy IIIbadania aerobiologicznenara enie naczelnychfunkcjonalno portu szybkiego transferudekontaminacja w zbiorniku zanurzeniowymoddechowa pletyzmografia indukcyjnaobs uga generatora aerozolimedia pobiercze biosamplerautrzymywanie podci nienia

Powiązane artykuły