Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

51.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/53825

⸱

26 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Types Program, Allen Institute for Brain Science, 2The Ben and Catherine Ivy Center for Advanced Brain Tumor Treatment, Swedish Neuroscience Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Streszczenie

Ten protokół jest praktycznym przewodnikiem po ochronnej metodzie odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) podczas przygotowywania wycinków mózgu. Liczne ostatnie badania potwierdziły przydatność tej metody w zwiększaniu zachowania neuronów i ogólnej żywotności wycinków mózgu. Wdrożenie tej techniki przez wczesnych użytkowników ułatwiło szczegółowe badania funkcji mózgu przy użyciu różnorodnych zastosowań eksperymentalnych i obejmujących szeroki zakres wieku zwierząt, regionów mózgu i typów komórek. Przedstawiono kroki w celu przeprowadzenia techniki ochronnego wycinka mózgu z wykorzystaniem zoptymalizowanego preparatu pożywki ze sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego NMDG (aCSF) oraz ulepszonej procedury w celu niezawodnego uzyskania zdrowych wycinków mózgu do elektrofizjologii klamry łatkowej. Dzięki temu zaktualizowanemu podejściu obserwuje się znaczną poprawę szybkości i niezawodności tworzenia gigaomowych uszczelnień podczas ukierunkowanych eksperymentów z nagrywaniem patch clamp, przy jednoczesnym zachowaniu doskonałej ochrony neuronów, ułatwiając w ten sposób trudne zastosowania eksperymentalne. Przedstawiono reprezentatywne wyniki eksperymentów z zapisem wieloneuronowych łatek w celu zbadania połączeń synaptycznych w wycinkach mózgu kory nowej przygotowanych z młodych dorosłych myszy transgenicznych i dojrzałych dorosłych ludzkich próbek neurochirurgicznych. Co więcej, zoptymalizowana metoda odzyskiwania ochronnego NMDG polegająca na krojeniu mózgu jest kompatybilna zarówno z młodymi, jak i dorosłymi zwierzętami, rozwiązując w ten sposób ograniczenie oryginalnej metodologii. Podsumowując, pojedynczy preparat podłoża i procedura krojenia mózgu mogą być wdrożone u różnych gatunków i w różnym wieku, aby osiągnąć doskonałą żywotność i zachowanie tkanek.

Wprowadzenie

Przygotowanie ostrego wycinka mózgu jest niezbędnym eksperymentalnym systemem modelowym w neurobiologii. Przez około pół wieku platforma ta umożliwiała dynamiczne badania funkcjonalne żywego mózgu w wielu różnych anatomicznych regionach mózgu i gatunkach zwierząt. Niezależnie od tego, czy zamierzonym zastosowaniem jest biochemia, obrazowanie funkcjonalne, morfologia czy elektrofizjologia, niezwykle ważne jest zapewnienie optymalnej integralności i żywotności pokrojonej tkanki. Z tego powodu do tej pory najbardziej preferowany był wysoce odporny preparat z wycinków mózgu młodych gryzoni (tj. młodszy niż 30 dzień po urodzeniu myszy). Trudność w uzyskaniu wystarczająco zdrowych wycinków mózgu od dojrzałych dorosłych i starzejących się zwierząt okazała się ogromnym wyzwaniem dla większości i nałożyła poważne ograniczenia na badanie funkcjonalnej architektury dojrzałego mózgu. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku rejestracji patch clamp, techniki, która wymaga doskonałego zachowania morfologicznego i funkcjonalnego oraz jest niezbędna do scharakteryzowania szczegółowych właściwości wewnętrznych i synaptycznych zidentyfikowanych pojedynczych neuronów. W ciągu ostatnich kilku dekad zdecydowana większość elektrofizjologów z klamrą punktową polegała na metodzie "cięcia ochronnego" z użyciem podstawionej sacharozą aCSF1 o niskiej zawartości Na+ w celu przygotowania zdrowych wycinków mózgu od młodych i w znacznie mniejszym stopniu młodych dorosłych zwierząt. Metoda ta opiera się na założeniu, że bierny napływ Na+, a następnie wnikanie wody i pęcznienie komórek podczas etapu krojenia plastrów jest dominującą zniewagą, która prowadzi do słabej przeżywalności neuronów, szczególnie w przypadku neuronów znajdujących się w warstwach powierzchownych, które są najbardziej narażone na bezpośrednie urazy spowodowane ruchem ostrza. Jednak metoda cięcia ochronnego nadal pozostawia wiele do życzenia w przygotowaniu plastrów mózgu od dojrzałych dorosłych zwierząt, niezależnie od konkretnego zastosowanego preparatu aCSF.

Proste, ale skuteczne rozwiązanie tego problemu zostało opisane2,3,4,5,6 i nazwane metodą "ochronnego odzyskiwania" wycinków mózgu. Pierwotna wersja tej metody wykorzystuje aCSF podstawiony NMDG, ponieważ NMDG został zidentyfikowany jako najbardziej wszechstronny i skuteczny spośród różnych innych potencjalnych substytutów jonów sodu (w tym sacharozy, glicerolu, choliny i Tris). Formuła pożywki została dodatkowo ulepszona przez dodanie HEPES, aby przeciwdziałać obrzękowi wycinków mózgu i zapewnić silniejsze buforowanie pH7, a także dodanie suplementów przeciwdziałających szkodliwym skutkom stresu oksydacyjnego (Tabela 1). Empirycznie ustalono, że początkowy etap inkubacji regeneracji w niskim Na+, niskim Ca2+ i wysokim Mg2+ NMDG aCSF bezpośrednio po pokrojeniu dorosłej tkanki mózgowej był zarówno konieczny, jak i wystarczający do poprawy zachowania neuronów w szerokim zakresie regionów mózgu, typów komórek i wieku zwierząt3,5,6.

Warto zauważyć, że wcześniejsze wcielenia tego, co obecnie nazywa się metodą odzyskiwania ochronnego, można znaleźć w literaturze1,8,9,10,11,12,13, chociaż pełny potencjał zapisu wycinków mózgu dojrzałych i starzejących się zwierząt nie został rozpoznany ani zademonstrowany w tych wcześniejszych pracach. Ponadto wciąż pojawiają się niuanse proceduralne wspierające konkretne zastosowania eksperymentalne4,14,15,16. Zbiorowy dorobek tych licznych grup badawczych daje duże zaufanie do solidności ochronnej metody odzyskiwania w celu poprawy konserwacji tkanek. Ochronna metoda odzyskiwania NMDG została obecnie szeroko przyjęta i wdrożona w licznych opublikowanych badaniach naukowych z wykorzystaniem preparatów z wycinków mózgu dorosłych zwierząt. Te badania nad ostrym cięciem obejmują korę nową3,17,18, hipokamp<sup class="xref">15,19,20,21, striatal22,23,24, śródmózgowie25,26,27,28,29, and hindbrain30,31,32,33,34 regiony oraz różne typy neuroprzekaźników i neuromodulatorów, w tym glutaminergiczne4,30, GABAergic18,20,31,35,36, dopaminergic24,29,37,38, cholinergic14,37, 38,39, noradrenergic40, and serotonergic27,28 neurotransmisja. Metoda ta doskonale nadaje się również do optogenetycznej kontroli aktywności neuronalnej w wycinkach pochodzących od zwierząt transgenicznych3,39 lub po iniekcjach wirusowych in vivo17,27,28,40,41,42,43, a także funkcjonalne obrazowanie aktywności neuronalnej Ca2+2,44,45,46. Zgłoszono analizy zarówno plastyczności krótkoterminowej4,47,48 jak i różnych form plastyczności długoterminowej16,35,48. W niedawnym badaniu zastosowano metodę odzyskiwania ochronnego NMDG, aby ułatwić rozległe i systematyczne sondowanie połączeń synaptycznych w korze wzrokowej w dojrzałych wycinkach mózgu dorosłych myszy przy użyciu konfiguracji nagrywania oktopatch49 — potężna demonstracja użyteczności i solidności tej metody. Ochronna metoda odzyskiwania została nawet z powodzeniem zastosowana w wcześniej nieprzewidzianych kontekstach eksperymentalnych, takich jak poprawa zachowania naczyń krwionośnych i perycytów w wycinkach mózgu dorosłych korowych50, zapis patch clamp z przeszczepionych populacji interneuronów w 1–1,5-letnich modelach myszy z chorobą Alzheimera20, oraz test transportu receptorów wycinków mózgu dla dorosłych51.

Poniższy protokół opisuje krok po kroku procedury wdrażania zoptymalizowanej metody odzyskiwania NMDG w celu przygotowania wycinków mózgu w celu poprawy żywotności ostrych wycinków mózgu. Omówiono zasady poprawy zachowania neuronów, a także wykazano wyraźne korzyści płynące z tej metodologii w złożonych eksperymentach z zapisem wieloneuronowych naszywek zarówno w wycinkach mózgu młodych dorosłych transgenicznych myszy, jak i dojrzałych dorosłych neurochirurgicznych wycinkach mózgu człowieka. Poniższy protokół został zatwierdzony dla myszy w wieku od 21 dni do ponad jednego roku, a także dla ludzkich próbek neurochirurgicznych pochodzących od dorosłych pacjentów.

Protokół

Procedury z udziałem transgenicznych myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Allen Institute for Brain Science. W eksperymentach wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy C57BL/6 (zakres wagowy 10-30 g). Niektóre z reprezentatywnych wyników opisują dane zebrane z żywych wycinków ludzkiego mózgu. Próbki tkanki kory nowej zostały pozyskane podczas operacji neurochirurgicznych w celu usunięcia guza. Konieczne było usunięcie leżącej nad nim tkanki kory nowej, aby uzyskać dostęp do chorej tkanki. We wszystkich przypadkach uzyskano świadomą zgodę pacjenta na wykorzystanie tkanki neurochirurgicznej do celów badawczych zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szwedzkiego Centrum Medycznego.

1. Przygotowanie pożywek i odczynników (Tabela 1)

UWAGA: Roztwory należy sporządzać w oczyszczonej wodzie, która jest wolna od metali śladowych i innych zanieczyszczeń. Zaleca się, aby roztwory były sporządzane na świeżo w dniu doświadczenia, chociaż niewykorzystane roztwory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, jeśli jest to pożądane. 1 l każdego z powyższych preparatów wystarcza na 1-2 zabiegi krojenia. Wszystkie roztwory aCSF muszą być nasycone karbogenem (95%O2/5% CO2) przed użyciem, aby zapewnić stabilne buforowanie pH i odpowiednie natlenienie. pH wszystkich roztworów należy dostosować do 7,3-7,4, a osmolalność zmierzyć i dostosować do 300-310 mOsmol/kg.

  1. Przygotować NMDG-HEPES aCSF (w mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 2 tiomocznik, 5 Na-askorbinian, 3 Na-pirogronian, 0,5 CaCl2·2H2O i 10 MgSO4·7H2O. Miareczkować pH do 7,3–7,4 za pomocą 17 ml +/- 0,5 ml 5 M kwasu solnego.
    UWAGA: Ten etap miareczkowania najlepiej przeprowadzić przed dodaniem kationów dwuwartościowych, aby uniknąć wytrącania się; jednak wytrącanie można odwrócić po dostosowaniu pH do zakresu fizjologicznego.
  2. Przygotować HEPES zawierający aCSF (w mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 2 tiomocznik, 5 Na-askorbinian, 3 Na-pirogronian, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O. Miareczkować pH do 7,3–7,4 kilkoma kroplami stężonego 10 N NaOH.
  3. Przygotować zapis aCSF (w mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukozy, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O. Miareczkować pH do 7,3-7,4 kilkoma kroplami stężonego 10 N NaOH.
  4. Przygotować roztwór Na+ (2 M): 580 mg NaCl rozpuszczony w 5 ml świeżo przygotowanego NMDG-HEPES aCSF. To wystarczające rozwiązanie na przygotowanie jednego plasterka mózgu.
  5. Przygotuj 2% agarozy do użycia do zatapiania tkanek. Rozpuść 2 g agarozy typu 1B (patrz tabela materiałów) w 100 ml 1x PBS i mikrofaluj w kuchence mikrofalowej aż do wrzenia. Zamieszaj, aby wymieszać, a następnie wlej mieszaninę do sterylnej 10-centymetrowej szalki Petriego i pozostaw do zestalenia. Przechowywać płytkę agarozową w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  6. Przygotować znieczulający roztwór do wstrzykiwań. Zmieszać 2,5 g 2,2,2-tribromoetanolu z 5 ml 2-metylo-2-butanolu, a następnie stopniowo rozpuścić w 200 ml PBS o pH 7,0–7,3. Przed użyciem przefiltrować roztwór podstawowy filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C w chronić przed światłem.
    UWAGA: Zapoznaj się z odpowiednimi wytycznymi i zasadami komitetu ds. stosowania zwierząt w celu określenia procedury ważności i usuwania znieczulającego roztworu roboczego.

2. Konfiguracja stacji krojenia

  1. Ustaw stację krojenia z krajalnicą do tkanek i narzędziami chirurgicznymi (patrz tabela materiałów). Aby skalibrować krajalnicę, przymocuj cyrkonowo-ceramiczne ostrze wtryskiwacza do ramienia ostrza za pomocą kleju szybkoprzylepnego, a następnie włóż uchwyt próbki i wyrównaj krawędź natarcia ostrza z krawędzią uchwytu próbki, pozostawiając niewielką szczelinę, aby ostrze nie zeskrobało metalu.
    UWAGA: Jeśli krawędź ostrza nie jest fizycznie uszkodzona, można jej ponownie używać przez wiele tygodni, a nawet miesięcy bez wymiany. Na rynku dostępne są różne modele krajalnic do tkanek, z których wiele może zapewnić doskonałą wydajność po optymalnej kalibracji. Idealny instrument powinien mieć minimalne ugięcie osi z, albo bezpośrednio mierzone i dostrojone, albo obserwowane empirycznie.
  2. Ustawić zlewkę o pojemności 250 ml wypełnioną 200 ml NMDG-HEPES aCSF i wstępnie schłodzić na lodzie ze stałą karbonizacją (nakładaną za pomocą kamienia dyfuzora gazu zanurzonego w pożywce) przez >10 min.
    UWAGA: Roztwór ten będzie stosowany do perfuzji przezsercowej oraz do napełniania zbiornika krajalnicy podczas cięcia.
  3. Ustawić początkową komorę odzyskiwania wycinków mózgu wypełnioną 150 ml NMDG-HEPES aCSF (utrzymać stałą karbonogenację) i umieścić komorę w podgrzewanej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 32–34 °C.
    UWAGA: Komora na plasterki według projektu Edwardsa i Konnertha (1992)52 jest zalecana dla tego kroku. Komory te mogą być wykonane z łatwo dostępnych przedmiotów laboratoryjnych (zlewka 250 ml, siatka nylonowa, probówka stożkowa 50 ml, okrągłe naczynie z tworzywa sztucznego 35 mm). Należy dołożyć starań, aby siatka na plastry pozostała wolna od pęcherzyków powietrza, w szczególności tych, które są w sposób ciągły wytwarzane przez kamienie pęcherzykowe gazu karbogenicznego, ponieważ mogą one powodować unoszenie się plastrów na wodzie i ich uszkodzenie. Siatka powinna być zanurzona około 1 cm pod powierzchnią cieczy.
  4. Skonfiguruj komorę do przechowywania wycinków mózgu; zalecana jest konstrukcja z wieloma niezależnymi studniami w większym zbiorniku (patrz Tabela materiałów). Napełnij zbiornik 450 ml HEPES aCSF i ogrzej do temperatury pokojowej pod stałym karbonogenicznym aż do użycia.
    UWAGA: Wycinki mózgu zostaną przeniesione z początkowej komory regeneracyjnej do tej komory w celu długotrwałego przechowywania przed zapisem elektrofizjologicznym. Należy dołożyć starań, aby siatka na plastry była zawsze wolna od pęcherzyków powietrza.
  5. Przygotuj stopioną agarozę do zatopienia w tkance. Użyj otwartego końca stożkowej fiolki o pojemności 50 ml, takiej jak foremka do ciastek, aby wyciąć blok 2% agarozy z wcześniej przygotowanego dania. Luźno zakręć stożkową fiolkę, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 10–30 sekund, aż agaroza się rozpuści. Nie przegrzewaj.
  6. Wlej stopioną agarozę do probówek o pojemności 1,5 ml. Utrzymać agarozę w stanie stopionym za pomocą termomiksera ustawionego na 42 °C z energicznym wstrząsaniem. Ostrożnie upewnij się, że stopiona agaroza nie zestala się przedwcześnie.
  7. W tym momencie umieść dodatkowy blok chłodzący do krajalnicy na lodzie, aby wstępnie ostygł.

3. Perfuzja przezsercowa

UWAGA: Procedura perfuzji przezsercowej jest ważnym krokiem podczas pracy z dorosłymi zwierzętami i jest ważna dla osiągnięcia szybkiego chłodzenia mózgu i spowolnienia metabolizmu poprzez infuzję mózgową roztworu o niskiej zawartości Na+, niskiej Ca2 + / wysokiej zawartości Mg2 + aCSF. Perfuzja przezsercowa służy również do usuwania czerwonych krwinek z naczyń krwionośnych mózgu, co zmniejsza autofluorescencję, która może zakłócać wizualizację i celowanie w fluorescencyjnie znakowane populacje komórek w liniach transgenicznych. Nie zaleca się pomijania perfuzji przezsercowej.

  1. Myszy należy głęboko znieczulić przez dootrzewnowe wstrzyknięcie znieczulającego roztworu roboczego (250 mg/kg: 0,2 ml 1,25% znieczulającego roztworu roboczego na 10 g masy ciała, patrz Tabela materiałów). Po ~2–3 minutach sprawdź wystarczającą głębokość znieczulenia, oceniając odruch szczypania palców u stóp. W razie potrzeby wstrzyknąć dodatkową objętość środka znieczulającego i ponownie ocenić odruch szczypania palca u nogi po kolejnych 2-3 minutach.
  2. Załadować strzykawkę o pojemności 30 ml z 25 ml karbogenicznego NMDG-HEPES aCSF ze wstępnie schłodzonej zlewki o pojemności 250 ml (optymalna jest temperatura 2–4 °C, w przeciwieństwie do roztworu błotnego lub mrożonego). Zamocuj igłę o rozmiarze 25 5/8.
  3. Trzymając mysz na grzbiecie, przypnij przednie i tylne łapy, aby zapewnić stabilność. Jako podstawa dobrze sprawdza się szklana szalka Petriego o średnicy 15 cm wypełniona utwardzonym silikonem.
  4. Za pomocą skalpela wykonaj boczne nacięcie, aby otworzyć klatkę piersiową na poziomie przepony. Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową po obu stronach, uważając, aby nie przyciąć serca i płuc.
  5. Przypnij środkową część klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Włożyć igłę strzykawki o pojemności 30 ml do lewej komory i przeciąć prawy przedsionek cienkimi nożyczkami, aby umożliwić przepływ krwi z serca.
  6. Wcisnąć tłok strzykawki za pomocą ręcznego stałego nacisku i wykonać fuzję zwierzęcia schłodzonym NMDG-HEPES aCSF z szybkością ~10 ml/min.
    UWAGA: Jeśli perfuzja się powiedzie, wątroba zmieni kolor z ciemnoczerwonego na bladożółty, aw niektórych przypadkach można zaobserwować przezroczyste płyny wychodzące z nozdrzy pod koniec zabiegu.

4. Sekcja mózgu i krojenie

  1. Odetnij głowę zwierzęciu. Użyj skalpela, aby otworzyć skórę na głowie i odsłonić czapkę czaszki.
  2. Użyj cienkich, super ciętych nożyczek, aby odciąć skórę nad czapką czaszki i wykonaj małe nacięcia boczne po obu stronach u ogonowej/brzusznej podstawy czaszki. Wykonaj dodatkowe płytkie nacięcia, zaczynając od ogonowo-grzbietowej części czaszki, przesuwając się w kierunku rostralnym w górę grzbietowej linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić leżącego poniżej mózgu. Wykonaj końcowe cięcie w kształcie litery "T" prostopadle do linii środkowej na poziomie opuszki węchowej.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że nie dojdzie do uszkodzenia obszaru (obszarów) mózgu. W szczególności w żadnym momencie nie powinna być stosowana żadna siła ściskająca na sam mózg.
  3. Użyj kleszczy z okrągłą końcówką, aby chwycić czaszkę, zaczynając od aspektu rostralno-przyśrodkowego i odklej się z powrotem w kierunku ogonowo-bocznym. Powtórz dla obu stron, aby otworzyć i usunąć grzbietowe połówki czapki czaszki, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij nienaruszony mózg do zlewki z wstępnie schłodzonym NMDG-HEPES aCSF. Pozwól mózgowi równomiernie ostygnąć przez ~1 min.
  4. Użyj dużej szpatułki, aby wyjąć mózg ze zlewki na szalkę Petriego pokrytą bibułą filtracyjną. Przytnij i zablokuj mózg zgodnie z preferowanym kątem krojenia i pożądanym obszarem mózgu będącym przedmiotem zainteresowania. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałego niedoboru tlenu podczas przenoszenia.
    UWAGA: Możliwych jest wiele kątów krojenia. Dokładna metoda blokowania i kąt krojenia będą zależeć od dokładnego regionu mózgu, typu komórki i obwodu, który ma być badany.
  5. Przymocuj blok mózgu do uchwytu próbki za pomocą kleju klejącego. Cofnij wewnętrzną część uchwytu próbki na tyle, aby całkowicie wycofać blok mózgu do środka. Wlej stopioną agarozę bezpośrednio do uchwytu, aż blok mózgu zostanie całkowicie pokryty agarozą. Zacisnąć wstępnie schłodzony dodatkowy blok chłodzący wokół uchwytu próbki przez ~10 s, aż agaroza zastygnie.
  6. Włóż uchwyt próbki do pojemnika w krajalnicy i sprawdź prawidłowe wyrównanie. Napełnij zbiornik pozostałymi, wstępnie schłodzonymi, natlenionymi NMDG-HEPES aCSF ze zlewki o pojemności 250 ml i przenieś kamień bąbelkowy do zbiornika na czas krojenia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.
  7. Wyreguluj mikrometr, aby rozpocząć przesuwanie próbki mózgu zatopionej w agarozie. Uruchom krajalnicę i empirycznie dostosuj prędkość posuwu i częstotliwość oscylacji do żądanego poziomu.
    UWAGA: Oba ustawienia powinny znajdować się w dolnym zakresie. Aby uzyskać najlepsze wyniki, pojedyncze przejście ramienia ostrza powinno zająć około 20 sekund, a oscylacja powinna wytwarzać bardzo gładki i delikatny dźwięk buczenia bez jawnego brzęczenia.
  8. Kontynuuj posuwanie się naprzód i krojenie tkanki w odstępach co 300 μm (lub innej preferowanej grubości), aż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zostanie w pełni wycięty; całkowity czas procedury krojenia powinien być krótszy niż 15 minut.

5. Zoptymalizowana procedura odzyskiwania ochronnego NMDG

  1. Początkowy etap odzyskiwania NMDG (etap krytyczny): Po zakończeniu procedury dzielenia należy zebrać wszystkie plastry za pomocą odciętej plastikowej rurki Pasteura t i przenieść je do wstępnie ogrzanej (34 °C) komory początkowego odzysku wypełnionej 150 ml NMDG-HEPES aCSF. Przenieś wszystkie plastry w krótkich odstępach czasu i uruchom stoper, gdy tylko wszystkie plastry zostaną przeniesione do komory odzyskiwania.
  2. Zapoznaj się z Tabelą 2, aby określić optymalny harmonogram skoków Na+ w zależności od wieku myszy.
    UWAGA: Ta procedura jest praktyczną metodą osiągnięcia kontrolowanego tempa ponownego wprowadzania Na+ do komory wycinka mózgu i jest zoptymalizowana pod kątem określonej geometrii komory wycinka mózgu oraz objętości i typu zbiornika (patrz Tabela materiałów).
  3. Przeprowadzić stopniową procedurę naskokowego Na+, dodając wskazane objętości roztworu naskokowego Na+ we wskazanym czasie. Dodaj roztwór Na+ spike-in bezpośrednio do komina bełkotki początkowej komory odzysku, aby ułatwić szybkie mieszanie.
  4. Przenieś wszystkie plastry do komory długoterminowego przetrzymywania HEPES aCSF utrzymywanej w temperaturze pokojowej. Pozwól plasterkom zregenerować się przez dodatkowy 1 godzinę w komorze trzymania HEPES przed rozpoczęciem eksperymentów z nagrywaniem z zaciskiem krosowym.

6. Nagrywanie z zaciskiem krosowym

UWAGA: Poniższe podstawowe procedury zawierają jedynie pewne względy praktyczne i nie mają na celu przedstawienia szczegółowych protokołów nagrywania zacisków krosowych, ponieważ można je znaleźć gdzie indziej53,54. Do tego zastosowania wymagany jest zestaw do elektrofizjologii z zaciskiem krosowym. Na ogół składa się on z pionowego mikroskopu wyposażonego w optykę kontrastu różnicowego interferencyjnego w podczerwieni (IR-DIC) i system oświetlenia fluorescencyjnego, wzmacniacza z zaciskiem krosowym i digitizera danych, zmotoryzowanego mikromanipulatora i platformy mikroskopowej, stołu do izolacji drgań, klatki Faradaya oraz systemu podgrzewania i perfuzji roztworu. Komora na próbki i platforma powinny być zaprojektowane do zapisu w zanurzonych warstwach. Do nagrań z wieloma neuronami patch clamp wymagany jest zestaw wyposażony w wiele wzmacniaczy, stopni czołowych i wysokiej jakości mikromanipulatorów. Ponadto, aby uzyskać najlepsze wyniki, wysoce zalecany jest zestaw wyposażony w filtr pasma IR 900 nm i dopasowane komponenty optyczne, aby zapewnić odpowiednią wizualizację komórek znajdujących się na głębokości >50 μm w wycinkach mózgu. Prawidłowe ustawienie oświetlenia Kӧhler jest również ważne dla przejrzystej wizualizacji.

  1. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór pipety (w mM): 130 K-glukonian, 4 KCl, 10 HEPES, 0,3 EGTA, 10 fosfokreatyno-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na 2-GTP i 13,4 biocytyna. Dostosuj pH do 7,35 za pomocą 1 M KOH, a osmolalność do 285–290 mOsmol/kg za pomocą sacharozy w razie potrzeby.
  2. Przygotuj elektrody do zacisków krosowych z grubościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego; idealna elektroda krosowa ma stosunkowo krótki i przysadzisty stożek z rezystancją wypełnionej końcówki ~3–6 MOhm w kąpieli.
  3. Upewnij się, że druty elektrody srebrnej są odpowiednio chlorkowane, aby zapewnić stabilne zapisy. Zrób to (typowo), zanurzając ostatnie 3-4 mm srebrnego drutu w płynnym wybielaczu na około 30 minut lub do momentu, gdy drut zmieni kolor na.
  4. Ustalić perfuzję roztworu za pomocą pompy perystaltycznej ustawionej na 3–4 ml/min. Cyrkulować karbogeniczny zapis CSF przez komorę rejestracyjną, zwracając uwagę na dopasowanie dopływu i odpływu, aby uniknąć przepełnienia.
  5. Przenieś pojedynczy plasterek mózgu do zanurzonej komory rejestracyjnej i zabezpiecz na miejscu za pomocą kotwy w kształcie litery U z nylonowymi sznurkami krzyżowymi. Zidentyfikuj docelowy obszar mózgu za pomocą obiektywu powietrznego 4X przed przełączeniem na obiektyw o większej mocy (np. obiektywy o dużej aperturze numerycznej 40X lub 60X zanurzone w wodzie).
  6. Wizualnie zidentyfikuj zdrową komórkę docelową. Wygląd błony neuronalnej w somie, uwidoczniony za pomocą mikroskopii IR-DIC, służy do oceny przydatności komórki kandydacyjnej do rejestracji za pomocą zacisku krosowego.
    UWAGA: Zdrowe neurony zazwyczaj wykazują następujące cechy: ani skurczone, ani spuchnięte somaty, miękki kontrast krawędzi błony i gładki wygląd błony. Ponadto większość zdrowych komórek znajduje się na głębokości >30 μm w warstwie, ponieważ powierzchowne neurony mogą zostać uszkodzone przez przerwane procesy dendrytyczne. Należy unikać neuronów, które mają pomarszczony wygląd, wyraźnie widoczne jądra lub wygląd "jajka sadzonego" lub bardzo ciemne lub kontrastowe krawędzie błony.
  7. Napełnij pipetę z plastrem ~5 μl roztworu wewnątrzkomórkowego i załaduj ją do uchwytu elektrody. Przenieś pipetę do kąpieli nagrywającej nad wycinkiem mózgu i zastosuj lekki dodatni nacisk, aby usunąć wszelkie przeszkody w końcówce. Wyzeruj przesunięcie pipety i monitoruj rezystancję końcówki za pomocą funkcji testu membranowego.
  8. Przesunąć końcówkę pipety w kontakt z ciałem komórki docelowego neuronu; na powierzchni błony powinien powstać mały wgłębienie z powodu dodatniego ciśnienia światła.
  9. Gdy tylko zaobserwuje się wgłębienie membrany, szybko usuń nadciśnienie i zastosuj delikatne ssanie, aby ułatwić tworzenie uszczelnienia. Gdy rezystancja pipety wzrośnie do >100 MOhm, włącz polecenie przytrzymania do poziomu odpowiadającego przewidywanemu potencjałowi spoczynkowemu błony dla docelowego typu ogniwa (dobrym punktem wyjścia jest -70 mV).
  10. Gdy rezystancja końcówki osiągnie ≥1 gigaoma, spróbuj włamać się do komórki, rozrywając membranę pod pipetą z plastrem, używając krótkich napadów ostrego ssania; funkcja "zap" może być wykorzystana do ułatwienia włamania w razie potrzeby.
    UWAGA: Potencjał utrzymywania -70 mV jest sugerowany dla eksperymentów z cęgami napięcia na neuronach korowych. Zdrowe neurony będą miały prąd upływowy nie większy niż -100 pA na czas trwania eksperymentu, ale jest to częściowo zależne od typu komórki. Neuron zostałby wykluczony z analizy, gdyby spoczynkowy potencjał błonowy był bardziej zdepolaryzowany niż -50 mV lub gdyby opór dostępu zmienił się o więcej niż 20%.
  11. Po uzyskaniu stabilnego zapisu klamry krosowej całej komórki, skieruj dodatkowe neurony do nagrywania, powtarzając kroki 6.6–6.10. Uważaj, aby uniknąć zakłóceń mechanicznych, które mogłyby skutkować utratą pierwszego nagrania.
    1. Wybierz dodatkowe neurony w promieniu 100 μm od pierwszego neuronu, aby zapewnić rozsądne prawdopodobieństwo znalezienia neuronów sprzężonych synaptycznie.
      UWAGA: W niektórych przypadkach pomocne może być zidentyfikowanie wielu neuronów kandydujących z góry oraz wstępne załadowanie i ustawienie wszystkich pipet w pobliżu różnych komórek docelowych przed ustanowieniem pierwszego zapisu zacisku krosowego.

Wyniki

W tej sekcji przedstawiono reprezentatywne wyniki rutynowego przygotowania skrawków mózgu oraz eksperymentów elektrofizjologicznych metodą patch clamp z zastosowaniem zoptymalizowanej metody ochronnej regeneracji NMDG (tj. ochronnej regeneracji NMDG połączonej z procedurą stopniowego wprowadzania Na+). Najpierw oceniono zachowanie morfologiczne neuronów w różnych obszarach skrawków mózgu przygotowanych z zastosowaniem lub bez zastosowania zoptymalizowanej metody ochronnej regeneracji NMDG (Rycina 1). Do tych eksperymentów wybrano dorosłe myszy w wieku trzech miesięcy, a do oceny stanu zdrowia neuronów na podstawie kształtu i ogólnego wyglądu somat oraz dendrytów proksymalnych wykorzystano mikroskopię IR-DIC. Zwróćmy uwagę na pomarszczony, pyknotyczny wygląd większości neuronów na reprezentatywnych obrazach skrawków mózgu przygotowanych bez metody ochronnej regeneracji (wszystkie obrazy uzyskano 1–2 h po przygotowaniu skrawków). Skrawki kontrolne te były przygotowywane przy użyciu aCSF z NMDG do perfuzji przezsercowej i etapu cięcia, ale początkowo regenerowano je w HEPES aCSF o wysokiej zawartości Na+. W przeciwieństwie do nich, reprezentatywne obrazy skrawków przygotowanych za pomocą zoptymalizowanej metody ochronnej regeneracji NMDG ukazują neurony o poprawionej morfologii (wygląd gładszy, pełniejszy, mniej pomarszczony), które nadają się do rejestracji metodą patch clamp (Rycina 1). Poprawione zachowanie neuronów zaobserwowano w wielu obszarach mózgu, w tym w warstwach II/III i V neocortex, subiculum oraz w grzbietowym jądrze kolanosowatym bocznym (dLGN).

Następnie zoptymalizowaną metodę regeneracji ochronnej z użyciem NMDG porównano z oryginalną metodą regeneracji ochronnej z użyciem NMDG (t. j., bez stopniowego dodawania Na+ procedura dodawania wewnętrznego standardu (spike-in). Średni czas tworzenia uszczelnienia o rezystancji gigaoma podczas prób rejestracji patch-clamp uległ radykalnemu i znacznemu skróceniu (9,9 s w porównaniu z 3,3 s, **p <0,05, sparowane t-test) podczas stopniowego Na+ zastosowano procedurę dodawania wewnętrznego standardu (spike-in) wraz z etapem regeneracji ochronnej z użyciem NMDG (Rycina 2). Szybszy i bardziej niezawodny czas uszczelniania membrany znacząco zwiększył przepustowość rejestracji metodą patch-clamp w plastrach mózgu młodych dorosłych osobników. Optymalny Na+ harmonogram dodawania wewnętrznych standardów (spike-in) został dodatkowo zmodyfikowany w zależności od wieku zwierząt (Tabela 2) i przyniosło korzyści w przypadku wszystkich badanych grup wiekowych (myszy od 3 tygodni do 1 roku życia). Przedstawiono profil stopniowego wzrostu stężenia jonów sodu w trakcie procedury dodawania standardu (Rycina 3) stanowiące uzupełnienie harmonogramów przedstawionych w Tabela 2.

W ramach Programu Typów Komórkowych Instytutu Allena (http://celltypes.brain-map.org/) prowadzony jest zakrojony na szeroką skalę wysiłek mający na celu systematyczną charakterystykę wewnątrzpochodnych właściwości elektrofizjologicznych pojedynczych neuronów w plastrach kory wzrokowej mózgu młodych dorosłych myszy (dni postnatalne 40-80), pochodzących z linii transgenicznych z ekspresją swoistych dla typów komórek markerów fluorescencyjnych w genetycznie zdefiniowanych populacjach neuronalnych (linie Cre specyficzne dla warstwy kory i typu komórek skrzyżowane z linią reporterową fluorescencyjną zależną od Cre55). Rysunek 4 przedstawia przykładowe zapisy wzorców wyładowań zarejestrowane z szybko wyładowujących (FS) interneuronów korowych wykazujących ekspresję parwalbuminy (Pvalb) (myszy Pvalb-IRES-Cre/Ai14) w odpowiedzi na serię 1 s skoków wtryskiwanego prądu, obejmujących zakres dynamiczny wyładowań neuronów. Po prawej stronie przedstawiono krzywą F-I dla zbioru danych obejmującego 2 interneurony FS kory. Podobne ukierunkowane eksperymenty z rejestracją metodą patch clamp przeprowadzono w celu charakterystyki 23 pobudzających neuronów wykazujących ekspresję Rorb w warstwie IV u myszy Rorb-IRES-Cre/Ai14 (Rysunek 4). Różnorodne zdrowe typy neuronów, w tym interneurony FS i neurony piramidalne z różnych obszarów i warstw kory, mogą być rutynowo i niezawodnie targetowane do rejestracji metodą patch clamp przez co najmniej 6-8 h po przygotowaniu plastra przy użyciu tego zoptymalizowanego protokołu.

Oprócz pomiaru wewnętrznych właściwości neuronalnych, badano łączność synaptyczną pomiędzy wieloma jednocześnie rejestrowanymi neuronami określonych typów w mikroukładach kory wzrokowej. Technika wieloneuronowej rejestracji metodą patch clamp jest wyjątkowo wymagająca, ponieważ w stosunkowo niewielkim polu widzenia skrawka mózgu musi znajdować się wiele zdrowych neuronów kandydackich określonych typów, aby zapewnić rozsądną szansę na uzyskanie wysokiej jakości jednoczesnych pomiarów oraz identyfikację w dobrej wierze połączenia synaptyczne. Rycina 5 Przedstawiono rejestrację sparowaną dwóch interneuronów FS tdTomato+ w korze wzrokowej wycynkach mózgu młodych dorosłych myszy Pvalb-IRES-Cre/Ai14. Wykryto silne jednokierunkowe hamujące połączenie synaptyczne (rejestrowane przy użyciu wewnętrznego roztworu pipety o wysokim stężeniu chlorków). Zaprezentowano przykładowe rejestracje i protokoły pomiaru właściwości krótkotrwałej plastyczności synaptycznej. Serie wysokoczęstotliwościowej stymulacji pociągowej (po 10 impulsów przy 10, 50 i 10 Hz) poprzedzały pojedyncze testowe impulsy regeneracji w różnych odstępach czasowych (1, 2 lub 4 s) w celu pomiaru przebiegu czasowego powrotu po depresji synaptycznej.

Doskonałe rezultaty osiągnięto również w przypadku ludzkich neuronów neokortykalnych w dojrzałych, dorosłych przekrojach mózgu ex vivo. Próbki neurochirurgiczne pobierane są od pacjentów poddawanych planowym operacjom usunięcia guza w lokalnych szpitalach. Procedury pobierania ludzkiej tkanki neurochirurgicznej i przygotowywania przekrojów mózgu różnią się od procedur stosowanych dla mózgu myszy w kilku aspektach praktycznych. W skrócie, wycięta tkanka neokortykalna (oddalona od miejsca patologii) jest pobierana z sali operacyjnej, zanurzana w lodowatym, natlenionym roztworze NMDG-HEPES aCSF i transportowana w warunkach ciągłego chłodzenia i natleniania z sali operacyjnej do laboratorium w czasie nieprzekraczającym 30 min. Przekroje mózgu są przygotowywane zgodnie z procedurą ochronnej regeneracji NMDG i pozostawiane do regeneracji przez wydłużony czas wynoszący około 3 h przed rozpoczęciem rejestracji metodą patch clamp. Rycina 6 przedstawia udany eksperyment z rejestracją parzystą oraz udany eksperyment z poczwórną rejestracją patch clamp z ludzkich przekrojów mózgu ex vivo, przygotowanych w ten sposób z obszaru kory czołowej. Rejestracja parzysta wykazuje jednokierunkowe pobudzające wejście synaptyczne z korowego neuronu piramidalnego do korowego neuronu interneurona (rejestrowane jako pobudzające prądy postsynaptyczne). W eksperymencie z poczwórnym patchem jednocześnie zarejestrowano dwa neurony pobudzające i dwa hamujące, a z dwunastu wszystkich badanych połączeń wykryto trzy hamujące połączenia synaptyczne (rejestrowane jako hamujące potencjały postsynaptyczne). Tym samym ta zoptymalizowana metodologia przygotowania przekrojów mózgu pozwala na niezawodny sukces eksperymentalny w najtrudniejszych zastosowaniach przekrojów mózgu, w tym w eksperymentach z patch clampem wieloneuronowym służących do badania łączności obwodów w świeżo wyciętej tkance mózgu dojrzałego człowieka.

Porównanie histologiczne obszarów mózgu; obrazy mikroskopowe warstw V/II/III neocortex, subiculum oraz dLGN.
Rysunek 1: Poprawa przeżywalności neuronów dzięki zoptymalizowanej metodzie ochrony i regeneracji z użyciem NMDG podczas przygotowywania skrawków mózgu. Pozyskano reprezentatywne obrazy IR-DIC z różnych obszarów mózgu w ostrych skrawkach pochodzących od trzymiesięcznej myszy. Kontrolna metoda cięcia z ochroną NMDG bez etapu regeneracji ochronnej (panele lewe) w porównaniu z zoptymalizowaną metodą regeneracji ochronnej NMDG (panele prawe).A) warstwa V neocortex, (B) warstwa II/III neocortex, (C) subiculum, oraz (D) grzbietowo-boczny jądro kolanowate (dLGN). Paski skali na wszystkich panelach wynoszą 20 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dane elektrofizjologiczne; wykres przedstawiający czas uzyskania uszczelnienia rzędu gigaomów oraz analizę potencjałów spoczynkowych błony.
Rysunek 2: Przyspieszenie i poprawa niezawodności tworzenia uszczelnienia rzędu gigaomów w eksperymentach z rejestracją patch clamp z zastosowaniem metody regeneracji ochronnej NMDG z Na+ procedura dodawania standardu wewnętrznego (spike-in). (A) Wykres czasów tworzenia uszczelnienia gigaomowego dla samej regeneracji NMDG (czarne punkty danych, n = 19) w porównaniu z regeneracją NMDG z dodatkiem Na++ procedura dodawania standardu wewnętrznego (czerwone punkty danych, n = 23). Wszystkie zarejestrowane komórki były neuronami piramidalnymi w warstwie II/III lub V kory wzrokowej. Należy zauważyć, że czas maksymalny został ograniczony do 10 s, aby uwzględnić komórki, w których nigdy nie uzyskano uszczelnienia rzędu gigaomów. Sparowane t-test, **p <0.005. (B) Wykres potencjału spoczynkowego błony (RMP) dla neuronów piramidowych warstwy V (pomarańczowe punkty danych, n = 10/11), neuronów piramidowych warstwy II/III (zielone punkty danych, n = 9/10) lub korowych interneuronów koszyczkowych (FS) Pvalb+ (niebieskie punkty danych, n = 23/2). Pełne koła oznaczają warunki regeneracji w NMDG, a puste koła regenerację w NMDG z dodatkiem Na++ procedura spike-in. Każdy punkt danych reprezentuje jeden neuron; przedstawiono średnią oraz +/- SEM. Nie stwierdzono istotnych różnic w RMP przy porównaniu warunków przygotowania skrawków mózgu dla wszystkich trzech typów komórek (testy sparowane Proszę o podanie tekstu źródłowego do tłumaczenia.-test). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy stężenia NaCl w funkcji czasu przedstawiające zmiany związane z wiekiem, wyniki analizy eksperymentu.
Rysunek 3Profil stopniowego wzrostu stężenia jonów sodu w trakcie procedury dodawania standardu wewnętrznego (spike-in). (A) Wykres zależności stężenia dodanego NaCl od czasu. (B) Wykres całkowitego stężenia NaCl w przestrzeni zewnątrzkomórkowej w funkcji czasu. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wykresy częstotliwości wyładowań neuronów; odpowiedź na wstrzyknięcie prądu; panel A 60mV, panel B 80mV; schemat.
Rysunek 4Wewnętrzne właściwości elektrofizjologiczne genetycznie zdefiniowanych typów komórek korowych. (A) Przykładowe zapisy wyładowań neuronalnych w odpowiedzi na skokowe wstrzykiwanie prądu dla kortykalnych interneuronów szybkokitrających (FS) Pvalb+ (panel lewy). Rejestracje przeprowadzono w neuronach tdTomato+ w skrawkach mózgu myszy Pvalb-IRES-Cre/Ai14. Podsumowanie danych dla zależności między częstotliwością wyładowań a wstrzykiwanym prądem (krzywa F-I) przedstawiono po prawej stronie (n = 2). (B) Przykładowe zapisy wyładowań neuronów w odpowiedzi na skokowe wstrzykiwanie prądu dla pobudzeniowych neuronów IV warstwy kory wykazujących ekspresję Rorb (panel lewy). Do rejestracji w skrawkach mózgu myszy Rorb-IRES-Cre/Ai14 wybrano neurony tdTomato+. Podsumowanie danych dla zależności między częstotliwością wyładowań a wstrzykiwanym prądem (krzywa F-I) przedstawiono po prawej stronie (n = 23). Każda cienka kolorowa linia reprezentuje krzywą F-I dla pojedynczego neuronu, natomiast grube czarne linie reprezentują średnią dla każdej grupy +/-SEM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Eksperyment neurobiologiczny; schemat plastyczności synaptycznej; wykres amplitudy IPSP neuronu; elektrofizjologia.
Rycina 5: Krótkotrwała plastyczność w synaptycznie połączonych korowych interneuronach FS wykazujących ekspresję Pvalb. (A) Do celowania w dodatnie pod kątem tdTomato, wykazujące ekspresję Pvalb interneurony kosmkowe (FS) pierwotnej kory wzrokowej myszy zastosowano kontrast różnicowy (DIC) oraz epifluorescencję. Kolorowy schemat połączeń przedstawiający jednostronne połączenie synaptyczne pomiędzy dwoma interneuronami. (B) Schemat protokołów stymulacji wykorzystanych do oceny dynamiki krótkoterminowej neuronów połączonych synaptycznie. W neuronie presynaptycznym wywołuje się serie po 10 potencjałów czynnościowych (10, 50 i 10 Hz), po których następuje pojedynczy potencjał czynnościowy (impuls testowy regeneracji, RTP) dostarczony z różnym opóźnieniem czasowym (1, 2 i 4 s) po zakończeniu serii. Każdy RTP został oznaczony kolorami dla większej przejrzystości. (CŚrednie przebiegi odpowiadających im jednostronnych hamujących potencjałów postsynaptycznych (uIPSP) w komórce nr 2 w odpowiedzi na serie potencjałów czynnościowych wywołanych w komórce nr 1. Szara wstawka zawiera powiększoną skalę czasu w celu ukazania rozdzielności serii uIPSP.D) Znormalizowane amplitudy uIPSP przedstawiono w funkcji ich pozycji w seriach impulsów o różnych częstotliwościach. Wyraźna depresja netto występuje przy wszystkich częstotliwościach wejściowych, z istotnym powrotem uIPSP do wartości wyjściowych po 4 s. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

Schemat aktywności neuronalnej z ludzkimi śladami rejestracji parowej i poczwórnej do analizy badań synaptycznych.
Rycina 6: Rejestracje metodą patch clamp z wielu neuronów wykonane w przekrojach mózgu dorosłego człowieka uzyskanych podczas zabiegów neurochirurgicznych. (A) Obrazy IR-DIC przy małym i dużym powiększeniu wskazujące lokalizację i tożsamość rejestrowanych neuronów (panele górne). Jednoczesna rejestracja neuronu piramidowego (czarna gwiazdka) oraz sąsiedniego neuronu interneuronowego (czerwona gwiazdka). Przykładowe kolorowe przebiegi jednokierunkowego pobudzającego połączenia synaptycznego (ESPC) z komórki piramidowej do interneuronu (mierzone jako EPSCs w technice voltage clamp) oraz odpowiadająca im mapa połączeń fizycznych (panele dolne). (B) Eksperyment z rejestracją metodą patch clamp w układzie czterokanałowym w dorosłym ludzkim preparacie neurochirurgicznym plastra mózgu z grzbietowo-bocznej kory przedczołowej. Jednocześnie rejestrowane są dwa neurony piramidowe i dwa interneurony, co pozwala na sekwencyjne badanie dwunastu możliwych połączeń synaptycznych. seria wywołanych potencjałów czynnościowych w komórce nr 3 (ślady zielone) doprowadziła do wykrycia hamujących potencjałów postsynaptycznych (IPSP) w każdym z trzech pozostałych jednocześnie rejestrowanych neuronów (trzy obszary w ramkach, panele górne). Odpowiedzi zarejestrowane z każdego poszczególnego neuronu są oznaczone kolorami dla przejrzystości. Mapa połączeń fizycznych przedstawiona jest w panelu dolnym. Należy zwrócić uwagę na surowe ślady pokazane w (B) reprezentują średnie z co najmniej 20 kolejnych surowych pomiarów (sweepów). Domniemana identyfikacja typu komórki opierała się na kształcie somy, analizie morfologii za pomocą wypełniania barwnikiem fluorescencyjnym podczas rejestracji oraz na wrodzonych właściwościach elektrofizjologicznych, w tym na wzorcach wyładowań w odpowiedzi na skokowe wstrzykiwanie prądu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

aCSF NMDG-HEPESpodtrzymujący aCSF z HEPESRejestracja w aCSF
KomponentmMMWg/litrmMMWg/litrmMMWg/l
N-metyl-D-glukamina92195.2217.96
HCl9236.46*
NaCl9258.445.3812458.447.25
KCl2.574.550.192.574.550.192.574.550.19
NaH2PO41.2138.000.171.2138.000.171.2138.000.17
NaHCO₃33084.012.523084.012.522484.012.02
HEPES20238.314.7720238.314.775238.311.19
Glukoza25180.204.5125180.204.5112.5180.202.25
askorbinian sodu5198.000.995198.000.990198.000.00
Tio mocznik276.120.15276.120.15076.120.00
pirowinian sodu3110.040.333110.040.330110.040.00
MgSO4.7H2O10246.485 ml2246.481 ml2246.481 ml (roztwór stokowy 2M)
CaCl22.2H2O0.5147.010,25 ml2147.011 mL2147.011 mL (roztwór stokowy 2M)
* przeprowadzić miareczkowanie pH sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF) NMDG-HEPES do wartości 7,3–7,4 przy użyciu stężonego HCl
Wszystkie roztwory powinny znajdować się w zakresie 30–310 mOsm/kg.

Tabela 1: Składy pożywek.

Wiek zwierząt
Czas (min)*<1 miesiąc1–3 miesiące3–6 miesięcy6–12 miesięcypowyżej 12 miesięcy
0250 µL250 µL
1
2250 µL
3
4500 µL
5250 µL250 µL
61000 µL
7
82000 µL
9
10transfer500 µL250 µL250 µL
11
12
13
14
151000 µL500 µL250 µL250 µL
16
17
18
19
202000 µL1000 µL500 µL250 µL
21
22
23
24
25transfer2000 µL1000 µL500 µL
26
27
28
29
30transfer2,000 µL1,000 µL
31
32
33
34
35transfer2,000 µL
36
37
38
39
40transfer
*Momentem zero jest chwila przeniesienia plasterków do początkowej komory regeneracyjnej

Tabela 2: Zalecany harmonogram stopniowej procedury dodawania Na+ w zależności od wieku myszy.

Dyskusja

Na+ Spike-In poprawia formowanie gigaomowych uszczelnień i pomyślne nagrywanie zacisków krosowych
Pierwotna wersja metody odzysku ochronnego NMDG została specjalnie zaprojektowana dla zwierząt dorosłych i starzejącychsię 2,5. Niektórzy pierwsi użytkownicy starali się również zastosować tę metodologię do krojenia mózgów młodych zwierząt (tj. myszy w wieku <30 dni). Zauważono jednak, że w przeciwieństwie do wyjątkowego, wizualnie potwierdzonego zachowania neuronów za pomocą ochronnej metody odzyskiwania NMDG w tym przedziale wiekowym, tworzenie uszczelnień gigaomowych może często utknąć w martwym punkcie, co prowadzi do nieudanych prób nagrania klamry. Jedna z hipotez głosi, że kationy NMDG są łatwiej uwięzione w młodocianych wycinkach mózgu w porównaniu z dorosłymi wycinkami mózgu i mogą utrudniać tworzenie się fok; jednak gigaomowe uszczelki mogą łatwo się tworzyć, podczas gdy młode wycinki mózgu są całkowicie zanurzone w NMDG aCSF (dane nie pokazane), co wskazuje, że NMDG aCSF per se nie utrudnia tworzenia gigaomowych uszczelnień.

Szybkie przejście od roztworu o niskiej do wysokiej zawartości Na+ po zakończeniu początkowego etapu odzyskiwania wycinków mózgu powoduje uszkodzenie błon neuronalnych i zaburza proces tworzenia uszczelnień. Jest to intuicyjne, biorąc pod uwagę, że przejście od niskiej do wysokiej temperatury Na+, niskiej do ciepłej temperatury i dramatyczny wzrost stosunku Ca2+ do Mg2+ łącznie prowadzą do masowego odrodzenia spontanicznej aktywności synaptycznej. Ta hamująca faza odbicia w procedurze krojenia mózgu prawdopodobnie odzwierciedla uszkodzenie reperfuzyjne po urazie niedokrwiennym. W związku z tym, aby jeszcze bardziej złagodzić uszkodzenie błony neuronalnej w początkowej fazie rekonwalescencji, zastosowano procedurę stopniowego skoku Na+, w której wzrost stężenia Na+ w ochronnej komorze inkubacyjnej NMDG jest powoli i powtarzalnie zwiększany z precyzyjnym czasem. Podobnie jak w pierwotnej procedurze odzyskiwania ochronnego, korzystna jest czasowa dysocjacja wzrostu Na+ od temperatury i podniesienie stosunku Ca2+ / Mg2+. Ale dodatkowo, procedura skoku Na+ prowadzi do niewielkiego przyrostowego wzrostu zewnątrzkomórkowego stężenia Na+ we wczesnych punktach czasowych i dużego wzrostu w kierunku późnych punktów czasowych, dając w ten sposób tkance mózgowej możliwość lepszego dostosowania się do rosnących poziomów Na+. Procedura ta jest alternatywą dla stopniowej wymiany roztworu kontrolowanej przez pompę perfuzyjną lub grawitacyjne linie kroplujące, które prowadzą do stałego wzrostu poziomu Na+ i wymagają zwrócenia uwagi zarówno na dopływ, jak i odpływ, aby uniknąć przepełnienia komory plastrów. Warto zauważyć, że w tej procedurze nakłuwania Na+ osmolalność roztworu w komorze plastrów stopniowo wzrasta w ciągu kilku minut, zanim plastry powrócą do normalnego roztworu osmolalności, ale nie wpłynęło to negatywnie na zdrowie plastra ani sukces zapisu zacisku krosowego. Roztwór tnący o wysokiej osmolalności był wcześniej stosowany do przygotowywania plastrów śródmózgowia w celu lepszego zachowania neuronów dopaminowych do zapisów patch clamp57,58, wykazując w ten sposób, że ta tymczasowa hiperosmolalność może być korzystna w niektórych kontekstach.

Dzięki wdrożeniu zoptymalizowanej procedury łączącej metodę ochronnego odzyskiwania NMDG i stopniowy krok skoku Na+, użyteczność tej metodologii wycinków mózgu została rozszerzona na wiek młodocianych i dojrzałych dorosłych. Ten zaktualizowany protokół jest teraz odpowiedni dla szerokiego zakresu wieku zwierząt przy użyciu jednego optymalnego preparatu i procedury NMDG aCSF. W razie potrzeby procedura nastawiania Na+ może być stosowana z coraz dłuższym opóźnieniem i/lub wolniejszym czasem w celu zwiększenia żywotności wycinków mózgu starszych zwierząt, a my przedstawiliśmy podstawowy przewodnik po zalecanych harmonogramach nawijania w zależności od wieku zwierzęcia (patrz Tabela 2). Chociaż dostarczyliśmy podstawową strukturę odpowiednią dla szerokiej gamy zastosowań, dodatkowe zaawansowane kroki mogą być badane w celu dalszego zwiększenia żywotności i długowieczności wycinków mózgu od dorosłych i starzejących się zwierząt. Na przykład, strategie odbudowy glutationu są szczególnie skuteczne w tym zakresie i mogą być wdrażane zgodnie z opisem w innym miejscu 2,6.

Zwiększanie przepustowości w przypadku wymagających eksperymentów
Analiza połączeń synaptycznych za pomocą zapisu patch clamp jest wymagającym zastosowaniem, które wymaga doskonałego zachowania zarówno struktury, jak i funkcji neuronów w celu osiągnięcia wysokiej niezawodności sukcesu. Ponieważ liczba neuronów, które mają być jednocześnie rejestrowane, rośnie liniowo, poziom trudności technicznej wzrasta nadliniowo. Istnieje wiele trybów awarii, a jedną z najczęstszych przyczyn awarii jest niemożność uformowania odpowiednich gigaomowych uszczelek na jednym lub więcej docelowych ogniwach. Może to znacznie spowolnić postęp, szczególnie gdy trzy lub więcej neuronów musi być rejestrowanych jednocześnie. Zgodnie z odkryciem szybszego czasu tworzenia uszczelnienia gigaomowego za pomocą zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG, nastąpiła wyraźna poprawa wskaźnika sukcesu i przepustowości eksperymentów z zapisem klamry z wieloma neuronami zarówno na wycinkach mózgu dorosłych transgenicznych myszy, jak i na neurochirurgicznych wycinkach mózgu dorosłego człowieka. Zwiększona wydajność jest prawie na pewno spowodowana zarówno szybszym i bardziej niezawodnym tworzeniem uszczelnień gigaomowych, jak i lepszym zachowaniem neuronów w warstwach dzięki temu protokołowi. Chociaż protokół ten koncentruje się wyraźnie na korzyściach dla aplikacji do nagrywania z zaciskiem krosowym, przewiduje się, że podobne korzyści pojawią się w przypadku innych wymagających zastosowań eksperymentalnych, w których najważniejsza jest żywotność wycinków mózgu.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca została sfinansowana przez Allen Institute for Brain Science. Autorzy pragną podziękować założycielom Allen Institute, Paulowi G. Allenowi i Jody Allen, za ich wizję, zachętę i wsparcie. Dziękujemy również personelowi wsparcia technicznego Allen Institute za opiekę nad zwierzętami, hodowlę i genotypowanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Compresstome VF-200Instrumenty precyzyjneVF-200Wibracyjna krajalnica do tkanek (zalecana)
N-metylo-D-glukaminaSigma AldrichM2004składnik aCSF
Chlorek soduSigma AldrichS3014składnik aCSF
Chlorek potasuSigma AldrichP5405składnik aCSF
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodnySigma Aldrich71505aCSF składnik
Wodorowęglan soduSigma AldrichS5761składnik aCSF
HEPESSigma AldrichH4034składnik aCSF
GlukozaSigma AldrichG7021składnik CSF
Askorbinian soduSigma AldrichA4034składnik
aCSFTiomocznikSigma AldrichT8656składnik CSF
pirogronian soduSigma AldrichP5280składnik aCSF
Chlorek wapnia dwuwodnySigma AldrichC7902składnik CSF
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma AldrichM1880składnik CSF
2,2,2-tribromoetanol Sigma AldrichT48402Składnik znieczulający 1
2-metylo-2-butanol Sigma Aldrich240486Komponent anestezjologiczny 2
Zakrzywione kleszczeNarzędzia do nauki11065-07Narzędzia do preparowania mózgu
Cienkie nożyczki preparacyjne (supercut)Narzędzia do nauk ścisłych14058-09Narzędzia do preparowania mózgu
Duże, wytrzymałe nożyczki 7''Narzędzia do nauki o dużej14000-18Narzędzia do preparowania mózgu
Metalowa szpatułkaSigma AldrichZ511455-1PAKNarzędzia do preparowania mózgu
ŻyletkiVWR89031-954Narzędzia do preparowania mózgu
Brain Slice Keeper-4AutomateScientific S-BSK4komora do przytrzymywania plasterków mózgu
nylonowa Warner Instruments64-0198Do budowy małych studzienek do odzysku plastrów
Zlewki ze szkła pyrexowego (250 ml)VWR89090-434Do budowy małych komór do odzysku plastrów
Naczynie z tworzywa sztucznego 35 mm, okrągłeVWR100488-376Do budowy małych studzienek
do odzysku plastrów Kamienie dyfuzora gazu (10 &mikro; m)Sigma Aldrich59277Do stałego karbonowania (drobne pęcherzyki)
Agaroza Typ I-BSigma AldrichA0576Do zatapiania próbek mózgu Końcówki
do mikroładowarekEppendorf22491229Do napełniania elektrod zaciskowych
SylgardVWR102092-312Do wykonania niestandardowej platformy preparacyjnej
Kwas solny Sigma AldrichH1758-100MLDo regulacji pH podłoża
Wodorotlenek sodu Sigma Aldrich221465-25GDo regulacji pH podłoża
Wodorotlenek potasuSigma Aldrich221473Do regulacji pH mediów
Plastikowe pipety transferowe z podziałką 3 mlVWR89497-676Do przenoszenia plastrów
Ceramiczne łopatki wtryskiwaczy z cyrkonuOstrza specjalistyczneEF-INZ10http://cadenceinc.com/
KG-33 szkło borokrzemowe kapilara z żarnikiemKing Glass Companyniestandardowa wycenaID: 0,87 mm, OD 1,50 mm
BiocytinSigma AldrichB4261Roztwór do pipet wewnętrznych
Fosfokreatyna disodowaSigma AldrichP7936Roztwór do pipet Intern
Glukonianpotasu Sigma AldrichG4500-100GRoztwór do pipet Intern
EGTASigma AldrichE3889Roztwór do pipet wewnętrznych
Mg-ATPSigma AldrichA9187Roztwór do pipet wewnętrznych
Na2-GTPSigma Aldrich51120Roztwór do pipet wewnętrznych
sacharozaSigmaAldrich S0389Roztwór do pipet wewnętrznych
Podgrzewana kąpiel wodna (2,5 l)VWR13491-060filtracyjna
krążki VWR28456-022Różne
Klej cyjanoakrylowyAmazonB000BQRBO6Różne
Szklana szalka PetriegoVWR89000-326Różne
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma AldrichP5493Różne
Strzykawki 30 mlVWRBD302832Różne
Strzykawki 1 mlVWRBD-309628Różne
25 igieł o rozmiarze 5/8VWR89219-292
Różne Termomiksery (z blokiem probówek 1,5 ml)VWR89232-908Do utrzymywania stopionej agarozy 
wytrzymałości siatka Różne Bibuła

Bibliografia

  1. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  2. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  3. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  4. Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  5. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
  6. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
  7. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303 (3), 141-144 (2001).
  8. Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148 (4), 1004-1014 (2007).
  9. Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, (Pt 3) 715-730 (1998).
  10. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  11. Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23 (2), 422-429 (2003).
  12. Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26 (41), 10461-10471 (2006).
  13. Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24 (27), 6228-6236 (2004).
  14. Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), 584-589 (2015).
  15. Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144(2013).
  16. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  17. Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  18. Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31 (2), 265-270 (2015).
  19. LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
  20. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34 (29), 9506-9515 (2014).
  21. Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37 (7), 1154-1160 (2013).
  22. Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95 (1-2), 42-49 (2015).
  23. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390(2014).
  24. Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925(2014).
  25. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. , (2015).
  26. Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32 (42), 14519-14531 (2012).
  27. McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8 (6), 1857-1869 (2014).
  28. Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18 (5), 728-735 (2015).
  29. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84 (3), 393-406 (2013).
  30. Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
  31. Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110 (3), 672-679 (2013).
  32. Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113 (1), 380-389 (2015).
  33. Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, (Pt 13) 2799-2811 (2014).
  34. Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16 (12), 1764-1772 (2013).
  35. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  36. Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
  37. Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34 (9), 3253-3262 (2014).
  38. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034(2012).
  39. Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, (Pt 16) 3559-3576 (2014).
  40. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33 (48), 18792-18805 (2013).
  41. DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33 (4), 1486-1497 (2013).
  42. Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39 (1), 98-106 (2014).
  43. Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64 (3), 597-603 (2014).
  44. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  45. Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
  46. Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35 (2), 776-785 (2015).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501(2014).
  49. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 9462(2015).
  50. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9 (2), 323-336 (2014).
  51. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
  52. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
  53. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358(2015).
  54. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706(2014).
  55. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  56. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58 (6), 599-619 (1971).
  57. Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9 (7), 868-869 (2006).
  58. Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59 (2), 288-297 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Ochronna rekonwalescencja w NMDGprzygotowanie skrawk w m zguelektrofizjologia patch clampNMDG HEPES aCSFprocedura uzupe niania sodu sodium spike int ator do tkanekzatapianie w agaroziekonserwacja neuron wtworzenie uszczelnienia gigaohmicznego
Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.