Artykuł metodologiczny

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

DOI:

10.3791/53825

⸱

26 lutego 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Types Program, Allen Institute for Brain Science, 2The Ben and Catherine Ivy Center for Advanced Brain Tumor Treatment, Swedish Neuroscience Institute

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół jest praktycznym przewodnikiem po ochronnej metodzie odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) podczas przygotowywania wycinków mózgu. Liczne ostatnie badania potwierdziły przydatność tej metody w zwiększaniu zachowania neuronów i ogólnej żywotności wycinków mózgu. Wdrożenie tej techniki przez wczesnych użytkowników ułatwiło szczegółowe badania funkcji mózgu przy użyciu różnorodnych zastosowań eksperymentalnych i obejmujących szeroki zakres wieku zwierząt, regionów mózgu i typów komórek. Przedstawiono kroki w celu przeprowadzenia techniki ochronnego wycinka mózgu z wykorzystaniem zoptymalizowanego preparatu pożywki ze sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego NMDG (aCSF) oraz ulepszonej procedury w celu niezawodnego uzyskania zdrowych wycinków mózgu do elektrofizjologii klamry łatkowej. Dzięki temu zaktualizowanemu podejściu obserwuje się znaczną poprawę szybkości i niezawodności tworzenia gigaomowych uszczelnień podczas ukierunkowanych eksperymentów z nagrywaniem patch clamp, przy jednoczesnym zachowaniu doskonałej ochrony neuronów, ułatwiając w ten sposób trudne zastosowania eksperymentalne. Przedstawiono reprezentatywne wyniki eksperymentów z zapisem wieloneuronowych łatek w celu zbadania połączeń synaptycznych w wycinkach mózgu kory nowej przygotowanych z młodych dorosłych myszy transgenicznych i dojrzałych dorosłych ludzkich próbek neurochirurgicznych. Co więcej, zoptymalizowana metoda odzyskiwania ochronnego NMDG polegająca na krojeniu mózgu jest kompatybilna zarówno z młodymi, jak i dorosłymi zwierzętami, rozwiązując w ten sposób ograniczenie oryginalnej metodologii. Podsumowując, pojedynczy preparat podłoża i procedura krojenia mózgu mogą być wdrożone u różnych gatunków i w różnym wieku, aby osiągnąć doskonałą żywotność i zachowanie tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przygotowanie ostrego wycinka mózgu jest niezbędnym eksperymentalnym systemem modelowym w neurobiologii. Przez około pół wieku platforma ta umożliwiała dynamiczne badania funkcjonalne żywego mózgu w wielu różnych anatomicznych regionach mózgu i gatunkach zwierząt. Niezależnie od tego, czy zamierzonym zastosowaniem jest biochemia, obrazowanie funkcjonalne, morfologia czy elektrofizjologia, niezwykle ważne jest zapewnienie optymalnej integralności i żywotności pokrojonej tkanki. Z tego powodu do tej pory najbardziej preferowany był wysoce odporny preparat z wycinków mózgu młodych gryzoni (tj. młodszy niż 30 dzień po urodzeniu myszy). Trudność w uzyskaniu wystarczająco zdrowych wycinków mózgu od dojrzałych dorosłych i starzejących się zwierząt okazała się ogromnym wyzwaniem dla większości i nałożyła poważne ograniczenia na badanie funkcjonalnej architektury dojrzałego mózgu. Jest to szczególnie prawdziwe w przypadku rejestracji patch clamp, techniki, która wymaga doskonałego zachowania morfologicznego i funkcjonalnego oraz jest niezbędna do scharakteryzowania szczegółowych właściwości wewnętrznych i synaptycznych zidentyfikowanych pojedynczych neuronów. W ciągu ostatnich kilku dekad zdecydowana większość elektrofizjologów z klamrą punktową polegała na metodzie "cięcia ochronnego" z użyciem podstawionej sacharozą aCSF1 o niskiej zawartości Na+ w celu przygotowania zdrowych wycinków mózgu od młodych i w znacznie mniejszym stopniu młodych dorosłych zwierząt. Metoda ta opiera się na założeniu, że bierny napływ Na+, a następnie wnikanie wody i pęcznienie komórek podczas etapu krojenia plastrów jest dominującą zniewagą, która prowadzi do słabej przeżywalności neuronów, szczególnie w przypadku neuronów znajdujących się w warstwach powierzchownych, które są najbardziej narażone na bezpośrednie urazy spowodowane ruchem ostrza. Jednak metoda cięcia ochronnego nadal pozostawia wiele do życzenia w przygotowaniu plastrów mózgu od dojrzałych dorosłych zwierząt, niezależnie od konkretnego zastosowanego preparatu aCSF.

Proste, ale skuteczne rozwiązanie tego problemu zostało opisane2,3,4,5,6 i nazwane metodą "ochronnego odzyskiwania" wycinków mózgu. Pierwotna wersja tej metody wykorzystuje aCSF podstawiony NMDG, ponieważ NMDG został zidentyfikowany jako najbardziej wszechstronny i skuteczny spośród różnych innych potencjalnych substytutów jonów sodu (w tym sacharozy, glicerolu, choliny i Tris). Formuła pożywki została dodatkowo ulepszona przez dodanie HEPES, aby przeciwdziałać obrzękowi wycinków mózgu i zapewnić silniejsze buforowanie pH7, a także dodanie suplementów przeciwdziałających szkodliwym skutkom stresu oksydacyjnego (Tabela 1). Empirycznie ustalono, że początkowy etap inkubacji regeneracji w niskim Na+, niskim Ca2+ i wysokim Mg2+ NMDG aCSF bezpośrednio po pokrojeniu dorosłej tkanki mózgowej był zarówno konieczny, jak i wystarczający do poprawy zachowania neuronów w szerokim zakresie regionów mózgu, typów komórek i wieku zwierząt3,5,6.

Warto zauważyć, że wcześniejsze wcielenia tego, co obecnie nazywa się metodą odzyskiwania ochronnego, można znaleźć w literaturze1,8,9,10,11,12,13, chociaż pełny potencjał zapisu wycinków mózgu dojrzałych i starzejących się zwierząt nie został rozpoznany ani zademonstrowany w tych wcześniejszych pracach. Ponadto wciąż pojawiają się niuanse proceduralne wspierające konkretne zastosowania eksperymentalne4,14,15,16. Zbiorowy dorobek tych licznych grup badawczych daje duże zaufanie do solidności ochronnej metody odzyskiwania w celu poprawy konserwacji tkanek. Ochronna metoda odzyskiwania NMDG została obecnie szeroko przyjęta i wdrożona w licznych opublikowanych badaniach naukowych z wykorzystaniem preparatów z wycinków mózgu dorosłych zwierząt. Te badania nad ostrym cięciem obejmują korę nową3,17,18, hipokamp<sup class="xref">15,19,20,21, striatal22,23,24, śródmózgowie25,26,27,28,29, and hindbrain30,31,32,33,34 regiony oraz różne typy neuroprzekaźników i neuromodulatorów, w tym glutaminergiczne4,30, GABAergic18,20,31,35,36, dopaminergic24,29,37,38, cholinergic14,37, 38,39, noradrenergic40, and serotonergic27,28 neurotransmisja. Metoda ta doskonale nadaje się również do optogenetycznej kontroli aktywności neuronalnej w wycinkach pochodzących od zwierząt transgenicznych3,39 lub po iniekcjach wirusowych in vivo17,27,28,40,41,42,43, a także funkcjonalne obrazowanie aktywności neuronalnej Ca2+2,44,45,46. Zgłoszono analizy zarówno plastyczności krótkoterminowej4,47,48 jak i różnych form plastyczności długoterminowej16,35,48. W niedawnym badaniu zastosowano metodę odzyskiwania ochronnego NMDG, aby ułatwić rozległe i systematyczne sondowanie połączeń synaptycznych w korze wzrokowej w dojrzałych wycinkach mózgu dorosłych myszy przy użyciu konfiguracji nagrywania oktopatch49 — potężna demonstracja użyteczności i solidności tej metody. Ochronna metoda odzyskiwania została nawet z powodzeniem zastosowana w wcześniej nieprzewidzianych kontekstach eksperymentalnych, takich jak poprawa zachowania naczyń krwionośnych i perycytów w wycinkach mózgu dorosłych korowych50, zapis patch clamp z przeszczepionych populacji interneuronów w 1–1,5-letnich modelach myszy z chorobą Alzheimera20, oraz test transportu receptorów wycinków mózgu dla dorosłych51.

Poniższy protokół opisuje krok po kroku procedury wdrażania zoptymalizowanej metody odzyskiwania NMDG w celu przygotowania wycinków mózgu w celu poprawy żywotności ostrych wycinków mózgu. Omówiono zasady poprawy zachowania neuronów, a także wykazano wyraźne korzyści płynące z tej metodologii w złożonych eksperymentach z zapisem wieloneuronowych naszywek zarówno w wycinkach mózgu młodych dorosłych transgenicznych myszy, jak i dojrzałych dorosłych neurochirurgicznych wycinkach mózgu człowieka. Poniższy protokół został zatwierdzony dla myszy w wieku od 21 dni do ponad jednego roku, a także dla ludzkich próbek neurochirurgicznych pochodzących od dorosłych pacjentów.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Procedury z udziałem transgenicznych myszy zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (IACUC) w Allen Institute for Brain Science. W eksperymentach wykorzystano zarówno samce, jak i samice myszy C57BL/6 (zakres wagowy 10-30 g). Niektóre z reprezentatywnych wyników opisują dane zebrane z żywych wycinków ludzkiego mózgu. Próbki tkanki kory nowej zostały pozyskane podczas operacji neurochirurgicznych w celu usunięcia guza. Konieczne było usunięcie leżącej nad nim tkanki kory nowej, aby uzyskać dostęp do chorej tkanki. We wszystkich przypadkach uzyskano świadomą zgodę pacjenta na wykorzystanie tkanki neurochirurgicznej do celów badawczych zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez instytucjonalną komisję rewizyjną Szwedzkiego Centrum Medycznego.

1. Przygotowanie pożywek i odczynników (Tabela 1)

UWAGA: Roztwory należy sporządzać w oczyszczonej wodzie, która jest wolna od metali śladowych i innych zanieczyszczeń. Zaleca się, aby roztwory były sporządzane na świeżo w dniu doświadczenia, chociaż niewykorzystane roztwory mogą być przechowywane w temperaturze 4 °C przez okres do 1 tygodnia, jeśli jest to pożądane. 1 l każdego z powyższych preparatów wystarcza na 1-2 zabiegi krojenia. Wszystkie roztwory aCSF muszą być nasycone karbogenem (95%O2/5% CO2) przed użyciem, aby zapewnić stabilne buforowanie pH i odpowiednie natlenienie. pH wszystkich roztworów należy dostosować do 7,3-7,4, a osmolalność zmierzyć i dostosować do 300-310 mOsmol/kg.

  1. Przygotować NMDG-HEPES aCSF (w mM): 92 NMDG, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 2 tiomocznik, 5 Na-askorbinian, 3 Na-pirogronian, 0,5 CaCl2·2H2O i 10 MgSO4·7H2O. Miareczkować pH do 7,3–7,4 za pomocą 17 ml +/- 0,5 ml 5 M kwasu solnego.
    UWAGA: Ten etap miareczkowania najlepiej przeprowadzić przed dodaniem kationów dwuwartościowych, aby uniknąć wytrącania się; jednak wytrącanie można odwrócić po dostosowaniu pH do zakresu fizjologicznego.
  2. Przygotować HEPES zawierający aCSF (w mM): 92 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 30 NaHCO3, 20 HEPES, 25 glukozy, 2 tiomocznik, 5 Na-askorbinian, 3 Na-pirogronian, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O. Miareczkować pH do 7,3–7,4 kilkoma kroplami stężonego 10 N NaOH.
  3. Przygotować zapis aCSF (w mM): 124 NaCl, 2,5 KCl, 1,25 NaH2PO4, 24 NaHCO3, 12,5 glukozy, 5 HEPES, 2 CaCl2·2H2O i 2 MgSO4·7H2O. Miareczkować pH do 7,3-7,4 kilkoma kroplami stężonego 10 N NaOH.
  4. Przygotować roztwór Na+ (2 M): 580 mg NaCl rozpuszczony w 5 ml świeżo przygotowanego NMDG-HEPES aCSF. To wystarczające rozwiązanie na przygotowanie jednego plasterka mózgu.
  5. Przygotuj 2% agarozy do użycia do zatapiania tkanek. Rozpuść 2 g agarozy typu 1B (patrz tabela materiałów) w 100 ml 1x PBS i mikrofaluj w kuchence mikrofalowej aż do wrzenia. Zamieszaj, aby wymieszać, a następnie wlej mieszaninę do sterylnej 10-centymetrowej szalki Petriego i pozostaw do zestalenia. Przechowywać płytkę agarozową w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
  6. Przygotować znieczulający roztwór do wstrzykiwań. Zmieszać 2,5 g 2,2,2-tribromoetanolu z 5 ml 2-metylo-2-butanolu, a następnie stopniowo rozpuścić w 200 ml PBS o pH 7,0–7,3. Przed użyciem przefiltrować roztwór podstawowy filtrem 0,22 μm i przechowywać w temperaturze 4 °C w chronić przed światłem.
    UWAGA: Zapoznaj się z odpowiednimi wytycznymi i zasadami komitetu ds. stosowania zwierząt w celu określenia procedury ważności i usuwania znieczulającego roztworu roboczego.

2. Konfiguracja stacji krojenia

  1. Ustaw stację krojenia z krajalnicą do tkanek i narzędziami chirurgicznymi (patrz tabela materiałów). Aby skalibrować krajalnicę, przymocuj cyrkonowo-ceramiczne ostrze wtryskiwacza do ramienia ostrza za pomocą kleju szybkoprzylepnego, a następnie włóż uchwyt próbki i wyrównaj krawędź natarcia ostrza z krawędzią uchwytu próbki, pozostawiając niewielką szczelinę, aby ostrze nie zeskrobało metalu.
    UWAGA: Jeśli krawędź ostrza nie jest fizycznie uszkodzona, można jej ponownie używać przez wiele tygodni, a nawet miesięcy bez wymiany. Na rynku dostępne są różne modele krajalnic do tkanek, z których wiele może zapewnić doskonałą wydajność po optymalnej kalibracji. Idealny instrument powinien mieć minimalne ugięcie osi z, albo bezpośrednio mierzone i dostrojone, albo obserwowane empirycznie.
  2. Ustawić zlewkę o pojemności 250 ml wypełnioną 200 ml NMDG-HEPES aCSF i wstępnie schłodzić na lodzie ze stałą karbonizacją (nakładaną za pomocą kamienia dyfuzora gazu zanurzonego w pożywce) przez >10 min.
    UWAGA: Roztwór ten będzie stosowany do perfuzji przezsercowej oraz do napełniania zbiornika krajalnicy podczas cięcia.
  3. Ustawić początkową komorę odzyskiwania wycinków mózgu wypełnioną 150 ml NMDG-HEPES aCSF (utrzymać stałą karbonogenację) i umieścić komorę w podgrzewanej łaźni wodnej utrzymywanej w temperaturze 32–34 °C.
    UWAGA: Komora na plasterki według projektu Edwardsa i Konnertha (1992)52 jest zalecana dla tego kroku. Komory te mogą być wykonane z łatwo dostępnych przedmiotów laboratoryjnych (zlewka 250 ml, siatka nylonowa, probówka stożkowa 50 ml, okrągłe naczynie z tworzywa sztucznego 35 mm). Należy dołożyć starań, aby siatka na plastry pozostała wolna od pęcherzyków powietrza, w szczególności tych, które są w sposób ciągły wytwarzane przez kamienie pęcherzykowe gazu karbogenicznego, ponieważ mogą one powodować unoszenie się plastrów na wodzie i ich uszkodzenie. Siatka powinna być zanurzona około 1 cm pod powierzchnią cieczy.
  4. Skonfiguruj komorę do przechowywania wycinków mózgu; zalecana jest konstrukcja z wieloma niezależnymi studniami w większym zbiorniku (patrz Tabela materiałów). Napełnij zbiornik 450 ml HEPES aCSF i ogrzej do temperatury pokojowej pod stałym karbonogenicznym aż do użycia.
    UWAGA: Wycinki mózgu zostaną przeniesione z początkowej komory regeneracyjnej do tej komory w celu długotrwałego przechowywania przed zapisem elektrofizjologicznym. Należy dołożyć starań, aby siatka na plastry była zawsze wolna od pęcherzyków powietrza.
  5. Przygotuj stopioną agarozę do zatopienia w tkance. Użyj otwartego końca stożkowej fiolki o pojemności 50 ml, takiej jak foremka do ciastek, aby wyciąć blok 2% agarozy z wcześniej przygotowanego dania. Luźno zakręć stożkową fiolkę, a następnie podgrzewaj w kuchence mikrofalowej przez 10–30 sekund, aż agaroza się rozpuści. Nie przegrzewaj.
  6. Wlej stopioną agarozę do probówek o pojemności 1,5 ml. Utrzymać agarozę w stanie stopionym za pomocą termomiksera ustawionego na 42 °C z energicznym wstrząsaniem. Ostrożnie upewnij się, że stopiona agaroza nie zestala się przedwcześnie.
  7. W tym momencie umieść dodatkowy blok chłodzący do krajalnicy na lodzie, aby wstępnie ostygł.

3. Perfuzja przezsercowa

UWAGA: Procedura perfuzji przezsercowej jest ważnym krokiem podczas pracy z dorosłymi zwierzętami i jest ważna dla osiągnięcia szybkiego chłodzenia mózgu i spowolnienia metabolizmu poprzez infuzję mózgową roztworu o niskiej zawartości Na+, niskiej Ca2 + / wysokiej zawartości Mg2 + aCSF. Perfuzja przezsercowa służy również do usuwania czerwonych krwinek z naczyń krwionośnych mózgu, co zmniejsza autofluorescencję, która może zakłócać wizualizację i celowanie w fluorescencyjnie znakowane populacje komórek w liniach transgenicznych. Nie zaleca się pomijania perfuzji przezsercowej.

  1. Myszy należy głęboko znieczulić przez dootrzewnowe wstrzyknięcie znieczulającego roztworu roboczego (250 mg/kg: 0,2 ml 1,25% znieczulającego roztworu roboczego na 10 g masy ciała, patrz Tabela materiałów). Po ~2–3 minutach sprawdź wystarczającą głębokość znieczulenia, oceniając odruch szczypania palców u stóp. W razie potrzeby wstrzyknąć dodatkową objętość środka znieczulającego i ponownie ocenić odruch szczypania palca u nogi po kolejnych 2-3 minutach.
  2. Załadować strzykawkę o pojemności 30 ml z 25 ml karbogenicznego NMDG-HEPES aCSF ze wstępnie schłodzonej zlewki o pojemności 250 ml (optymalna jest temperatura 2–4 °C, w przeciwieństwie do roztworu błotnego lub mrożonego). Zamocuj igłę o rozmiarze 25 5/8.
  3. Trzymając mysz na grzbiecie, przypnij przednie i tylne łapy, aby zapewnić stabilność. Jako podstawa dobrze sprawdza się szklana szalka Petriego o średnicy 15 cm wypełniona utwardzonym silikonem.
  4. Za pomocą skalpela wykonaj boczne nacięcie, aby otworzyć klatkę piersiową na poziomie przepony. Użyj cienkich nożyczek, aby przeciąć klatkę piersiową po obu stronach, uważając, aby nie przyciąć serca i płuc.
  5. Przypnij środkową część klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Włożyć igłę strzykawki o pojemności 30 ml do lewej komory i przeciąć prawy przedsionek cienkimi nożyczkami, aby umożliwić przepływ krwi z serca.
  6. Wcisnąć tłok strzykawki za pomocą ręcznego stałego nacisku i wykonać fuzję zwierzęcia schłodzonym NMDG-HEPES aCSF z szybkością ~10 ml/min.
    UWAGA: Jeśli perfuzja się powiedzie, wątroba zmieni kolor z ciemnoczerwonego na bladożółty, aw niektórych przypadkach można zaobserwować przezroczyste płyny wychodzące z nozdrzy pod koniec zabiegu.

4. Sekcja mózgu i krojenie

  1. Odetnij głowę zwierzęciu. Użyj skalpela, aby otworzyć skórę na głowie i odsłonić czapkę czaszki.
  2. Użyj cienkich, super ciętych nożyczek, aby odciąć skórę nad czapką czaszki i wykonaj małe nacięcia boczne po obu stronach u ogonowej/brzusznej podstawy czaszki. Wykonaj dodatkowe płytkie nacięcia, zaczynając od ogonowo-grzbietowej części czaszki, przesuwając się w kierunku rostralnym w górę grzbietowej linii środkowej, uważając, aby nie uszkodzić leżącego poniżej mózgu. Wykonaj końcowe cięcie w kształcie litery "T" prostopadle do linii środkowej na poziomie opuszki węchowej.
    UWAGA: Należy zachować ostrożność, aby upewnić się, że nie dojdzie do uszkodzenia obszaru (obszarów) mózgu. W szczególności w żadnym momencie nie powinna być stosowana żadna siła ściskająca na sam mózg.
  3. Użyj kleszczy z okrągłą końcówką, aby chwycić czaszkę, zaczynając od aspektu rostralno-przyśrodkowego i odklej się z powrotem w kierunku ogonowo-bocznym. Powtórz dla obu stron, aby otworzyć i usunąć grzbietowe połówki czapki czaszki, aby odsłonić mózg. Delikatnie zgarnij nienaruszony mózg do zlewki z wstępnie schłodzonym NMDG-HEPES aCSF. Pozwól mózgowi równomiernie ostygnąć przez ~1 min.
  4. Użyj dużej szpatułki, aby wyjąć mózg ze zlewki na szalkę Petriego pokrytą bibułą filtracyjną. Przytnij i zablokuj mózg zgodnie z preferowanym kątem krojenia i pożądanym obszarem mózgu będącym przedmiotem zainteresowania. Pracuj szybko, aby uniknąć długotrwałego niedoboru tlenu podczas przenoszenia.
    UWAGA: Możliwych jest wiele kątów krojenia. Dokładna metoda blokowania i kąt krojenia będą zależeć od dokładnego regionu mózgu, typu komórki i obwodu, który ma być badany.
  5. Przymocuj blok mózgu do uchwytu próbki za pomocą kleju klejącego. Cofnij wewnętrzną część uchwytu próbki na tyle, aby całkowicie wycofać blok mózgu do środka. Wlej stopioną agarozę bezpośrednio do uchwytu, aż blok mózgu zostanie całkowicie pokryty agarozą. Zacisnąć wstępnie schłodzony dodatkowy blok chłodzący wokół uchwytu próbki przez ~10 s, aż agaroza zastygnie.
  6. Włóż uchwyt próbki do pojemnika w krajalnicy i sprawdź prawidłowe wyrównanie. Napełnij zbiornik pozostałymi, wstępnie schłodzonymi, natlenionymi NMDG-HEPES aCSF ze zlewki o pojemności 250 ml i przenieś kamień bąbelkowy do zbiornika na czas krojenia, aby zapewnić odpowiednie natlenienie.
  7. Wyreguluj mikrometr, aby rozpocząć przesuwanie próbki mózgu zatopionej w agarozie. Uruchom krajalnicę i empirycznie dostosuj prędkość posuwu i częstotliwość oscylacji do żądanego poziomu.
    UWAGA: Oba ustawienia powinny znajdować się w dolnym zakresie. Aby uzyskać najlepsze wyniki, pojedyncze przejście ramienia ostrza powinno zająć około 20 sekund, a oscylacja powinna wytwarzać bardzo gładki i delikatny dźwięk buczenia bez jawnego brzęczenia.
  8. Kontynuuj posuwanie się naprzód i krojenie tkanki w odstępach co 300 μm (lub innej preferowanej grubości), aż obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania zostanie w pełni wycięty; całkowity czas procedury krojenia powinien być krótszy niż 15 minut.

5. Zoptymalizowana procedura odzyskiwania ochronnego NMDG

  1. Początkowy etap odzyskiwania NMDG (etap krytyczny): Po zakończeniu procedury dzielenia należy zebrać wszystkie plastry za pomocą odciętej plastikowej rurki Pasteura t i przenieść je do wstępnie ogrzanej (34 °C) komory początkowego odzysku wypełnionej 150 ml NMDG-HEPES aCSF. Przenieś wszystkie plastry w krótkich odstępach czasu i uruchom stoper, gdy tylko wszystkie plastry zostaną przeniesione do komory odzyskiwania.
  2. Zapoznaj się z Tabelą 2, aby określić optymalny harmonogram skoków Na+ w zależności od wieku myszy.
    UWAGA: Ta procedura jest praktyczną metodą osiągnięcia kontrolowanego tempa ponownego wprowadzania Na+ do komory wycinka mózgu i jest zoptymalizowana pod kątem określonej geometrii komory wycinka mózgu oraz objętości i typu zbiornika (patrz Tabela materiałów).
  3. Przeprowadzić stopniową procedurę naskokowego Na+, dodając wskazane objętości roztworu naskokowego Na+ we wskazanym czasie. Dodaj roztwór Na+ spike-in bezpośrednio do komina bełkotki początkowej komory odzysku, aby ułatwić szybkie mieszanie.
  4. Przenieś wszystkie plastry do komory długoterminowego przetrzymywania HEPES aCSF utrzymywanej w temperaturze pokojowej. Pozwól plasterkom zregenerować się przez dodatkowy 1 godzinę w komorze trzymania HEPES przed rozpoczęciem eksperymentów z nagrywaniem z zaciskiem krosowym.

6. Nagrywanie z zaciskiem krosowym

UWAGA: Poniższe podstawowe procedury zawierają jedynie pewne względy praktyczne i nie mają na celu przedstawienia szczegółowych protokołów nagrywania zacisków krosowych, ponieważ można je znaleźć gdzie indziej53,54. Do tego zastosowania wymagany jest zestaw do elektrofizjologii z zaciskiem krosowym. Na ogół składa się on z pionowego mikroskopu wyposażonego w optykę kontrastu różnicowego interferencyjnego w podczerwieni (IR-DIC) i system oświetlenia fluorescencyjnego, wzmacniacza z zaciskiem krosowym i digitizera danych, zmotoryzowanego mikromanipulatora i platformy mikroskopowej, stołu do izolacji drgań, klatki Faradaya oraz systemu podgrzewania i perfuzji roztworu. Komora na próbki i platforma powinny być zaprojektowane do zapisu w zanurzonych warstwach. Do nagrań z wieloma neuronami patch clamp wymagany jest zestaw wyposażony w wiele wzmacniaczy, stopni czołowych i wysokiej jakości mikromanipulatorów. Ponadto, aby uzyskać najlepsze wyniki, wysoce zalecany jest zestaw wyposażony w filtr pasma IR 900 nm i dopasowane komponenty optyczne, aby zapewnić odpowiednią wizualizację komórek znajdujących się na głębokości >50 μm w wycinkach mózgu. Prawidłowe ustawienie oświetlenia Kӧhler jest również ważne dla przejrzystej wizualizacji.

  1. Przygotować wewnątrzkomórkowy roztwór pipety (w mM): 130 K-glukonian, 4 KCl, 10 HEPES, 0,3 EGTA, 10 fosfokreatyno-Na2, 4 MgATP, 0,3 Na 2-GTP i 13,4 biocytyna. Dostosuj pH do 7,35 za pomocą 1 M KOH, a osmolalność do 285–290 mOsmol/kg za pomocą sacharozy w razie potrzeby.
  2. Przygotuj elektrody do zacisków krosowych z grubościennych kapilar ze szkła borokrzemianowego; idealna elektroda krosowa ma stosunkowo krótki i przysadzisty stożek z rezystancją wypełnionej końcówki ~3–6 MOhm w kąpieli.
  3. Upewnij się, że druty elektrody srebrnej są odpowiednio chlorkowane, aby zapewnić stabilne zapisy. Zrób to (typowo), zanurzając ostatnie 3-4 mm srebrnego drutu w płynnym wybielaczu na około 30 minut lub do momentu, gdy drut zmieni kolor na.
  4. Ustalić perfuzję roztworu za pomocą pompy perystaltycznej ustawionej na 3–4 ml/min. Cyrkulować karbogeniczny zapis CSF przez komorę rejestracyjną, zwracając uwagę na dopasowanie dopływu i odpływu, aby uniknąć przepełnienia.
  5. Przenieś pojedynczy plasterek mózgu do zanurzonej komory rejestracyjnej i zabezpiecz na miejscu za pomocą kotwy w kształcie litery U z nylonowymi sznurkami krzyżowymi. Zidentyfikuj docelowy obszar mózgu za pomocą obiektywu powietrznego 4X przed przełączeniem na obiektyw o większej mocy (np. obiektywy o dużej aperturze numerycznej 40X lub 60X zanurzone w wodzie).
  6. Wizualnie zidentyfikuj zdrową komórkę docelową. Wygląd błony neuronalnej w somie, uwidoczniony za pomocą mikroskopii IR-DIC, służy do oceny przydatności komórki kandydacyjnej do rejestracji za pomocą zacisku krosowego.
    UWAGA: Zdrowe neurony zazwyczaj wykazują następujące cechy: ani skurczone, ani spuchnięte somaty, miękki kontrast krawędzi błony i gładki wygląd błony. Ponadto większość zdrowych komórek znajduje się na głębokości >30 μm w warstwie, ponieważ powierzchowne neurony mogą zostać uszkodzone przez przerwane procesy dendrytyczne. Należy unikać neuronów, które mają pomarszczony wygląd, wyraźnie widoczne jądra lub wygląd "jajka sadzonego" lub bardzo ciemne lub kontrastowe krawędzie błony.
  7. Napełnij pipetę z plastrem ~5 μl roztworu wewnątrzkomórkowego i załaduj ją do uchwytu elektrody. Przenieś pipetę do kąpieli nagrywającej nad wycinkiem mózgu i zastosuj lekki dodatni nacisk, aby usunąć wszelkie przeszkody w końcówce. Wyzeruj przesunięcie pipety i monitoruj rezystancję końcówki za pomocą funkcji testu membranowego.
  8. Przesunąć końcówkę pipety w kontakt z ciałem komórki docelowego neuronu; na powierzchni błony powinien powstać mały wgłębienie z powodu dodatniego ciśnienia światła.
  9. Gdy tylko zaobserwuje się wgłębienie membrany, szybko usuń nadciśnienie i zastosuj delikatne ssanie, aby ułatwić tworzenie uszczelnienia. Gdy rezystancja pipety wzrośnie do >100 MOhm, włącz polecenie przytrzymania do poziomu odpowiadającego przewidywanemu potencjałowi spoczynkowemu błony dla docelowego typu ogniwa (dobrym punktem wyjścia jest -70 mV).
  10. Gdy rezystancja końcówki osiągnie ≥1 gigaoma, spróbuj włamać się do komórki, rozrywając membranę pod pipetą z plastrem, używając krótkich napadów ostrego ssania; funkcja "zap" może być wykorzystana do ułatwienia włamania w razie potrzeby.
    UWAGA: Potencjał utrzymywania -70 mV jest sugerowany dla eksperymentów z cęgami napięcia na neuronach korowych. Zdrowe neurony będą miały prąd upływowy nie większy niż -100 pA na czas trwania eksperymentu, ale jest to częściowo zależne od typu komórki. Neuron zostałby wykluczony z analizy, gdyby spoczynkowy potencjał błonowy był bardziej zdepolaryzowany niż -50 mV lub gdyby opór dostępu zmienił się o więcej niż 20%.
  11. Po uzyskaniu stabilnego zapisu klamry krosowej całej komórki, skieruj dodatkowe neurony do nagrywania, powtarzając kroki 6.6–6.10. Uważaj, aby uniknąć zakłóceń mechanicznych, które mogłyby skutkować utratą pierwszego nagrania.
    1. Wybierz dodatkowe neurony w promieniu 100 μm od pierwszego neuronu, aby zapewnić rozsądne prawdopodobieństwo znalezienia neuronów sprzężonych synaptycznie.
      UWAGA: W niektórych przypadkach pomocne może być zidentyfikowanie wielu neuronów kandydujących z góry oraz wstępne załadowanie i ustawienie wszystkich pipet w pobliżu różnych komórek docelowych przed ustanowieniem pierwszego zapisu zacisku krosowego.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta sekcja dostarcza reprezentatywnych wyników dla rutynowych eksperymentów z elektrofizjologią przygotowania wycinków mózgu i patch clamp przy użyciu zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG (tj. odzyskiwania ochronnego NMDG połączonego ze stopniową procedurą na+ spike-in). Po pierwsze, oceniono zachowanie morfologiczne neuronów w różnych obszarach mózgu wycinków mózgu przygotowanych z lub bez wdrożenia zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG (Ryc. 1). Do tych eksperymentów wybrano trzymiesięczne dorosłe myszy, a my użyliśmy mikroskopii IR-DIC, aby określić zdrowie neuronów na podstawie kształtu i ogólnego wyglądu somatów i dendrytów proksymalnych. Zwróć uwagę na pomarszczony, pyknotyczny wygląd większości neuronów na reprezentatywnych obrazach wycinków mózgu przygotowanych bez ochronnej metody odzyskiwania (wszystkie obrazy uzyskano 1-2 godziny po przygotowaniu wycinka). Te plastry kontrolne przygotowano przy użyciu NMDG aCSF do etapów perfuzji przezsercowej i krojenia, ale początkowo odzyskano je w HEPES aCSF o wysokiej zawartości Na+. W przeciwieństwie do tego, reprezentatywne obrazy z wycinków przygotowanych przy użyciu zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG ujawniają neurony o ulepszonej morfologii (gładszy, pełniejszy, mniej pomarszczony wygląd), które nadają się do rejestracji klamry łatowej (Ryc. 1). Poprawę zachowania neuronów zaobserwowano w wielu obszarach mózgu, w tym w warstwach kory nowej II/III i V, subiculum i grzbietowym jądrze kolankowatym bocznym (dLGN).

Następnie, zoptymalizowana metoda odzyskiwania ochronnego NMDG została porównana z oryginalną metodą odzyskiwania ochronnego NMDG (tj. bez procedury stopniowego zwiększania Na+). Średni czas tworzenia uszczelnienia gigaomowego w próbach nagrania zacisku krosowego został radykalnie i znacznie skrócony (9,9 s w porównaniu z 33,3 s, **p <0,005, sparowany test t), gdy zastosowano procedurę stopniowego skoku Na+ wraz z krokiem odzyskiwania ochronnego NMDG (Rysunek 2). Szybszy i bardziej niezawodny czas uszczelniania membrany znacznie poprawił przepustowość zapisu za pomocą zacisku krosowego w wycinkach mózgu młodych dorosłych. Optymalny harmonogram skoków Na+ był dalej modyfikowany w zależności od wieku zwierzęcia (Tabela 2) i był korzystny dla wszystkich badanych grup wiekowych (myszy w wieku od 3 tygodni do 1 roku). Przedstawiono profil stopniowego wzrostu stężenia jonów sodu w trakcie procedury skoku (Rysunek 3) w celu uzupełnienia schematów przedstawionych w tabeli 2.

W ramach Programu Typów Komórek Instytutu Allena (http://celltypes.brain-map.org/) prowadzone są zakrojone na szeroką skalę wysiłki mające na celu systematyczne scharakteryzowanie wewnętrznych właściwości elektrofizjologicznych poszczególnych neuronów u młodych dorosłych (40-80 dzień po urodzeniu) mysich wizualnych wycinków mózgu pochodzących z linii transgenicznych z ekspresją markerów fluorescencyjnych specyficznych dla typu komórki w genetycznie zdefiniowanych populacjach neuronów (warstwa korowa i komórka specyficzne dla typu linie sterujące Cre skrzyżowane z zależną od Cre fluorescencyjną linią reporterową55). Rysunek 4 pokazuje przykładowe ślady wzorców wypalania zarejestrowanych przez interneurony korowe z ekspresją Parvalbuminy (Pvalb) (myszy Pvalb-IRES-Cre/Ai14) w odpowiedzi na serię kroków iniekcji prądu 1 s, które obejmują dynamiczny zakres odpalania neuronów. Krzywa F-I dla zestawu danych 22 korowych interneuronów FS jest pokazana po prawej stronie. Podobne eksperymenty z nagrywaniem ukierunkowanych krostek przeprowadzono w celu scharakteryzowania 23 neuronów pobudzających wyrażających Rorb w warstwie IV od myszy Rorb-IRES-Cre / Ai14 (Figura 4). Różnorodne zdrowe typy neuronów, w tym interneurony FS i neurony piramidowe w regionach i warstwach kory mózgowej, mogą być rutynowo i niezawodnie rejestrowane w celu nagrywania patch clamp przez co najmniej 6-8 godzin po przygotowaniu plastra przy użyciu tego zoptymalizowanego protokołu.

Oprócz pomiaru wewnętrznych właściwości neuronów, badano połączenia synaptyczne między wieloma jednocześnie rejestrowanymi neuronami zdefiniowanych typów w mikroobwodach kory wzrokowej. Technika zapisu wielu neuronów jest wyjątkowo wymagająca, ponieważ wiele zdrowych neuronów kandydujących na określone typy musi być obecnych w stosunkowo małym polu wycinka mózgu, aby zapewnić rozsądną szansę na uzyskanie wysokiej jakości jednoczesnych nagrań i zidentyfikowanie połączeń synaptycznych w dobrej wierze. Rysunek 5 pokazuje sparowane nagranie dwóch interneuronów tdTomato+FS w korze wzrokowej wycinków mózgu pochodzących od młodych dorosłych myszy Pvalb-IRES-Cre/Ai14. Wykryto silne jednokierunkowe hamujące połączenie synaptyczne (zarejestrowane przy użyciu roztworu pipety wewnętrznej o wysokiej zawartości chlorków). Przedstawiono przykładowe zapisy i protokoły pomiaru właściwości krótkotrwałej plastyczności synaptycznej. Po napadach stymulacji pociągiem o wysokiej częstotliwości (po 10 impulsów przy 10, 50 i 100 Hz) następowały pojedyncze impulsy testowe odzyskiwania w różnych odstępach czasu (1, 2 lub 4 s) w celu zmierzenia przebiegu powrotu do zdrowia po depresji synaptycznej.

Doskonały sukces osiągnięto również dla ludzkich neuronów kory nowej w dojrzałych dorosłych wycinkach mózgu ex vivo. Próbki neurochirurgiczne są pobierane od pacjentów poddawanych planowym operacjom usunięcia guza w lokalnych szpitalach. Procedury pobierania tkanek neurochirurgicznych u ludzi i przygotowania wycinków mózgu różnią się od procedur wycinków mózgu myszy pod kilkoma praktycznymi względami. Krótko mówiąc, wycięta tkanka kory nowej (dystalna do miejsca patologii) jest pobierana z sali operacyjnej i zanurzana w lodowato natlenionym NMDG-HEPES aCSF i transportowana z ciągłym schładzaniem i natlenianiem z sali operacyjnej do laboratorium w ciągu 30 minut lub krócej. Wycinki mózgu są przygotowywane przy użyciu procedury odzyskiwania ochronnego NMDG i pozostawiane do odzyskania przez dłuższy czas około 3 godzin przed rozpoczęciem zapisów patch clamp. Rysunek 6 pokazuje udany eksperyment z nagrywaniem w parach oraz udany eksperyment z nagrywaniem z poczwórnym zaciskiem krosowym z ludzkich wycinków mózgu ex vivo przygotowanych w ten sposób z obszaru kory czołowej. Sparowany zapis pokazuje jednokierunkowy pobudzający wkład synaptyczny z korowego neuronu piramidowego do interneuronu korowego (zarejestrowanego jako pobudzające prądy postsynaptyczne). W eksperymencie z poczwórną łatką zarejestrowano jednocześnie dwa neurony pobudzające i dwa hamujące i wykryto trzy hamujące połączenia synaptyczne (zarejestrowane jako hamujące potencjały postsynaptyczne) z dwunastu wszystkich zbadanych połączeń. W związku z tym ta zoptymalizowana metodologia wycinków mózgu pozwala na niezawodny sukces eksperymentalny w najtrudniejszych zastosowaniach wycinków mózgu, w tym w eksperymentach z klamrami z wieloma neuronami w celu zbadania połączeń obwodów w ostro wyciętej tkance mózgowej dorosłego dorosłego człowieka.

figure-results-1
Rysunek 1: Poprawa zachowania neuronów dzięki zoptymalizowanej metodzie odzyskiwania ochronnego NMDG polegającej na przygotowaniu wycinków mózgu. Reprezentatywne obrazy IR-DIC uzyskano z różnych obszarów mózgu w ostrych wycinkach trzymiesięcznej myszy. Kontroluj ochronną metodę cięcia NMDG bez ochronnego etapu odzyskiwania (lewe panele) w porównaniu ze zoptymalizowaną metodą odzyskiwania ochronnego NMDG (prawe panele). (A) Warstwa V kory nowej, (B) warstwa II/III kory nowej, (C) subiculum i (D) grzbietowe jądro kolankowate boczne (dLGN). Podziałka skali we wszystkich panelach wynosi 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-2
Rysunek 2: Przyspieszona prędkość i poprawiona niezawodność tworzenia gigaomowych uszczelnień w eksperymentach z nagrywaniem patch clamp przy użyciu metody odzyskiwania ochronnego NMDG z procedurą Na+ spike-in. (A) Wykres czasów tworzenia gigaomów uszczelnień dla samego odzysku NMDG (czarne punkty danych, n = 19) w porównaniu z odzyskiem NMDG plus Na+ Procedura skoku (czerwone punkty danych, n = 23). Wszystkie zarejestrowane komórki były neuronami piramidowymi w warstwie II/III lub V kory wzrokowej. Należy pamiętać, że maksymalny czas jest ograniczony do 100 s, aby uwzględnić ogniwa, które nigdy nie utworzyły uszczelek gigaomowych. Sparowany test t, **p <0,005. (B) Wykres spoczynkowego potencjału błonowego (RMP) dla neuronów piramidowych warstwy V (pomarańczowe punkty danych, n = 10/11), neuronów piramidowych II/III (zielone punkty danych, n = 9/10) lub interneuronów korowych Pvalb+ FS (niebieskie punkty danych, n = 23/22). Pełne okręgi oznaczają stan regeneracji NMDG, a otwarte okręgi odzyskiwanie NMDG plus procedura skoku Na+. Każdy punkt danych reprezentuje jeden neuron i wyświetlana jest zarówno średnia, jak i +/-SEM. Nie ma istotnych różnic w RMP porównujących warunki przygotowania wycinków mózgu dla wszystkich trzech typów komórek (sparowany test t). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-3
Rysunek 3: Profil stopniowego wzrostu stężenia jonów sodu w trakcie procedury skoku. (A) Wykres skokowego stężenia NaCl w funkcji czasu. (B) Wykres całkowitego zewnątrzkomórkowego stężenia NaCl w funkcji czasu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-4
Rysunek 4: Wewnętrzne właściwości elektrofizjologiczne genetycznie zdefiniowanych typów komórek korowych. (A) Przykładowe ślady odpalania neuronów w odpowiedzi na obecne etapy iniekcji dla interneuronów Pvalb+ korowych FS (lewy panel). Neurony tdTomato+ były celem zapisów w wycinkach mózgu myszy Pvalb-IRES-Cre/Ai14. Dane podsumowujące zależność szybkość zapłonu od prądu wtrysku (krzywa F-I) są pokazane po prawej stronie (n = 22). (B) Przykładowe ślady odpalania neuronów w odpowiedzi na obecne etapy iniekcji neuronów pobudzających warstwę IV kory mózgowej z ekspresją Rorb (lewy panel). Neurony tdTomato+ były celem nagrań w wycinkach mózgu myszy Rorb-IRES-Cre/Ai14. Dane podsumowujące zależność między szybkością zapłonu a prądem wtrysku (krzywa F-I) są pokazane po prawej stronie (n = 23). Każda cienka kolorowa linia reprezentuje krzywą F-I dla pojedynczego neuronu; natomiast grube czarne linie reprezentują średnią dla każdej grupy +/-SEM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

figure-results-5
Rysunek 5: Krótkotrwała plastyczność w synaptycznie połączonych interneuronach korowych FS eksprymujących Pvalb. (A) Różnicowy kontrast interferencyjny i epifluorescencja zostały użyte do celowania w tdPomidorowo-dodatnie, eksprymujące Pvalb interneurony FS pierwszorzędowej kory wzrokowej myszy. Schemat połączeń oznaczony kolorami demonstrujący jednostronne połączenie synaptyczne między dwoma interneuronami. (B) Schemat protokołów stymulacji stosowanych do oceny krótkoterminowej dynamiki neuronów połączonych synaptycznie. Ciągi o 10 potencjałach czynnościowych (10, 50 i 100 Hz) są wywoływane w neuronach presynaptycznych, a następnie pojedynczy potencjał czynnościowy (impuls testowy odzyskiwania, RTP) dostarczany z różnym opóźnieniem czasowym (1, 2 i 4 s) po zakończeniu pociągu. Każdy RTP jest oznaczony kolorami dla przejrzystości. (C) Średnie ślady odpowiadających jednostronnie hamujących potencjałów postsynaptycznych (uIPSP) w komórce #2 w odpowiedzi na ciągi potencjałów czynnościowych wywołanych w komórce #1. Szara wstawka ma rozszerzoną skalę czasu, aby pokazać wytyczenie pociągu uIPSP. (D) Znormalizowane amplitudy uIPSP wykreśla się na wykresie w funkcji ich położenia podczas pociągów o różnej częstotliwości. Depresja netto jest wyraźna we wszystkich wskaźnikach wejściowych, ze znacznym wzrostem uIPSP po 4 s. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego wykresu.

figure-results-6
Rysunek 6: Nagrania klamer wieloneuronowych w neurochirurgicznych wycinkach mózgu dorosłego człowieka. (A) Obrazy IR-DIC o małym i dużym powiększeniu wskazujące lokalizację i tożsamość zarejestrowanych neuronów (górne panele). Neuron piramidowy (gwiazdka) i sąsiedni interneuron (czerwona gwiazdka) zostały zarejestrowane jednocześnie. Przykładowe oznaczone kolorami ślady jednokierunkowego pobudzającego połączenia synaptycznego (ESPC) z komórki piramidalnej do interneuronu (mierzone jako EPSC w zacisku napięcia) i odpowiadająca im mapa połączeń fizycznych (dolne panele). (B) Eksperyment z zapisem poczwórnego zacisku plastra w neurochirurgicznym wycinku mózgu dorosłego człowieka w grzbietowo-bocznej korze przedczołowej. Dwa neurony piramidowe i dwa interneurony są rejestrowane jednocześnie, co pozwala na sekwencyjne sondowanie dwunastu możliwych połączeń synaptycznych. Ciąg wywołanych potencjałów czynnościowych w komórce #3 (zielone ślady) doprowadził do wykrycia hamujących potencjałów postsynaptycznych (IPSP) w każdym z pozostałych trzech jednocześnie zarejestrowanych neuronów (trzy regiony pudełkowe, górne panele). Odpowiedzi zarejestrowane z każdego pojedynczego neuronu są oznaczone kolorami dla jasności. Fizyczna mapa połączeń jest pokazana w dolnym panelu. Należy zauważyć, że nieprzetworzone ślady pokazane w (B) reprezentują średnie z co najmniej 20 kolejnych przemiatania danych pierwotnych. Przypuszczalna identyfikacja typu komórki opierała się na kształcie somy, analizie morfologii za pomocą fluorescencyjnego wypełniania barwnikiem podczas nagrań oraz wewnętrznych właściwościach elektrofizjologicznych, w tym wzorcach wypalania w odpowiedzi na bieżące etapy wstrzykiwania. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

NMDG-HEPES aCSF HEPES trzymający CSF Nagrywanie CSF składnik Mm Mw g/litr Mm Mw g/litr Mm Mw g/litr Organizacja Zarządzania Bezpieczeństwem (NMDG Rozdział 92 195,22 pkt. Godzina 17,96 Hcl Rozdział 92 Rejon 36,46 pkt. * Zawartość NaCl Rozdział 92 Klasa 58,44 pkt. Klasa 5,38 124 Rozdział Klasa 58,44 pkt. Godzina 7,25 Kcl Rozdział 2.5 Klasa 74,55 pkt. 0,19 pkt. Rozdział 2.5 Klasa 74,55 pkt. 0,19 pkt. Rozdział 2.5 Klasa 74,55 pkt. 0,19 pkt. NaH2PO4 Rozdział 1.2 godz. 138.00 0,17 pkt. Rozdział 1.2 godz. 138.00 0,17 pkt. Rozdział 1.2 godz. 138.00 0,17 pkt. NaHCO3 Rozdział 30 84,01 pkt. Pytanie 2,52 Rozdział 30 84,01 pkt. Pytanie 2,52 24 84,01 pkt. Pytanie 2,02 HEPESY 20 238,31 szt. Godzina 4,77 20 238,31 szt. Godzina 4,77 5 238,31 szt. Pytanie 1,19 glukoza 25 180,20 zł Z godziny 4,51 25 180,20 zł Z godziny 4,51 Rozdział 12,5 180,20 zł Godzina 2,25 askorbinian sodu 5 godz. 198.00 0,99 pkt. 5 godz. 198.00 0,99 pkt. 0 godz. 198.00 0,00 Tiomocznik cyfra arabska 76,12 pkt. 0,15 pkt. cyfra arabska 76,12 pkt. 0,15 pkt. 0 76,12 pkt. 0,00 pirogronian sodu 3 110.04 0,33 pkt. 3 110.04 0,33 pkt. 0 110.04 0,00 MgSO 4,7H2 O 10 246,48 pkt. 5 ml cyfra arabska 246,48 pkt. 1 ml cyfra arabska 246,48 pkt. 1 ml (2 mln zapasów) CaCl 2,2H2 O 0,5 147.01 0,25 ml cyfra arabska 147.01 1 ml cyfra arabska 147.01 1 ml (zapas 2M) * miareczkować pH NMDG-HEPES aCSF do 7,3-7,4 za pomocą stężonego HCl Wszystkie roztwory powinny mieścić się w zakresie 300-310 mOsm/Kg

Tabela 1: Formuły mediów.

Wiek zwierzęcia Czas (min)* <1 miesiąc 1-3 miesiące 3–6 miesięcy 6–12 miesięcy 12+ miesięcy 0 250 μL 250 μL 1 cyfra arabska 250 μL 3 4 500 μL 5 250 μL 250 μL 6 1000 μL 7 8 2000 μL 9 10 przelać 500 μL 250 μL 250 μL 11 12 13 14 15 1000 μL 500 μL 250 μL 250 μL 16 17 Rozdział 18 Rozdział 19 20 2000 μL 1000 μL 500 μL 250 μL 21 22 Rozdział 22 23 24 25 przelać 2000 μL 1000 μL 500 μL 26 27 Rozdział 27 28 29 Rozdział 30 przelać 2 000 μL 1 000 μL Rozdział 31 Rozdział 32 33 Rozdział 33 Rozdział 34 35 Rozdział przelać 2 000 μL 36 37 38 Rozdział 38 39 Rozdział 39 Rozdział 40 przelać *Czas zero to moment, w którym plastry są przenoszone do początkowej komory odzysku

Tabela 2: Zalecany harmonogram stopniowego zwiększania dawki Na+ w zależności od wieku myszy.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na+ Spike-In poprawia formowanie gigaomowych uszczelnień i pomyślne nagrywanie zacisków krosowych
Pierwotna wersja metody odzysku ochronnego NMDG została specjalnie zaprojektowana dla zwierząt dorosłych i starzejącychsię 2,5. Niektórzy pierwsi użytkownicy starali się również zastosować tę metodologię do krojenia mózgów młodych zwierząt (tj. myszy w wieku <30 dni). Zauważono jednak, że w przeciwieństwie do wyjątkowego, wizualnie potwierdzonego zachowania neuronów za pomocą ochronnej metody odzyskiwania NMDG w tym przedziale wiekowym, tworzenie uszczelnień gigaomowych może często utknąć w martwym punkcie, co prowadzi do nieudanych prób nagrania klamry. Jedna z hipotez głosi, że kationy NMDG są łatwiej uwięzione w młodocianych wycinkach mózgu w porównaniu z dorosłymi wycinkami mózgu i mogą utrudniać tworzenie się fok; jednak gigaomowe uszczelki mogą łatwo się tworzyć, podczas gdy młode wycinki mózgu są całkowicie zanurzone w NMDG aCSF (dane nie pokazane), co wskazuje, że NMDG aCSF per se nie utrudnia tworzenia gigaomowych uszczelnień.

Szybkie przejście od roztworu o niskiej do wysokiej zawartości Na+ po zakończeniu początkowego etapu odzyskiwania wycinków mózgu powoduje uszkodzenie błon neuronalnych i zaburza proces tworzenia uszczelnień. Jest to intuicyjne, biorąc pod uwagę, że przejście od niskiej do wysokiej temperatury Na+, niskiej do ciepłej temperatury i dramatyczny wzrost stosunku Ca2+ do Mg2+ łącznie prowadzą do masowego odrodzenia spontanicznej aktywności synaptycznej. Ta hamująca faza odbicia w procedurze krojenia mózgu prawdopodobnie odzwierciedla uszkodzenie reperfuzyjne po urazie niedokrwiennym. W związku z tym, aby jeszcze bardziej złagodzić uszkodzenie błony neuronalnej w początkowej fazie rekonwalescencji, zastosowano procedurę stopniowego skoku Na+, w której wzrost stężenia Na+ w ochronnej komorze inkubacyjnej NMDG jest powoli i powtarzalnie zwiększany z precyzyjnym czasem. Podobnie jak w pierwotnej procedurze odzyskiwania ochronnego, korzystna jest czasowa dysocjacja wzrostu Na+ od temperatury i podniesienie stosunku Ca2+ / Mg2+. Ale dodatkowo, procedura skoku Na+ prowadzi do niewielkiego przyrostowego wzrostu zewnątrzkomórkowego stężenia Na+ we wczesnych punktach czasowych i dużego wzrostu w kierunku późnych punktów czasowych, dając w ten sposób tkance mózgowej możliwość lepszego dostosowania się do rosnących poziomów Na+. Procedura ta jest alternatywą dla stopniowej wymiany roztworu kontrolowanej przez pompę perfuzyjną lub grawitacyjne linie kroplujące, które prowadzą do stałego wzrostu poziomu Na+ i wymagają zwrócenia uwagi zarówno na dopływ, jak i odpływ, aby uniknąć przepełnienia komory plastrów. Warto zauważyć, że w tej procedurze nakłuwania Na+ osmolalność roztworu w komorze plastrów stopniowo wzrasta w ciągu kilku minut, zanim plastry powrócą do normalnego roztworu osmolalności, ale nie wpłynęło to negatywnie na zdrowie plastra ani sukces zapisu zacisku krosowego. Roztwór tnący o wysokiej osmolalności był wcześniej stosowany do przygotowywania plastrów śródmózgowia w celu lepszego zachowania neuronów dopaminowych do zapisów patch clamp57,58, wykazując w ten sposób, że ta tymczasowa hiperosmolalność może być korzystna w niektórych kontekstach.

Dzięki wdrożeniu zoptymalizowanej procedury łączącej metodę ochronnego odzyskiwania NMDG i stopniowy krok skoku Na+, użyteczność tej metodologii wycinków mózgu została rozszerzona na wiek młodocianych i dojrzałych dorosłych. Ten zaktualizowany protokół jest teraz odpowiedni dla szerokiego zakresu wieku zwierząt przy użyciu jednego optymalnego preparatu i procedury NMDG aCSF. W razie potrzeby procedura nastawiania Na+ może być stosowana z coraz dłuższym opóźnieniem i/lub wolniejszym czasem w celu zwiększenia żywotności wycinków mózgu starszych zwierząt, a my przedstawiliśmy podstawowy przewodnik po zalecanych harmonogramach nawijania w zależności od wieku zwierzęcia (patrz Tabela 2). Chociaż dostarczyliśmy podstawową strukturę odpowiednią dla szerokiej gamy zastosowań, dodatkowe zaawansowane kroki mogą być badane w celu dalszego zwiększenia żywotności i długowieczności wycinków mózgu od dorosłych i starzejących się zwierząt. Na przykład, strategie odbudowy glutationu są szczególnie skuteczne w tym zakresie i mogą być wdrażane zgodnie z opisem w innym miejscu 2,6.

Zwiększanie przepustowości w przypadku wymagających eksperymentów
Analiza połączeń synaptycznych za pomocą zapisu patch clamp jest wymagającym zastosowaniem, które wymaga doskonałego zachowania zarówno struktury, jak i funkcji neuronów w celu osiągnięcia wysokiej niezawodności sukcesu. Ponieważ liczba neuronów, które mają być jednocześnie rejestrowane, rośnie liniowo, poziom trudności technicznej wzrasta nadliniowo. Istnieje wiele trybów awarii, a jedną z najczęstszych przyczyn awarii jest niemożność uformowania odpowiednich gigaomowych uszczelek na jednym lub więcej docelowych ogniwach. Może to znacznie spowolnić postęp, szczególnie gdy trzy lub więcej neuronów musi być rejestrowanych jednocześnie. Zgodnie z odkryciem szybszego czasu tworzenia uszczelnienia gigaomowego za pomocą zoptymalizowanej metody odzyskiwania ochronnego NMDG, nastąpiła wyraźna poprawa wskaźnika sukcesu i przepustowości eksperymentów z zapisem klamry z wieloma neuronami zarówno na wycinkach mózgu dorosłych transgenicznych myszy, jak i na neurochirurgicznych wycinkach mózgu dorosłego człowieka. Zwiększona wydajność jest prawie na pewno spowodowana zarówno szybszym i bardziej niezawodnym tworzeniem uszczelnień gigaomowych, jak i lepszym zachowaniem neuronów w warstwach dzięki temu protokołowi. Chociaż protokół ten koncentruje się wyraźnie na korzyściach dla aplikacji do nagrywania z zaciskiem krosowym, przewiduje się, że podobne korzyści pojawią się w przypadku innych wymagających zastosowań eksperymentalnych, w których najważniejsza jest żywotność wycinków mózgu.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca została sfinansowana przez Allen Institute for Brain Science. Autorzy pragną podziękować założycielom Allen Institute, Paulowi G. Allenowi i Jody Allen, za ich wizję, zachętę i wsparcie. Dziękujemy również personelowi wsparcia technicznego Allen Institute za opiekę nad zwierzętami, hodowlę i genotypowanie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Compresstome VF-200Instrumenty precyzyjneVF-200Wibracyjna krajalnica do tkanek (zalecana)
N-metylo-D-glukaminaSigma AldrichM2004składnik aCSF
Chlorek soduSigma AldrichS3014składnik aCSF
Chlorek potasuSigma AldrichP5405składnik aCSF
Fosforan sodu jednozasadowy dwuwodnySigma Aldrich71505aCSF składnik
Wodorowęglan soduSigma AldrichS5761składnik aCSF
HEPESSigma AldrichH4034składnik aCSF
GlukozaSigma AldrichG7021składnik CSF
Askorbinian soduSigma AldrichA4034składnik
aCSFTiomocznikSigma AldrichT8656składnik CSF
pirogronian soduSigma AldrichP5280składnik aCSF
Chlorek wapnia dwuwodnySigma AldrichC7902składnik CSF
Siarczan magnezu siedmiowodnySigma AldrichM1880składnik CSF
2,2,2-tribromoetanol Sigma AldrichT48402Składnik znieczulający 1
2-metylo-2-butanol Sigma Aldrich240486Komponent anestezjologiczny 2
Zakrzywione kleszczeNarzędzia do nauki11065-07Narzędzia do preparowania mózgu
Cienkie nożyczki preparacyjne (supercut)Narzędzia do nauk ścisłych14058-09Narzędzia do preparowania mózgu
Duże, wytrzymałe nożyczki 7''Narzędzia do nauki o dużej14000-18Narzędzia do preparowania mózgu
Metalowa szpatułkaSigma AldrichZ511455-1PAKNarzędzia do preparowania mózgu
ŻyletkiVWR89031-954Narzędzia do preparowania mózgu
Brain Slice Keeper-4AutomateScientific S-BSK4komora do przytrzymywania plasterków mózgu
nylonowa Warner Instruments64-0198Do budowy małych studzienek do odzysku plastrów
Zlewki ze szkła pyrexowego (250 ml)VWR89090-434Do budowy małych komór do odzysku plastrów
Naczynie z tworzywa sztucznego 35 mm, okrągłeVWR100488-376Do budowy małych studzienek
do odzysku plastrów Kamienie dyfuzora gazu (10 &mikro; m)Sigma Aldrich59277Do stałego karbonowania (drobne pęcherzyki)
Agaroza Typ I-BSigma AldrichA0576Do zatapiania próbek mózgu Końcówki
do mikroładowarekEppendorf22491229Do napełniania elektrod zaciskowych
SylgardVWR102092-312Do wykonania niestandardowej platformy preparacyjnej
Kwas solny Sigma AldrichH1758-100MLDo regulacji pH podłoża
Wodorotlenek sodu Sigma Aldrich221465-25GDo regulacji pH podłoża
Wodorotlenek potasuSigma Aldrich221473Do regulacji pH mediów
Plastikowe pipety transferowe z podziałką 3 mlVWR89497-676Do przenoszenia plastrów
Ceramiczne łopatki wtryskiwaczy z cyrkonuOstrza specjalistyczneEF-INZ10http://cadenceinc.com/
KG-33 szkło borokrzemowe kapilara z żarnikiemKing Glass Companyniestandardowa wycenaID: 0,87 mm, OD 1,50 mm
BiocytinSigma AldrichB4261Roztwór do pipet wewnętrznych
Fosfokreatyna disodowaSigma AldrichP7936Roztwór do pipet Intern
Glukonianpotasu Sigma AldrichG4500-100GRoztwór do pipet Intern
EGTASigma AldrichE3889Roztwór do pipet wewnętrznych
Mg-ATPSigma AldrichA9187Roztwór do pipet wewnętrznych
Na2-GTPSigma Aldrich51120Roztwór do pipet wewnętrznych
sacharozaSigmaAldrich S0389Roztwór do pipet wewnętrznych
Podgrzewana kąpiel wodna (2,5 l)VWR13491-060filtracyjna
krążki VWR28456-022Różne
Klej cyjanoakrylowyAmazonB000BQRBO6Różne
Szklana szalka PetriegoVWR89000-326Różne
10X Sól fizjologiczna buforowana fosforanemSigma AldrichP5493Różne
Strzykawki 30 mlVWRBD302832Różne
Strzykawki 1 mlVWRBD-309628Różne
25 igieł o rozmiarze 5/8VWR89219-292
Różne Termomiksery (z blokiem probówek 1,5 ml)VWR89232-908Do utrzymywania stopionej agarozy 
wytrzymałości siatka Różne Bibuła

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aghajanian, G. K., Rasmussen, K. Intracellular studies in the facial nucleus illustrating a simple new method for obtaining viable motoneurons in adult rat brain slices. Synapse. 3 (4), 331-338 (1989).
  2. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics. Methods Mol Biol. 1183, 221-242 (2014).
  3. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  4. Peca, J., et al. Shank3 mutant mice display autistic-like behaviours and striatal dysfunction. Nature. 472 (7344), 437-442 (2011).
  5. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals. Society for Neuroscience Abstracts. 520, (2011).
  6. Ting, J. T. F., et al. Improved methods for acute brain slice preparation from adult and aging animals (Part II): Glutathione depletion underlies rapid deterioration of adult brain slices. Society for Neuroscience Abstracts. 505, (2012).
  7. MacGregor, D. G., Chesler, M., Rice, M. E. HEPES prevents edema in rat brain slices. Neurosci Lett. 303 (3), 141-144 (2001).
  8. Liu, Y. B., Guo, J. Z., Chiappinelli, V. A. Nicotinic receptor-mediated biphasic effect on neuronal excitability in chick lateral spiriform neurons. Neuroscience. 148 (4), 1004-1014 (2007).
  9. Xiang, Z., Huguenard, J. R., Prince, D. A. GABAA receptor-mediated currents in interneurons and pyramidal cells of rat visual cortex. J Physiol. 506, (Pt 3) 715-730 (1998).
  10. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nat Protoc. 1 (4), 2075-2081 (2006).
  11. Contractor, A., et al. Loss of kainate receptor-mediated heterosynaptic facilitation of mossy-fiber synapses in KA2-/- mice. J Neurosci. 23 (2), 422-429 (2003).
  12. Pita-Almenar, J. D., Collado, M. S., Colbert, C. M., Eskin, A. Different mechanisms exist for the plasticity of glutamate reuptake during early long-term potentiation (LTP) and late LTP. J Neurosci. 26 (41), 10461-10471 (2006).
  13. Ito, K., Contractor, A., Swanson, G. T. Attenuated plasticity of postsynaptic kainate receptors in hippocampal CA3 pyramidal neurons. J Neurosci. 24 (27), 6228-6236 (2004).
  14. Van Dort, C. J., et al. Optogenetic activation of cholinergic neurons in the PPT or LDT induces REM sleep. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (2), 584-589 (2015).
  15. Ferando, I., Mody, I. Altered gamma oscillations during pregnancy through loss of delta subunit-containing GABA(A) receptors on parvalbumin interneurons. Front Neural Circuits. 7, 144(2013).
  16. Walker, A. G., et al. Metabotropic glutamate receptor 3 activation is required for long-term depression in medial prefrontal cortex and fear extinction. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (4), 1196-1201 (2015).
  17. Takahashi, Y. K., et al. Neural estimates of imagined outcomes in the orbitofrontal cortex drive behavior and learning. Neuron. 80 (2), 507-518 (2013).
  18. Pan, G., et al. Preserving GABAergic interneurons in acute brain slices of mice using the N-methyl-D-glucamine-based artificial cerebrospinal fluid method. Neurosci Bull. 31 (2), 265-270 (2015).
  19. LaSarge, C. L., Santos, V. R., Danzer, S. C. PTEN deletion from adult-generated dentate granule cells disrupts granule cell mossy fiber axon structure. Neurobiol Dis. 75, 142-150 (2015).
  20. Tong, L. M., et al. Inhibitory interneuron progenitor transplantation restores normal learning and memory in ApoE4 knock-in mice without or with Abeta accumulation. J Neurosci. 34 (29), 9506-9515 (2014).
  21. Fleming, R. L., et al. Binge-pattern ethanol exposure during adolescence, but not adulthood, causes persistent changes in GABAA receptor-mediated tonic inhibition in dentate granule cells. Alcohol Clin Exp Res. 37 (7), 1154-1160 (2013).
  22. Kummer, K. K., El Rawas, R., Kress, M., Saria, A., Zernig, G. Social interaction and cocaine conditioning in mice increase spontaneous spike frequency in the nucleus accumbens or septal nuclei as revealed by multielectrode array recordings. Pharmacology. 95 (1-2), 42-49 (2015).
  23. Qi, J., et al. A glutamatergic reward input from the dorsal raphe to ventral tegmental area dopamine neurons. Nat Commun. 5, 5390(2014).
  24. Wang, L., et al. Modulation of dopamine release in the striatum by physiologically relevant levels of nicotine. Nat Commun. 5, 3925(2014).
  25. Siuda, E. R., et al. Spatiotemporal Control of Opioid Signaling and Behavior. Neuron. , (2015).
  26. Tucker, K. R., Huertas, M. A., Horn, J. P., Canavier, C. C., Levitan, E. S. Pacemaker rate and depolarization block in nigral dopamine neurons: a somatic sodium channel balancing act. J Neurosci. 32 (42), 14519-14531 (2012).
  27. McDevitt, R. A., et al. Serotonergic versus nonserotonergic dorsal raphe projection neurons: differential participation in reward circuitry. Cell Rep. 8 (6), 1857-1869 (2014).
  28. Wang, D. V., et al. Mesopontine median raphe regulates hippocampal ripple oscillation and memory consolidation. Nat Neurosci. 18 (5), 728-735 (2015).
  29. Engle, S. E., Shih, P. Y., McIntosh, J. M., Drenan, R. M. alpha4alpha6beta2* nicotinic acetylcholine receptor activation on ventral tegmental area dopamine neurons is sufficient to stimulate a depolarizing conductance and enhance surface AMPA receptor function. Mol Pharmacol. 84 (3), 393-406 (2013).
  30. Vance, K. M., Ribnicky, D. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. Artemisia santolinifolia enhances glutamatergic neurotransmission in the nucleus of the solitary tract. Neurosci Lett. 582, 115-119 (2014).
  31. Dergacheva, O., Boychuk, C. R., Mendelowitz, D. Developmental changes in GABAergic neurotransmission to presympathetic and cardiac parasympathetic neurons in the brainstem. J Neurophysiol. 110 (3), 672-679 (2013).
  32. Dergacheva, O. Chronic intermittent hypoxia alters neurotransmission from lateral paragigantocellular nucleus to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. J Neurophysiol. 113 (1), 380-389 (2015).
  33. Dyavanapalli, J., et al. Chronic intermittent hypoxia-hypercapnia blunts heart rate responses and alters neurotransmission to cardiac vagal neurons. J Physiol. 592, (Pt 13) 2799-2811 (2014).
  34. Apostolides, P. F., Trussell, L. O. Regulation of interneuron excitability by gap junction coupling with principal cells. Nat Neurosci. 16 (12), 1764-1772 (2013).
  35. Graziane, N. M., Polter, A. M., Briand, L. A., Pierce, R. C., Kauer, J. A. Kappa opioid receptors regulate stress-induced cocaine seeking and synaptic plasticity. Neuron. 77 (5), 942-954 (2013).
  36. Ferando, I., Mody, I. In vitro gamma oscillations following partial and complete ablation of delta subunit-containing GABAA receptors from parvalbumin interneurons. Neuropharmacology. 88, 91-98 (2015).
  37. Foster, D. J., et al. M5 receptor activation produces opposing physiological outcomes in dopamine neurons depending on the receptor's location. J Neurosci. 34 (9), 3253-3262 (2014).
  38. Engle, S. E., Broderick, H. J., Drenan, R. M. Local application of drugs to study nicotinic acetylcholine receptor function in mouse brain slices. J Vis Exp. (68), e50034(2012).
  39. Wang, L., et al. Temporal components of cholinergic terminal to dopaminergic terminal transmission in dorsal striatum slices of mice. J Physiol. 592, (Pt 16) 3559-3576 (2014).
  40. Holloway, B. B., et al. Monosynaptic glutamatergic activation of locus coeruleus and other lower brainstem noradrenergic neurons by the C1 cells in mice. J Neurosci. 33 (48), 18792-18805 (2013).
  41. DePuy, S. D., et al. Glutamatergic neurotransmission between the C1 neurons and the parasympathetic preganglionic neurons of the dorsal motor nucleus of the vagus. J Neurosci. 33 (4), 1486-1497 (2013).
  42. Abbott, S. B., Holloway, B. B., Viar, K. E., Guyenet, P. G. Vesicular glutamate transporter 2 is required for the respiratory and parasympathetic activation produced by optogenetic stimulation of catecholaminergic neurons in the rostral ventrolateral medulla of mice in vivo. Eur J Neurosci. 39 (1), 98-106 (2014).
  43. Dergacheva, O., Dyavanapalli, J., Pinol, R. A., Mendelowitz, D. Chronic intermittent hypoxia and hypercapnia inhibit the hypothalamic paraventricular nucleus neurotransmission to parasympathetic cardiac neurons in the brain stem. Hypertension. 64 (3), 597-603 (2014).
  44. Chen, Q., et al. Imaging neural activity using Thy1-GCaMP transgenic mice. Neuron. 76 (2), 297-308 (2012).
  45. Luongo, F. H., Horn, M. E. Sohal V.S. Putative microcircuit-level substrates for attention are disrupted in mouse models of autism. Biological Psychiatry. 79 (8), 667-675 (2016).
  46. Vance, K. M., Rogers, R. C., Hermann, G. E. PAR1-activated astrocytes in the nucleus of the solitary tract stimulate adjacent neurons via NMDA receptors. J Neurosci. 35 (2), 776-785 (2015).
  47. Feliciano, P., Andrade, R., Bykhovskaia, M. Synapsin II and Rab3a cooperate in the regulation of epileptic and synaptic activity in the CA1 region of the hippocampus. J Neurosci. 33 (46), 18319-18330 (2013).
  48. Tomioka, N. H., et al. Elfn1 recruits presynaptic mGluR7 in trans and its loss results in seizures. Nat Commun. 5, 4501(2014).
  49. Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 9462(2015).
  50. Mishra, A., et al. Imaging pericytes and capillary diameter in brain slices and isolated retinae. Nat Protoc. 9 (2), 323-336 (2014).
  51. Gabriel, L. R., Wu, S., Melikian, H. E. Brain slice biotinylation: an ex vivo approach to measure region-specific plasma membrane protein trafficking in adult neurons. J Vis Exp. (86), (2014).
  52. Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods Enzymol. 207, 208-222 (1992).
  53. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and morphological characterization of neuronal microcircuits in acute brain slices using paired patch-clamp recordings. J Vis Exp. (95), e52358(2015).
  54. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons. J Vis Exp. (91), e51706(2014).
  55. Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nat Neurosci. 13 (1), 133-140 (2010).
  56. Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. J Gen Physiol. 58 (6), 599-619 (1971).
  57. Martin, M., Chen, B. T., Hopf, F. W., Bowers, M. S., Bonci, A. Cocaine self-administration selectively abolishes LTD in the core of the nucleus accumbens. Nat Neurosci. 9 (7), 868-869 (2006).
  58. Chen, B. T., et al. Cocaine but not natural reward self-administration nor passive cocaine infusion produces persistent LTP in the VTA. Neuron. 59 (2), 288-297 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ochronna rekonwalescencja w NMDGprzygotowanie skrawk w m zguelektrofizjologia patch clampNMDG HEPES aCSFprocedura uzupe niania sodu sodium spike int ator do tkanekzatapianie w agaroziekonserwacja neuron wtworzenie uszczelnienia gigaohmicznego

Powiązane artykuły