Izolacja mysich komórek mięśni gładkich naczyń wieńcowych

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie technik izolacji i hodowli mysich pierwotnych komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z krążenia wieńcowego. Po wyizolowaniu VSMC można je stosować w wielu standardowych technikach hodowli.

Streszczenie

Chociaż izolacja i hodowla komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) z dużych naczyń krwionośnych jest dobrze znana, staraliśmy się wyizolować i hodować VSMC z krążenia wieńcowego. Serca z nienaruszonymi łukami aorty usunięto i perfuzjono za pomocą wstecznego Langendorffa z roztworem trawiącym zawierającym 300 jednostek/ml kolagenazy typu II, 0,1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej i 1 M CaCl₂. Perfuzaty zbierano w odstępach 15-minutowych przez 90 minut, granulowano przez wirowanie, ponownie zawieszono w pożywkach galwanicznych i posiewano na szalkach do hodowli tkankowych. VSMC charakteryzowały się obecnością SM22α, α-SMA i wimentyny. Jedną z głównych zalet stosowania tej techniki jest możliwość izolowania VSMC z krążenia wieńcowego myszy. Chociaż niewielka liczba uzyskanych komórek może ograniczać niektóre zastosowania, do których można wykorzystać komórki, izolowane VSMC naczyń wieńcowych mogą być stosowane w różnych dobrze znanych technikach i testach hodowli komórkowych. Badania nad VSMC od genetycznie zmodyfikowanych myszy mogą dostarczyć dalszych informacji na temat struktury, funkcji i procesów sygnalizacyjnych związanych z patologiami naczyniowymi.

Wprowadzenie

Celem tej metody jest odizolowanie komórek mięśni gładkich naczyń krwionośnych (VSMC) od mysiego krążenia wieńcowego do wykorzystania w hodowlach komórkowych i standardowych testach hodowli komórkowych. Opracowaliśmy tę technikę do oceny molekularnych mechanizmów przebudowy naczyń krwionośnych w cukrzycy. Wcześniej informowaliśmy o wewnętrznej przebudowie przerostowej w przegrodach tętniczek wieńcowych w mysim modelu cukrzycy db / db¹. Ze względu na ograniczoną ilość tkanki znajdującej się w wieńcach przegrody mysiej, standardowe techniki eksperymentalne badające zmiany białek (np. Western blot) u myszy db/db i kontrolnych są w najlepszym razie trudne. Ponadto wcześniej wykazaliśmy, że bloker receptora angiotensyny (ARB) losartan zmniejsza przebudowę obserwowaną u myszy db / db². Dlatego izolacja pierwotnych VSMC z krążenia wieńcowego pozwala nam na dalsze badanie zmian w fenotypie VSMC lub aktywowanych szlakach sygnałowych u myszy z cukrzycą, które mogą przyczyniać się do niekorzystnej przebudowy tętniczek wieńcowych.

Liczne badania wyjaśniły kanoniczne szlaki sygnałowe za pomocą VSMC izolowanych z aorty gryzoni, a nie w każdym konkretnym łożysku naczyniowym. Wykazaliśmy jednak specyficzną dla łożyska naczyniowego przebudowę w krążeniu wieńcowym, aortalnym i krezkowym myszy db / db¹, co sugeruje, że VSMC w każdym łożysku naczyniowym mogą być różne. Dlatego konieczne jest wyizolowanie VSMC z każdego łożyska naczyniowego, aby lepiej zrozumieć zmiany patologiczne zachodzące w każdym zestawie VSMC. Istnieje wiele różnych metod izolowania i hodowli VSMC aorty. Jednak obecnie opublikowano tylko jedno badanie dotyczące izolacji VSMC z krążenia wieńcowego myszy³. Teng i wsp. był pierwszym, który poinformował o metodzie izolowania VSMC od krążenia wieńcowego myszy; Jednak znacznie zmieniliśmy protokół, ponieważ wyizolowano również komórki śródbłonka. Inne laboratoria również wykorzystały protokół Teng i wsp. do wyizolowania miocytów tętnic wieńcowych i komórek mięśni gładkich dróg oddechowych^4,5. Zmiany, które wprowadziliśmy, stworzą populację komórek wysoce wzbogaconych o VSMC z krążenia wieńcowego.

Wsteczna perfuzja izolowanego serca ssaków, czyli technika Langendorffa, została zapoczątkowana w 1897 roku⁶ przez Oscara Langendorffa i jest nadal szeroko stosowana do izolacji komórek sercowo-naczyniowych. Zaprezentowana tu technika, w połączeniu z postępem w nowoczesnych modyfikacjach genetycznych myszy, stanowi cenne narzędzie do dokładniejszego badania zachowania molekularnego VSMC z krążenia wieńcowego.

Protokół

Oświadczenie etyczne: To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zostało zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Nationwide Children's Hospital.

1. Przygotowanie/Konfiguracja

Uwaga: Ta technika izolacji wymaga dwóch wężownic grzewczych Langendorff umieszczonych obok siebie na stojaku pierścieniowym i połączonych równolegle z obiegową łaźnią wodną.

1. Włącz łaźnię z wodą obiegową i dostosuj temperaturę, aby osiągnąć temperaturę końcową 33-34 °C na końcówce kaniuli Langendorffa (łaźnia wodna używana w tej konfiguracji jest ustawiona na 40 °C z powodu utraty temperatury o 6-7 °C na rurce). Włącz pompy perfuzyjne i ustaw szybkość perfuzji na 0,5 ml/min.
   1. Wyczyść obie wężownice grzewcze z płaszczem wodnym, dołączone rurki i kaniulę o rozmiarze 25, przepłukując każdą z nich 50 ml 70% etanolu, a następnie 100 ml autoklawowanej ultraczystej wody.
   2. Wyczyść wężownice grzewcze, przepychając powietrze strzykawką i przemyj 10 ml Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) bez czerwieni fenolowej. Pozostaw HBSS w wężownicach grzewczych i rurkach.
   3. Podłączyć do rurki sterylną strzykawkę typu luer-lock o pojemności 10 ml wypełnioną HBSS o temperaturze pokojowej bez czerwieni fenolowej. Upewnij się, że żadne pęcherzyki powietrza nie są uwięzione w rurkach i wężownicach grzewczych podczas podłączania strzykawki wypełnionej HBSS, ponieważ może to spowodować zatorowość powietrzną podczas trawienia, co może negatywnie wpłynąć na izolację VSMC.
2. Wyjmij kaniulę o rozmiarze 25 z wężownic grzewczych i umieść na innej sterylnej strzykawce o pojemności 10 ml wypełnionej lodowatym HBSS bez czerwieni fenolowej. Trzymaj to na lodzie, aż będzie gotowe do użycia. Powtórz dla drugiej kaniuli.
3. Przygotować roztwór do trawienia enzymatycznego.
   1. Zważyć kolagenazę typu 2 zgodnie z konkretnym numerem partii na 75 ml roztworu wytrawiającego w celu uzyskania końcowego stężenia 300 jednostek/ml.
   2. Rozpuść kolagenazę w 75 ml HBSS z czerwienią fenolową. Następnie dodać do mieszaniny 1,5 ml 0,1 mg/ml inhibitora trypsyny sojowej i 75 μl 1 M CaCl₂ do mieszaniny.
4. W przypadku natychmiastowego użycia roztworu wytrawiającego należy go ogrzać do temperatury 37 °C. Jeśli nie, umieść go w temperaturze 4 °C na maksymalnie 6 godzin. To rozwiązanie musi być codziennie świeże.
5. Przygotować roztwór zatrzymujący/podłoże galwaniczne.
   1. Dodać 100 ml inaktywowanego termicznie FBS, 5 ml L-glutaminy, 5 ml aminokwasów endogennych, 5 ml HEPES i 1 ml primocyny do 500 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy (4,5 g/l). Zalecana jest sterylizacja filtra.
   2. Podwielokrotność 6 ml roztworu zatrzymanego do każdej z dwunastu stożkowych probówek o pojemności 15 ml ponumerowanych A1-A6 i B1-B6 i umieścić w temperaturze 4 °C. Podamy 50 ml roztworu zatrzymanego do stożkowego pojemnika o pojemności 50 ml i umieścić w inkubatorze o temperaturze 37 °C.
      Uwaga: Ten krok można również przygotować dzień przed izolacją, jeśli to konieczne. Ten roztwór zatrzymujący zostanie użyty jako medium galwaniczne po izolacji komórek.
6. Przygotować dwie strzykawki o pojemności 1 ml wyposażone w igłę 30 G ze 100 μl heparyny (1 000 jednostek/ml).
7. Wytnij 5 cm kawałek jedwabiu chirurgicznego 5-0. Zawiąż luźny węzeł z jedwabiu chirurgicznego tak, aby jeden koniec był dwa razy dłuższy od drugiego. Umieść na kaniuli o rozmiarze 25, ale nie dokjaj. Powtórz tę czynność dla drugiej kaniuli 25 G.
8. Napełnij cztery sterylne szalki Petriego o średnicy 35 mm (#1-4) 2 ml sterylnego, lodowatego HBSS bez czerwieni fenolowej. Trzymaj na lodzie.

2. Eutanazja, izolacja serca i kaniulacja

1. Przed izolacją serca upewnij się, że roztwór trawiący i 50 ml stożkowego lub zatrzymującego roztwór są ciepłe. Wyjąć strzykawkę wypełnioną HBSS z dołączoną kaniulą 25 G z lodu i umieścić w biurety clamp (lub stojak pierścieniowy clamp) na stojaku pierścieniowym.
2. Znieczulij myszy za pomocą 3% izofluoranu. Upewnij się, że mysz jest znieczulona, dotykając palcami każdej tylnej kończyny. Jeśli noga drga, mysz nie jest jeszcze znieczulona, więc odczekaj 1 minutę i powtórz dotyk palca.
3. Odsłoń żyłę szyjną, usuwając nożyczkami sierść i skórę z przodu szyi. Następnie za pomocą kleszczy ostrożnie usuń tłuszcz otaczający żyłę szyjną. Po usunięciu tłuszczu powoli wstrzyknij 100 μl heparyny (1000 jednostek/ml). Umieść gąbkę chirurgiczną na żyle, aby uniknąć nadmiernego krwawienia.
4. Po 1 minucie otwórz klatkę piersiową, aby odsłonić serce, podnieś serce zakrzywionymi kleszczami i wytnij je nożyczkami, upewniając się, że aorta wstępująca jest nienaruszona przez pierwszą gałąź ramienno-głowową. Natychmiast umieść serce w naczyniu o średnicy 35 mm z lodowatym HBSS bez czerwieni fenolowej i spłucz.
   Uwaga: Wykonaj następujące 4 kroki za pomocą lunety sekcyjnej.
5. Ustaw kaniulę 25 G, która jest zamontowana na statywie pierścieniowym pod kątem 45°, tak aby końcówka znajdowała się tuż pod powierzchnią lodowatego HBSS w naczyniu #2 i była wyraźnie widoczna przez mikroskop preparacyjny. Przełóż serce do naczynia #2.
6. Za pomocą kleszczy Dumonta odsłoń aortę, delikatnie usuwając nadmiar tkanki tłuszczowej poprzez rozwarstwienie, aby zapobiec przebiciu lub rozerwaniu aorty. Następnie za pomocą kleszczy nasuń aortę na kaniulę 25 G.
7. Poprowadź kaniulę w dół przez aortę, blisko, ale nie poza zastawkę aortalną, co zagrozi integralności zastawki, a tym samym perfuzji wstecznej. Gdy kaniula znajdzie się na miejscu, nasuń wstępnie zawiązany jedwab na aortę i dokręć. Zawiąż drugi węzeł, aby utworzyć kwadratowy węzeł wokół aorty, aby zabezpieczyć serce.
8. Po bezpiecznym zawiązaniu aorty delikatnie wypłucz pozostałą krew z krążenia wieńcowego za pomocą lodowatego HBSS w strzykawce podłączonej do kaniuli 25 G. Uważaj, aby nie naciskać zbyt mocno, aby uniknąć nadmiernego ciśnienia wieńcowego. Do zakończenia spłukiwania wymagane jest tylko bardzo powolne i delikatne spłukiwanie. Podczas tego delikatnego płukania można również zaobserwować szczelną kaniulację aorty.
9. Włącz pompę perfuzyjną, aby rozpocząć przepływ HBSS. Wyjmij kaniulę 25 G (z dołączonym sercem) ze strzykawki wypełnionej HBSS, uważając, aby piasta kaniuli była wypełniona HBSS i podłącz ją do ciepłych wężownic grzewczych wypełnionych HBSS. Rozpocznij perfuzję serca za pomocą pompy perfuzyjnej z szybkością 0,5 ml/min przez 8 minut.
10. Po kaniulacji pierwszego serca i jego perfuzji w systemie, powtórz kroki 2.1-2.8 dla drugiego serca. Izolacje te będą rozłożone w czasie dla każdego serca, dlatego wymagane jest staranne planowanie i czas.

3. Trawienie

1. Po przepłukaniu HBSS należy zmienić strzykawkę o pojemności 10 ml HBSS znajdującą się obecnie na pompie na strzykawkę wypełnioną 10 ml wstępnie podgrzanego roztworu do wytrawiania. Ukrwić każde serce roztworem trawiącym przez 12 minut z szybkością 0,5 ml/min. Nie zbieraj frakcji pochodzących z tego pierwszego trawienia, ponieważ będzie to zawierało resztki krwi i komórek śródbłonka.
2. Po 12 minutach zmienić szybkość perfuzji na 0,4 ml/min, umieścić 15 ml stożkowego (probówka A1 lub B1, odpowiadająca pierwszemu lub drugiemu sercu dla każdego trawienia) wypełnionego zimnym roztworem zatrzymującym w pojemniku na lód pod sercem, aby rozpocząć zbieranie perfuzatu wzbogaconego VSMC.
3. Po 15 minutach natychmiast po zebraniu obu frakcji zmienić stożkową rurkę zbiorczą na rurkę A2 lub B2 i wirować stożkową probówkę A1 i B1 o gramaturze 89 x g. Gdy w strzykawce napełnionej roztworem wytrawiającym na pompie znajduje się mniej niż 1 ml roztworu, należy zastąpić świeżo napełnioną strzykawką o pojemności 10 ml z roztworem wytrawiającym.
4. Po odwirowaniu odessać supernatant z każdej probówki zbiorczej, pozostawiając około 0,5 ml. Zawiesić osad z A1 za pomocą 2 ml ciepłego roztworu zatrzymującego (lub podłoża do powlekania). Dodać ponownie zawiesinę z probówki A1 do probówki B1 i umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z luźną nakrętką.
5. Powtarzać kroki 3.3 i 3.4, aż wszystkie probówki (przez A6 i B6) zostaną zużyte przez łączny czas zbierania 90 minut. Po 80 minutach trawienia rozetnij wierzchołek serca, aby wypłukać wszelkie komórki, które mogą być uwięzione w komorze i zbierz te komórki odpowiednio w probówce A6 i B6.
   Uwaga: Czasami serce spadnie z kaniuli przed upływem 90 minut. W takim przypadku należy pobrać serce i umieścić je na sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm wypełnionej 2 ml roztworu trawiącego. Odetnij wierzchołek serca i delikatnie opłucz serce roztworem trawiącym. Następnie przefiltrować 2 ml roztworu wytrawiającego przez sterylne sitko do komórek 100 μm do stożkowego o pojemności 50 ml i dodać do probówki A6 lub B6.
6. Po każdym wirowaniu kolejnych probówek (A2 i B2) dodaj zawieszone VSMC do poprzedniej probówki zbiorczej (połączone A1 i B1). Należy również uważać, aby nie dopuścić do wyczerpania się roztworu wytrawiającego w pompie i w razie potrzeby zmieniać strzykawki o pojemności 10 ml przez cały czas trawienia.
7. Po połączeniu wszystkich probówek odwirować zawiesinę bogatą w VSMC o stężeniu 89 x g przez 10 minut.
8. Odessać jak najwięcej supernatantu z probówek zbiorczych. Zawiesić pozostały osad w 2 ml podłoża galwanicznego i płytki na jednym naczyniu hodowlanym o średnicy 35 mm. Umieścić naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 24 godziny.

4. Hodowla komórkowa

Uwaga: Wykonaj pozostałe kroki w komorze bezpieczeństwa biologicznego.

1. Po 24 godzinach delikatnie zassać media galwaniczne. Kultura zwykle będzie zawierała dużą ilość gruzu. Aby umyć komórki, dodaj 2 ml ciepłego, sterylnego PBS i delikatnie postukaj naczyniem o dwa palce, obracając się ruchem wskazówek zegara.
2. Po obróceniu o 360° zassać PBS i powtórzyć po raz drugi. Odessać PBS i dodać kolejne 2 ml sterylnego, ciepłego PBS. Sprawdź naczynie hodowlane pod mikroskopem, aby upewnić się, że na talerzu nie ma żadnych zanieczyszczeń. W tym czasie można również określić zbieg komórek.
3. Jeśli w naczyniu hodowlanym pozostaną zanieczyszczenia, powtórz krok 4.2. Jeśli naczynie hodowlane jest wolne od zanieczyszczeń, odessać PBS i dodać 2 ml ciepłego podłoża galwanicznego.
4. Po 24 godzinach ponownie umyj komórki ciepłym, sterylnym PBS, aby usunąć wszelkie końcowe zanieczyszczenia lub martwe komórki z hodowli. Odessać PBS i umieścić kolejne 2 ml ciepłego podłoża galwanicznego na komórkach.
5. Sprawdzaj stan komórek codziennie i podawaj je co 48 godzin świeżym, podgrzanym podłożem galwanicznym. W tym momencie komórki można wykorzystać do standardowych testów hodowli komórkowych. VSMC powinny być w około 80% zlewające się 4-5 dni po posiewaniu, chociaż może minąć do 7 dni, zanim procedura zostanie udoskonalona. W przypadku dzielenia na kolejne przejścia należy użyć maksymalnie szalek o średnicy 1:4 35 mm (lub do porównywalnego obszaru szalek hodowlanych).

Wyniki

Ze względu na nowatorski charakter naszej techniki izolacji VSMC tętnic wieńcowych, postanowiliśmy określić czystość wyizolowanych komórek. Mysie VSMC tętnic wieńcowych identyfikowano na podstawie ich morfologii oraz barwienia immunofluorescencyjnego do drugiego pasażu. Na podstawie morfologii komórek w hodowli po pierwszym przemyciu stwierdzono, że procedura izolacji skutecznie usuwa kardiomiocyty i komórki śródbłonka. Komórki VSMC zachowują swoją morfologię do drugiego pasażu (R...

Dyskusja

Celem tego badania było dostosowanie istniejących protokołów izolacji komórek w celu zwiększenia wydajności gładkich naczyń wieńcowych z mysich serc. Większość pionierskich prac w zakresie biologii mięśni gładkich naczyń krwionośnych przeprowadzono na hodowanych komórkach mięśni gładkich aorty szczura. Badania te dostarczyły podstawowej wiedzy na temat mechanizmów molekularnych, które kontrolują wzrost, migrację i hipertrofię VSMC⁷. Jednak wraz z postępem w tej dziedzinie stało się jasne, że fenotyp i funkcja ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płodowa surowica bydlęca	Life Technologies	16140-071
HEPES 1 M roztwór	Fisher	MT-25-060
Primocin - 20 ml	Invivogen	ant-pm-2
DMEM (wysoka glukoza, pirogronian sodu, L-glutamina)	Life Technologies	11995-065
MEM NEAA 10 mM 100x	Life Technologies	11140-050
L-Glut 200 mM - Gibco	Life Technologies	25030-081
Sterylne sitko komórkowe 100 µ m siatka nylonowa	Fisher	22363549
Nunclon Naczynie polistrenowe z pokrywką, sterylne, 35 mm	Fisher	12-565-91
Aparat Harvarda jedwabny szew 5-0	Fisher	14-516-124
Kolagenaza Typ-2	Worthington Biochemical	LS004176
Inhibitor trypsyny sojowej 25 mg	Sigma	T6522
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x), płynny (klarowny)	Life Technologies	14175-103
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS) (1x), płyn (czerwień fenolowa)	Life Technologies	14170-161
Wężownica grzewcza 5,0 ml z odgazowującą pułapką bąbelkową	Pompa Radnoti	158830
11 plus	Aparat Harvard	70-2208
Pompa			dowolnej marki będzie działać

cyrkulacyjna podgrzewanej wody