Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków

9K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/54018

⸱

23 sierpnia 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) pozwala nowotworom stać się inwazyjnymi. W celu zbadania EMT opisano model in vitro oparty na neuronalnych komórkach macierzystych (NSC) pozbawiony surowicy i enzymów. Ten ustandaryzowany system umożliwia ilościową i jakościową ocenę migracji komórek, ekspresji genów i białek. Model nadaje się do odkrywania leków.

Streszczenie

Przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT) opisuje proces transdyferencjacji nabłonka w mezenchym. EMT jest podstawowym procesem podczas rozwoju embrionalnego, który często występuje również w glejaku, najczęstszym złośliwym guzie mózgu. EMT obserwowano również w wielu nowotworach poza mózgiem, w tym raku piersi, raku płuc, raku jelita grubego, raku żołądka. EMT jest centralnie powiązany z nowotworami złośliwymi poprzez promowanie migracji, inwazji i tworzenia przerzutów. Mechanizmy indukcji EMT nie są w pełni poznane. W tym miejscu opisujemy system in vitro do standaryzowanej izolacji korowych nerwowych komórek macierzystych (NSC) i późniejszej indukcji EMT. System ten zapewnia elastyczność w stosowaniu zarówno pojedynczych komórek, jak i hodowli eksplantatów. W tym systemie zarodkowe NSC przodomózgowia szczurów lub myszy są hodowane w określonym podłożu, pozbawionym surowicy i enzymów. NSC wykazywały ekspresję Olig2 i Sox10, dwóch czynników transkrypcyjnych obserwowanych w komórkach prekursorowych oligodendrocytów (OPC). Korzystając z tego systemu, zaobserwowano interakcje między sygnalizacją FGF, BMP i TGFβ z udziałem Zeb1, Zeb2 i Twist2, w których aktywacja TGFβ znacznie zwiększyła migrację komórek, co sugeruje synergiczną interakcję BMP-/TGFβ. Wyniki wskazują na to, że sieć sygnalizacji FGF, BMP i TGFβ jest zaangażowana w indukcję i konserwację EMT. Ten system modelowy jest odpowiedni do badania EMT in vitro. Jest ekonomiczny i wykazuje wysoką powtarzalność. Pozwala również na porównanie różnych związków pod względem ich reakcji migracyjnych (ilościowy pomiar odległości) oraz wysokoprzepustowe badania przesiewowe związków w celu zahamowania lub wzmocnienia EMT (pomiar jakościowy). Model ten doskonale nadaje się zatem do testowania bibliotek leków pod kątem substancji wpływających na EMT.

Wprowadzenie

Podczas kilku etapów rozwoju embrionalnego, komórki nabłonkowe tracą silne przyleganie do siebie (np. ścisłe połączenia) i nabywają fenotyp migracyjny w procesie zwanym przejściem nabłonkowym do mezenchymalnego (EMT)1. EMT jest wymagany do tworzenia dodatkowych typów komórek, takich jak mezenchymalne komórki grzebienia nerwowego, populacja, która oddziela się od nabłonka nerwowego2. EMT jest niezbędny nie tylko w fazie embrionalnej, ale także w późniejszych etapach dorosłego życia do utrzymania procesów fizjologicznych w dorosłym organizmie, takich jak gojenie się ran3i regeneracja ośrodkowego układu nerwowego (OUN) w zmianach demielinizacyjnych4.

Guzy nabłonkowe są znane z tego, że reaktywują EMT jako etap inicjacji migracji, inwazji i przerzutów, ostatecznie prowadząc do progresji raka1,3. EMT jest rzeczywiście ściśle związane z silną migracją1,3. Komórkowe etapy kondycjonowania, inicjowania, poddawania się i utrzymywania EMT nie są w pełni poznane i wymagają dalszych badań.

Tutaj prezentowany jest ustandaryzowany system modelowy EMT in vitro oparty na NSC, ze zdefiniowanymi czynnikami wzrostu i pożywkami (bez użycia surowicy i enzymów). Ten modelowy system ma znaczenie dla naukowców zajmujących się EMT. Wykazano, że rodziny białek Snail, Zeb i Twist mają kluczowe znaczenie dla EMT zarówno w rozwoju, jak i chorobie1. W prezentowany system zaangażowane są również rodziny Snail, Zeb i Twist. System opiera się na specyficznym regionie przodomózgowia, który normalnie nie jest poddawany EMT, co zapewnia szczególną przewagę w badaniu początkowych zdarzeń podczas indukcji EMT.

System modelowy mógłby potencjalnie zostać zastosowany do badania EMT w nabłonku poza OUN, ponieważ kluczowe induktory EMT, takie jak białka Ślimaka, Zeb i Twist, znajdują się również podczas EMT w systemach tkankowych poza OUN. Ten modelowy system pozwala na standaryzowaną izolację NSC od rozwijającej się kory mózgowej w celu badania cech komórek macierzystych w ogóle, a EMT w szczególności. Korzystając z tego systemu, wyizolowaliśmy NSC, indukowaliśmy EMT i badaliśmy późniejszą migrację pod wpływem FGF2 i BMP4. Zaobserwowaliśmy, że sygnalizacja FGF i BMP oddziałuje z sygnalizacją TGFβ w celu promowania migracji komórek, potwierdzając w ten sposób system modelowy.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie procedury na zwierzętach były zgodne z "Przewodnikiem opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych" (publikacja NIH, wydanie 8, 2011) i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Dobrostanu Zwierząt w Bazylei (Szwajcarskie Wytyczne dotyczące opieki i wykorzystania zwierząt). Zgodnie z tymi wytycznymi, protokół dotyczący zwierząt jest uważany za "najniższy stopień dotkliwości dla zwierząt".

1. Przygotowanie podłoża ekspansyjnego

Uwaga: Pracuj w warunkach aseptycznych jako standard dla hodowli tkankowych.

  1. Weź dwie probówki o pojemności 15 ml i dodaj 5 ml DMEM/F12 bez L-glutaminy (1:1) z 500 ml średniej butelki do każdej z dwóch probówek o pojemności 15 ml. Do pierwszej probówki o pojemności 15 ml dodać 50 mg ludzkiej apo-transferyny, 50 μl putrescyny 1 M (0,1 mM stężenie końcowe) i 30 μl sodu selenu 500 μM (końcowe stężenie 30 nM).
    1. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do oryginalnej butelki DMEM/F12.
  2. Do drugiej probówki o pojemności 15 ml dodać 12,5 mg insuliny. Dodać 6 - 9 kropli 1 M NaOH. Wir, aby całkowicie rozpuścić insulinę. Przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,2 μm do oryginalnej butelki DMEM/F12.
    Uwaga: NaOH jest toksyczny i. Używaj rękawic ochronnych, płaszcza i okularów ochronnych.
  3. Dodać 5 ml penicyliny (10 000 jednostek/ml) / streptomycyny (10 000 μg/ml) / amfoterycyny B (25 μg/ml) do butelki z pożywką DMEM/F12.
  4. Dodać 5 ml 200 mM świeżo rozmrożonego bulionu L-glutaminy lub oligopeptydów zawierających glutaminę (200 mM dipeptydu L-alanylo-L-glutaminy) do butelki DMEM/F12.
  5. Wstrząsnąć. Przygotować 50 ml porcji.
    Uwaga: Pożywka ekspandująca może być przechowywana przez co najmniej 2 tygodnie w temperaturze 4 °C. Probówki z porcjami wykazują mniejsze zmiany pH w porównaniu z pożywką przechowywaną w butelkach o pojemności 500 ml.

2. Przygotowanie medium pasażującego

  1. Do 1 L Pożywki HBSS wolnej od Ca2+ i Mg2+ dodać 990,85 mg glukozy (5 mM stężenie końcowe) i 840,10 mg NaHCO3 (stężenie końcowe 10 mM). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą HCl (1 M zapasu). Filtrować sterylizować filtrem 0,2 μm i uzyskać 50 ml porcji.
    Uwaga: Podłoże pasażowe można przechowywać przez co najmniej 4 tygodnie w temperaturze 4 °C.

3. Przygotowanie czynników wzrostu

  1. Przygotować sterylny 1x PBS z 1% BSA (PBS-BSA) samodzielnie lub z kwasem solnym (HCl) w 4 mM (PBS-BSA-HCl).
    Uwaga: HCl jest i toksyczny i wymaga specjalnych środków bezpieczeństwa (płaszcze, gogle, rękawice, kaptur).
  2. Rozpuścić 10 μg/ml rekombinowanego ludzkiego czynnika wzrostu fibroblastów 2 (rhFGF2) w PBS-BSA (stężenie końcowe 10 ng/ml), 10 μg/ml rekombinowanego ludzkiego białka morfogenetycznego kości 4 (rhBMP4) w PBS-BSA (stężenie końcowe 10 ng/ml) i 20 μg/ml rekombinowanego ludzkiego transformującego czynnika wzrostu β 1 (rhTGFβ1) w PBS-BSA-HCl (stężenie końcowe 40 ng/ml).
    1. Nie sterylizować filtrem. Przygotuj porcje.
      Uwaga: Podwielokrotności czynnika wzrostu mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 lata.

4. Powlekanie naczyń z kultur komórkowych

  1. Rozpuścić 1,875 mg poli-L-ornityny (PLO) w 500 ml destylowanegoH2O, aby przygotować 250-krotny bulion PLO. Filtrować sterylizować za pomocą filtra strzykawkowego 0,2 μm i uzyskać 2 ml porcji.
    Uwaga: Podwielokrotności te mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C przez co najmniej 2 lata.
  2. Rozpuścić 1 mg fibronektyny bydlęcej w 1 ml sterylnie destylowanegoH2O, aby przygotować 1,000x bulion fibronektyny. Nie wiruj, ponieważ może to spowodować skrzepnięcie lepkiego białka. Delikatnie wstrząsaj ręką przez 10 minut.
    1. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, od czasu do czasu wstrząsając. Sprawdź, czy nie ma całkowitego rozpuszczenia. Podgrzać roztwór do temperatury poniżej 37 °C w celu całkowitego rozpuszczenia fibronektyny. Nie sterylizować filtrem.
      Uwaga: Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 6 miesięcy.
  3. Użyj plastikowych naczyń do hodowli komórkowych poddanych obróbce plazmowej (100 mm lub innych rozmiarów, zgodnie z wymaganiami eksperymentu). Do oceny migracji należy użyć szalek 35 mm z siatką 500 μm. Inkubować naczynia przez noc z 2 ml 1x PLO przez 12 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli tkankowych o stężeniu 5% CO2 . Przemyć dwukrotnie 2 ml 1x PBS.
  4. Dodać 2 ml 1x fibronektyny (1 μg/ml stężenie końcowe) i inkubować naczynia przez co najmniej 12 godzin w temperaturze 37 °C w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 . Usuń fibronektynę tuż przed posianiem komórek.
    Uwaga: Naczynia pokryte fibronektyną mogą być przechowywane przez co najmniej 2 tygodnie w temperaturze 37 °C.

5. Standaryzowane rozwarstwienie i przygotowanie strefy podkomorowej kory mózgowej (SVZ)

  1. Uzyskać zarodki zarodków szczura w dniu 14.5 (E14.5, Sprague-Dawley) i myszy E13.5 (C57BL/6) przez krycie czasowe. Łącz zwierzęta w pary od 18:00 do 08:00 następnego ranka. Południe po dniu krycia uważa się za E0,5.
  2. Znieczulić ciężarne zwierzę 5% izofluranem i przepływem tlenu 0,8 l/min. Sprawdź reakcję przez ściskanie łapy za pomocą ostrych kleszczy preparacyjnych. Odetnij głowę zwierzęciu. Unikaj uduszenia CO2 , ponieważ CO2 wpływa na regenerację komórek macierzystych.
  3. Pobieranie zarodków przez cesarskie cięcie.
    1. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i zdezynfekuj sierść 70% etanolem. Za pomocą kleszczy chirurgicznych i nożyczek wykonaj nacięcie skóry w kształcie litery V o długości około 8 cm w dolnej części brzucha nad macicą. Nacinaj tylko skórę z futrem, zachowując nienaruszone ściany mięśni.
    2. Użyj świeżych kleszczy i nożyczek, aby naciąć mięśnie i ścianę mięśniową brzucha, aby dostać się do otrzewnej.
    3. Zidentyfikuj macicę w dolnej tylnej otrzewnej. Usuń macicę przez ostre oddzielenie od otaczających tkanek.
    4. Umyj macicę z zarodkami sterylnym 1x PBS i umieść w lodowatym chłodzie 1x PBS.
    5. Użyj nożyczek z cienką końcówką, aby otworzyć ściany macicy, aby uwolnić zarodek po zarodku pod mikroskopem preparacyjnym (3-krotne powiększenie, ryc. 1B). Użyj kleszczy, aby usunąć łuski zarodkowe (ryc. 1B). Trzymaj zarodki w pożywce ekspansywnej na lodzie.
    6. Sprawdź prawidłowy etap rozwoju za pomocą Atlasu rozwijającego się układu nerwowego szczura5. Prawidłowa wielkość zarodka jest pokazana na rycinie 1B.
    7. Sprawdź dalej prawidłowy wiek poprzez obecność początkowej formacji palców w kończynie przedniej szczura (FL), jak pokazano na rysunku 1A.
      Uwaga: Kończyna tylna (HL) nie wykazuje jeszcze separacji palców (ryc. 1B).
  4. W celu przeprowadzenia sekcji przenieś zarodki na niepowlekane szalki Petriego wypełnione lodowatym 1x PBS. Przeprowadzić sekcję pod mikroskopem stereoskopowym (powiększenie od 3 do 20 razy) za pomocą autoklawowanych cienkich kleszczyków.
    Uwaga: Szalki Petriego zapobiegają przyczepianiu się tkanki do powierzchni szalki, co może się zdarzyć w przypadku szalek do hodowli komórkowych pokrytych plazmą. Zaostrzone igły z drutu wolframowego lub podobne są również pomocne w niektórych etapach sekcji.
  5. Usuń głowę, skórę i czaszkę, zaczynając od skrzyżowania rozwijającego się kresomózgowia (TEL) i międzymózgowia (DI) (ryc. 1B), ciągnąc jednocześnie do przodu i do tyłu dwoma kleszczami, aby uzyskać dostęp do rozwijającej się cewy nerwowej (ryc. 1C).
  6. Zidentyfikuj granicę śródmózgowia i tyłomózgowia (MHB, grot strzałki na rysunku 1B-D), oddzielającą śródmózgowie (MES) od rombencefalonu. Przetnij rombencefalon tuż na lub poniżej MHB (ryc. 1D, trójkątna strzałka).
    Uwaga: Dodatkowa przestrzeń podskórna w MHB ułatwia usuwanie skóry bez uszkadzania cewy nerwowej.
  7. Przerwij połączenie między kresomózgowiem/międzymózgowiem u podstawy czaszki a szkieletem twarzy (ryc. 1E). W ten sposób powstaje blok zawierający kresomózgowie, międzymózgowie i śródmózgowie (TEL-DI-MES) (ryc. 1F-H).
  8. Przenieś blok TEL-DI-MES na podłoże dylatacyjne na lodzie. Przechowywać go całkowicie pokrytego podłożem ekspandacyjnym na niepowlekanej szalce Petriego. Przytrzymaj blok na śródmózgowiu za pomocą kleszczy, aby uniknąć dotykania kresomózgowia, który zawiera korowy SVZ z NSC.
  9. Powtórz kroki od 5.5 do 5.8 ze wszystkimi zarodkami (ryc. 1F-H).
  10. Przenieś jeden blok TEL-DI-MES do świeżego, lodowatego 1x PBS. Przeciąć wzdłuż przerywanej linii w przednim śródmózgowiu (ryc. 1F-H), oddzielając śródmózgowie od międzymózgowia, jak pokazano na rysunku 1I.
  11. Oddziel DI od TEL, przecinając wzdłuż linii przerywanych na rysunku 1F. Patrz izolowana kresomózgowie, na rycinie 1J.
  12. Podziel dwie półkule kresomózgowia, przecinając wzdłuż przerywanej linii na rysunku 1J. Powoduje to powstanie dwóch oddzielonych półkul, jak pokazano na rysunku 1K.
    Uwaga: Lewa półkula jest powiększona na rysunku 1L.
  13. Zidentyfikuj wypukłości zwojów przyśrodkowych (MGE, ryc. 2A; *) i wypukłości zwojów bocznych (LGE, ryc. 2A; +) widocznych przez przyszły otwór międzykomorowy.
    1. Za pomocą kleszczy lub igły wyciąć wzdłuż linii prostej na przecięciu MGE i LGE oraz kory przedniej (ant-ctx, ryc. 2B). Przetnij linię prostą przez korę, hipokamp (biodro) i splot naczyniówkowy (CP). To oddziela korę przednią, w tym opuszkę węchową (ob) od wypukłości zwojowych (GE, ryc. 2B, C).
  14. Wytnij drugą linię prostą na przecięciu wyniosłości zwoju ogonowego (CGE, ryc. 2C, D) i kory tylnej (ryc. 2C), ponownie przecinając korę, hipokamp i splot naczyniówkowy.
  15. Spłaszcz kresomózgowie. Całkowicie usuń tylny biegun i opuszkę węchową (rysunek 2D). Zidentyfikuj rąbek korowy zawierający hipokamp i splot naczyniówkowy (ryc. 2C), jak zdefiniowano wcześniej 6,7.
    Uwaga: Hipokamp ma cieńszy nabłonek nerwowy niż kora. CP zawiera czerwone naczynia.
    1. Oddziel rąbek kory mózgowej od kory, pozostawiając rozmiar kory identyczny z rozmiarem wypukłości zwojowych (ryc. 2D). Powoduje to powstanie bloku kory (tkanki docelowej) i wypukłości zwojowych (GE, ryc. 2D).
  16. Odwróć blok korowy-GE stroną komorową (wewnętrzną) do powierzchni naczynia.
    Uwaga: Zewnętrzna powierzchnia półkuli będzie zwrócona w stronę eksperymentatora (Rysunek 2E). Na zewnętrznej powierzchni znajdują się opony mózgowe zawierające naczynia krwionośne (ryc. 2E).
    1. Przypnij GE do powierzchni naczynia lewą ręką i oderwij opony mózgowe za pomocą kleszczy w prawej (dominującej) ręce (Rysunek 2F).
      Uwaga: Jest to technicznie najbardziej wymagający krok, ponieważ opony mózgowe silnie przylegają do kory. Oddzielenie opon mózgowych od kory jest ułatwione przez przecięcie całkowicie prostej linii (nie postrzępionej) w krokach 5.13.1 i 5.14.
  17. Powtórzyć kroki od 5.12 do 5.16 dla drugiej półkuli i wszystkich zarodków. Przeciąć korę wzdłuż LGE w odległości równej połowie głównej średnicy LGE (ryc. 2G, 2H). Wypreparowana kora obejmuje obszar 1,2 mm x 2,4 mm (ryc. 2H) i obejmuje SVZ/warstwę zarodkową z NSC.

6. Przygotowanie kultur eksplantatów

  1. Przeciąć korę na eksplantaty o średnicy mniejszej niż 400 μm (ryc. 2I). Użyć siatki 400 μm (rysunek uzupełniający 1) umieszczonej poniżej płytki Petriego do rozbioru w celach informacyjnych (rysunek 2H i 2I). Przenieś wszystkie eksplantaty na świeżą szalkę Petriego z lodowatym podłożem ekspandacyjnym.
  2. Usunąć fibronektynę z naczynia do hodowli tkankowej (krok 4.4). Pozostaw do wyschnięcia. Dodać 1 ml zimnego podłoża rozprężnego na środek naczynia o średnicy 35 mm o wymiarach siatki 10 mm x 10 mm (Rysunek 3). Pozwól, aby podłoże utworzyło kulistą kroplę (Rysunek 3).
  3. Włóż do 8 eksplantatorów do środka kropli. Do celów analizy migracji eksplantaty powinny być idealnie umieszczone na siatce z zachowaniem odległości co najmniej 3 mm od siebie (patrz sekcja 8).
  4. Inkubować naczynie przez około 1 godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 21%O2, 5% CO2) w celu przyłączenia eksplantatów. Pozwól eksplantatom osiąść i przyczepić się do powierzchni pokrytej fibronektyną. Nie potrząsaj naczyniem, ponieważ eksplantaty mogą się odczepić i przesunąć poza optymalny środek siatki.
  5. Po 1 godzinie inkubacji (37 °C, 21%O2, 5% CO2) napełnić naczynie do całkowitej objętości 2 ml pożywki ekspancyjnej wraz z czynnikami wzrostu lub substancjami będącymi przedmiotem zainteresowania do badania i inkubacji.
    Uwaga: Ani trawienie enzymatyczne, ani surowica ani odwirowanie nie są konieczne do przygotowania eksplantatów. Jest to optymalne dla integralności komórek.

7. Przygotowanie hodowli jednokomórkowej NSC

  1. Podłoże rozprężne i pasażujące rozgrzać w temperaturze 37 °C.
  2. Przenieść wypreparowane kawałki kory mózgowej (z kroku 5.17) do probówki o pojemności 15 ml z zimnym podłożem rozprężnym (probówka A). Odwiruj kawałki kory przez 5 minut w temperaturze 1,200 x g. Odessać supernatant. Dodaj 200 μl wstępnie podgrzanej pożywki ekspancyjnej, aby ponownie zawiesić kawałki kory.
  3. Dodać 700 μl wstępnie podgrzanego podłoża pasażującego do probówki o pojemności 15 ml z końcówką P1,000 (probówka A). Delikatnie zawiesić granulkę. Umieść końcówkę na dnie probówki o pojemności 15 ml. Delikatnie i powoli rozdziel kawałki tkanki, odsysając trzykrotnie końcówkę P1,000.
    Uwaga: Pożywka pasażowa sprzyja separacji komórek i jest wymagana, aby uniknąć stosowania enzymów.
  4. Pozostaw rurkę na 30 do 60 sekund, aby większe (cięższe) nierozdzielone kawałki osiadły na dnie. Pojedyncze zdysocjowane komórki pozostaną w supernatancie. Przenieść około 700 μl supernatantu do świeżej probówki o pojemności 15 ml (probówka B).
  5. Powtórz kroki 7.3 i 7.4, aby oddzielić większe kawałki.
  6. Powtórz kroki 7.3 i 7.4 po raz drugi, aby oddzielić większe kawałki. Przenieść cały sklarowany osad do świeżej probówki o pojemności 15 ml (probówka B).
  7. Dodać pożywkę ekspandacyjną do całkowitej objętości 5 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Oceń martwe komórki za pomocą barwienia błękitem trypanowym.
    Uwaga: Małe NSC tolerują kroki od 7,2 do 7,6 lepiej niż większe komórki. Z 10 zarodków spodziewaj się około 4 x 106 komórek z 10% martwych komórek.
  8. Do rozprężania NSC należy podać płytkę 1,5 x 106 komórek na 10 cm naczynie do hodowli tkankowych pokrytych fibronektyną w objętości 8 ml pożywki ekspansyjnej. W przypadku standardowej ekspansji dodaj 8 μl 1,000x rhFGF2. Dodawaj 8 μl rhFGF2 codziennie i zmieniaj pożywkę co drugi dzień.
    Uwaga: Kora na tym etapie rozwoju zawiera większość NSC i tylko mniejszość zróżnicowanych komórek. Zróżnicowane komórki mniejszościowe nie reagują na leczenie rhFGF2 i umierają podczas hodowli ekspansyjnej.
  9. Pasaż rozszerzył NSC na 60% zbiegu.
    1. Aby przejść przez NSC, usuń podłoże rozprężne. Szybko i trzykrotnie szybko umyć komórki 5 ml środka do pasażowania. Odczekaj 2 - 4 min. Bez Ca2+ i Mg2+ komórki powoli odrywają się od powierzchni, zaokrąglając się w górę. Sprawdź odłączenie komórek pod mikroskopem fazowym. W razie potrzeby odczekaj kolejne kilka minut, aż zaobserwuje się wizualne oderwanie od powierzchni.
      Uwaga: Pojedyncze komórki całkowicie się odłączą, ale większość komórek nadal będzie przylegać do powierzchni naczynia. Czas potrzebny do oderwania zależy od czasu trwania powłoki fibronektyny. Krótka powłoka fibronektyny (12 godzin lub mniej) powoduje szybsze odrywanie komórek. W przypadku dłuższych eksperymentów (> 1 tydzień) zaleca się powlekanie fibronektyną dłużej niż 24 godziny.
  10. Użyj pipety o pojemności 10 ml, aby delikatnie oderwać komórki od powierzchni. Zebrać 5 ml pożywki pasażującej z komórkami i przenieść ją do świeżej probówki o pojemności 15 ml. Powtórzyć z dodatkowymi 5 ml pożywki pasażowej.
  11. Oddzielić komórki w probówce o pojemności 15 ml, pipetując trzykrotnie w górę i w dół, umieszczając pipetę o pojemności 10 ml na dnie probówki. Wirować probówkę przez 15 minut w temperaturze 1 200 x g w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 2 ml pożywki ekspandercyjnej. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Użyj błękitu trypanowego do oceny martwych komórek.
    Uwaga: Po rozwinięciu do 60% konfluencji spodziewaj się 4 - 5 x 106 komórek z liczbą martwych komórek na poziomie około 10%.
  12. Talerz 8 x 105 komórek na 10 cm naczynie do dalszych przejść.

8. Ocena migracji

  1. W celu oceny migracji należy wyizolować eksplantaty zgodnie z sekcją 5. Wysiewaj eksplantaty w szalkach o siatce 35 mm. Godzinę po posianiu dodać FGF2 (rhFGF2). Umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 2 dni.
    Uwaga: Aby uzyskać optymalne mocowanie eksplantatów, unikaj przesuwania naczyń.
  2. Usunąć podłoże za pomocą końcówki o objętości 1 000 μl. Dodać 2 ml podłoża ekspandującego końcówką o objętości 1 000 μl, zaczynając od wewnętrznego okręgu (ryc. 3). Zmniejsza to napięcie powierzchniowe na eksplantatach.
  3. Dodaj czynniki wzrostu pojedynczo lub w połączeniu, zgodnie z wymaganiami eksperymentu. Użyj FGF2/BMP4/TGFβ1 jako kontroli pozytywnej. Uwaga: W tym eksperymencie dodano 2 μl FGF2 na szalkę 35 mm, 2 μl BMP4 i 4 μl TGFβ1 pojedynczo i w połączeniu (ryc. 5).
    1. Dodać dodatkowe czynniki i/lub substancje, które można przebadać. Przechowywać naczynia w nienaruszonym stanie przez 2 dni w temperaturze 37 °C.
  4. Zrób zdjęcia eksplantatów pod mikroskopem odwróconym.
    Uwaga: Żywe eksplantaty dają lepsze obrazy kontrastu fazowego niż stałe komórki. Oba mogą być używane.
  5. Do oceny migracji należy użyć oprogramowania graficznego, które umożliwia pomiary pikseli (np. Fiji8).
  6. Zmierz siatkę talerza w odległości 500 μm w pikselach i użyj jej jako wewnętrznego odniesienia.
  7. Zdefiniuj środek eksplantacji jako punkt początkowy migracji. Zmierz odległość między środkiem eksplantatu a najbardziej zewnętrzną grupą 10 komórek.
    Uwaga: Wszystkie komórki migrują odśrodkowo od eksplantatu. W badanych warunkach spontanicznie tworzą arkusz na obrzeżach (ryc. 5).

9. Ocena inwazji

  1. Przygotować 24-dołkowe płytki do hodowli tkankowej pokrytej fibronektyną zgodnie z sekcją 4 protokołu.
  2. Umieścić 300 μl ciepłej pożywki ekspansyjnej w górnej studzience komór inwazyjnych komórek. Inkubować komory przez 30 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
  3. Usuń pożywkę rozprężną z górnej studzienki i umieść komorę Boydena w powlekanej płytce 24-dołkowej.
  4. Dodać 500 μl ciepłej pożywki eksplatacyjnej z 0,5 μl rhFGF2 i 0,5 μl rhBMP4 do dolnej studzienki.
  5. Przejście NSC i liczenie zgodnie z opisem w sekcji 7. Odpowiednie są przejścia od 1 do 4.
  6. Płytka 5 x 105 komórek w objętości 300 μl ciepłej pożywki ekspandacyjnej z 0,3 μl rhFGF2 i 0,3 μl rhBMP4 w górnej studzience komory Boydena.
  7. Hodowla zasianych NSC przez 24 godziny.
  8. Dodać dodatkowe czynniki i/lub badane substancje do komory i hodować komórki przez kolejne 48 godzin.
    Uwaga: Jeśli komórki są inwazyjne, przejdą od górnej studni przez warstwę błony podstawnej do studni dolnej. Inwazyjne komórki przylgną do dna komory Boydena.
  9. Postępuj zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Użyj bawełnianych wacików (dołączonych do zestawu do testów inwazji), aby usunąć nieinwazyjne komórki w górnej studzience, czyszcząc dwukrotnie.
  10. Usunąć pożywkę z dołków i dodać do studzienek 500 μl pożywki ekspandacyjnej z barwnikiem błonowym plazmatycznym dla żywych komórek i z barwnikiem jądrowym DAPI.
  11. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C i 5% CO2,
    Uwaga: Barwniki zintegrują się odpowiednio z błoną i jądrem komórek inwazyjnych, zapewniając optymalną wizualizację8. Opcja: Pomiń barwnik błony plazmatycznej, jeśli planowana jest immunocytochemia wielobarwna.
  12. Usuń podłoże z barwnikami i przemyj dwukrotnie podłożem rozprężnym. Wizualizacja i liczenie komórek inwazyjnych za pomocą odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego, jak pokazano wcześniej,8,
    Uwaga: Niektóre komórki inwazyjne mogły oderwać się od dna komory i opaść na powierzchnię studzienki poniżej, gdzie przyklejają się do powlekanej powierzchni. Aby uzyskać pełną analizę, uwzględnij komórki na powierzchni studni.
  13. Usuń pożywkę i utrwal komórki w lodowato świeżym 4% PFA przez 10 min. Umyj 3x 1x PBS. Przeprowadź immunocytochemię na komórkach inwazyjnych, jak opisano wcześniej8-10.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Ten system modelowy EMT opiera się na standaryzowanej izolacji NSC, zarówno jako pojedyncze komórki, jak i eksplanty z określonego regionu rozwijającej się cewy nerwowej, czyli kory centralnej (Rysunki 1 i 2). Do oceny ilościowej eksplanty wysiano dokładnie w centrum naczynia hodowlanego z siatką o oczkach 500 µm (Rysunek 3). Eksplanty z kory centralnej poddano najpierw dwudniowej inkubacji z FGF2, po czym przez kolejne dwa dni hodowano j...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W pracy opisano znormalizowany system analizy EMT z wykorzystaniem NSC (podsumowany na rysunku uzupełniającym 3). Standaryzacja zapewnia odtwarzalność (tabele 1 i 2). NSC pochodzą z rozwijającej się kory mózgowej, tkanki, która normalnie nie jest poddawana EMT. Jest to korzystne dla analizy wczesnych kroków w EMT. Początkowe kroki w EMT nie mogą być odpowiednio zbadane w komórkach nowotworowych, które nagromadziły zmiany genetyczne i mogły już przyjąć cechy EMT. Co więcej, pierwotne prób...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Badanie było wspierane przez Fundację Naukową Uniwersytetu w Bazylei oraz Szwajcarską Narodową Fundację Nauki poprzez grant dla MHS and AG (SNF IZLIZ3_157230). Dziękujemy: dr Tanii Rinaldi Burkat za hojne udostępnienie infrastruktury; wszystkim członkom grupy Bettler w celu dyskusji i komentarzy. Dziękujemy Gerhardowi Dorne'owi (Leica Microsystems, Szwajcaria) za profesjonalną i kompetentną instalację kamery wideo Full HD MC170 (Leica Microsystems, Szwajcaria).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
BMP4, rhBMP4RnD 314-BP-01M
Insulina trzustka bydlęcaSigma I1882
Komora Boydena, test inwazji komórek CytoSelectpłytek 24-dołkowychCell BiolabsCBA-110
Naczynie do hodowli komórkowych z siatkąSzalka Ibidi 500 mm, 35 mm80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045Barwnik błony plazmatycznej, stosować w stosunku 1:1,000.
DAPILifeTechnologiesD1306Zapas w dawce 5 mg/ml. Użyć w skali 1:10 000. Rakotwórcze. Wymagana odpowiednia ochrona (rękawice, fartuch, gogle).
DMEM/F12 1:1 średnia butelkaGibco Invitrogen21331-020
FGF2, rhFGF2RnD Systems233-FB-01M
Fibronektyna, bydlęcaSigma F4759
Suplement Glutamax Gibco Invitrogen 35050-061
Oprogramowanie graficzne z funkcją pomiaru pikseliFijifiji.sc/Fijiwersja 2.0.0-rc-30/1.49s
HBSSMedia Sigma H9394
Ludzka apo-transferynaSigmaT1147Możliwe działanie drażniące na płuca. Unikać wdychania. Stosuj odpowiednią ochronę.
L-glutaminaGibco Invitrogen 25030-024
Nestin, Mysie przeciwciało anty NestinGenetexGTX26142Stosować w stosunku 1:100, 4% wiązania PFA, Triton X100 przy 0,1%
Olig2, Przeciwciało anty Olig2 królikaDostarczone przez Hirohide TakebayashZapasy osobisteStosować w stosunku 1:2,000, utrwalenie PFA 4%, Triton X100 w 0,1%
Penicylina/Streptomycyna/FungizoneGibco Invitrogen 15240-062
Podoplanina, mysie przeciwciało anty podoplaninyAcrisDM3614PStosować w stosunku 1:250, 4% wiązania PFA, unikać Triton X100
Poly-L-ornithineSigma P3655
PutrescineSigma P5780Działa drażniąco na skórę i oczy. Wymagana jest odpowiednia ochrona.
Selenin soduSigma S5261
Sox10, Królicze przeciwciało anty Sox10Millipore ChemiconAB5774Stosować w stosunku 1:200, 4% wiązania PFA, Triton X100 przy 0,1%
TGFb1, rhTGFb1RnD Systems240-B-010
Niepowlekane szalki PetriegoFalcon Corning351029
Systemy System

Bibliografia

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14(2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763(2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

neuronalne komórki macierzysteindukcja EMThodowla eksplantatówmigracja komóreksygnalizacja TGF Betatraktowanie BMP4sekcja korypowlekanie fibronektynąwysokoprzepustowe przesiewanie
Wolny od enzymów i surowicy model hodowli nerwowych komórek macierzystych do badań EMT, odpowiedni do odkrywania leków
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.