Kwantyfikacja krążącego mikroRNA przy użyciu chemii barwnika wiążącego DNA i kropelkowego cyfrowego PCR

Podsumowanie

Opisana jest czuła i dokładna metoda kwantyfikacji mikroRNA bez komórek przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii kropelkowej cyfrowego PCR.

Streszczenie

Krążące (bezkomórkowe) mikroRNA (miRNA) są uwalniane z komórek do krwiobiegu. Ilość specyficznych mikroRNA w krążeniu została powiązana ze stanem chorobowym i może być wykorzystana jako biomarker choroby. Niedawno opracowano czułą i dokładną metodę kwantyfikacji mikroRNA w krążeniu przy użyciu chemii opartej na barwniku i technologii cyfrowego PCR kropelkowego. W szczególności, przy użyciu starterów specyficznych dla miRNA na bazie zablokowanych kwasów nukleinowych (LNA) z zielonym fluorescencyjnym barwnikiem wiążącym DNA w kompatybilnym cyfrowym systemie PCR kropelkowym, możliwe jest uzyskanie bezwzględnej kwantyfikacji określonych miRNA. W tym miejscu opisujemy, w jaki sposób wykonanie tej techniki oceny ilości miRNA w płynach biologicznych, takich jak osocze i surowica, jest zarówno wykonalne, jak i skuteczne.

Wprowadzenie

MikroRNA (miRNA) są uwalniane do krwiobiegu przez potencjalnie wszystkie komórki organizmu, w wyniku aktywnego uwalniania lub procesów nekrotycznych i apoptotycznych. Bezkomórkowe miRNA zostały wykryte w krwiobiegu albo jako wolne, stabilne cząsteczki, albo połączone z lipoproteinami lub otoczone wewnątrz egzosomów i mikropęcherzyków ^1-3. Uważa się, że funkcjonują one jako komunikatory międzykomórkowe ⁴, a ich ilość zmienia się w przypadku raka, zaburzeń pracy serca lub chorób autoimmunologicznych ^5-7. Ich dokładna i powtarzalna kwantyfikacja stanowi podstawę do ich oceny jako biomarkerów choroby. Jednak z kilku powodów opisanych już w innym miejscu ^8,9, kwantyfikacja miRNA w surowicy lub osoczu, a także w innych płynach ustrojowych, może być bardzo trudna ^10,11. Niedawno opracowaliśmy metodę bezwzględnej kwantyfikacji krążących miRNA, opartą na starterach LNA specyficznych dla miRNA i technologii cyfrowego PCR (ddPCR) z kropelkami barwnika wiążącego DNA ¹². Metodologia ta została zastosowana do walidacji biomarkerów raka piersi ^{miRNA 13,14}.

Po podziale każdej cząsteczki miRNA z odwrotną transkrypcją wewnątrz kropli o rozmiarze nanolitra, możliwe jest policzenie liczby kopii każdego miRNA w każdej próbce, zasadniczo licząc liczbę zielonych, a więc dodatnich, fluorescencyjnych kropel. Gdy tylko dojdzie do reakcji PCR, uzyskuje się dodatnią liczbę, bez konieczności ustalania krzywej wzorcowej lub uwzględniania skuteczności PCR przy obliczaniu ilości docelowej, jak ma to miejsce w przypadku ilościowego RT-PCR (RT-qPCR). Ponadto ddPCR okazał się bardziej czuły i dokładny niż RT-qPCR w kwantyfikacji krążącego miRNA ¹⁵. W tym artykule przedstawiamy szczegółowy protokół tej metodologii, omawiając najistotniejsze kroki, a w szczególności biorąc pod uwagę próbki kliniczne surowicy i osocza.

Protokół

Izolacja mikroRNA z osocza lub surowicy

Uwaga: Przygotowanie osocza i surowicy jest istotnym krokiem w ilościowym oznaczaniu krążącego miRNA. Nie ma preferowanej procedury przygotowania osocza i surowicy. Jedyną ważną rzeczą do rozważenia jest to, że wszystkie próbki z tego samego eksperymentu muszą być przetwarzane przy użyciu dokładnie tego samego przepływu pracy. Zacznij od 200 μl surowicy lub osocza. Całkowite RNA można wyizolować z surowicy lub osocza za pomocą dostępnych na rynku zestawów.

1. Protokół izolacji całkowitego RNA (w tym miRNA)

1. Rozmrozić próbki surowicy/osocza na lodzie.
2. Dodać 1 ml odczynnika do lizy (np. QIAzolu) do 200 μl surowicy/osocza.
3. Wymieszać przez wirowanie i umieścić probówkę zawierającą homogenat na stole w temperaturze pokojowej na 5 minut.
4. Dodać 3 μl roztworu 4,16 nM syntetycznego miRNA cel-miR-39-3p z C. elegans.
5. Dodać 200 μl chloroformu. Energicznie wstrząsaj tubką przez 15 sekund. Umieść rurkę na ławce w temperaturze RT na 2 minuty.
6. Wirować przez 15 minut przy 12 000 x g w temperaturze 4 °C w celu uzyskania separacji faz: górna faza wodna zawiera RNA.
7. Przenieś fazę wodną do nowej probówki, około 700 μl, unikając przenoszenia białego materiału międzyfazowego.
8. Dodać 1 ml 100% etanolu i wymieszać przez odwrócenie.
9. Odpipetować 700 μl próbki do mini kolumny wirowej umieszczonej na probówce zbiorczej o pojemności 2 ml. Zamknij pokrywę i odwiruj przy 12 000 x g przez 15 sekund. Odrzuć przepływ.
10. Powtórz ten krok, używając pozostałej próbki.
11. Dodać 700 μl buforu RWT do mini kolumny wirowej, zamknąć pokrywę i wirować przez 15 sekund przy 12 000 x g, aby umyć kolumnę. Odrzuć przepływ.
12. Odpipetować 500 μl buforu RPE do mini kolumny wirowej. Zamknij pokrywę i wiruj przez 15 sekund przy 12 000 obr./min. Odrzuć przepływ. Powtórz ten krok ponownie.
13. Odwirować mini kolumnę wirową z pełną prędkością przez 2 minuty, aby wysuszyć membranę kolumny wirowej z resztek etanolu.
14. Przenieść mini wirującą kolumnę do nowej probówki zbiorczej o pojemności 1,5 ml i odpipetować 35 μl wody wolnej od RNaz na membranę kolumny.
15. Wirować przez 1 minutę przy 12 000 x g w celu elucji RNA.
16. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C.
    Uwaga: Ponieważ nie można dokładnie określić stężenia RNA, należy używać stałych objętości jako miary ilości wejściowej.

2. Odwrotna transkrypcja mikroRNA

1. Rozmrozić składniki mieszanki odczynników do odwrotnej transkrypcji (RT): 5x bufor reakcyjny, woda wolna od nukleaz. Wymieszaj delikatnie odwracając rurki i ułóż na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem wyjmij mieszankę enzymów z zamrażarki i umieść na lodzie. Odkręć wszystkie odczynniki.
2. Przygotować mieszaninę odczynników RT na lodzie, jak opisano w Tabeli 1. Przygotuj co najmniej 10% nadwyżki mieszanki.
3. Wymieszać reakcję przez pipetowanie, a następnie odwirować.
4. Inkubować przez 60 minut w temperaturze 42 °C.
5. Inaktywować odwrotną transkryptazę termicznie przez 5 minut w temperaturze 95 °C.
6. Natychmiast schłodzić do temperatury 4 °C.
7. Przechowywać cDNA w temperaturze -20 °C.

3. Rozcieńczenie cDNA

1. Rozcieńczyć ilość matrycy cDNA potrzebną do planowanych reakcji ddPCR w wodzie wolnej od nukleaz. Rozcieńczyć reakcję cDNA między 1:50 a 1:500 w wodzie, w zależności od docelowej obfitości miRNA. Rozcieńczony cDNA należy przechowywać w temperaturze -20 °C. Rozcieńczone cDNA okazało się stabilne przez co najmniej 3 miesiące w temperaturze -20 °C.

4. Wytwarzanie kropelek i PCR

Uwaga: Wytwarzanie kropel powinno odbywać się na 8 próbkach jednocześnie. Ze względu na wysoką odtwarzalność tej technologii nie są wymagane powtórzenia techniczne ^12,15. Próbka bez kontroli szablonu (NTC) powinna być prowadzona na każdej płytce i dla każdego innego warunku ddPCR.

1. Rozmrozić i zrównoważyć mieszankę główną (np. EvaGreen Master Mix), zestaw starterów mikroRNA i cDNA w RT.
2. Dokładnie wymieszaj Master Mix, kilkakrotnie odwracając probówkę. Odkręć wszystkie odczynniki.
3. Przygotować mieszaninę ddPCR zgodnie z opisem w Tabeli 2. Gdy przeprowadza się wiele reakcji ddPCR, należy przygotować roztwór roboczy mieszaniny ddPCR. Przygotuj co najmniej 10% nadwyżki mieszanki.
4. Po złożeniu dokładnie wymieszaj i odwiruj mieszankę ddPCR.
5. Dozuj 12 μl mieszanki ddPCR do 96-dołkowej płytki PCR lub probówek PCR.
6. Dodać 8 μl rozcieńczonej matrycy cDNA do każdej probówki/studzienki.
7. Włóż wkład generatora kropel do uchwytu.
8. Ostrożnie przenieść 20 μl każdej przygotowanej próbki do dołków na próbki (środkowy rząd) wkładu generatora kropel, unikając pęcherzyków powietrza na dnie studzienki.
9. Napełnij każdą studzienkę olejową (dolny rząd) 70 μl oleju z generatora kropelk.
10. Zaczepić uszczelkę nad uchwytem wkładu i włożyć do generatora kropel.
11. Zamknij pokrywę, aby rozpocząć wytwarzanie kropel zgodnie z protokołem producenta. Po zakończeniu wytwarzania kropel otwórz pokrywę, wyjmij jednorazową uszczelkę. Górne studzienki wkładu zawierają kropelki.
12. Powoli i płynnie odpipetować 40 μl zawartości ośmiu górnych studzienek (kropelek) do pojedynczej kolumny 96-dołkowej płytki PCR.
13. Natychmiast po przeniesieniu kropel należy uszczelnić płytkę do PCR folią, aby uniknąć parowania. Używaj przebijalnych uszczelek z płytek foliowych, które są kompatybilne z igłami w czytniku kropelkowym.
14. Rozpocznij cykl termiczny (PCR) w ciągu 30 minut od uszczelnienia płytki.
15. Postępuj zgodnie z protokołem kolarskim zgodnie z tabelą 3.

5. Odczyt kropli

1. Włącz czytnik kropel.
2. Przenieś płytkę z termocyklera do czytnika kropel.
3. Umieścić 96-dołkową płytkę do PCR zawierającą kropelki po PCR w podstawie uchwytu płytki.
4. Umieść górną część uchwytu na płytce PCR. Mocno dociśnij oba zaczepy zwalniające w dół, aby zamocować płytkę PCR w uchwycie.
5. Uruchom oprogramowanie z komputera systemowego.
   1. Kliknij przycisk Ustawienia, aby zdefiniować eksperyment (kwantyfikacja bezwzględna), a następnie kliknij przycisk Uruchom, aby rozpocząć odczyt kropli.
   2. Po zakończeniu odczytu kropelki kliknij przycisk "Analizuj", aby otworzyć i przeanalizować dane.
   3. Użyj wykresu amplitudy 2D w oprogramowaniu do analizy, aby wybrać dodatnie krople (narzędzie lasso) (rysunek 1B).
   4. Użyj karty Zdarzenia, aby sprawdzić liczbę dodatnich i całkowitych kropel. Całkowita liczba 18 000 - 21 000 kropel jest zwykle osiągana za pomocą ddPCR bez sondy.
   5. Po wybraniu dodatnich kropel wyeksportuj wartości stężenia miRNA za pomocą opcji eksportu .csv z zakładki Stężenie.

Wyniki

Bezwzględną ilość specyficznych miRNA na ml osocza lub surowicy można oznaczyć przy użyciu zielonego fluorescencyjnego barwnika wiążącego DNA oraz technologii droplet digital PCR. Rysunek 1 przedstawia proces selekcji kropel pozytywnych, który określa końcowe stężenie miRNA (kopii/µl) w reakcji amplifikacji obliczane przez oprogramowanie analityczne. Ilość każdego miRNA we krwi jest bardzo zróżnicowana, a niektóre gatunki miRNA występują częściej niż inne. Stosując cDNA r...

Dyskusja

Krążące miRNA są obecne we krwi w bardzo niskich stężeniach, a ilość RNA, którą można wyekstrahować z próbek osocza i surowicy, jest niska. Z tego powodu trudno je określić ilościowo za pomocą innych technik, takich jak sekwencjonowanie mikromacierzy i RNA. Co więcej, istnieje uogólniony brak zgody co do normalizacji danych i obecności endogennych "referencyjnych" miRNA we krwi. W tym kontekście bardzo atrakcyjna jest czuła technologia, taka jak cyfrowy PCR kropelkowy, zdolna do zliczania kopii miRNA na ml surowicy lub o...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Kolumny do całkowitego RNA, w tym miRNA, ekstrakcji z surowicy/osocza
100 nmol RNA oligo Cel-miR-39-3p	Zintegrowane technologie DNA	Sekwencja niestandardowa	: UCACCGGGUGUAAUCAGCUUG
Uniwersalny zestaw do syntezy cDNA II, 8-64 rxns	Zestaw Exiqon	203301	do odwrotnej transkrypcji mikroRNA
Zestaw starterów MicroRNA LNA PCR 	Exiqon	204000-206xxx i 2100000-21xxxxx	Startery do amplifikacji miRNA wewnątrz kropel
Generator kropel QX200	BioRad	186-4002	Przyrząd do odczytu
kropel Czytnik kropel QX200	BioRad	186-4003	Przyrząd do generowania kropel
Oprogramowanie QuantaSoft	BioRad	186-3007	Oprogramowanie do zbierania i analizy danych
Zgrzewarka do płytek PX1 PCR	BioRad	181-4000	Zgrzewarka do płyt
DG8 wkłady i uszczelki generatora kropel	BioRad	186-4008	Wkłady służące do mieszania próbki i oleju w celu wytworzenia kropel
QX200 ddPCR EvaGreen supermix	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 olej do generatora kropel do barwnika EvaGreen	BioRad	186-4005	Olej do wytwarzania kropelek