Swoistość wiązania przeciwciał dla ludzkich przeciwciał Kappa (Vκ) zawierających łańcuch lekki (IgM): kwas polisjalowy (PSA) dołączony do NCAM jako studium przypadku

Podsumowanie

Przedstawiamy protokół do identyfikacji grup białkowych zawierających antygeny dla ludzkich i mysich przeciwciał IgM ze specyficznymi łańcuchami lekkimi kappa (Vκ). Protokół ten nie ogranicza się do przeciwciał klasy IgM, ale ma zastosowanie do wszystkich izotypów immunoglobulin, które celują w swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem podczas immunoprecypitacji.

Streszczenie

Przeciwciała izotypu IgM są często zaniedbywane jako potencjalne terapie w badaniach na ludziach, zwierzęce modele chorób ludzkich, jak również środki wykrywające w standardowych technikach laboratoryjnych. W przeciwieństwie do tego, kilka ludzkich IgM wykazało skuteczność w modelach nowotworowych i modelach zaburzeń OUN, w tym stwardnienia rozsianego (SM) i stwardnienia zanikowego bocznego (ALS). Powody ich nieuwzględnienia obejmują trudności w ekspresji, oczyszczaniu i stabilizacji przeciwciał IgM, trudności z identyfikacją antygenów (niebiałkowych), niskie powinowactwo wiązania i podstawowe luki w wiedzy w badaniach nad węglowodanami i lipidami.

Ten manuskrypt używa HIgM12 jako przykładu, aby dostarczyć szczegółowy protokół wykrywania antygenów za pomocą Western blot, immunoprecypitacji i immunocytochemii. HIgM12 jest ukierunkowany na kwas polisjalny (PSA) przyłączony do cząsteczki adhezyjnej komórek nerwowych (NCAM). Wczesna pourodzona tkanka mózgowa myszy od myszy typu dzikiego (WT) i myszy z nokautem NCAM (KO) bez trzech głównych wariantów splicingu ośrodkowego układu nerwowego (OUN) NCAM180, 140 i 120 wykorzystano do oceny znaczenia NCAM w wiązaniu z HIgM12. Dalsze trawienie enzymatyczne tkanki OUN i hodowanych komórek OUN przy użyciu endoneuraminidaz doprowadziło nas do zidentyfikowania PSA jako specyficznego epitopu wiążącego dla HIgM12.

Wprowadzenie

Przeciwciała izotypu IgM wykazują duży potencjał terapeutyczny w leczeniu różnych chorób, w tym raka i zaburzeń OUN ^1-7. Grupa Vollmersa zidentyfikowała liczne przeciwciała u pacjentów z rakiem do potencjalnego wykorzystania jako biomarkery specyficzne dla nowotworu lub aktywne terapie, które są w stanie zabijać komórki nowotworowe poprzez indukowanie szlaków apoptotycznych ^4,8,9. Co ciekawe, wszystkie zidentyfikowane przeciwciała o potencjale terapeutycznym są izotypu IgM i należą do grupy "naturalnych autoprzeciwciał" (NAbs).

Podobnie, grupa Rodrigueza zidentyfikowała mysie i ludzkie przeciwciała, które stymulują remielinizację w przewlekle zdemielinizowanych zmianach rdzenia kręgowego w modelach stwardnienia rozsianego (MS). Identyczne z przeciwciałami o działaniu przeciwnowotworowym, wszystkie przeciwciała promujące remielinizację są NAbs i mają izotyp ^{IgM 1,6,7,10}. Dokładne antygeny dla większości zidentyfikowanych IgM są nadal nieokreślone, w tym ludzkie przeciwciało promujące remielinizację rHIgM22, obecnie w fazie I badań klinicznych dla pacjentów ze stwardnieniem rozsianym ¹¹. Pomimo wielokrotnych wysiłków ekspertów w dziedzinie badań nad lipidami i węglowodanami, zarówno w środowisku akademickim, jak i we współpracy z przemysłem ¹¹, próby identyfikacji antygenu rHIgM22 nie powiodły się. Niepowodzenie standardowych technik stosowanych do identyfikacji antygenów przeciwciał IgG w pracy z przeciwciałami IgM wskazuje na krytyczną potrzebę udoskonalenia metod specyficznych dla tych przeciwciał, które najprawdopodobniej są ukierunkowane na antygeny węglowodanowe lub lipidowe.

Tematem tego manuskryptu jest ludzkie przeciwciało regeneracyjne HIgM12 i eksperymentalne procedury używane do identyfikacji jego antygenu. Przeciwciało HIgM12 zidentyfikowano u pacjentów z makroglobulinemią Waldenstroma, stymuluje wzrost neurytów in vitro ^12-14 i jest ukierunkowane na kwas polisjalny (PSA) przyłączony do cząsteczki adhezyjnej komórek nerwowych (PSA-NCAM) ^15,16. HIgM12 wydłuża życie w mysim modelu ALS ¹⁷ i poprawia wyniki funkcjonalne u myszy zakażonych wirusem mysiego zapalenia mózgu i rdzenia Theilera (TMEV). W szczególności HIgM12 stymuluje spontaniczną poziomą i pionową aktywność motoryczną u myszy przewlekle zdemielinizowanych i zwiększa liczbę aksonów rdzenia kręgowego o małej i średniej średnicy osiem tygodni po pojedynczej, niskiej dawce przeciwciała wstrzykniętego dootrzewnowo ¹⁸.

Cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych (NCAM) to glikoproteina z nadrodziny immunoglobulin (Ig) wyrażona na powierzchni komórek neuronów, gleju, mięśni szkieletowych i komórek NK ^19-25. Trzy główne izoformy NCAM określane jako NCAM180, NCAM140 i NCAM120, są alternatywnymi wariantami splicingu pierwotnego transkryptu, które różnią się tylko w swojej domenie cytoplazmatycznej. W obrębie OUN NCAM jest główną cząsteczką polisjalilową (> 95%) z długimi, ujemnie naładowanymi homopolimerami kwasu sjalowego. Kwas polisjalowy o n > 10 jest określany jako PSA, ale istnieją krótsze struktury oligomeryczne, które są również istotne biologicznie. Inne białka polisylylowane ulegające ekspresji w OUN to SynCAM1 ²⁶, Neuropilina-2 (NRP-2) ^27,28 i podjednostka kanału sodowego ²⁵ (w celu zapoznania się z sekcją ²⁹).

Opisane tutaj metody pozwalają na identyfikację antygenu dla ludzkich i mysich immunoglobulin zawierających specyficzne łańcuchy lekkie kappa (Vκ) (łańcuchy lekkie VκI, VκIII lub VκIV dla przeciwciał ludzkich i łańcuchy lekkie VκI dla przeciwciał myszych) niezależnie od izotypu przeciwciała (np. IgG, IgM, IgA, IgD lub IgE). Ograniczenie to opiera się na zastosowaniu białka L agarozy do immunoprecypitacji przeciwciałami o izotypie IgM. Alternatywne strategie mogą obejmować lektyny wiążące mannozę i drugorzędowe przeciwciała IgG anty-IgM kowalencyjnie połączone z kulkami agarozy, co może rozszerzyć zastosowanie tej metody na więcej przeciwciał IgM, w tym te z łańcuchami lekkimi lambda (λ) (patrz dyskusja). Stosunek łańcuchów lekkich IgM Vκ w surowicy do łańcuchów lekkich IgM λ pochodzących od osób zdrowych wynosi 1,5:1 ³⁰.

Na podstawie metodologii chromatograficznej użytej tutaj do separacji, wzbogacenia i immunologicznego wykrywania pewnych cząsteczek ³¹, wszystkie antygeny muszą zawierać co najmniej jedną małą domenę białkową. Specyficzny epitop wiążący przeciwciało może znajdować się w domenie białkowej lub poza nią (np. w glikoproteinach, lipoproteinach). Wstępne etapy biochemiczne stosowane w celu identyfikacji specyficznego antygenu dla HIgM12, odpowiednie do zawężenia listy potencjalnych kandydatów, są najważniejszymi krokami w tej metodzie. Preparaty specyficzne dla typu komórki i charakterystyki oparte na morfologii komórek są opisane dla komórek glejowych, ale ta metodologia może być ekstrapolowana w celu uwzględnienia innych typów komórek w OUN lub poza nim.

Istnieje pilna potrzeba opracowania nowych lub zmodyfikowanych technik mających zastosowanie do rosnącej liczby przeciwciał IgM o potencjale terapeutycznym dla różnych ludzkich zaburzeń, szczególnie w tych przypadkach (większość antygenów IgM), gdzie celem przeciwciał są struktury węglowodanowe lub lipidowe.

Protokół

Protokoły i procedury dla zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health i zatwierdzone przez instytucjonalne komitety ds. opieki i użytkowania zwierząt w Klinice Mayo (numer protokołu Mayo IACUC numer #A51912).

1. Ogólne przygotowanie tkanek OUN

1. Wygeneruj myszy z niedoborem NCAM (KO) na tle C57 / Bl6 (uprzejmie dostarczone przez dr Lynn Landmesser, Case Western Reserve University, Cleveland, Ohio), heterozygotyczne myszy NCAM i rodzeństwo z miotu typu dzikiego (WT) (C57 / Bl6) poprzez krzyżowanie heterozygot. Genotypowanie myszy NCAM KO zostało opisane wcześniej ^32-34 i nie będzie wyjaśniane bardziej szczegółowo.

Uwaga: Kroki 1.2 - 1.6 są opcjonalne.

2. Przed zabiegiem chirurgicznym należy podać roztwór pentobarbitalu (Stock: 25 mg/ml; 50/100 μl pentobarbitalu we wczesnych stadiach pourodzeniowych lub dorosłych) we wstrzyknięciu dootrzewnowym (igła 27G i strzykawka 1 ml).
3. Odczekaj 2 minuty lub do momentu, gdy zwierzę osiągnie chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. W razie potrzeby w trakcie każdej operacji należy podać dodatkowe środki znieczulające, aby utrzymać chirurgiczną płaszczyznę znieczulenia. Użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić głębokość znieczulenia. Zwierzęta muszą nie reagować przed kontynuacją.
4. Wykonaj boczne nacięcie o długości 0,5 - 1 cm przez powłokę i ścianę brzucha tuż pod klatką piersiową. Ostrożnie oddziel wątrobę od przepony. Wykonaj małe nacięcie w przeponie za pomocą zakrzywionych, nożyczek. Kontynuuj nacięcie przepony na całej długości klatki piersiowej, aby odsłonić jamę opłucnową.
5. Umieść zakrzywione, nożyczki po jednej stronie klatki piersiowej, ostrożnie przesuwając płuca, i wykonaj cięcie przez klatkę piersiową aż do obojczyka. Wykonaj podobne cięcie po stronie przeciwnej. Unosząc mostek, ostrożnie przytnij tkankę łączącą go z sercem.
6. Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku zwierzęcia za pomocą nożyczek do tęczówki, aby stworzyć jak największy ujście. Powoli wstrzyknąć 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do lewej komory zwierzęcia (jasnoczerwonej; szybkość przepływu: 1 ml/min) za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 27G. Nie należy zwiększać ciśnienia/przepływu PBS podczas perfuzji, aby uniknąć zniszczenia tkanki.
7. Odetnij głowę nowonarodzonym myszom za pomocą nożyczek chirurgicznych.
8. Usuń mózg, chwytając oczodoły kleszczami i wkładając małe nożyczki do kręgosłupa. Przetnij czaszkę do przodu na poziomie ucha. Oderwij czaszkę i delikatnie umieść mózg na szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej 10 ml lodowatego podłoża do preparowania na lodzie (Tabela 1). Umieścić każdy mózg w probówce do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i natychmiast przechowywać na suchym lodzie (-79 ºC).
9. Naciąć móżdżek i pień mózgu od zamrożonych mózgów za pomocą czystej żyletki na lodzie. Pracuj szybko, aby uniknąć rozmrożenia tkanki.
10. Zważyć zamrożony mózg, umieścić w 15 ml probówce na lodzie i dodać lodowaty bufor do lizy (patrz Tabela 1) do końcowego stężenia 150 μg tkanki mózgowej na μl buforu do lizy. Powtórz dla pozostałej części mózgu. Utrzymuj mózg na lodzie przez cały czas dla kroków 1.9 - 1.11.
11. Homogenizować mózgi w buforze do lizy przez rozcieranie przez końcówkę pipety o pojemności 1 ml (10 razy), a następnie rozcieranie za pomocą strzykawki o pojemności 5 ml wyposażonej w igłę o rozmiarze 27 (10 razy). Inkubuj lizaty mózgu przez dodatkowe 30 minut na lodzie, aby umożliwić całkowitą lizę tkanek.
12. Usunąć materiał nierozpuszczalny w detergentach i lipidy mózgowe poprzez seryjne wirowanie (cztery rundy przy 19 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C). Odrzucić (białą) mielinę i szczątki komórek zawierające osad, ale zachować supernatant po każdym etapie wirowania. Podwielokrotność mózgu lizatuje i przechowuje w temperaturze -80 ºC.

2. Immunoprecypitacje z użyciem ludzkich IgM (HIgM12 i IgM kontrolujących izotypy) jako czynnika "ściągającego" z lizatów mózgowych myszy WT i NCAM KO

1. Białko L Preparat z kulek agarozy^9,35,36
   1. Przygotować 200 ml buforu IP wraz z powierzchnią spożytku (zob. tabela 1). Przygotować kolejne 200 ml tego samego buforu IP bez BSA.
   2. Na reakcję immunoprecypitacji przenieść 100 μl zawiesiny białka L Agarozy za pomocą pipety 200 μl do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Nie wirować kulek białkowych L agarozy! Dodać 1 ml buforu IP (patrz tabela 1) do każdej probówki. Wymieszaj białko L-agarozę i bufor IP ręcznie przez inwersję (pięć razy).
   3. Czterokrotnie przemyć kulki białkowe L agarozowe przez odwirowanie w wirówce stołowej (1 000 x g, 2 min, 25 ºC). Usunąć supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl, nie naruszając osadu agarozowego. Powtórzyć kroki prania 2.1.2-2.1.3 jeszcze trzy razy.
   4. Zrównoważyć białko L-agarozę w 1 ml świeżo dodanego buforu IP na wałku przez noc w temperaturze 4 °C.
2. Tworzenie kompleksu przeciwciało-antygen-agaroza L i wykrywanie antygenu w Western Blot
   1. Inkubować 30 mg zlizowanej tkanki mózgowej (~ 200 μl lizatu) w 1 ml lodowatego buforu IP z 20 μg przeciwciała IgM (HIgM12) w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml przez noc na walcu w temperaturze 4 °C.
   2. Odwirować kulki białkowe L agarozy (od kroku 2.1.4) w wirówce stołowej przez 2 minuty w temperaturze 1 000 x g, 4 °C. Odrzucić supernatant za pomocą pipety o pojemności 200 μl, nie naruszając osadu agarozy. Dodać schłodzony roztwór lizatu przeciwciało-mózg (z kroku 2.2.1) do białka L agarozy za pomocą pipety o pojemności 1 ml.
   3. Inkubować zawiesinę L agarozy przeciwciało-antygen-białko przez 2 godziny na walcu w temperaturze 4 °C. Przemyć kompleks przeciwciało-antygen przyłączony do agarozy L przez odwirowanie w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty, 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant bez naruszania osadu i dodać 1 ml lodowatego buforu IP zawierającego 0,2% BSA.
   4. Powtórz krok mycia jeszcze raz, używając lodowatego bufora IP zawierającego 0,2% BSA i dwa dodatkowe razy, używając lodowatego bufora IP bez BSA.
   5. Odwirować kompleks przeciwciało-antygen przyłączony do agarozy L w temperaturze 1 000 x g przez 2 minuty, 4 °C. Najpierw całkowicie odrzucić supernatant za pomocą pipety 200 μl, aż ~ 50 μl roztworu pozostanie na wierzchu osadu białkowego L agarozy, a następnie pipety 10 μl. Próbki należy przechowywać na lodzie.
   6. Dodać 40 μl buforu elucyjnego IP (patrz tabela 1) na 1,5 ml probówek do mikrowirówek, 6 razy przesunąć palcami probówki i ogrzewać przez 5 minut w temperaturze 95 °C. Umieścić próbki na lodzie na 2 minuty i wirować przez 30 sekund w temperaturze 13 000 x g, 4 °C.
   7. Przenieść supernatant za pomocą pipety o pojemności 10 μl (łącznie ~ 35 μl) do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml bez naruszania osadu. Potwierdzić brak kulek białkowych L agarozy, spłukując niewielką ilość eluowanej próbki na ściance rurki wewnętrznej.
      Uwaga: "Granulowane" kulki białkowe L agarozy są wyraźnie widoczne, jeśli są obecne.
   8. Jeśli obecne są kulki białkowe L agarozy, odwirowywać próbkę przez kolejne 30 sekund przy 13 000 x g i przenieść supernatant do czystej probówki. Powtarzaj krok, aż nie będą wykrywalne żadne kulki agarozy.
   9. Załadować 10 - 20 μl eluowanych próbek na studzienkę na żel poliakrylamidowy SDS w systemie buforowym Tris/Glycine/SDS (patrz Tabela 1).
      Uwaga: Do wykrywania PSA-NCAM lub izoform NCAM lub NCAM należy stosować żele gradientowe o sile 4,5% lub 4 - 20% o objętości 50 μl na studzienkę.
   10. Uruchom żele przez ~ 1 godzinę przy 100 V (1,74 V/cm²) na blacie stołu. Na tym etapie nie jest wymagane dodatkowe chłodzenie ^37,38.
   11. Przenieść białka do membrany PVDF (polifluorek winylidenu) (wielkość porów 0,45 μm) przez 2,5 godziny w chłodni przy napięciu 100 V (1,74 V/^cm2) przy użyciu buforu do transferu na zimno (5 - 10 ºC) (patrz Tabela 1).
   12. Blokować membrany 10% (w/v) suchym mlekiem w proszku w PBS-T przez 1 godzinę w temperaturze 25 ºC na wytrząsarce orbitalnej stołowej, myć membrany dwukrotnie przez 10 minut PBS-T i sondować przez noc z przeciwciałem pierwszorzędowym w 5% BSA w PBS-T na wytrząsarce orbitalnej w chłodni
   .
   13. Następnego ranka przemyć membrany jeden raz krótko nadmiarem PBS-T w temperaturze 25 ºC (w tym pokrywka i pojemnik), a następnie 3 przepłukać PBS-T przez 10 minut każde na wytrząsarce orbitalnej (80 obr./min) (wszystkie etapy płukania wykonuje się w temperaturze 25 ºC).
   14. Dodać przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało anty-ludzkie anty-IgM sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) (dla HIgM12) (rozcieńczenie 1:30 000) w 5% suchym mleku w proszku w PBS-T przez 1 godzinę w temperaturze 25 ºC na wytrząsarce orbitalnej (70 obr./min).
   15. Dokładnie umyć membrany jeden raz krótko nadmiarem PBS-T w temperaturze 25 ºC (w tym pokrywkę i pojemnik), a następnie 3 płukania PBS-T przez 10 minut każde na wytrząsarce orbitalnej (80 obr./min) (wszystkie etapy mycia wykonuje się w temperaturze 25 ºC).
   16. Zmieszać 1 ml schłodzonego, wzmocnionego chemiluminescencyjnego substratu HRP, składnika A (odczynnik o wzmocnionej luminoli) z 1 ml składnika B (odczynnik utleniający) (na mini blot) w temperaturze 25 °C.
   17. Użyj plastikowych kleszczyków, aby przenieść membrany na ręczniku papierowym, aby usunąć nadmiar płynu (trzymaj je na samych krawędziach). Osusz pojemniki ręcznikami papierowymi i włóż membrany z powrotem do pojemników (po jednej na każdą membranę). Natychmiast dodać 2 ml wstępnie zmieszanego substratu HRP o wzmocnionej chemiluminescencji (związek A + B) (etap 2.2.16) do każdej membrany i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 25 °C na wytrząsarce orbitalnej (90 obr./min). Upewnij się, że membrany są równomiernie zwilżone odczynnikiem chemiluminescencyjnym.
   18. Przenieś membrany do przezroczystego plastikowego rękawa i usuń nadmiar płynu i pęcherzyków powietrza za pomocą ręczników papierowych. Umieść membrany w plastikowej tulei w kasecie z folią i ostatecznie przyklej plastikową tuleję do kasety. Zamknij kasetę.
   19. Zabierz kasetę, film, timer i nożyczki do ciemni. Odetnij prawy górny róg od każdego filmu w celach orientacyjnych, naświetl (różne) filmy przez różne okresy czasu (10 sekund, 1 min, 10 minut) i wywołaj filmy w wywoływaczu filmowym.

3. Trawienie endouraminidazy-NF PSA dołączone do NCAM ³⁹

1. Trawić lizowaną tkankę mózgową od dnia po urodzeniu (P) 7 myszy WT i myszy P7 NCAM KO (przygotowanych z kroku 1.12) przez 2 godziny na lodzie przy użyciu endoneuraminidazy-NF (ENDO-NF), jak pokazano w Tabeli 2 ³⁹.
2. Dodać 5 μl 4x buforu do próbki Laemmli do każdej probówki (1 - 6) z kroku 3.1 (Tabela 2).
3. Załadować próbki na żel poliakryloamidowy SDS o gradiacji 4 - 20% i powtórzyć kroki od 2.2.10 do 2.2.19. Membrany sondy z HIgM12 (1 μg/ml), dostępnym w handlu mAb anty-PSA (klon 2-2B) (1 μg/ml) i przeciwciałem β-aktyny (kontrola obciążenia) (1 μg/ml) w 5% BSA w PBS-T.

4. Przygotowanie kultur OUN u szczurów i myszy

1. Przygotowanie szklanych szkiełek nakrywkowych
   1. Myć kwasem szkiełka nakrywkowe o średnicy 25 mm w 1 M HCl w temperaturze 50 - 60 ºC przez 4 - 16 godzin w dygestorium za pomocą szklanego pojemnika. Od czasu do czasu mieszaj szkiełka nakrywkowe poprzez delikatne wirowanie.
   2. Szkiełka nakrywkowe należy dokładnie umyć w wodzie destylowanej (3x). Upewnij się, że wypłukałeś kwas między ułożonymi w stos szkiełkami nakrywkowymi.
   3. Opłucz szkiełka nakrywkowe w 100% etanolu i wysusz je na Parafilm w kapturze do hodowli komórkowych. Dzień przed użyciem podgrzewać szklane szkiełka nakrywkowe przez 24 godziny w szklanym pojemniku z pokrywką w temperaturze 100 ºC w piekarniku.
   4. Umieścić szklane szkiełka nakrywkowe w naczyniu 6-dołkowym i pokryć 3 ml 40 μg/ml poli-D-lizyny w sterylnej wodzie przez 1 godzinę w temperaturze 37 ºC.
   5. Umyć dwukrotnie sterylną wodą, całkowicie wysuszyć pod kapturem do hodowli komórkowych i zastosować światło UV przez 20 minut.
2. Przygotowanie plastiku do hodowli tkankowych dla komórek OUN
   1. Szalki do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm lub kolby do hodowli tkankowych o średnicy 75^cm2 należy pokryć odpowiednio 3 ml lub 10 ml 40 μg/ml poli-D-lizyny w sterylnej wodzie przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
   2. Umyć dwukrotnie wodą, całkowicie wysuszyć pod kapturem do hodowli komórkowych i stosować światło UV przez 20 minut.
3. Szczur mieszany Izolacja gleju ⁴⁰
   1. Znieczulenie nowonarodzonych szczurów w zatwierdzonej przez IACUC komorze eutanazji gryzoni z zasilaniem gazem CO₂ (w pełni zautomatyzowane). Użyj metody reakcji na uszczypnięcie palca, aby określić brak reakcji zwierzęcia. Odetnij głowę nowonarodzonemu szczurowi Sprague Dawley (P0P1) (6 - 10 młodych na raz).
   2. Usuń mózg, chwytając oczodoły kleszczami i wkładając małe nożyczki do kręgosłupa. Przetnij czaszkę do przodu na poziomie ucha. Oderwij czaszkę i delikatnie umieść mózg na szalce Petriego o średnicy 60 mm, wypełnionej 10 ml lodowatego podłoża do preparowania na lodzie (patrz Tabela 1).
   3. Powtórz dla pozostałych szczeniąt szczurów (6 - 10 szczeniąt). Utrzymuj tkankę na lodzie dla etapów 4.3.2 - 4.3.7.
   4. Podziel mózg wzdłuż linii środkowej na dwie półkule mózgowe, a następnie odetnij opuszki węchowe, zwoje podstawy poniżej kory mózgowej i hipokamp za pomocą kleszczy Dumonta. Umieść izolowaną korę mózgową na czystej szalce Petriego zawierającej podłoże preparacyjne na lodzie.
   5. Weźmy jedną korę mózgową. Usuń opony mózgowe kleszczami z cienkimi końcówkami pod mikroskopem preparacyjnym.
   6. Powtórz z pozostałą korą. Umieść wszystkie kory mózgowe bez opon mózgowych na jednej czystej szalce Petriego na lodzie.
   7. Połącz półkule korowe wszystkich szczeniąt na szalce Petriego o średnicy 60 mm i użyj sterylnej żyletki, aby pokroić tkankę mózgową na 1 mm zmielone kawałki.
   8. Przenieść zmieloną tkankę mózgową za pomocą pipety o pojemności 10 ml do sterylnej, niepowlekanej szklanej kolby o pojemności 500 ml i dodać 10 ml lodowatej pożywki preparacyjnej na mózg szczura. Delikatnie zamieszać kolbą, dodając 1 ml roztworu trypsyny w HBSS (Hank's Balanced Salt Solution) (5 mg/ml trypsyny) do 9 ml HBSS na mózg szczura. Dodać 2% całkowitej objętości w roztworze DNazy I (1 mg/ml) i 2% całkowitej objętości w roztworze_MgSO4 (3,82%_MgSO4 w HBSS (w/v)) do zawiesiny tkanki mózgowej i delikatnie zawirować.
   9. Trypsynizować tkankę pod delikatnym potrząsaniem na wytrząsarce rotacyjnej przez 30 minut w temperaturze 37 ºC. Upewnij się, że kawałki tkanki unoszą się na tym etapie i nie osadzają się na dnie. W razie potrzeby zwiększ prędkość obrotową.
   10. Dodać płodową surowicę bydlęcą (FBS) do końcowego stężenia 10% (v/v) i wymieszać, obracając kolbę 10 razy przez 10 sekund. Schłodzić zawiesinę tkankową w lodowatej wodzie przez 15 minut. Delikatnie obracać kolbę pięć razy co sekundę
   .
   11. Delikatnie przenieść zawiesinę tkankową do sterylnych probówek o pojemności 50 ml za pomocą pipet o pojemności 25 ml lub 50 ml i odwirować przez 5 minut w temperaturze 200 x g, 4 °C.
   12. Odrzucić supernatant i delikatnie ponownie zawiesić strawioną tkankę OUN w 15 ml lodowatego podłoża preparacyjnego uzupełnionego 5 ml płodowej surowicy bydlęcej, 0,4 ml roztworu_MgSO4 (3,82%_MgSO4 w HBSS) i 1,6 ml DNazy I (1 mg/ml).
   13. Podziel zawiesinę tkankową równomiernie na dwie sterylne probówki o pojemności 15 ml (~ 10 ml każda) i powoli rozcieraj za pomocą pipety 10 ml (10 razy), aż zawiesina stanie się mętna/mleczna. Utrzymuj zawieszone komórki na lodzie podczas przetwarzania następnej probówki. Odczekaj 3 minuty, aż pozostałe strawione tkanki OUN opadną na dno probówki. Przenieść supernatant do czystej probówki o pojemności 50 ml bez naruszania frakcji osadu.
   14. Opcjonalnie przepuścić mętne supernatanty przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów i połączyć powstałą zawiesinę jednokomórkową w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml na lodzie.
   15. Wirować zawiesinę komórkową przez 5 minut w temperaturze 200 x g, 4 ºC.
   16. Delikatnie usunąć sklarowany osad za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aż ~ 2 ml pożywki preparacyjnej pozostaną na wierzchu osadu komórkowego.
   17. Granulki komórek do przesuwania palcem w probówkach o pojemności 50 ml (~ 10 razy). Powoli dodawać 5 ml ciepłej pożywki wzrostowej (patrz Tabela 1) do zawiesiny komórek, delikatnie obracając ręcznie probówkę.
   18. Opcjonalnie powtórzyć krok DNazy 4.3.12 przez dodatkowe 10 minut na lodzie ze świeżym roztworem DNazy I i roztworem MgSO₄ w przypadku widocznych skupisk tkanek lub grudek DNA. Obracaj rurkę ręcznie 5 razy co sekundę min.
   19. Umieść 50 000 komórek na szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm w kałuży 400 μl pożywki wzrostowej w 6-dołkowym naczyniu i pozwól komórkom przyczepić się na 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO₂, 37 ºC).
   20. W przypadku zlewania się (w ciągu 24 - 48 godzin po posiewie) 60 mm szalek do hodowli komórkowych i 75 cm² kolb do hodowli tkankowych, należy podać 500 000 komórek (szalka 60 mm) lub 2 miliony komórek (kolby 75 cm²).
   21. Delikatnie dodać 2 ml (na studzienkę, 25 mm szklane szkiełka nakrywkowe w naczyniu 6-dołkowym), 3 ml (szalki 60 mm) lub 10 ml (75 cm² kolby) ciepłej pożywki do każdej studzienki. Inkubuj komórki przez noc i całkowicie zmień podłoże następnego ranka. Następnie zmieniaj podłoże co drugi dzień (dzień 3, dzień 5, dzień 7 itd.).
       Uwaga: Mieszane kultury gleju szczurów są gotowe do użycia do immunocytochemii lub biochemii 24 - 48 godzin po posiewie.
4. Mysie mieszane kultury glejowe
   1. Identycznie jak w przypadku sekcji mózgów noworodków szczurów opisanej w sekcjach 4.3.1 do 4.3.6, należy odciąć głowę noworodkom z P0 WT i NCAM KO na tle C57/Bl6, usunąć mózgi i umieścić je w lodowatym pożywce preparacyjnej (patrz Tabela 1). Utrzymuj chusteczkę na lodzie przez cały czas.
   2. Podziel mózg wzdłuż linii środkowej na dwie półkule mózgowe, a następnie odetnij opuszki węchowe, zwoje podstawy poniżej kory mózgowej i hipokamp za pomocą kleszczy Dumonta. Umieść izolowaną korę mózgową na czystej szalce Petriego zawierającej HBSS na lodzie.
   3. Weźmy jedną korę mózgową. Usuń opony mózgowe kleszczami z cienkimi końcówkami pod mikroskopem preparacyjnym. Powtórz z pozostałą korą. Umieść wszystkie kory mózgowe bez opon mózgowych na jednej czystej szalce Petriego na lodzie.
   4. Przenieś półkule korowe z pipetą o pojemności 1 ml od każdej myszy do oddzielnych, sterylnych probówek o pojemności 15 ml. Dodaj 1,2 ml lodowatego podłoża preparacyjnego do każdego mózgu i mechanicznie rozerwij tkankę mózgową, pipetując ją 2 razy w górę iw dół za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml.
   5. Dodaj 150 μl roztworu papainy (10 mg/ml w PBS), 100 μl roztworu DNazy I (1 mg/ml w HBSS) i 50 μl_MgSO4 (3,82% w HBSS) do każdego mózgu i wymieszaj, przesuwając palcem.
   6. Inkubować zawiesinę mózgu przez 30 minut w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej i mieszać zawiesiny mózgowe co dwie minuty, przesuwając palcem. Dodać 1 ml FBS na probówkę, wymieszać i schłodzić zawiesinę tkankową przez 10 minut na lodzie.
   7. Wirować tkankę mózgową przez 4 minuty w temperaturze 200 x g, 4 ºC i ponownie zawiesić osad tkankowy w 1 ml lodowatego buforu preparacyjnego uzupełnionego 70 μl roztworu DNazy I (1 mg/ml w HBSS) i 30 μl roztworu_MgSO4 (3,82% w HBSS).
   8. Tkankę mózgową należy rozcierać za pomocą końcówki pipety o pojemności 1 ml pokrytej FBS (~ 5 razy), aż supernatant stanie się mętny. Przepuścić supernatant przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów i przenieść do czystej probówki na lodzie.
   9. Mieszany osad komórek glejowych przez wirowanie przez 5 minut w temperaturze 200 x g, 4 ºC. Odsysać supernatant do momentu, aż ~ 100 μl pożywki pozostanie na wierzchu osadu komórkowego. Ponownie zawiesić osad komórkowy, przesuwając palcem (~ 5 razy) i dodać 1 ml ciepłej pożywki dla myszy (patrz Tabela 1).
   10. Opcjonalnie rozpuść widoczne skupiska komórek i zlizowane komórki/wytrącone DNA, delikatnie pipetując zawiesinę komórkową w górę iw dół (pięć razy).
   11. Płytki mysich mieszanych komórek glejowych na szkiełkach nakrywkowych pokrytych PDL lub szalkach o średnicy 60 mm, jak opisano w krokach 4.3.19 - 4.3.21. Umyj komórki następnego ranka ciepłym podłożem dla myszy, a następnie co drugi dzień. Mysi mieszany glej jest gotowy do użycia do immunocytochemii 48 - 72 godziny po posiewie.
5. Izolacja mikrogleju szczurów
   1. Hodowla mieszanego gleju szczura w 75 cm² kolbach do hodowli tkankowych w pożywce wzrostowej (patrz Tabela 1) przez 10 dni. Strząsnąć klastry komórek mikrogleju z mieszanych kultur glejowych na wytrząsarce rotacyjnej wewnątrz inkubatora do hodowli komórkowych (5% CO₂, 37 ºC) przy 140 obr./min przez 1 godzinę.
   2. Zdjąć supernatant zawierający mikroglej z mieszanych kultur glejowych, przepuścić go przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów i przechowywać zawiesinę komórek w sterylnych probówkach o pojemności 50 ml.
      Uwaga: Kultury mikrogleju są zazwyczaj > 95% czyste po tym etapie z niewielką ilością zanieczyszczających OPC i bardzo małą liczbą astrocytów.
   3. Opcjonalnie należy zastąpić pożywkę wzrostową w mieszanych kulturach gleju w celu przeprowadzenia przyszłych prób mikrogleju. Zazwyczaj wykonuje się wiele prób mikrogleju (raz w tygodniu) z mieszanych kultur glejowych.
   4. Fakultatywnie, w celu uzyskania wyższej czystości 95% należy rozmieścić na płytce 10 ml supernatantu zawierającego mikroglej (etap 4.5.2) na 100 mm szalki Petriego i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Tylko mikroglej przyczepia się do szalek Petriego, podczas gdy astrocyty i OPC pozostają w supernatancie.
   5. Delikatnie potrząśnij szalkami Petriego zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (po pięć razy każda) w kapturze do hodowli komórkowych. Całkowicie odessać pożywkę do hodowli komórkowej i zastąpić ją 10 ml pożywki wzrostowej. Powstałe w ten sposób kultury mikrogleju są > czystości w 98%.
   6. Hodowla mikrogleju przez okres do 7 dni w DMEM uzupełniona 1% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny.
6. Izolacja OPC szczura/oligodendrocytów
   1. Aby uzyskać wysoce wzbogacone kultury OPC, należy najpierw strząsnąć komórki mikrogleju z 10-dniowych mieszanych kultur glejowych wyhodowanych w kolbach o długości 75^cm2 na wytrząsarce rotacyjnej w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO₂, 37 ºC) przy 140 obr./min przez 1 godzinę. Odrzucić supernatant zawierający tylko mikroglej lub użyć do eksperymentów specyficznych dla mikrogleju (patrz krok 5.5).
   2. Zastąp supernatant zawierający mikroglej 10 ml pożywki wzrostowej i strząsaj mieszane kultury glejowe przez kolejne 18 godzin na wytrząsarce rotacyjnej z prędkością 200 obr./min (5% CO₂, 37 °C).
   3. Zebrać supernatant zawierający mikroglej i OPC z mieszanych kultur gleju i przepuścić przez sitko do komórek o średnicy 40 mikronów. Zawiesinę komórkową należy zebrać do sterylnych probówek o pojemności 50 ml.
   4. Opcjonalnie należy wymienić pożywkę wzrostową na mieszane kultury gleju na przyszłe otrząsi OPC.
      Uwaga: OPC nadal rozprzestrzeniają się w warstwach zasilających astrocyty i mogą być strząsane po raz drugi i trzeci (raz w tygodniu), aczkolwiek z niższą wydajnością.
   5. Umieścić 10 ml supernatantu zawierającego mikroglej i OPC na 100 mm szalkach Petriego i inkubować w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Mikroglej przyłączy się do szalek Petriego, podczas gdy OPC i astrocyty pozostaną w supernatancie.
   6. Delikatnie potrząśnij szalkami Petriego zgodnie z ruchem wskazówek zegara i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara (po 5 razy każda) w kapturze do hodowli komórkowych. Z inkubatora do hodowli komórkowych należy wyjmować tylko kilka szalek Petriego na raz (mikroglej zacznie się odklejać od szalek Petriego po energicznym wstrząśnięciu w chłodniejszym podłożu).
   7. Zebrać i połączyć supernatant zawierający OPC w probówkach o pojemności 50 ml. Opcjonalnie dodać pożywkę hodowlaną do szalek Petriego w celu wykorzystania w eksperymentach specyficznych dla mikrogleju.
   8. Opcjonalnie, w celu dalszego zwiększenia czystości kultur OPC, należy powtórzyć kroki 5.6.5 i 5.6.6 jednokrotnie ze świeżymi szalkami Petriego, aby zmniejszyć zasięg mikrogleju w preparatach OPC.
   9. Odwirowywać wzbogacony supernatant zawierający OPC w wirówce przez 5 minut w temperaturze 250 x g, 4 °C. Delikatnie zassać supernatant bez naruszania osadu komórkowego. Pozostawić 3 ml supernatantu na wierzchu osadu i rozpocząć ponowne zawieszanie OPC, przesuwając palcem (10 razy).
   10. Delikatnie rozcierać klastry komórek OPC za pomocą pipety o pojemności 10 ml (5 - 10 razy).
   11. Policz komórki i płytkę 50 000 OPC na szklane szkiełko nakrywkowe o średnicy 25 mm (pokryte PDL) w kałuży 400 μl pożywki wzrostowej w naczyniu 6-dołkowym i pozwól komórkom przyczepić się na 30 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych (5% CO₂, 37 ºC). Delikatnie dodać 2 ml ciepłej pożywki do proliferacji (patrz Tabela 1) do każdej studzienki. W przypadku powlekanych PDL naczyń do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm, należy umieścić 1 - 1,5 miliona OPC w 3 ml pożywki proliferacyjnej.
   12. Ostrożnie wymień pożywkę proliferacyjną zawierającą FBS na świeżą pożywkę proliferacyjną 3 godziny po posianiu OPC (upewnij się, że OPC są prawidłowo podłączone i nie przemieszczają się podczas wymiany pożywki). Wymieniaj medium co drugi dzień.
       Uwaga: Szczurze hodowle OPC przygotowane przy użyciu tego protokołu są zazwyczaj czyste w 90%, a głównym typem komórek zanieczyszczających jest mikroglej, a następnie astrocyty.

5. Immunocytochemia z wykorzystaniem HIgM12 w pierwotnych komórkach glejowych

1. Immunofluorescencja potrójnego znakowania przy użyciu HIgM12, mAb anty-PSA i markerów specyficznych dla typu komórki w pierwotnych komórkach glejowych myszy WT i NCAM KO
   1. W warunkach żywych komórek oznacz 60% zlewającymi się mieszanymi mieszanymi mieszanymi kulturami gleju myszy z myszy WT i NCAM KO hodowanych na powlekanych PDL szklanych szkiełkach nakrywkowych o średnicy 25 mm z HIgM12 (10 μg / ml) i anty-PSA mAb (klon 2-2B) (10 μg / ml) w PBS uzupełnionym 10% FBS w 4 ºC przez 30 min.
   2. Umyj komórki trzy razy przez 20 sekund za pomocą lodowatego PBS uzupełnionego 10% FBS i utrwal 4% paraformaldehydem w PBS, pH 7,4 przez 15 minut w temperaturze 25 ºC.
   3. Przemyć utrwalone komórki dwa razy przez 1 minutę każdy PBS uzupełnionym 10% FBS i przeniknąć komórki 0,1% Triton-X100 w PBS, pH 7,4 przez 2 minuty w temperaturze 25 ºC. Umyć komórki dwukrotnie przez 1 minutę i oznaczyć markerami glejowymi GFAP (astrocyty) lub IBA-1 (mikroglej) (1 μg/ml) w PBS uzupełnionym 10% FBS przez noc w temperaturze 4 ºC w chłodni.
   4. Postępuj zgodnie ze standardowymi warunkami immunofluorescencji, w tym pożywką montażową zawierającą DAPI ³¹,
      Uwaga: Zdecydowanie zaleca się stosowanie znakowanych fluorescencyjnie fragmentów Fab₂ jako przeciwciał drugorzędowych dla ludzkich (HIgM12) i mysich (mAb anty-PSA, klon 2 - 2B) IgM.
   5. Rób zdjęcia fluorescencyjne w powiększeniu 60x lub 100x. Użyj tych samych ustawień instrumentu dla wszystkich obrazów i przetwarzaj obrazy identycznie.
2. Znakowanie immunofluorescencyjne komórek glejowych WT traktowanych ENDO-NF przy użyciu HIgM12 jako przeciwciała pierwszorzędowego
   1. Hodowla myszy WT mieszany glej hodowany przez 3 dni w Neurobasal A uzupełniony 10% FBS i suplementem B27 (1:50) na szkiełkach nakrywkowych o średnicy 25 mm pokrytych PDL. Dodać ENDO-NF (30 μg/ml) do 1 ml pożywki hodowlanej i inkubować przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych (37 °C, 5% CO₂ ).
   2. Znakowane komórki żyją na zimno za pomocą HIgM12 i wewnętrznego markera astrocytarnego GFAP po utrwaleniu i przepuszczalności, jak opisano w krokach 5.1.1 do 5.1.5. Rób zdjęcia fluorescencyjne w powiększeniu 60x lub 100x. Używaj tych samych ustawień instrumentu dla wszystkich obrazów i przetwarzaj je identycznie.

Wyniki

Ta sekcja ilustruje przykłady wyników, które można uzyskać, badając ludzkie antygeny PSA specyficzne dla IgM w OUN. Przedstawiono zastosowanie ludzkich przeciwciał IgM zawierających specyficzne łańcuchy lekkie Vκ w warunkach biochemicznych i za pomocą immunocytochemii fluorescencyjnej

.

HIgM12 immunoprecyzuje swój antygen z lizatów mózgowych mózgu i działa jako czynnik wykrywający (przeciwciało pierwotne) w zachodnich plamach. Ani przeciwciało kontrolne izotypu, ani kulki L agarozy nie wytrącają immunologicznie podobnego antygenu, co świadczy o swoistości ściągania w dół (ryc. 1). Western blot przy użyciu lizatów OUN z myszy WT i NCAM KO wykazują specyficzność wiązania HIgM12 z NCAM zawierającym PSA (Figura 2A). Enzymatyczne trawienie tkanki OUN od myszy WT przy użyciu ENDO-NF identyfikuje PSA przyłączone do NCAM jako specyficzny epitop wiążący dla HIgM12 (Figura 2B). Stosując metodę opisaną w niniejszym dokumencie, uzyskuje się IBA-1-dodatnie hodowle mikrogleju szczurów o wysokiej czystości (ryc. 3). Dostępne w handlu przeciwciało anty-PSA (klon 2-2B) nie znakuje powierzchni komórek ani wewnętrznych pul PSA w utrwalonych i przepuszczalnych komórkach mikrogleju IBA-1-dodatnich za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Zgodnie z wcześniej opublikowaną literaturą, która donosi o braku ekspresji PSA-NCAM na powierzchni komórki w mikrogleju ^16,41 HIgM12 nie znakuje antygenów powierzchniowych komórek w oczyszczonym mikrogleju szczurów. Co ciekawe, znakowanie HIgM12 utrwalonego i przepuszczalnego mikrogleju powoduje wewnątrzkomórkowy, okołojądrowy wzór, który nie jest ograniczony do określonych organelli (Figura 3). Wyniki są sprzeczne z wynikami uzyskanymi przy użyciu przeciwciała anty-PSA IgG (klon 735) ²⁶, które jest ukierunkowane na PSA-SynCAM w mikrogleju na poziomie Golgiego ⁴¹.

W przeciwieństwie do mikrogleju, HIgM12 i A2B5 atakują antygeny powierzchniowe komórek w wysoko wzbogaconych szczurzych hodowlach OPC w warunkach żywych komórek (Rysunek 4). Kultury OPC zawierają ~ 5% zanieczyszczających komórek mikrogleju. Rycina 5 ilustruje praktycznie identyczny wzór barwienia powierzchni komórki między HIgM12 a anty-PSA mAb (klon 2-2B) w astrocytach GFAP-dodatnich (Figura 5A). Znakowanie immunofluorescencyjne astrocytów WT trawionych przez ENDO-NF w porównaniu z astrocytami WT traktowanymi buforem przy użyciu HIgM12 wykazuje obecność astrocytowego PSA (Figura 5B). Obecność astrocytów PSA-dodatnich in vivo nie została jeszcze potwierdzona.

Ryc. 1: HIgM12 działa jako czynnik "ściągający" w immunoprecypitacjach. Immunoprecypitacje z całkowitego lizatu mózgu trzymiesięcznych myszy przy użyciu HIgM12, ludzkiej kontroli izotypu HIgM126 lub kulek L agarozy tylko jako środków "ściągających". Elucjowane białka prowadzono w Western blot z błonami badanymi pod kątem HIgM12. Masy cząsteczkowe eluowanych białek z kulek pokrytych HIgM12 mieściły się w zakresie 160 - 200 kDa oprócz łańcucha ciężkiego IgMs (~ 65 - 73 kDa). Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie J. Neurochem. ¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: HIgM12 celuje w ugrupowanie kwasu polisjalowego (PSA) na NCAM. Homogenaty mózgu myszy z całkowitym KO P7, P13, P16 i P27 NCAM i heterozygotycznych członków miotu przeprowadzono w Western blot z błonami sondowanymi pod kątem HIgM12, PSA i β-aktyny jako kontroli obciążenia. Ur. 10 μg lizatu mózgu dorosłej myszy WT w 1% NP40 w PBS, pH 6,5 traktowano endoneuraminidazą N (ENDO-N) (egzo)neuraminidazą ze specyficznością polimerową kwasu polisjalowego α2-3 (Sialidaza) lub PBS przez noc w temperaturze 37 ºC, przebiegano jako dublety w Western blot i badano pod kątem HIgM12, PSA i β-aktyny jako kontroli obciążenia. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie J. Neurochem. ¹⁵. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Brak PSA w mikrogleju szczurów jest odzwierciedlony przez brak oznakowania HIgM12. Mikroglej szczurów hodowano przez 48 godzin na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną i znakowano żywym na lodzie HIgM12 lub po utrwaleniu HIgM12 lub anty-PSA mAb (klon 2-2B). Komórki zostały potrójnie znakowane markerem mikrogleju IBA-1 (zielony), HIgM12/PSA (czerwony) i DAPI (niebieski). Obrazy pokazują brak wiązania powierzchni komórek mikrogleju za pomocą HIgM12 (górny rząd) i brak wiązania anty-PSA (klon 2-2B) z powierzchnią komórki i wewnętrznymi magazynami w pierwotnym mikrogleju szczurów (dolny rząd). Opierając się na morfologii dwubiegunowej i braku barwienia IBA-1, zasugerowano, że mała komórka PSA-dodatnia (dolny rząd) jest OPC. W komórkach utrwalonych barwienie HIgM12 spowodowało punktowy, okołojądrowy wzór, który nie był ograniczony do określonych organelli i był uważany za niespecyficzne wiązanie (środkowy rząd). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: HIgM12 celuje w powierzchnię komórki PSA-NCAM na szczurzych OPC. Szczurze OPC i mikroglej hodowano przez 4 dni w pożywce proliferacyjnej na szkiełkach nakrywkowych pokrytych poli-D-lizyną i potrójnie znakowano żywym na lodzie za pomocą HIgM12 lub A2B5 (zielony), wewnętrznego markera makrofagów/monocytów CD68 (klon ED-1) (czerwony) i DAPI (niebieski). Obrazy pokazują populacje komórek głównie dodatnie dla markera OPC A2B5 (górny rząd) i HIgM12 (dolny rząd) z niewielką liczbą CD68-dodatniego mikrogleju (~ 5%). Dodano kontrast fazowy i obrazy DAPI, aby ujawnić integralność komórek i liczbę komórek dla każdej populacji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: HIgM12 i anty-PSA mAb znakują jednocześnie subpopulację astrocytów w mieszanym gleju myszy. Mysie mieszane komórki glejowe od zwierząt WT i NCAM total KO zawierających astrocyty, komórki linii oligodendrocytów i mikrogleju hodowano przez 3 dni i znakowano żywym na lodzie HIgM12 (zielony), anty-PSA mAb (klon 2-2B) (czerwony), a następnie marker astrocytarny GFAP (fioletowy) i DAPI (niebieski). HIgM12 i anty-PSA ujawniają praktycznie identyczny wzór barwienia na astrocytach WT GFAP-dodatnich, ale nie wiążą się z hodowanymi astrocytami myszy NCAM KO. Rysunek ten został zmodyfikowany na podstawie J. Neurochem. ¹⁵. B. Mieszany glej hodowano identycznie, jak opisano w punkcie A. i leczono przez noc endoneuraminidazą-NF (uprzejmie dostarczoną przez dr Martinę Muehlenhoff) lub kontrolą PBS. Komórki znakowano żywym na lodzie HIgM12 (zielonym), a następnie barwiono pod kątem wewnętrznych markerów GFAP (czerwony) i DAPI (niebieski). HIgM12 celuje w antygeny powierzchniowe komórek w mieszanych kulturach glejowych traktowanych PBS, ale nie w mieszanych glejach traktowanych endoneuraminidazą-NF. Rysunek ten został zmodyfikowany w stosunku do JNSCI¹⁶. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wszystkie obrazy zostały wykonane przy 60-krotnym powiększeniu przy użyciu tych samych ustawień instrumentu i przetworzone identycznie.

Tabela 1: Receptury i roztworów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

	Tkanka OUN	ENDO-NF/PBS	Bufor do lizy	Całkowita objętość
1. Mysz WT	67 μg (0,45 μl)	2 μl (12 μg) ENDO-NF	7,55 μl	10 μl
2. Mysz WT	67 μg (0,45 μl)	2 μl PBS	7,55 μl	10 μl
3. Mysz WT	67 μg (0,45 μl)	brak PBS lub ENDO-NF	9,55 μl	10 μl
4. Mysz NCAM KO	67 μg (0,45 μl)	2 μl (12 μg) ENDO-NF	7,55 μl	10 μl
5. Mysz NCAM KO	67 μg (0,45 μl)	2 μl PBS	7,55 μl	10 μl
6. Mysz NCAM KO	67 μg (0,45 μl)	brak PBS lub ENDO-NF	9,55 μl	10 μl

Tabela 2: Trawienie ENDO-NF tkanki OUN myszy P7 WT i NCAM KO.

Dyskusja

Ludzkie naturalne autoprzeciwciała IgM są atrakcyjnymi kandydatami do immunoterapii i wykazały potencjał terapeutyczny w leczeniu różnych chorób, w tym nowotworów i zaburzeń OUN ^1-7. Korzystne jest to, że przeciwciała te nie wywołają odpowiedzi immunologicznej, w której wytwarzanie przeciwciał neutralizujących znacznie zmniejsza skuteczną dawkę terapeutyczną i skuteczność. Co ważne, wszystkie przeciwciała o potencjale terapeutycznym są izotypu IgM i należą do repertuaru NAb ^{3-5,8,9,37,40,42-45}. Główną przeszkodą w potencjalnym klinicznym zastosowaniu przeciwciał IgM jest identyfikacja ich antygenów, które w wielu przypadkach są nieokreślone. Standardowe techniki stosowane w przypadku przeciwciał IgG często nie mają zastosowania do identyfikacji antygenu IgM.

Protokół ten opisuje identyfikację PSA-NCAM jako antygenu regeneracyjnego ludzkiego przeciwciała IgM HIgM12, skutecznego w zwierzęcych modelach SM i ALS ^15-18. Zastosowana metodologia ma zasadnicze zastosowanie do wszystkich przeciwciał ludzkich ze specyficznymi łańcuchami lekkimi Vκ VκI, VκIII i VκIV oraz przeciwciał mysich z łańcuchami lekkimi VκI, niezależnie od izotypu przeciwciała.

Najważniejszym krokiem w tym protokole jest zastosowanie przeciwciał IgM w zastosowaniach chromatografii powinowactwa. Mówiąc dokładniej, skuteczne przeciwciała są niezbędne do działania jako czynniki ściągające w immunoprecypitacji w celu wyizolowania lub wzbogacenia antygenu ze złożonych lizatów kultur tkankowych lub komórkowych. Wzbogacone frakcje antygenu można porównać z immunoprecypitacjami z przeciwciał kontrolnych izotypu, a następnie przeanalizować pod kątem różnic za pomocą spektrometrii mas. Jednym z podstawowych wymagań lub ograniczeń tego etapu jest obecność prawidłowego przeciwciała Vκ łańcucha lekkiego i gospodarza (człowieka, myszy), aby umożliwić wiązanie przeciwciała z białkiem L-agarozy. Zastosowanie białka wiążącego mannan związanego z agarozą (zwanego również lektyną wiążącą mannozę) zamiast białka L agarozy jest potencjalną alternatywą dla immunoprecypitatu IgM bez specyficznych łańcuchów lekkich Vκ. Jednak, jak stwierdzili Arnold i wsp. ³⁵, przeciwciała IgM związane z antygenem nie wiążą się z białkiem wiążącym mannan, ponieważ docelowy glikan wydaje się być niedostępny, gdy IgM zwiąże się ze swoim antygenem. Na podstawie tych ustaleń białko wiążące mannan nie może być stosowane jako matryca wiążąca do immunoprecypitacji cząsteczek IgM obciążonych antygenem ³⁵. Innymi potencjalnymi alternatywami może być zastosowanie wtórnych przeciwciał anty-IgM IgG związanych z agarozą ^46,47 lub zastosowanie aktywowanych powierzchniowo kulek magnetycznych ⁴⁸. Przeciwciała IgG skierowane przeciwko IgM mogą być chemicznie sieciowane z agarozą A lub agarozą G w celu zmniejszenia zakresu eluowanego przeciwciała wraz z badanym antygenem. Właściwe porównanie różnych wariantów immunoprecypitacji IgM w odniesieniu do pomyślnie zidentyfikowanych antygenów jest trudne, ponieważ większość immunoprecypitacji przeprowadzono w celu wyizolowania lub zubożenia IgM bez dalszego zainteresowania ich antygenami. Ponadto immunoprecypitacje z wykorzystaniem IgMs stosowano głównie w celu potwierdzenia już znanego lub oczekiwanego pojedynczego antygenu z ekspozycją przeciwciał na oczyszczone antygeny ⁴⁹. Wadą IgG sprzężonych z agarozą skierowanych przeciwko ludzkim IgM jest bardzo niska wydajność (10 - 15%) immunoprecypitowanych cząsteczek IgM surowicy w porównaniu z materiałem wyjściowym ⁵⁰. W przeciwieństwie do tego, aktywowane powierzchniowo kulki magnetyczne z powodzeniem zastosowano do przeciwciał o różnych izotypach, w tym IgM, w celu immunoprecypitacji włókienek związanych z trzęsawką ⁴⁸. Metoda ta nie jest ograniczona do specyficznych łańcuchów kappa (Vκ) lub lambda (λ) ani do konkretnego gospodarza i może znacznie poszerzyć spektrum przeciwciał IgM stosowanych w immunoprecypitacji.

Kolejnym ważnym krokiem w protokole jest zdolność przeciwciała do działania jako przeciwciało wykrywające (przeciwciało pierwszorzędowe) w Western blot lub innych platformach przesiewowych. Skuteczne przeciwciała muszą być ukierunkowane na swój antygen z wystarczająco wysokim powinowactwem, aby umożliwić wiązanie antygenu w obecności niejonowych lub ewentualnie jonowych detergentów. Przeciwciała o wysokim powinowactwie są powszechne wśród przeciwciał IgG dojrzałych w powinowactwie, ale rzadziej wśród przeciwciał izotypu IgM, co jest jednym z powodów, dla których istnieje stosunkowo niewiele dostępnych na rynku przeciwciał IgM jako środków wykrywających w warunkach biochemicznych. Wysokie powinowactwo wiązania przeciwciał jest wymagane do immunoprecypitacji antygenów molekularnych i do Western blot. Obniżenie stężenia detergentów lub całkowity brak detergentów w IP i do lizy umożliwia celowanie w antygen przez przeciwciała o niskim powinowactwie za pośrednictwem jego domeny Fab. W przeciwieństwie do tego, zdolność przeciwciała do celowania w białko L agaroza poprzez jego część Fc nie jest znacząco zmieniona wśród kontroli izotypów w zakresie różnych stężeń detergentów. Jednak niskie stężenie detergentu w buforze do lizy i buforze IP zapobiega rozerwaniu błony komórkowej i izolacji określonych cząsteczek. Podobnie, niskie stężenie detergentu w do płukania Western blot (np. PBS-T) umożliwia wiązanie antygenu przeciwciał o niskim powinowactwie, ale jednocześnie zwiększa niespecyficzne wiązanie i dlatego nie jest opcją.

Obecność rdzenia białka antygenowego jest kolejnym wymogiem dla tej metody. Białka z modyfikacjami potranslacyjnymi (np. glikoproteiny, lipoproteiny) i niemodyfikowane białka, ale nie same lipidy lub węglowodany, są wykrywalne w Western Bloc. Nie jest możliwe immunoprecypitacja lipidów (np. sfingolipidów) z lizatów tkankowych lub komórkowych w obecności lub bez detergentów. Właściwości fizykochemiczne detergentów i lipidów są zbyt podobne, aby umożliwić selektywne interakcje lipid-przeciwciało, podczas gdy jednocześnie detergenty są niezbędne do rozerwania błon, aby umożliwić selektywną izolację określonych cząsteczek. Zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, immunoprecypitacje składające się wyłącznie z węglowodanów, przy braku rdzenia białkowego, nie były wcześniej zgłaszane. Staje się to szczególnie istotne, ponieważ przeciwciała IgM często są skierowane przeciwko węglowodanom i glikolipidom, które niekoniecznie są związane z jednostką białkową. Inne techniki chromatograficzne są wymagane do separacji i immunologicznej identyfikacji lipidów i węglowodanów w przypadku braku rdzenia białkowego. Na przykład chromatografia cienkowarstwowa (TLC) lipidów komórkowych z późniejszym wykrywaniem przeciwciał na płytce TLC (immuno-TLC) może być zaimplementowana ^51,52.

Inne przeciwciała anty-PSA zostały opisane w poprzednich badaniach i wynikach porównanych z HIgM12, a także z dostępnym na rynku anty-PSA IgM (klon 2-2B). Najczęściej stosowanym przeciwciałem w dziedzinie PSA jest przeciwciało IgG (klon 735) dostępne jako mysie przeciwciało monoklonalne lub poliklonalne królika ⁵³. To przeciwciało anty-PSA IgG wykrywa PSA na SynCAM i NCAM na różnych typach komórek OUN, w tym komórkach mikrogleju ⁴¹. W przeciwieństwie do przeciwciała anty-PSA IgG, ludzkie przeciwciała IgM HIgM12, HIgM42 i mysie przeciwciała anty-PSA IgM (klon 2-2B) nie są w stanie celować w PSA na SynCAM (ale na NCAM) w różnych stadiach embrionalnych i wczesnych stadiach postnatalnych u myszy, podczas gdy niepolisjalilowany SynCAM jest łatwo wykrywalny ¹⁵. Zastosowane przeciwciała IgM również nie są w stanie wykryć PSA na komórkach mikrogleju (ryc. 3 + 4). Możliwym wyjaśnieniem różnic obserwowanych między izotypami przeciwciał może być niski poziom PSA-SynCAM w porównaniu z poziomami PSA-NCAM w połączeniu z potencjalnie niższym powinowactwem wiązania przeciwciał IgM w porównaniu z przeciwciałami anty-PSA IgG. Aby przetestować tę hipotezę, przeprowadziliśmy immunoprecypitacje u zwierząt NCAM KO w stadium embrionalnym E17 z obecnymi ogromnymi ilościami SynCAM i użyliśmy HIgM12 jako "środka ściągającego"¹⁵. W E17 WT rodzeństwo z miotu kontroluje HIgM12 immunoprecypitowane PSA-NCAM w stopniu, który wykazywał podobną intensywność "ściągniętego" PSA-NCAM w porównaniu z łańcuchem ciężkim IgMs, wykrytym za pomocą densytometrii w kolejnym Western blot przy użyciu eluowanych antygenów. Wynik ten sugerował co najmniej wystarczające powinowactwo HIgM12 do docelowego PSA. W przeciwieństwie do kontroli z miotu WT, HIgM12 nie wykrył PSA przyłączonego do SynCAM u zwierząt NCAM KO. Identyczne wyniki uzyskano w immunoprecypitacjach z użyciem ludzkiego anty-PSA IgM HIgM42. HIgM12 i HIgM42, a także mysi anty-PSA IgM (klon 2-2B) nie były w stanie celować w PSA na SynCAM w Western blot od zwierząt WT i NCAM KO w embrionalnych i postnatalnych stadiach rozwoju. Biorąc pod uwagę niewielką ilość HIgM12 wymaganą (0,1 μg/ml) do specyficznego wykrycia PSA przyłączonego do NCAM w Western blot przy użyciu niewielkich ilości tkanki OUN (0,1 μg tkanki OUN na studzienkę) ¹⁵ , wydaje się mało prawdopodobne, aby samo niskie powinowactwo było odpowiedzialne za całkowity brak wykrywania PSA-SynCAM przez HIgM12 w trzech różnych metodach.

Wnioskujemy, że istnieją znaczące różnice między przeciwciałami anty-PSA IgM a często publikowanym przeciwciałem anty-PSA IgG (klon 735). Nie jest jasne, dlaczego dostępne na rynku przeciwciała anty-PSA IgM nie były w przeszłości częściej stosowane w celu potwierdzenia wyników uzyskanych z przeciwciałem anty-PSA IgG 735. Jest to szczególnie interesujące, ponieważ HIgM12 ma już udowodnioną skuteczność w różnych modelach choroby. Podczas gdy inne przeciwciała anty-PSA IgM mogą mieć podobne efekty terapeutyczne, pozostaje niejasne, czy przeciwciało anty-PSA IgG (klon 735) ma podobny wynik terapeutyczny w modelach stwardnienia rozsianego i ALS.

Krótko mówiąc, opisane tutaj metody zostały wykorzystane przede wszystkim do identyfikacji antygenu regeneracyjnego ludzkiego przeciwciała HIgM12 w celu wsparcia potencjalnych badań klinicznych dotyczących stwardnienia rozsianego i prawdopodobnie innych chorób neurodegeneracyjnych. Identyfikacja antygenów dla przeciwciał o aktywności biologicznej jest niezbędnym krokiem do zrozumienia ich mechanizmu działania. Staje się to szczególnie istotne w kontekście licznych przeciwciał monoklonalnych, które są obecnie testowane pod kątem bezpieczeństwa i skuteczności w badaniach na ludziach. Chociaż liczba przebadanych klinicznie przeciwciał IgM do tej pory jest niewielka, ostatnie postępy w technologii hybrydoma wraz z rosnącą liczbą badań podkreślających potencjał terapeutyczny tej klasy przeciwciał ^{1-10,37,40,42-45} wymagają opracowania nowych lub zmodyfikowanych metod mających zastosowanie do identyfikacji niebiałkowych antygenów IgM.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Fisher Scientific	MT-10-013-CVRF	Wysoka glukoza, z glutaminą, z pirogronianem sodu, 500 ml
DMEM/F-12, HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml, L-glutamina, pirogronian sodu, wysoka glukoza
Penicylina-Streptomycyna	Life Technologies	15140-122	10 000 U/ml, 100 ml
Suplement N-2 (100x)	Life Technologies	17502-048	5 ml
Suplement B-27 (50x)	Life Technologies	17504-044	bez surowicy, 10 ml
Surowica bydlęca płodu - Optima	Atlanta Biologicals	S12450	500 ml
Sterylna woda do irygacji	Baxter Healthcare	#2F7114	USP-1,000 ml, 12/CA
Bromowodorek poli-D-lizyny	Sigma	P7886-50MG	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys · xHBr, Masa cząsteczkowa 30 000-70 000 g/mol, 50 mg
frakcji albuminy surowicy bydlęcej V	Sigma	A-3294-100G	frakcja szoku cieplnego, bez proteazy, pH 7,  czystość 98%, 100 g
D-(+)-Glukoza	Sigma	G5767-500G	C6H12O6, Masa cząsteczkowa: 180,16 g / mol, odczynnik ACS, 500 g
Trypsyna z trzustki bydlęcej	Sigma	T9935-100 mg	zasadniczo bez soli, liofilizowany proszek, 9,000 jednostek BAEE / mg białka
Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej	Sigma	D5025-150KU	Typ IV, liofilizowany proszek, 2,000 jednostek Kunitza / mg białka
Rekombinowane białko podstawowe Rat FGF R	& Systemy D	3339-FB-025	BSA jako białko nośnikowe, 25 µ g, liofilizowane, > 95%, 16,2 kDa
Rekombinowane białko szczurze PDGF-AA R	& Systemy D	1055-AA-50	bez nośnika, 50 µ g, liofilizowane, > 97%, E. pochodna , 12,5 kDa
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 ml, Bez glutaminy, bez kwasu asparaginowego, bez kwasu glutaminowego
Paraformaldehyd	Sigma	P6148-1KG	krystaliczny, 1 kg, klasa odczynnika, Masa cząsteczkowa 30,03 g/mol (jako monomer)
Tris[hydroksymetylo]aminometan (Tris bas	Biorad	#1610719	1 kg, czystość 99,8%, proszek
Dodecyl siarczan sodu (SDS)	Biorad	#1610302	1 kg, proszek
Glycine	Fisher Scientific	BP-381-5	C2H5NO2, Masa cząsteczkowa: 75,07 g/mol, Biały krystaliczny proszek, 5 kg
Chlorek sodu	Sigma	S7653-5KG	NaCl, Masa cząsteczkowa: 58,44 g/mol, 5 kg
Fosforan sodu jednozasadowy	Sigma	S0751-500G	NaH2PO4, Masa cząsteczkowa: 119.98 g/mol, 500 g
Roztwór buforowany fosforanami 1x (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	Bez wapnia i magnezu, 6 x 500 ml
Naczynie do hodowli komórkowych Falcon 60 mm z powłoką TC	Corning Life Sciences	#353002	Naczynie do hodowli komórkowych 60 mm, polistyren poddany działaniu TC, 20 sztuk w opakowaniu, sterylne
Falcon Szalka Petriego 60 mm x 15 mm	Corning Life Sciences	#351007	Bakteriologiczna szalka Petriego bez TC, 20 sztuk w opakowaniu
6-dołkowe płytki do hodowli komórkowych	Corning Costar	CLS3516	6 dołków, płaskie dno (pakowane pojedynczo), napromieniowane promieniami gamma, obszar wzrostu 9,5 c
75 cm² kolba do hodowli tkankowych	Corning Life Sciences	430720U	75 cm² Kolba do hodowli komórkowych w kształcie litery U ze skośną szyjką z zatyczką
Pierce™ Białko L Plus Agaroza	ThermoFisher Scientific	#20520	2 ml, usieciowana 6% agaroza perałkowa (CL-6B), zdolność wiązania: 10 do 20 mg IgG
4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Prefabrykowany żel	Biorad	456-1094	10-dołkowy, 50 &mikro; l, do stosowania z komórkami do elektroforezy Mini-PROTEAN
Immobilon-P Membrane	Millipore	IPVH00010	PVDF, 0,45 µ m, rolka 26,5 cm x 3,75 m
Przeciwciało przeciw kwasowi polisjalowemu-NCAM, klon	Millipore	MAB5324	50 mikrolitrów, Gospodarz: mysz, monoklonalne IgM
4x Laemmli Sample Buffer	Biorad	#1610747	10 ml, 4x wstępnie zmieszany bufor do próbek białkowych
2-merkaptoetanol	Biorad	#1610710	25 ml, czystość 98%, 14,2 M
Endoneuraminidaza-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50 mikrolitrów, 200 i mikro; g/ml, 3,500 U/mg
25 mm szkiełka nakrywkowe	Fisher Scientific	12-545-102	Koła nr 1; Grubość: od 0,13 do 0,17 mm; Rozmiar: 25 mm
roztwór buforowy HEPES	ThermoFisher Scientific	15630-080	100 ml, 1 M
Zrównoważony roztwór soli Hanksa 1x (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	500 ml, bez wapnia, magnezu, fenolu Czerwona
papaina	Worthington Biochemical Cooperation	LS003119	liofilizowany proszek, 100 mg
siarczan magnezu	Sigma	M-2643-500G	proszek, 500 g
L-Glutaminy	Gibco	#25030-081	100 ml, 200 mM