Method Article

Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo

DOI:

10.3791/54564

⸱

October 17th, 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, University of Arkansas

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Najnowsze techniki mikroendoskopii z wiązkami włókien umożliwiają nieinwazyjną analizę tkanek in vivo przy użyciu technik obrazowania lub kombinacji technik spektroskopiowych. Połączenie technik obrazowania i spektroskopii w jednej sondzie optycznej może zapewnić pełniejszą analizę stanu tkanek . W tym artykule połączono dwie różne modalności, obrazowanie mikroendoskopowe fluorescencji o wysokiej rozdzielczości i spektroskopię odbicia rozproszonego, w jednej sondzie optycznej. Obrazowanie mikroendoskopowe fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości jest techniką stosowaną do wizualizacji mikroarchitektury tkanki wierzchołkowej i, chociaż jest to głównie technika jakościowa, wykazała skuteczne różnicowanie w czasie rzeczywistym między tkanką nowotworową i nienowotworową. Spektroskopia odbicia dyfuzyjnego to technika, która pozwala na wyodrębnienie parametrów fizjologicznych tkanek, w tym lokalnego stężenia hemoglobiny, stężenia melaniny i nasycenia tlenem. W tym artykule opisano specyfikacje wymagane do skonstruowania sondy światłowodowej, sposób budowy oprzyrządowania, a następnie zademonstrowano technikę na ludzkiej skórze in vivo. Prace te ujawniły, że mikroarchitektura tkanek, w szczególności keratynocyty wierzchołkowe skóry, mogą być współrejestrowane z powiązanymi z nimi parametrami fizjologicznymi. Prezentowane tutaj oprzyrządowanie i sonda światłowodowa mogą być zoptymalizowane jako urządzenie przenośne lub kompatybilne endoskopowo do stosowania w różnych układach narządów. Potrzebne są dodatkowe badania kliniczne, aby przetestować skuteczność tej techniki w różnych stanach choroby nabłonka.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Techniki mikroendoskopii z wiązkami włókien zazwyczaj analizują tkanki in vivo za pomocą technik obrazowania lub kombinacji technik spektroskopiowych. 1-3 Jedna z takich technik obrazowania, mikroendoskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości, może obrazować mikroarchitekturę tkanek wierzchołkowych z rozdzielczością subkomórkową w małym, mikroskalowym polu widzenia, przy użyciu miejscowego środka kontrastowego, takiego jak proflawina, fluoresceina lub tusz piraninowy. 1,3-11 Ta metoda obrazowania wykazała obiecującą skuteczność kliniczną w jakościowym różnicowaniu chorej i zdrowej tkanki nabłonkowej w czasie rzeczywistym przy niskiej zmienności między obserwatorami. 8 Od czasu do czasu badacze wykorzystują dane z mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości do wyodrębnienia cech ilościowych, takich jak wielkość komórki i jądra lub obszar gruczołu, ale pozostaje to przede wszystkim techniką jakościową ukierunkowaną na wizualizację morfologii tkanki. 1,3,8-10 Z drugiej strony, techniki spektroskopowe, takie jak spektroskopia odbicia dyfuzyjnego, są ukierunkowane na dostarczanie funkcjonalnych informacji o tkankach i wykazały obiecującą skuteczność kliniczną w ilościowej identyfikacji zmian nowotworowych w wielu narządach. 2,12-15

Dlatego potrzebne jest urządzenie łączące oba rodzaje modalności, aby potencjalnie jeszcze bardziej zmniejszyć zmienność między obserwatorami, utrzymać wizualizację mikroarchitektury tkanek w czasie rzeczywistym i zapewnić bardziej kompletną analizę zdrowia tkanek. Aby osiągnąć ten cel, skonstruowano multimodalny instrument oparty na sondzie, który łączy dwie modalności w jednej sondzie światłowodowej: mikroendoskopię fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości i subdyfuzyjną spektroskopię odbicia. 11 Metoda ta rejestruje jakościowe obrazy morfologii tkanki wierzchołkowej o wysokiej rozdzielczości (właściwości strukturalne) z ilościową informacją spektralną (właściwości funkcjonalne) z dwóch różnych głębokości tkanki, w tym lokalnego stężenia hemoglobiny ([Hb]), stężenia melaniny ([Mel]) i nasycenia tlenem (SaO2). 11,12,16 Ta specyficzna metoda spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego wykorzystuje dwie separacje źródło-detektor (SDS) do pobierania próbek o dwóch unikalnych głębokościach tkanki, aby zapewnić bardziej wszechstronny obraz zdrowia tkanek poprzez pobieranie próbek aż do błony podstawnej i leżącego poniżej zrębu tkanki. 11

Sonda światłowodowa składa się z centralnego światłowodu o średnicy 1 mm z około 50 000 elementów światłowodowych o średnicy 4,5 μm, średnicy powłoki 1,1 mm i całkowitej średnicy powłoki 1,2 mm. Włókno obrazowe otoczone jest pięcioma włóknami o średnicy 200 μm i średnicy okładziny 220 μm. Każde włókno wielomodowe o średnicy 200 μm znajduje się w odległości od środka do środka wynoszącej 864 μm. Każdy z włókien wielomodowych o wielkości 200 μm jest oddalony od siebie o 25°. Używając najbardziej wysuniętego na lewo światłowodu wielomodowego 200 μm jako światłowodu "źródłowego" i dodatkowych trzech światłowodów wielomodowych 200 μm jako włókien "zbiorczych", ta geometria z konieczności tworzy trzy SDS od środka do środka 374 μm, 730 μm, 1,051 μm i 1,323 μm. Końcówki włókien są zamknięte w cylindrycznej metalowej obudowie, która utrzymuje stałe odległości między włóknami. Średnica cylindrycznej metalowej obudowy wynosi 3 mm. Dystalny koniec (w kierunku końcówki sondy światłowodowej) sondy światłowodowej ma 2 stopy długości. Sonda następnie rozdziela się na sześć odpowiednich pojedynczych włókien na bliższym końcu (w kierunku oprzyrządowania), który ma dodatkowe 2 stopy długości, co daje łączną długość 4 stóp. Rysunek 1 przedstawia reprezentację sondy światłowodowej.

figure-introduction-1
Rysunek 1: Konstrukcja sondy światłowodowej. Sonda światłowodowa składa się z jednego światłowodu obrazowego o średnicy 1 mm i czterech światłowodów wielomodowych 200 μm. Rysunek ten przedstawia reprezentacje (a) metalowej zaślepki, która ogranicza geometrię włókien na końcówce sondy, aby uzyskać SDS 374, 730 i 1,051 μm w odniesieniu do najbardziej wysuniętego na lewo światłowodu wielomodowego 200 μm (podziałka ≈ 1 mm), (b) włókien ograniczonych w metalowej nasadce, pokazując rdzenie włókien, okładzina z włókien i powłoka z włókien (podziałka ≈ 1 mm), c) ochronna powłoka poliamidowa wokół włókien (podziałka ≈ 1 mm), (d) gotowa dystalna końcówka sondy z metalowym uchwytem na palec i pojedynczym czarnym zawierającym wszystkie włókna (podziałka ≈ 4 mm) oraz (e) zdjęcie dystalnej końcówki sondy (podziałka ≈ 4 mm). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ta multimodalna instrumentacja i związana z nią technika jest pierwszą kombinacją tych modalności w ramach jednej sondy, chociaż istnieją inne kombinowane techniki strukturalno-funkcjonalne, które łączą różne modalności. Na przykład obrazowanie hiperspektralne łączy obrazowanie szerokokątne z ilościowymi właściwościami hemoglobiny i melaniny,17,18 i opracowano inne techniki, które łączą optyczną tomografię koherentną (OCT) z analizą ekspresji białek tkankowych,19 by wymienić tylko kilka. W tym artykule opisano kompaktową i łatwą do wdrożenia konfigurację oprzyrządowania, która wykorzystuje ogólną sondę światłowodową, która może być zoptymalizowana do różnych celów, w tym do użytku endoskopowego w dolnym odcinku przewodu pokarmowego i przełyku lub jako sonda ręczna do użytku w jamie ustnej i zewnętrznym umieszczaniu skóry. 11,20

Sprzęt dla tego oprzyrządowania wymaga zarówno niestandardowego pozyskiwania danych, jak i kodu przetwarzania końcowego, aby uzyskać rozproszone widma odbicia, a następnie wyodrębnić wynikowe parametry fizjologiczne tkanek uśrednione objętościowo, w tym [Hb], [Mel] i SaO2. Niestandardowy kod akwizycji danych został zbudowany tak, aby umożliwić jednoczesną akwizycję z kamery (do mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości) i spektrometru (do spektroskopii odbicia dyfuzyjnego). Sterowniki są często dostępne na stronach internetowych producentów, aby umożliwić integrację z różnymi językami programowania. Niestandardowy kod przetwarzania końcowego importuje a priori wartości absorpcji in vivo [Hb] i [Mel]21, a następnie wykorzystuje wcześniej opracowany nieliniowy proces dopasowania optymalizacji, który tworzy dopasowaną krzywą widm. 22 Dopasowaną krzywą buduje się poprzez zminimalizowanie wartości χ2 między nią a widmami surowymi i wyznaczenie parametrów fizjologicznych tkanek ([Hb], [Mel] i SaO2) na podstawie dopasowanej krzywej i przy najniższej wartości χ2. 22 Kod może być modyfikowany w taki sposób, aby uwzględniał absorpcję również z innych chromoforów, takich jak zastosowany tutaj egzogenny atrament piraninowy, tak aby docelowe parametry fizjologiczne pozostały nienaruszone.

Fizjologiczne wskaźniki zdrowia tkanek, takie jak [Hb], [Mel] i SaO2, mogą być używane jako raporty o odpowiedzi guza na terapię lub jako wskaźniki miejscowego unaczynienia i angiogenezy. 14,23 Włączenie metody mikroendoskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości pomaga w umieszczeniu sondy i zapewnia badaczom pełniejszy obraz związku między strukturą a funkcją tkanki nabłonkowej. W artykule opisano budowę i zastosowanie mikroendoskopu multimodalnego. 11

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Institutional Review Board (IRB #15-09-149) uzyskano zgodę Institutional Review Board (IRB #15-09-149) na wszystkie aspekty tego badania. Opisane metody zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi, a od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę.

1. Montaż metody mikroendoskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości

Uwaga: Przedstawione kroki montażu metody mikroendoskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości można zobaczyć na rysunku 2.

  1. Umieść lustro dichroiczne 470 nm w kostce klatkowej o średnicy 30 mm.
    1. Zaopatrz się w sześcian klatkowy o średnicy 30 mm i zdejmij mocowanie filtra dichroicznego.
    2. Umieść lustro dichroiczne 470 nm w uchwycie filtra dichroicznego.
    3. Włóż ponownie i zabezpiecz mocowanie filtra dichroicznego z powrotem do kostki klatki.
  2. Przymocuj pręty montażowe koszyka do kostki klatki 30 mm.
    1. Przymocuj cztery 1.5-calowe pręty montażowe klatki z przodu kostki klatki.
    2. Przymocuj cztery pręty montażowe klatki 3.0 cala po prawej stronie kostki klatki.
    3. Zamocuj dwa pręty montażowe klatki 2.0 cala po przekątnej po lewej stronie kostki klatki.
  3. Zbuduj zespół płytki klatki/tubusu obiektywu.
    1. Zaopatrz się w gwintowaną płytę koszykową o średnicy 30 mm o średnicy 1,0 cala i przymocuj beznaprężeniowy pierścień ustalający do wewnętrznej strony płyty koszyka za pomocą dostarczonego gwintu.
    2. Przykręć tubus obiektywu o średnicy 1.0 cala do beznaprężeniowego pierścienia ustalającego.
    3. Przymocuj drugą 1.0-calową gwintowaną płytkę klatkową 30 mm do tubusu obiektywu 1.0 cala i wyreguluj standardowe pierścienie ustalające tak, aby dwie płytki klatki były wyrównane.
  4. Wsuń 1.0-calową płytkę klatkową/tubus obiektywu na lewą stronę kostki klatki 30 mm.
  5. Zbuduj zespół mocowania lustra pod kątem prostym.
    1. Uzyskaj mocowanie lustra pod kątem prostym i 1,0-calowe aluminiowe lustro wzmocnione promieniowaniem UV.
    2. Umieść 1.0-calowe aluminiowe lustro wzmocnione promieniowaniem UV w uchwycie lustra i dokręć.
    3. Przymocuj cztery pręty montażowe klatki 2.0 cala z przodu mocowania lusterka
    4. Zamocuj dwa pręty montażowe klatki 2.0 cala po przekątnej po prawej stronie kostki klatki.
  6. Podłącz zespół mocowania lustra pod kątem prostym po lewej stronie zespołu 1.0 cala płyty klatki/rurki obiektywu, umieszczając przeciwległe pręty zespołu klatki przez odpowiednie otwory w płycie klatki 30 mm.
  7. Przeciągnij mocowanie translacyjne osi z przez pręty montażowe klatki 3.0 cala po prawej stronie zespołu.
  8. Przymocuj achromatyczną soczewkę obiektywową 10X do mocowania translacyjnego osi z.
  9. Zbuduj 1,0-calową płytę adaptera światłowodowego / zespół mocowania obiektywu translacyjnego osi xy.
    1. Zaopatrz się w uchwyt translacyjny osi xy i 1.0-calową płytkę adaptera światłowodowego.
    2. Zamocuj 1.0-calową płytkę adaptera światłowodowego w mocowaniu obiektywu translacyjnego osi xy.
  10. Przesuń 1.0-calowy adapter światłowodowy/zespół mocowania soczewki translacyjnej osi xy przed soczewkę obiektywu.
  11. Zaopatrz się w dwa tubusy soczewek o długości 0,5 cala i średnicy 1,0 cala, jeden filtr pasmowoprzepustowy 440/40 nm (filtr wzbudzenia) i jeden filtr pasmowo-przepustowy 525/36 nm (filtr emisyjny).
  12. Umieść każdy filtr w tubusie obiektywu o długości 0.5 cala i średnicy 1.0 cala, tak aby strzałka na zewnątrz filtra była skierowana w stronę tubusu obiektywu z gwintami zewnętrznymi.
  13. Przymocuj filtry do zespołu.
    1. Zaopatrz się w dwa standardowe pierścienie ustalające.
    2. Zabezpiecz filtry wewnątrz tubusów soczewek o długości 0.5 cala i średnicy 1.0 cala za pomocą standardowych pierścieni ustalających.
    3. Przykręcić tubus obiektywu z filtrem wzbudzenia do przodu sześcianu klatkowego 30 mm i przykręcić tubus obiektywu z filtrem emisyjnym do mocowania lustra pod kątem prostym.
    4. Przykręć tubus obiektywu 0,5 cala z filtrem emisyjnym z przodu mocowania lustra pod kątem prostym.
  14. Zaopatrz się w dwie 1.0-calowe gwintowane płytki klatkowe 30 mm i umieść je przed rurkami soczewek o długości 0.5 cala i średnicy 1.0 cala zawierającymi filtry.
  15. Za pomocą żywicy epoksydowej lub mocnego kleju przymocuj diodę LED 455 nm do płyty klatki podłączonej do filtra wzbudzenia.
  16. Zaopatrz się w jeden tubus obiektywu o długości 0,5 cala i średnicy 1,0 cala oraz achromatyczny tubus o średnicy 1,0 cala i ogniskowej 50 mm.
  17. Umieść soczewkę tubusu wewnątrz tubusu obiektywu tak, aby strzałka na zewnątrz obiektywu była skierowana w stronę tubusu obiektywu z gwintami zewnętrznymi.
  18. Przykręć soczewkę rurki do zespołu.
    1. Zaopatrz się w jeden standardowy pierścień ustalający.
    2. Zamocuj obiektyw wewnątrz tubusu obiektywu o długości 0.5 cala i średnicy 1.0 cala za pomocą standardowego pierścienia ustalającego.
    3. Przymocuj tubus obiektywu z soczewką tubusu do skrajnej lewej płyty klatki.
  19. Umieść płytkę klatkową o średnicy 30 mm przed tubusem obiektywu o długości 0.5 cala i średnicy 1.0 cala, w którym znajduje się soczewka tubusu.
  20. Przymocuj bezprężny pierścień ustalający do wewnętrznej strony płyty koszyka 30 mm.
  21. Podłącz monochromatyczną kamerę USB do płyty klatki za pomocą beznaprężeniowego pierścienia ustalającego.
  22. Zbuduj optyczne urządzenia do montażu słupków.
    1. Zaopatrz się w cztery uchwyty na słupki 0,5 cala, cztery słupki optyczne 0,5 cala i cztery podstawy montażowe.
    2. Zabezpiecz słupki optyczne 0.5 cala wewnątrz uchwytów słupków 0.5 cala.
    3. Przymocuj uchwyty słupków 0.5 cala do podstaw montażowych.
  23. Przykręć cztery optyczne urządzenia mocujące słupek do otworów na znajdujących się pod kostką klatki 30 mm, mocowaniem lustra pod kątem prostym, płytą klatki podłączoną do diody LED oraz płytą klatki podłączoną do kamery.
  24. Przykręć cztery optyczne urządzenia do montażu słupka do płytki stykowej lub stołu optycznego, aby zakończyć budowę metody mikroendoskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości.

figure-protocol-1
Rysunek 2: Montaż metody mikroendoskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości. Modalność mikroendoskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości można skonstruować, budując powłokę z elementów o średnicy 1,0 cala, ze szczególną ostrożnością przy obchodzeniu się ze zwierciadłem dichroicznym, soczewką obiektywu, filtrami wzbudzenia/emisji i soczewką tubusu. Ze szklanymi powierzchniami tych elementów należy obchodzić się ostrożnie za pomocą papieru do soczewek. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Montaż modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego

Uwaga: Przedstawione kroki montażu modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego można zobaczyć na rysunku 3.

  1. Zaopatrz się w wolframowo-halogenowe źródło światła i za pomocą żywicy epoksydowej lub mocnego kleju przymocuj z przodu gwintowaną płytę klatkową 30 mm o średnicy 1,0 cala.
  2. Przymocuj cztery pręty montażowe klatki 3.0 cala do płyty klatki.
  3. Przymocuj mocowanie translacyjne osi Z do prętów montażowych klatki.
  4. Przykręć achromatyczną soczewkę obiektywową 20X do mocowania translacyjnego osi z.
  5. Zbuduj płytkę adaptera światłowodowego / zespół mocowania soczewki translacyjnej osi xy.
    1. Zaopatrz się w uchwyt translacyjny osi xy i płytkę adaptera światłowodowego o przekątnej 1,0 cala.
    2. Zamocuj płytkę adaptera światłowodu w uchwycie soczewki translacyjnej osi xy.
  6. Przesuń 1.0-calowy adapter światłowodowy/zespół mocowania z translacją xy przed soczewkę obiektywu.
  7. Zbuduj zespół ramienia silnika.
    1. Uzyskaj niestandardowo zbudowane aluminiowe ramię silnika i jedną płytę adaptera z włókna SMA.
    2. Wkręć płytkę adaptera z włókna (z gwintem zewnętrznym) w aluminiowe ramię silnika (z gwintem wewnętrznym).
    3. Przymocuj niestandardowy aluminiowy adapter ramienia silnika do ramienia silnika za pomocą czterech #4-40 0.5 cala.
  8. Zbuduj zespół silnika/ramienia silnika/obudowy silnika.
    1. Uzyskaj niestandardową aluminiową obudowę silnika i 400-stopniowy silnik krokowy.
    2. Wyrównaj otwory na w silniku krokowym i obudowie silnika, a następnie zabezpiecz czterema #4-40 0.5 cala.
    3. Przełóż obracający się pręt silnika krokowego przez otwór zespołu ramienia silnika i dokręć blokującą na aluminiowym adapterze ramienia silnika.
  9. Zbuduj zespół przełącznika optycznego.
    1. Zdobądź niestandardowy aluminiowy przełącznik optyczny i trzy 1,0-calowe płytki adaptera światłowodowego.
    2. Wkręć płytki adaptera w gwintowane otwory w przełączniku optycznym.
    3. Przymocuj niestandardową aluminiową płytę czołową przełącznika optycznego do przełącznika optycznego za pomocą czterech #4-40 0.5 cala.
  10. Przymocuj zespół silnika/ramienia silnika/obudowy silnika do przełącznika optycznego, przepuszczając obracający się pręt silnika krokowego przez środkowy otwór przełącznika optycznego.
  11. Zaopatrz się w płytkę obwodu elektrycznego i sterownik silnika krokowego, a następnie umieść sterownik silnika krokowego w poprzek środkowego rowka płytki stykowej.
  12. Przestrzegać schematu połączeń elektrycznych (Rysunek 3, 2.12) sterownika silnika krokowego, zasilacza 12 V i silnika krokowego.
  13. Podłącz sterownik silnika krokowego, zasilacz 12 V i silnik krokowy zgodnie ze schematem obwodu (Rysunek 3, 2.12), aby zakończyć konstrukcję zmotoryzowanego przełącznika optycznego.
  14. Przykręcić elementy przełącznika optycznego i wolframowo-halogenowe źródło światła do płytki stykowej lub stołu optycznego w pobliżu wcześniej skonstruowanego (Rysunek 2, 1.24) zespołu mikroendoskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości.
  15. Podłącz jeden koniec krosowego 550 μm, 0.22 NA do 1.0-calowej płyty adaptera światłowodowego zespołu ramienia silnika.
  16. Podłącz drugi koniec krosowego 550 μm, 0,22 NA do złącza światłowodowego spektrometru USB.
  17. Przykręć pięć dystalnych sondy do odpowiednich 1,0-calowych płytek adaptera światłowodowego na oprzyrządowaniu, aby zakończyć zakończenie multimodalnego obrazowania o wysokiej rozdzielczości i subdyfuzyjnej spektroskopii odbicia mikroendoskopu światłowodowego.
    1. Przykręć środkowy światłowodowy obrazu o średnicy 1 mm do płytki adaptera światłowodowego 1.0 cala wymienionej w kroku 1.9.2.
    2. Przykręć skrajny lewy światłowodowy wielomodowy 200 μm do 1.0-calowej płytki adaptera światłowodowego, o której mowa w kroku 2.6.
    3. Przykręć drugi wielomodowy światłowodowy 200 μm do skrajnego lewego adaptera światłowodowego 1.0 cala podłączonego do wolframowo-halogenowej lampy wspomnianej w kroku 2.9.2.
    4. Przykręć3-kanałowy światłowodowy wielomodowy 200 μm do środkowej 1.0-calowej płytki adaptera światłowodowego, o której mowa w kroku 2.9.2.
    5. Przykręć4-ty wielomodowy światłowodowy 200 μm do skrajnej prawej płyty adaptera światłowodowego 1.0 cala wymienionej w kroku 2.9.2.

figure-protocol-2
Rysunek 3: Montaż modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego. Modalność spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego można skonstruować przy użyciu podstawowej lampy wolframowo-halogenowej sprzężonej z soczewką obiektywową w celu skupienia światła przez światłowód wielomodowy o średnicy 200 μm i spektrometru. Dodatkowo, w ścieżce lampa-światłowód-spektrometr, można zbudować niestandardowy zmotoryzowany przełącznik optyczny, aby przełączać się między każdym SDS. Badacze używający wielu spektrometrów do pozyskiwania z wielu kart charakterystyki mogą ominąć element przełącznika optycznego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Kalibracja modalności spektroskopii odbicia subdyfuzyjnego

Uwaga: Następujące kroki (sekcja 3) muszą być wykonane przed zebraniem danych spektralnych (sekcja 4).

  1. Włącz wszystkie elementy oprzyrządowania, w tym diodę LED 455 nm, szerokopasmową lampę wolframowo-halogenową, kamerę CMOS, spektrometr USB, silnik krokowy i płytę sterującą silnikiem. Upewnij się, że migawka na lampie wolframowo-halogenowej jest otwarta.
  2. Wyłącz całe światło otoczenia.
  3. Otwórz niestandardowe oprogramowanie do akwizycji danych.
  4. Utrzymuj urządzenie w ruchu przez 30 minut, aby lampa osiągnęła odpowiednią temperaturę i aby zakłócenia wywołane przez spektrometr ustabilizowały się.
  5. Umieść 20% wzorzec odbicia rozproszonego w dolnym otworze niestandardowego, wydrukowanego w 3D wzorca kalibracji.
  6. Umieść sondę światłowodową w skrajnym lewym gnieździe niestandardowego, wydrukowanego w 3D uchwytu światłowodowego, pokazanego na rysunku 4. Skrajna lewa szczelina ustala prostopadłą odległość od końcówki sondy światłowodowej do wzorca odbicia na 2,1 mm, co jest optymalną odległością, w której sygnał docierający do spektrometru jest maksymalizowany dla pierwszego SDS wynoszącego 374 μm.
  7. Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w skrajnym lewym położeniu, tak aby spektrometr był podłączony do pierwszego SDS o długości 374 μm.
  8. Ustaw czas integracji na 500 ms. Ten czas całkowania musi być tak dobrany, aby nie nasycić spektrometru, ale utrzymać praktycznie niski czas integracji.
  9. Uzyskaj widmo, Rmax,374μm, klikając "Uzyskaj widmo" w oprogramowaniu.
  10. Zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej i nagraj widmo szumu tła o ciemnym R 374 μm, klikając "Uzyskaj widmo" w oprogramowaniu. Po zdobyciu ponownie otwórz migawkę.
  11. Umieść sondę światłowodową w skrajnym prawym gnieździe niestandardowego, wydrukowanego w 3D uchwytu światłowodowego, pokazanego na rysunku 4. Skrajna prawa szczelina ustala prostopadłą odległość od końcówki sondy światłowodowej do wzorca odbicia na 3,9 mm, co jest optymalną odległością, w której sygnał docierający do spektrometru jest maksymalizowany dla drugiej SDS wynoszącej 730 μm.
  12. Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w pozycji środkowej tak, aby spektrometr był podłączony do drugiej karty charakterystyki o średnicy 730 μm.
  13. Uzyskaj widmo, Rmax,730μm, klikając "Uzyskaj widmo" w oprogramowaniu.
  14. Zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej i nagraj widmo szumu tła o grubości 730 μm, klikając "Uzyskaj widmo" w oprogramowaniu.
  15. Ponownie otwórz migawkę.

figure-protocol-3
Rysunek 4: Kalibracja modalności spektroskopii odbicia poddyfuzyjnego. W przypadku kalibracji przedeksperymentalnej końcówka sondy światłowodowej musi być umieszczona w różnych prostopadłych odległościach od 20% normy odbicia rozproszonego w zależności od SDS. Aby konsekwentnie osiągać te prostopadłe odległości we wszystkich eksperymentach, zaprojektowano standardowe urządzenie kalibracyjne (przekrój poprzeczny urządzenia pokazany w (a)) do utrzymywania sondy w dokładnych odległościach od 20% normy odbicia rozproszonego. W tej specyficznej konfiguracji sondy światłowodowej światło z lampy wolframowo-halogenowej jest wyświetlane przez przełącznik optyczny w separacji źródło-detektor (b) 374 μm i (c) 730 μm (z silnikiem i ramieniem silnika usuniętymi ze ścieżki optycznej dla przejrzystości). Do kalibracji wymagane są odległości (d) 2,1 mm dla SDS 374 μm i (e) 3,9 mm dla SDS 730 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Akwizycja danych in vivo i ekstrakcja właściwości optycznych z ludzkiej skóry

W tej sekcji, technika multimodalnego mikroendoskopu zostanie zademonstrowana na ludzkiej skórze in vivo.

  1. Otwórz niestandardowe oprogramowanie do akwizycji danych i dostosuj czas integracji spektrometru, klikając "Czas integracji" i ustaw go tak, aby był taki sam jak podczas kalibracji, który w tym przypadku wynosił 500 ms (krok 3.8).
  2. Określ obszar skóry, w którym chcesz uzyskać dane, które mogą się różnić w zależności od aplikacji badacza. W tym przypadku jako demonstrację wybrano cienką skórę przedramienia.
  3. Jeśli obszar skóry zawiera włosy, usuń je jednorazową sterylną maszynką do golenia.
  4. Zaopatrz się w standardowy żółty rozświetlacz, który zawiera tusz piraninowy i delikatnie zaznacz wybrany obszar skóry.
  5. Włącz diodę LED 455 nm i zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej.
  6. Umieść sondę w delikatnym kontakcie ze skórą.
  7. Przesuwaj sondę po poplamionym obszarze tkanki, aby view na żywo obraz architektury keratynocytów wierzchołkowych w wysokiej rozdzielczości w viewokno oprogramowania.
  8. Wybierz odpowiedni czas ekspozycji i wzmocnienie, w tym przypadku 150 ms i wzmocnienie 10 dB, aby uniknąć nasycenia obrazu, klikając "Czas ekspozycji" i "Wzmocnienie", wpisując odpowiednie wartości, a następnie klikając "Zastosuj ustawienia" w interfejsie oprogramowania.
  9. Uzyskaj obraz, klikając "Uzyskaj obraz" w interfejsie oprogramowania.
  10. Trzymając sondę w tym samym miejscu obrazu, wyłącz diodę LED 455 nm i otwórz migawkę lampy wolframowo-halogenowej.
  11. Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w lewej pozycji, tak aby spektrometr był podłączony do drugiej karty charakterystyki 374 μm.
  12. Uzyskaj widma, tkankę R, 374 μm, klikając "Uzyskaj widma" w interfejsie oprogramowania.
  13. Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w pozycji środkowej tak, aby spektrometr był podłączony do drugiej karty charakterystyki o średnicy 730 μm.
  14. Uzyskaj widma, tkankę R, 730 μm, klikając "Zdobądź widma" w interfejsie oprogramowania.
  15. Otwórz niestandardowe oprogramowanie do przetwarzania końcowego.
  16. Uruchom oprogramowanie do przetwarzania końcowego, klikając "Uruchom" i wybierz obraz fluorescencji o wysokiej rozdzielczości, cztery widma kalibracyjne i dwa widma in vivo z folderu, w którym dane zostały zapisane po wyświetleniu monitu przez oprogramowanie.
    UWAGA: Niestandardowe oprogramowanie uzyskuje rzeczywisty bezwzględny współczynnik odbicia (Rabs,374μm i Rabs,730μm) przy użyciu następujących równań.
    figure-protocol-4
    figure-protocol-5
    Kod przetwarzania końcowego, jak opisano wcześniej, oblicza dopasowaną krzywą do widm odbicia rozproszonego (równania 1 i 2), a następnie określa parametry fizjologiczne tkanek, w tym ([Hb], [Mel] i SaO2). 11,22,24

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zgodnie z tym protokołem, badacz uzyska ostry obraz miejsca tkanki w wysokiej rozdzielczości z pełnym polem widzenia (Rysunek 5). Kontury komórek można zobaczyć, jeśli są zabarwione tuszem piraninowym ze standardowego żółtego rozświetlacza, podczas gdy pojedyncze jądra komórkowe można zobaczyć, jeśli są zabarwione barwnikiem, takim jak proflawina. Po akwizycji spektralnej, oprogramowanie do przetwarzania końcowego wykorzystuje wiedzę a priori na temat stężenia he...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisywany tutaj multimodalny mikroendoskop światłowodowy do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i subdyfuzyjnej spektroskopii odbicia może być zoptymalizowany i wykorzystany przez badaczy do różnych zastosowań, w tym do użytku endoskopowego lub ręcznego w badaniach na ludziach lub zwierzętach. W ten sposób zapewnia elastyczną metodę wizualizacji mikroarchitektury tkanek wierzchołkowych in vivo wraz z pomiarami stężenia hemoglobiny, stężenia melaniny i nasycenia tkanek tlenem z dwóch różnych głębokości tkanki. ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten materiał jest oparty na pracach wspieranych przez National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), Arkansas Biosciences Institute oraz University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy uznanych agencji finansujących.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kostka klatkowa 30 mm z mocowaniem filtra dichroicznegoThorlabs, Inc.CM1-DCH
470 nm Lustro dichroiczne (rozdzielacz wiązki)Chroma CorporationT470lpxr
Pręt montażowy klatki, 1,5 cala, 4-pakThorlabs, Inc.ER1.5-P4
Pręt montażowy koszyka, 3,0", 4-pakThorlabs, Inc.ER3-P4
Pręt montażowy koszyka, 2.0", 4-pakThorlabs, Inc.ER2-P4 SM1-Gwintowana
płyta klatkowa 30 mmThorlabs, Inc.CP02
Bezstresowy pierścień ustalający serii SM1Thorlabs, Inc.SM1PRR
SM1 Tubus obiektywu, głębokość gwintu 1,00"Thorlabs, Inc.SM1L10
Kątowe mocowanie lustra kinematycznegoThorlabs, Inc.KCB1
1-calowe aluminiowe lustro wzmocnione promieniami UVThorlabs, Inc.PF10-03-F01
Uchwyt translacyjny osi ZThorlabs, Inc.SM1Z
10X Plan-achromatyczny obiektyw OlympusThorlabs, Inc.RMS10X
XY Mocowanie obiektywu translacyjnegoThorlabs, Inc.CXY1
SMA Płyta adaptera światłowodowego z gwintem SM1Thorlabs, Inc.SM1SMA
SM1 Tubus obiektywu, głębokość gwintu 0,50"Thorlabs, Inc.SM1L05
Filtr pasmowo-przepustowy 440/40 (wzbudzenie)Filtr pasmowo-przepustowyChroma CorporationET440/40x
525/36 (emisja)Chroma CorporationET525/36m
Zestaw szybkiego zestawu obudowyEpoxy Loctite1395391
455 nm - zasilaczLED3 W ALK-LH-3W-KIT
1" Dublet achromatyczny, f = 50 mmThorlabs, Inc.AC254-050-A
Flea 3 Monochromatyczna kamera USBPunkt szary, Inc.FL3-U3-32S2M-CS
0,5" Uchwyt na słupki, L = 1,5"Thorlabs, Inc.PH1.5
0,5" Słupek optyczny, L = 4,0"Thorlabs, Inc.TR4
, 1" x 2.3" x 3/8"Thorlabs, Inc.BA1S
źródło światła o długiej żywotności (Vis-NIR)Ocean OpticsHL-2000-LL
20-krotny obiektyw planowyOlympus Edmund Optics, Inc.PLN20X
Wykonane na zamówienie aluminiowe ramię silnikaN/AN/ASpecjalnie zaprojektowane i zbudowane
Niestandardowe aluminiowe ramię silnika AdapterN/AN/ASpecjalnie zaprojektowane i zbudowane
Niestandardowe aluminiowe obudowy silnikaN/AN/ASpecjalnie zaprojektowany i zbudowany
silnik krokowy - 400 kroków / obrótSparkFun ElectronicsROB-10846Wielokrotny dostawcy
Wykonany na zamówienie aluminiowy przełącznik światłowodowyN/AN/ASpecjalnie zaprojektowany i zbudowany
Wykonany na zamówienie aluminiowy przełącznik światłowodowy Płyta czołowaN/AN/ASpecjalnie zaprojektowane i zbudowane
Arduino Uno - R3SparkFun ElectronicsDEV-11021Wielu dostawców
Elektroniczna płytka stykowa - samoprzylepnaSparkFun ElectronicsPRT-12002Wielu dostawców
EasyDriver - Sterownik silnika krokowegoSparkfun ElectronicsROB-12779
Zasilacz 12 V, 229 mAPhihongPSM03AWielu dostawców
Spektrometr USB o zwiększonej czułości (Vis-NIR)Ocean OpticsUSB2000+VIS-NIR-ES
550 µ m, 0,22 NA, światłowodowy SMA-SMAThorlabs, Inc.M37L01
Niestandardowa sonda światłowodowaMyriad Fiber ImagingN/A
20% Spectralon Diffuse Reflectance StandardLabsphere, Inc.SRS-20-010
Standardowy żółty rozświetlaczSharpie25005Wielu dostawców, można zastąpić proflawinę lub fluoresceinę
lampy LED Podstawa montażowa Wolframowo-halogenowe

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
  2. Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
  3. Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
  4. Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
  5. Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
  6. Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027(2010).
  7. Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598(2015).
  8. Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
  9. Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
  10. Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
  11. Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
  12. Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
  13. Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
  14. Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
  15. Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
  16. Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002(2014).
  17. Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
  18. Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
  19. Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512(2010).
  20. Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
  21. Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
  22. Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
  23. Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001(2015).
  24. Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501(2008).
  25. Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001(2012).
  26. Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
  27. Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
  28. Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002(2015).
  29. Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012(2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fiber bundle MicroendoscopyFluorescence Microendoscopy ImagingDiffuse Reflectance SpectroscopyTissue Micro architectureHemoglobin ConcentrationMelanin ConcentrationOxygen SaturationOptical Probe ConstructionInstrumentation CalibrationIn Vivo Tissue Analysis

Related Articles