Opisano montaż i użycie multimodalnego mikroendoskopu, który może rejestrować dane obrazu tkanek powierzchownych z parametrami fizjologicznymi tkanek, w tym stężeniem hemoglobiny, stężeniem melaniny i nasyceniem tlenem. Technika ta może być przydatna do oceny struktury tkanki i perfuzji oraz może być zoptymalizowana pod kątem indywidualnych potrzeb badacza.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Multimodalna platforma obrazowania i spektroskopii mikroendoskopii z wiązkami włókien do nieinwazyjnej analizy tkanek in vivo
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Najnowsze techniki mikroendoskopii z wiązkami włókien umożliwiają nieinwazyjną analizę tkanek in vivo przy użyciu technik obrazowania lub kombinacji technik spektroskopiowych. Połączenie technik obrazowania i spektroskopii w jednej sondzie optycznej może zapewnić pełniejszą analizę stanu tkanek . W tym artykule połączono dwie różne modalności, obrazowanie mikroendoskopowe fluorescencji o wysokiej rozdzielczości i spektroskopię odbicia rozproszonego, w jednej sondzie optycznej. Obrazowanie mikroendoskopowe fluorescencyjne o wysokiej rozdzielczości jest techniką stosowaną do wizualizacji mikroarchitektury tkanki wierzchołkowej i, chociaż jest to głównie technika jakościowa, wykazała skuteczne różnicowanie w czasie rzeczywistym między tkanką nowotworową i nienowotworową. Spektroskopia odbicia dyfuzyjnego to technika, która pozwala na wyodrębnienie parametrów fizjologicznych tkanek, w tym lokalnego stężenia hemoglobiny, stężenia melaniny i nasycenia tlenem. W tym artykule opisano specyfikacje wymagane do skonstruowania sondy światłowodowej, sposób budowy oprzyrządowania, a następnie zademonstrowano technikę na ludzkiej skórze in vivo. Prace te ujawniły, że mikroarchitektura tkanek, w szczególności keratynocyty wierzchołkowe skóry, mogą być współrejestrowane z powiązanymi z nimi parametrami fizjologicznymi. Prezentowane tutaj oprzyrządowanie i sonda światłowodowa mogą być zoptymalizowane jako urządzenie przenośne lub kompatybilne endoskopowo do stosowania w różnych układach narządów. Potrzebne są dodatkowe badania kliniczne, aby przetestować skuteczność tej techniki w różnych stanach choroby nabłonka.
Wprowadzenie
Techniki mikroendoskopii wiązkowej zazwyczaj analizują tkankę in vivo z wykorzystaniem technik obrazowania lub kombinacji technik spektroskopowych.1-3 Jedną z takich technik obrazowania jest mikroendoskopia fluorescencyjna o wysokiej rozdzielczości, która pozwala na obrazowanie mikroarchitektury tkanki wierzchołkowej z rozdzielczością podkomórkową w małym, mikroskalowym polu widzenia, przy użyciu miejscowego środka kontrastowego, takiego jak proflawina, fluoresceina lub tusz pyraninowy.1,3-11 Ta metoda obrazowania wykazała obiecującą skuteczność kliniczną w jakościowym różnicowaniu w czasie rzeczywistym tkanki nabłonkowej chorobowej i zdrowej przy niskiej zmienności między obserwatorami.8 Okazjonalnie badacze wykorzystują dane z mikroskopii fluorescencyjnej o wysokiej rozdzielczości do wyodrębniania cech ilościowych, takich jak rozmiar komórek i jąder lub powierzchnia gruczołu, jednak pozostaje ona przede wszystkim techniką jakościową nakierowaną na wizualizację morfologii tkanki.1,3,8-10 Z drugiej strony, techniki spektroskopowe, takie jak spektroskopia odbicia rozproszonego, są ukierunkowane na dostarczanie funkcjonalnych informacji o tkance i wykazały obiecującą skuteczność kliniczną w ilościowej identyfikacji zmian nowotworowych w wielu narządach.2,12-15
W związku z tym istnieje potrzeba opracowania urządzenia łączącego oba typy modalności, aby potencjalnie jeszcze bardziej zmniejszyć zmienność międzyobserwatorową, zachować wizualizację mikroarchitektury tkanki w czasie rzeczywistym i zapewnić pełniejszą analizę stanu zdrowia tkanki. Aby osiągnąć ten cel, zbudowano multimodalny instrument oparty na sondzie, który łączy dwie modalności w jednej sondzie światłowodowej: mikroendoskopię fluorescencyjną o wysokiej rozdzielczości oraz spektroskopię odbiciową poddyfuzyjną.11 Metoda ta współrejestruje jakościowe obrazy morfologii tkanki apikalnej o wysokiej rozdzielczości (właściwości strukturalne) z ilościowymi informacjami spektralnymi (właściwości funkcjonalne) z dwóch różnych głębokości tkanki, obejmując lokalne stężenie hemoglobiny ([Hb]), stężenie melaniny ([Mel]) oraz saturację tlenem (SaO2).11,12,16 Ta konkretna modalność spektroskopii odbiciowej poddyfuzyjnej wykorzystuje dwa odstępy źródło-detektor (SDS) do próbkowania dwóch unikalnych głębokości tkanki, co pozwala na uzyskanie bardziej kompleksowego obrazu stanu zdrowia tkanki poprzez próbkowanie aż do błony podstawnej i leżącego pod nią zrębu tkanki.11
Sonda światłowodowa składa się z centralnego włókna obrazującego o średnicy 1 mm, zawierającego około 50 000 elementów włóknistych o średnicy 4,5 µm, z płaszczem o średnicy 1,1 mm i całkowitą średnicą powłoki wynoszącą 1,2 mm. Włókno obrazujące jest otoczone pięcioma włóknami o średnicy 200 µm i średnicach płaszcza 220 µm. Każde wielomodowe włókno 200 µm znajduje się w odległości 864 µm (mierzonej od środka do środka) od centrum włókna obrazującego. Poszczególne wielomodowe włókna 200 µm są rozmieszczone co 25°. Przyjmując najbardziej lewe wielomodowe włókno 200 µm jako włókno „źródłowe”, a pozostałe trzy wielomodowe włókna 200 µm jako włókna „zbierające”, taka geometria tworzy trzy odległości SDS (mierzone od środka do środka) wynoszące odpowiednio 374 µm, 730 µm, 1 051 µm i 1 323 µm. Końcówki włókien są zamknięte w cylindrycznej metalowej obudowie, która utrzymuje stałe odległości między włóknami. Średnica cylindrycznej metalowej obudowy wynosi 3 mm. Odcinek dystalny (w stronę końcówki sondy światłowodowej) sondy światłowodowej ma długość 2 stóp. Następnie sonda rozdziela się na sześć poszczególnych włókien na końcu proksymalnym (w stronę aparatury), który ma dodatkowe 2 stopy długości, co daje całkowitą długość 4 stóp. Rysunek 1 przedstawia schemat sondy światłowodowej.
Rycina 1: Projekt sondy światłowodowej. Sonda światłowodowa składa się z jednego włókna obrazującego o średnicy 1 mm i czterech włókien wielomodowych o średnicy 200 µm. Na rycinie przedstawiono (a) metalową nasadkę końcową, która stabilizuje geometrię włókien na końcówce sondy, aby uzyskać SDS wynoszące 374, 730 i 1 051 µm względem najbardziej lewego włókna wielomodowego 200 µm (pasek skali ≈ 1 mm), (b) włókna unieruchomione w metalowej nasadce, z zaznaczonymi rdzeniami, płaszczami i powłokami włókien (pasek skali ≈ 1 mm), (c) ochronną osłonę poliamidową wokół włókien (pasek skali ≈ 1 mm), (d) gotową końcówkę dystalną sondy z metalowym uchwytem i pojedynczym czarnym kablem zawierającym wszystkie włókna (pasek skali ≈ 4 mm) oraz (e) zdjęcie końcówki dystalnej sondy (pasek skali ≈ 4 mm). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
To multimodalne oprzyrządowanie i powiązana z nim technika stanowią pierwsze połączenie tych modalności w obrębie jednej sondy, choć istnieją inne łączone techniki strukturalno-funkcjonalne wykorzystujące różne modalności. Na przykład obrazowanie hiperspektralne łączy obrazowanie szerokopolowe z ilościową analizą właściwości hemoglobiny i melaniny,17,18 a inne opracowane techniki łączą optyczną tomografię koherencyjną (OCT) z analizą ekspresji białek tkankowych,19 wymieniając jedynie niektóre z nich. Niniejszy artykuł opisuje kompaktowy i łatwy w implementacji zestaw aparatury wykorzystujący ogólną sondę światłowodową, którą można zoptymalizować do różnych celów, w tym do zastosowań endoskopowych w dolnym odcinku przewodu pokarmowego i przełyku lub jako sondę ręczną do użytku w jamie ustnej i na powierzchni skóry.11,20
Sprzęt dla tej aparatury wymaga zarówno specjalistycznego kodu do akwizycji danych, jak i kodu do postprocessingu, aby pozyskać widma odbicia rozproszonego, a następnie wyodrębnić wynikowe parametry fizjologiczne tkanki uśrednione objętościowo, w tym [Hb], [Mel] oraz SaO2. Specjalistyczny kod akwizycji danych został opracowany w celu umożliwienia jednoczesnego pobierania danych z kamery (do fluorescencyjnej mikroskopii o wysokiej rozdzielczości) oraz ze spektrometru (do spektroskopii odbicia rozproszonego). Sterowniki są często dostępne na stronach internetowych producentów, co umożliwia integrację z różnymi językami programowania. Specjalistyczny kod postprocessingu importuje wartości absorpcji a priori dla in vivo [Hb] i [Mel]21, a następnie wykorzystuje wcześniej opracowany proces nieliniowej optymalizacji dopasowania, który tworzy krzywą dopasowaną do widm.22 Krzywa dopasowana jest budowana poprzez minimalizację wartości χ2 między nią a surowymi widmami oraz wyznaczanie parametrów fizjologicznych tkanki ([Hb], [Mel] oraz SaO2) z krzywej dopasowanej o najniższej wartości χ2 .22 Kod można zmodyfikować tak, aby uwzględniał również absorpcję innych chromoforów, takich jak zastosowany tutaj egzogenny tusz pyraninowy, tak aby docelowe parametry fizjologiczne nie zostały zaburzone.
Wskaźniki fizjologiczne stanu tkanek, takie jak [Hb], [Mel] i SaO2, mogą służyć jako raporty z odpowiedzi guza na terapię lub jako wskaźniki lokalnej waskularyzacji i angiogenezy.14,23 Zastosowanie modalności wysokorozdzielczej mikroendoskopii fluorescencyjnej pomaga w prowadzeniu sondy i dostarcza badaczom pełniejszego obrazu zależności między strukturą a funkcją tkanki nabłonkowej. W niniejszym artykule opisano konstrukcję i zastosowanie multimodalnego mikroendoskopu.11
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Zatwierdzenie Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej (IRB #15-09-149) uzyskano z programu Badań na Ludziach na University of Arkansas dla wszystkich aspektów niniejszego badania. Opisane metody zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi wytycznymi, a od wszystkich uczestników uzyskano świadomą zgodę.
1. Montaż modułu wysokorozdzielczej mikroendoskopii fluorescencyjnej
Uwaga: Opisane kroki montażu modułu wysokorozdzielczej mikroendoskopii fluorescencyjnej można zobaczyć na Ryc. 2.
- Umieszczenie lustra dichroicznego 470 nm w kostce klatkowej (cage cube) 30 mm.
- Należy pobrać kostkę klatkową 30 mm i wyjąć uchwyt filtra dichroicznego.
- W uchwycie filtra dichroicznego należy umieścić lustro dichroiczne 470 nm.
- Należy ponownie włożyć i zabezpieczyć uchwyt filtra dichroicznego wewnątrz kostki klatkowej.
- Mocowanie prętów zespołu klatkowego do kostki klatkowej 30 mm.
- Do przedniej części kostki klatkowej należy przymocować cztery pręty zespołu klatkowego o długości 1,5 cala.
- Do prawej strony kostki klatkowej należy przymocować cztery pręty zespołu klatkowego o długości 3,0 cala.
- Do lewej strony kostki klatkowej należy przymocować ukośnie dwa pręty zespołu klatkowego o długości 2,0 cala.
- Budowa zespołu płyty klatkowej i tubusu soczewkowego.
- Należy pobrać gwintowaną płytę klatkową 30 mm o rozmiarze 1,0 cala i za pomocą odpowiedniego gwintu przymocować do jej wewnętrznej strony beznaprężeniowy pierścień mocujący.
- Do beznaprężeniowego pierścienia mocującego należy wkręcić tubus soczewkowy 1,0 cala.
- Do tubusu soczewkowego 1,0 cala należy przymocować drugą gwintowaną płytę klatkową 30 mm o rozmiarze 1,0 cala i wyregulować standardowe pierścienie mocujące tak, aby obie płyty klatkowe były zlicowane.
- Wsuniecie zespołu płyty klatkowej i tubusu soczewkowego 1,0 cala na lewą stronę kostki klatkowej 30 mm.
- Budowa zespołu uchwytu lustra prawokątnego.
- Należy pobrać uchwyt lustra prawokątnego oraz 1,0-calowe aluminiowe lustro z powłoką UV.
- Należy umieścić 1,0-calowe aluminiowe lustro z powłoką UV w uchwycie lustra i dokręcić.
- Do przedniej części uchwytu lustra należy przymocować cztery pręty zespołu klatkowego o długości 2,0 cala.
- Do prawej strony kostki klatkowej należy przymocować ukośnie dwa pręty zespołu klatkowego o długości 2,0 cala.
- Połączenie zespołu uchwytu lustra prawokątnego z lewą stroną zespołu płyty klatkowej i tubusu soczewkowego 1,0 cala poprzez wprowadzenie przeciwległych prętów zespołu klatkowego przez odpowiednie otwory płyty klatkowej 30 mm.
- Przełożenie uchwytu translacyjnego osi z przez 3,0-calowe pręty zespołu klatkowego po prawej stronie zespołu.
- Przymocowanie achromatycznego obiektywu 10X do uchwytu translacyjnego osi z.
- Budowa zespołu płyty adaptera światłowodowego 1,0 cala i uchwytu soczewkowego translacyjnego osi xy.
- Należy pobrać uchwyt translacyjny osi xy oraz 1,0-calową płytę adaptera światłowodowego.
- Należy przymocować 1,0-calową płytę adaptera światłowodowego w uchwycie soczewkowym translacyjnym osi xy.
- Wsuniecie zespołu adaptera światłowodowego i uchwytu soczewkowego translacyjnego osi xy 1,0 cala przed obiektyw.
- Należy pobrać dwa tubusy soczewkowe o długości 0,5 cala i średnicy 1,0 cala, jeden filtr pasmowo-przepuszczalny 440/40 nm (filtr wzbudzenia) oraz jeden filtr pasmowo-przepuszczalny 525/36 nm (filtr emisji).
- Każdy filtr należy umieścić w tubusie soczewkowym o długości 0,5 cala i średnicy 1,0 cala w taki sposób, aby strzałka na zewnętrznej stronie filtra była skierowana w stronę tubusu z gwintem zewnętrznym.
- Mocowanie filtrów do zespołu.
- Należy pobrać dwa standardowe pierścienie mocujące.
- Filtry wewnątrz tubusów soczewkowych o długości 0,5 cala i średnicy 1,0 cala należy zabezpieczyć standardowymi pierścieniami mocującymi.
- Tubus soczewkowy z filtrem wzbudzenia należy wkręcić w przednią część kostki klatkowej 30 mm, a tubus soczewkowy z filtrem emisji wkręcić w uchwyt lustra prawokątnego.
- 0,5-calowy tubus soczewkowy z filtrem emisji należy wkręcić w przednią część uchwytu lustra prawokątnego.
- Należy pobrać dwie gwintowane płyty klatkowe 30 mm o rozmiarze 1,0 cala i umieścić je przed 0,5-calowymi tubusami soczewkowymi o średnicy 1,0 cala zawierającymi filtry.
- Używając epoksydowej lub mocnej substancji klejącej, należy przymocować diodę LED 455 nm do płyty klatkowej połączonej z filtrem wzbudzenia.
- Należy pobrać jeden tubus soczewkowy o długości 0,5 cala i średnicy 1,0 cala oraz 1,0-calową soczewkę tubusową dublet achromatyczny o ogniskowej 50 mm.
- Soczewkę tubusową należy umieścić w tubusie soczewkowym tak, aby strzałka na zewnętrznej stronie soczewki była skierowana w stronę tubusu z gwintem zewnętrznym.
- Wkręcenie soczewki tubusowej do zespołu.
- Należy pobrać jeden standardowy pierścień mocujący.
- Soczewkę wewnątrz tubusu soczewkowego o długości 0,5 cala i średnicy 1,0 cala należy zabezpieczyć standardowym pierścieniem mocującym.
- Tubus soczewkowy z soczewką tubusową należy przymocować do najbardziej lewej płyty klatkowej.
- Przed 0,5-calowym tubusem soczewkowym o średnicy 1,0 cala zawierającym soczewkę tubusową należy umieścić płytę klatkową 30 mm.
- Do wewnętrznej strony płyty klatkowej 30 mm należy przymocować beznaprężeniowy pierścień mocujący.
- Za pomocą beznaprężeniowego pierścienia mocującego do płyty klatkowej należy przymocować monochromatyczną kamerę USB.
- Montaż urządzeń mocujących na słupkach optycznych.
- Należy pobrać cztery uchwyty słupków 0,5 cala, cztery słupki optyczne 0,5 cala oraz cztery podstawy montażowe.
- Słupki optyczne 0,5 cala należy przymocować w uchwytach słupków 0,5 cala.
- Uchwyty słupków 0,5 cala należy przymocować do podstaw montażowych.
- Cztery urządzenia mocujące na słupkach optycznych należy wkręcić w otwory śrubowe znajdujące się pod kostką klatkową 30 mm, uchwytem lustra prawokątnego, płytą klatkową połączoną z diodą LED oraz płytą klatkową połączoną z kamerą.
- Aby zakończyć budowę modułu wysokorozdzielczej mikroendoskopii fluorescencyjnej, cztery urządzenia mocujące na słupkach optycznych należy przykręcić do płyty optycznej lub stołu optycznego.
Rycina 2: Montaż modułu wysokorozdzielczej mikroendoskopii fluorescencyjnej. Moduł wysokorozdzielczej mikroendoskopii fluorescencyjnej można zbudować, wykorzystując obudowę z komponentów o średnicy 1,0 cala, zachowując szczególną ostrożność podczas manipulowania lustrem dichroicznym, obiektywem, filtrami wzbudzenia/emisji oraz soczewką tubusową. Szklane powierzchnie tych elementów należy ostrożnie czyścić za pomocą papieru do soczewek. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.
2. Montaż modułu spektroskopii odbiciowej podpowierzchniowej
Uwaga: Opisane kroki montażu modułu spektroskopii odbicia podpowierzchniowego można zobaczyć na Rysunku 3.
- Należy pozyskać źródło światła wolframowo-halogenowe, a następnie za pomocą epoksydu lub mocnego kleju przymocować z przodu gwintowaną płytkę klatkową 30 mm o rozmiarze 1,0 cala.
- Przymocuj cztery pręty zespołu klatki o długości 3,0 cala do płyty klatki.
- Przymocuj uchwyt translacyjny osi z do prętów zestawu klatkowego.
- Wkręć achromatyczny obiektyw 20X do uchwytu translacyjnego osi z.
- Zbuduj zespół płyty adaptera światłowodowego/uchwytu soczewki z translacją w osiach X-Y.
- Należy pozyskać uchwyt translacyjny w osiach xy oraz płytkę adapterową do światłowodów o rozmiarze 1,0 cala.
- Zamocuj płytkę adaptera światłowodowego w uchwycie soczewki z translacją w osiach xy.
- Przesuń zespół adaptera światłowodowego 1,0 cala i uchwytu translacyjnego xy przed obiektyw.
- Zmontuj zespół ramienia silnika.
- Należy przygotować wykonane na zamówienie aluminiowe ramię silnika oraz jedną płytkę adaptera do światłowodu SMA.
- Wkręć płytkę adaptera światłowodowego (z gwintem zewnętrznym) do alumionowego ramienia silnika (z gwintem wewnętrznym).
- Przymocuj wykonany na zamówienie aluminiowy adapter ramienia silnika do ramienia silnika za pomocą czterech śrub #4-40 o długości 0,5 cala.
- Zmontuj zespół silnik/ramię silnika/obudowa silnika.
- Należy przygotować wykonaną na zamówienie aluminiową obudowę silnika oraz silnik krokowy 400-krokowy.
- Dopasuj otwory na śruby w silniku krokowym i obudowie silnika, a następnie zabezpiecz je czterema śrubami #4-40 o długości 0,5 cala.
- Wprowadź obracający się trzpień silnika krokowego przez otwór w zestawie ramienia silnika i dokręć śrubę blokującą w aluminiowym adapterze ramienia silnika.
- Zmontuj zespół przełącznika optycznego.
- Należy przygotować wykonany na zamówienie aluminiowy przełącznik optyczny oraz trzy płytki adapterowe do światłowodów o rozmiarze 1,0 cala.
- Wkręć płytki adapterowe w gwintowane otwory w przełączniku optycznym.
- Przymocuj wykonaną na zamówienie aluminiową płytę przednią przełącznika optycznego do przełącznika optycznego za pomocą czterech śrub #4-40 o długości 0,5 cala.
- Przymocuj zespół silnika/ramienia silnika/obudowy silnika do przełącznika optycznego, przerowadzając obrotowy trzpień silnika krokowego przez otwór centralny przełącznika optycznego.
- Należy przygotować płytkę drukowaną oraz sterownik silnika krokowego, a następnie umieścić sterownik silnika krokowego w poprzek centralnego rowka płytki stykowej.
- Zapoznaj się ze schematem połączeń elektrycznych (Rysunek 3, 2,12) dla sterownika silnika krokowego, zasilacza 12 V i silnika krokowego.
- Podłącz sterownik silnika krokowego, zasilacz 12 V oraz silnik krokowy zgodnie ze schematem ideowym (Rycina 3, 2.12) w celu ukończenia budowy zmotoryzowanego przełącznika optycznego.
- Przykręć komponenty przełącznika optycznego oraz źródło światła wolframowo-halogenowego do płyty optycznej lub stołu optycznego w pobliżu wcześniej przygotowanego (Rysunek 2, 1.24) montaż mikroendoskopu fluorescencyjnego o wysokiej rozdzielczości.
- Przymocuj jeden koniec... 550 µmkabel patchowy o NA 0,22 do płytki adaptera światłowodowego o średnicy 1,0 cala w zespole ramienia silnika.
- Przymocuj drugi koniec 550 µm, kabel patchowy o NA 0,22 do złącza światłowodowego spektrometru USB.
- Przykręć pięć dystalnych kabli sondy do odpowiednich 1,0-calowych płytek adapterów światłowodowych w oprzyrządowaniu, aby ukończyć montaż multimodalnego mikroendoskopu światłowodowego do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i spektroskopii odbiciowej podpowierzchniowej.
- Wkręć centralny światłowód obrazujący o średnicy 1 mm do płyty adapterowej do światłowodów o rozmiarze 1,0 cala, wspomnianej w kroku 1.9.2.
- Wkręć najbardziej lewą śrubę 200 µm kabel światłowodowy wielomodowy do 1,0-calowej płyty adaptacyjnej światłowodowej wspomnianej w kroku 2.6.
- Wkręć 2nd 200 µm kabel światłowodowy wielomodowy do znajdującego się po lewej stronie adaptera światłowodowego o rozmiarze 1,0 cala, przymocowanego do lampy wolframowo-halogenowej wspomnianej w kroku 2.9.2.
- Wkręć 3B&R 200 µm kabel światłowodowy wielomodowy do środkowej 1,0-calowej płyty adaptacyjnej światłowodowej wspomnianej w kroku 2.9.2.
- Przykręć 4th 200 µm kabel światłowodowy wielomodowy do znajdującej się po prawej stronie płyty adapterowej światłowodowej o szerokości 1,0 cala, wspomnianej w kroku 2.9.2.
Rysunek 3: Montaż modułu spektroskopii odbicia podpowierzchniowego. Moduł spektroskopii odbicia podpowierzchniowego można zbudować, wykorzystując podstawową lampę wolframowo-halogenową sprzężoną z obiektywem w celu skupienia światła przez 200 µm wielomodowe światłowód dostawczy oraz spektrometr. Dodatkowo, w torze lampa-światłowód-spektrometr można zamontować niestandardowy zmotoryzowany przełącznik optyczny, aby przełączać się między poszczególnymi SDS. Badacze używający wielu spektrometrów do pomiarów z wielu SDS mogą pominąć komponent przełącznika optycznego. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.
3. Kalibracja modułu spektroskopii odbicia podpowierzchniowego
Uwaga: Następujące kroki (sekcja 3) muszą zostać wykonane przed rozpoczęciem zbierania danych spektralnych (sekcja 4).
- Włącz wszystkie komponenty aparatury, w tym diodę LED 455 nm, szerokopasmową lampę wolframowo-halogenową, kamerę CMOS, spektrometr USB, silnik krokowy oraz płytkę sterowania silnikiem. Upewnij się, że migawka lampy wolframowo-halogenowej jest otwarta.
- Wyłącz całe światło zewnętrzne.
- Uruchom dedykowane oprogramowanie do akwizycji danych.
- Pozostaw urządzenie włączone przez 30 min, aby lampa osiągnęła odpowiednią temperaturę, a szum własny spektrometru uległ stabilizacji.
- Umieść wzorzec dyfuzyjnego odbicia 20% w dolnym otworze specjalnie zaprojektowanego, wydrukowanego w technologii 3D urządzenia do kalibracji.
- Umieść sondę światłowodową w najbardziej lewym slocie dedykowanego, wydrukowanego w technologii 3D uchwytu na światłowód, pokazanego na Rysunku 4. Najbardziej lewy slot ustala prostopadłą odległość od końcówki sondy światłowodowej do wzorca odbicia na poziomie 2,1 mm, co jest odległością optymalną, przy której sygnał docierający do spektrometru jest maksymalizowany dla pierwszego SDS o rozmiarze 374 µm.
- Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w skrajnej lewej pozycji, tak aby spektrometr był połączony z pierwszym SDS o rozmiarze 374 µm.
- Ustaw czas całkowania na 500 msec. Czas całkowania musi być dobrany tak, aby nie nasycić spektrometru, zachowując jednocześnie praktycznie niski czas całkowania.
- Pozyskaj widmo, Rmax,374µm, klikając „Acquire Spectrum” w oprogramowaniu.
- Zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej i zarejestruj widmo szumu tła, Rdark,374µm, klikając „Acquire Spectrum” w oprogramowaniu. Po pozyskaniu widma ponownie otwórz migawkę.
- Umieść sondę światłowodową w najbardziej prawym slocie dedykowanego, wydrukowanego w technologii 3D uchwytu na światłowód, pokazanego na Rysunku 4. Najbardziej prawy slot ustala prostopadłą odległość od końcówki sondy światłowodowej do wzorca odbicia na poziomie 3,9 mm, co jest odległością optymalną, przy której sygnał docierający do spektrometru jest maksymalizowany dla drugiego SDS o rozmiarze 730 µm.
- Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w pozycji środkowej, tak aby spektrometr był połączony z drugim SDS o rozmiarze 730 µm.
- Pozyskaj widmo, Rmax,730µm, klikając „Acquire Spectrum” w oprogramowaniu.
- Zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej i zarejestruj widmo szumu tła, Rdark,730µm, klikając „Acquire Spectrum” w oprogramowaniu.
- Ponownie otwórz migawkę.
Rysunek 4: Kalibracja modalności spektroskopii refleksji podpowierzchniowej. W celu kalibracji przedeksperymentalnej końcówka sondy światłowodowej musi zostać umieszczona w różnych odległościach prostopadłych od wzorca refleksji rozproszonej 20% w zależności od SDS. Aby konsekwentnie uzyskiwać te odległości prostopadłe we wszystkich eksperymentach, zaprojektowano urządzenie do kalibracji wzorca (przekrój urządzenia pokazany na (a)), które utrzymuje sondę w dokładnych odległościach od wzorca refleksji rozproszonej 20%. W tej konkretnej konfiguracji sondy światłowodowej światło z lampy wolframowo-halogenowej przechodzi przez przełącznik optyczny przy odstępach źródło-detektor wynoszących (b) 374 µm i (c) 730 µm (z silnikiem i ramieniem silnika usuniętymi z toru optycznego dla przejrzystości). Do kalibracji wymagane są odległości (d) 2,1 mm dla SDS 374 µm oraz (e) 3,9 mm dla SDS 730 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.
4. Pozyskiwanie danych in vivo oraz wyznaczanie właściwości optycznych ludzkiej skóry
W tej sekcji technika multimodalnego mikroendoskopu zostanie zademonstrowana na ludzkiej skórze in vivo.
- Otwórz dedykowane oprogramowanie do akwizycji danych i dostosuj czas całkowania spektrometru, klikając „Integration Time” i ustawiając go na taką samą wartość, jaka była stosowana podczas kalibracji, co w tym przypadku wynosiło 500 msec (krok 3.8).
- Wyznacz obszar skóry, z którego będą pobierane dane, co może zależeć od decyzji badacza. W tym przypadku do demonstracji wybrano cienką skórę przedramienia.
- Jeśli obszar skóry jest owłosiony, usuń włosy za pomocą jednorazowej sterylnej maszynki do golenia.
- Użyj standardowego żółtego zakreślacza zawierającego atrament z pyraniną i lekko zaznacz wybrany obszar skóry.
- Włącz diodę LED 455 nm i zamknij migawkę lampy wolframowo-halogenowej.
- Przyłóż sondę delikatnie do skóry.
- Przesuwaj sondę po zabarwionym obszarze tkanki, aby wyświetlić w oknie oprogramowania obraz na żywo w wysokiej rozdzielczości przedstawiający architekturę apikalną keratynocytów.
- Wybierz odpowiedni czas ekspozycji i wzmocnienie (w tym przypadku 150 msec i wzmocnienie 10 dB), aby uniknąć nasycenia obrazu, klikając „Exposure Time” i „Gain”, wpisując odpowiednie wartości, a następnie klikając „Apply Settings” w interfejsie oprogramowania.
- Wykonaj zdjęcie, klikając „Acquire Image” w interfejsie oprogramowania.
- Trzymając sondę w tym samym miejscu obrazowania, wyłącz diodę LED 455 nm i otwórz migawkę lampy wolframowo-halogenowej.
- Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w pozycji lewej, tak aby spektrometr był połączony z drugim SDS o szerokości 374 µm.
- Zbierz widma, Rtissue,374µm, klikając „Acquire Spectra” w interfejsie oprogramowania.
- Ustaw zmotoryzowany przełącznik optyczny w pozycji środkowej, tak aby spektrometr był połączony z drugim SDS o szerokości 730 µm.
- Zbierz widma, Rtissue,730µm, klikając „Acquire Spectra” w interfejsie oprogramowania.
- Otwórz dedykowane oprogramowanie do postprocesingu.
- Uruchom oprogramowanie do postprocesingu, klikając „Run”, a następnie, gdy oprogramowanie o to poprosi, wybierz z folderu, w którym zapisano dane: obraz fluorescencyjny w wysokiej rozdzielczości, cztery widma kalibracyjne oraz dwa widma in vivo.
UWAGA: Dedykowane oprogramowanie wyznacza rzeczywiste absolutne odbicie (Rabs,374µm oraz Rabs,730µm) przy użyciu następujących równań.
Kod do postprocesingu, jak opisano wcześniej, oblicza krzywą dopasowaną do widm odbicia rozproszonego (równania 1 i 2), a następnie wyznacza fizjologiczne parametry tkanki, w tym ([Hb], [Mel] oraz SaO2).11,22,24
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Postępując zgodnie z niniejszym protokołem, badacz uzyska ostry obraz o wysokiej rozdzielczości miejsca tkanki z pełnym polem widzenia (Rysunek 5). Kontury komórek są widoczne, jeśli zostaną zabarwione tuszem piraninowym ze standardowego żółtego zakreślacza, natomiast poszczególne jądra komórkowe są widoczne po zabarwieniu barwnikiem, takim jak proflawina. Po akwizycji spektralnej oprogramowanie do przetwarzania danych wykorzystuje wiedzę a priori na temat stęże...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisywany tutaj multimodalny mikroendoskop światłowodowy do obrazowania o wysokiej rozdzielczości i subdyfuzyjnej spektroskopii odbicia może być zoptymalizowany i wykorzystany przez badaczy do różnych zastosowań, w tym do użytku endoskopowego lub ręcznego w badaniach na ludziach lub zwierzętach. W ten sposób zapewnia elastyczną metodę wizualizacji mikroarchitektury tkanek wierzchołkowych in vivo wraz z pomiarami stężenia hemoglobiny, stężenia melaniny i nasycenia tkanek tlenem z dwóch różnych głębokości tkanki. ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Ten materiał jest oparty na pracach wspieranych przez National Institutes of Health (1R03-CA182052, 1R15-CA202662), National Science Foundation Graduate Research Fellowship Program (G.G., DGE-1450079), Arkansas Biosciences Institute oraz University of Arkansas Doctoral Academy Fellowship. Wszelkie opinie, ustalenia, wnioski lub zalecenia wyrażone w tym materiale są opiniami autorów i niekoniecznie odzwierciedlają poglądy uznanych agencji finansujących.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Kostka klatkowa 30 mm z mocowaniem filtra dichroicznego | Thorlabs, Inc. | CM1-DCH | |
| 470 nm Lustro dichroiczne (rozdzielacz wiązki) | Chroma Corporation | T470lpxr | |
| Pręt montażowy klatki, 1,5 cala, 4-pak | Thorlabs, Inc. | ER1.5-P4 | |
| Pręt montażowy koszyka, 3,0", 4-pak | Thorlabs, Inc. | ER3-P4 | |
| Pręt montażowy koszyka, 2.0", 4-pak | Thorlabs, Inc. | ER2-P4 SM1-Gwintowana | |
| płyta klatkowa 30 mm | Thorlabs, Inc. | CP02 | |
| Bezstresowy pierścień ustalający serii SM1 | Thorlabs, Inc. | SM1PRR | |
| SM1 Tubus obiektywu, głębokość gwintu 1,00" | Thorlabs, Inc. | SM1L10 | |
| Kątowe mocowanie lustra kinematycznego | Thorlabs, Inc. | KCB1 | |
| 1-calowe aluminiowe lustro wzmocnione promieniami UV | Thorlabs, Inc. | PF10-03-F01 | |
| Uchwyt translacyjny osi Z | Thorlabs, Inc. | SM1Z | |
| 10X Plan-achromatyczny obiektyw Olympus | Thorlabs, Inc. | RMS10X | |
| XY Mocowanie obiektywu translacyjnego | Thorlabs, Inc. | CXY1 | |
| SMA Płyta adaptera światłowodowego z gwintem SM1 | Thorlabs, Inc. | SM1SMA | |
| SM1 Tubus obiektywu, głębokość gwintu 0,50" | Thorlabs, Inc. | SM1L05 | |
| Filtr pasmowo-przepustowy 440/40 (wzbudzenie)Filtr pasmowo-przepustowy | Chroma Corporation | ET440/40x | |
| 525/36 (emisja) | Chroma Corporation | ET525/36m | |
| Zestaw szybkiego zestawu obudowy | Epoxy Loctite | 1395391 | |
| 455 nm - zasilacz | LED | 3 W ALK-LH-3W-KIT | |
| 1" Dublet achromatyczny, f = 50 mm | Thorlabs, Inc. | AC254-050-A | |
| Flea 3 Monochromatyczna kamera USB | Punkt szary, Inc. | FL3-U3-32S2M-CS | |
| 0,5" Uchwyt na słupki, L = 1,5" | Thorlabs, Inc. | PH1.5 | |
| 0,5" Słupek optyczny, L = 4,0" | Thorlabs, Inc. | TR4 | |
| , 1" x 2.3" x 3/8" | Thorlabs, Inc. | BA1S | |
| źródło światła o długiej żywotności (Vis-NIR) | Ocean Optics | HL-2000-LL | |
| 20-krotny obiektyw planowy | Olympus Edmund Optics, Inc. | PLN20X | |
| Wykonane na zamówienie aluminiowe ramię silnika | N/A | N/A | Specjalnie zaprojektowane i zbudowane |
| Niestandardowe aluminiowe ramię silnika Adapter | N/A | N/A | Specjalnie zaprojektowane i zbudowane |
| Niestandardowe aluminiowe obudowy silnika | N/A | N/A | Specjalnie zaprojektowany i zbudowany |
| silnik krokowy - 400 kroków / obrót | SparkFun Electronics | ROB-10846 | Wielokrotny dostawcy |
| Wykonany na zamówienie aluminiowy przełącznik światłowodowy | N/A | N/A | Specjalnie zaprojektowany i zbudowany |
| Wykonany na zamówienie aluminiowy przełącznik światłowodowy Płyta czołowa | N/A | N/A | Specjalnie zaprojektowane i zbudowane |
| Arduino Uno - R3 | SparkFun Electronics | DEV-11021 | Wielu dostawców |
| Elektroniczna płytka stykowa - samoprzylepna | SparkFun Electronics | PRT-12002 | Wielu dostawców |
| EasyDriver - Sterownik silnika krokowego | Sparkfun Electronics | ROB-12779 | |
| Zasilacz 12 V, 229 mA | Phihong | PSM03A | Wielu dostawców |
| Spektrometr USB o zwiększonej czułości (Vis-NIR) | Ocean Optics | USB2000+VIS-NIR-ES | |
| 550 µ m, 0,22 NA, światłowodowy SMA-SMA | Thorlabs, Inc. | M37L01 | |
| Niestandardowa sonda światłowodowa | Myriad Fiber Imaging | N/A | |
| 20% Spectralon Diffuse Reflectance Standard | Labsphere, Inc. | SRS-20-010 | |
| Standardowy żółty rozświetlacz | Sharpie | 25005 | Wielu dostawców, można zastąpić proflawinę lub fluoresceinę |
Bibliografia
- Muldoon, T. J., et al. Subcellular-resolution molecular imaging within living tissue by fiber microendoscopy. Opt Express. 15, 16413-16423 (2007).
- Rajaram, N., Reichenberg, J. S., Migden, M. R., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Pilot clinical study for quantitative spectral diagnosis of non-melanoma skin cancer. Lasers Surg Med. 42, 716-727 (2010).
- Louie, J. S., Richards-Kortum, R., Anandasabapathy, S. Applications and advancements in the use of high-resolution microendoscopy for detection of gastrointestinal neoplasia. Clin Gastroenterol Hepatol. 12, 1789-1792 (2014).
- Chang, S. S., et al. High resolution microendoscopy for classification of colorectal polyps. Endoscopy. 45, 553-559 (2013).
- Muldoon, T. J., et al. Noninvasive imaging of oral neoplasia with a high-resolution fiber-optic microendoscope. Head Neck. 34, 305-312 (2011).
- Muldoon, T. J., et al. Evaluation of quantitative image analysis criteria for the high-resolution microendoscopic detection of neoplasia in Barrett's esophagus. J Biomed Opt. 15, 026027(2010).
- Prieto, S. P., Powless, A. J., Boice, J. W., Sharma, S. G., Muldoon, T. J. Proflavine Hemisulfate as a Fluorescent Contrast Agent for Point-of-Care Cytology. PLoS One. 10, e0125598(2015).
- Parikh, N., et al. In vivo diagnostic accuracy of high resolution microendoscopy in differentiating neoplastic from non-neoplastic colorectal polyps: a prospective study. Am J Gastroenterol. 109, 68-75 (2014).
- Shin, D., et al. Quantitative analysis of high-resolution microendoscopic images for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma. Clin Gastroenterol Hepatol. 13, 272-279 (2015).
- Prieto, S. P., et al. Qualitative and quantitative comparison of colonic microendoscopy image features to histopathology. Proc SPIE Int Soc Opt Eng. 9328, (2015).
- Greening, G. J., et al. Fiber-bundle microendoscopy with sub-diffuse reflectance spectroscopy and intensity mapping for multimodal optical biopsy of stratified epithelium. Biomed Opt Express. 6, 4934-4950 (2015).
- Rajaram, N., Gopal, A., Zhang, X., Tunnell, J. W. Experimental validation of the effects of microvasculature pigment packaging on in vivo diffuse reflectance spectroscopy. Lasers Surg Med. 42, 680-688 (2010).
- Spliethoff, J. W., et al. Monitoring of tumor response to cisplatin using optical spectroscopy. Transl Oncol. 7, 230-239 (2014).
- Chang, V. T., et al. Quantitative physiology of the precancerous cervix in vivo through optical spectroscopy. Neoplasia. 11, 325-332 (2009).
- Yu, B., Shah, A., Nagarajan, V. K., Ferris, D. G. Diffuse reflectance spectroscopy of epithelial tissue with a smart fiber-optic probe. Biomed Opt Express. 5, 675-689 (2014).
- Hennessy, R., Goth, W., Sharma, M., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Effect of probe geometry and optical properties on the sampling depth for diffuse reflectance spectroscopy. J Biomedical Opt. 19, 107002(2014).
- Ghassemi, P., Travis, T. E., Moffatt, L. T., Shupp, J. W., Ramella-Roman, J. C. A polarized multispectral imaging system for quantitative assessment of hypertrophic scars. Biomed Opt Express. 5, 3337-3354 (2014).
- Vasefi, F., et al. Polarization-sensitive hyperspectral imaging in vivo: a multimode dermoscope for skin analysis. Sci Rep. 4, (2014).
- Winkler, A. M., Rice, P. F. S., Drezek, R. A., Barton, J. K. Quantitative tool for rapid disease mapping using optical coherence tomography images of azoxymethane-treated mouse colon. J Biomedl Opt. 15, 041512(2010).
- Bish, S. F., et al. Handheld Diffuse Reflectance Spectral Imaging (DRSi) for in-vivo characterization of skin. Biomed Opt Express. 5, 573-586 (2014).
- Prahl, S. A. Optical Absorption of Hemoglobin. , http://omlc.org/spectra/hemoglobin/ (1999).
- Rajaram, N., et al. Design and validation of a clinical instrument for spectral diagnosis of cutaneous malignancy. Appl Opt. 49, 142-152 (2010).
- Hennessy, R., Markey, M. K., Tunnell, J. W. Impact of one-layer assumption on diffuse reflectance spectroscopy of skin. J Biomed Opt. 20, 27001(2015).
- Rajaram, N., Nguyen, T. H., Tunnell, J. W. Lookup table-based inverse model for determining optical properties of turbid media. J Biomed Opt. 13, 050501(2008).
- Nichols, B. S., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Performance of a lookup table-based approach for measuring tissue optical properties with diffuse optical spectroscopy. J Biomed Opt. 17, 057001(2012).
- Greening, G. J., James, H. M., Muldoon, T. J. Optical Phantoms: Diffuse and Sub-diffuse Imaging and Spectroscopy Validation. , SPIE Spotlights. 1-37 (2015).
- Karsten, A. E., Smit, J. E. Modeling and verification of melanin concentration on human skin type. Photochem Photobiol. 88, 469-474 (2012).
- Glennie, D. L., Hayward, J. E., Farrell, T. J. Modeling changes in the hemoglobin concentration of skin with total diffuse reflectance spectroscopy. J Biomed Opt. 20, 035002(2015).
- Lim, L., Nichols, B., Rajaram, N., Tunnell, J. W. Probe pressure effects on human skin diffuse reflectance and fluorescence spectroscopy measurements. J Biomed Opt. 16, 011012(2011).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
