Wyzwalanie stresu i śmierci komórek za pomocą konwencjonalnej mikroskopii konfokalnej z laserem UV

Podsumowanie

Ukierunkowane manipulacje mające na celu wywołanie ukierunkowanego stresu lub śmierci w poszczególnych komórkach były stosunkowo trudne do osiągnięcia. W tym artykule opisano metodę ablacji w rozdzielczości pojedynczej komórki, polegającą na selektywnym stresowaniu i zabijaniu pojedynczych komórek w hodowli komórkowej i żywych zwierzętach, w oparciu o standardowy konfokalny laser UV.

Streszczenie

Używając standardowego ustawienia konfokalnego, metoda ablacji UV może być wykorzystana do selektywnego wywoływania uszkodzeń komórkowych i wizualizacji odpowiedzi pojedynczej komórki i interakcji komórka-komórka w OUN w czasie rzeczywistym. Wcześniej badanie tych specyficznych dla komórek reakcji po urazie często wymagało skomplikowanych konfiguracji lub przenoszenia komórek lub zwierząt do różnych, niefizjologicznych środowisk, co zakłócało natychmiastową i krótkoterminową analizę. Na przykład metody ablacji za pośrednictwem leków często nie mają specyficzności, która jest wymagana do badania odpowiedzi pojedynczych komórek i natychmiastowych interakcji komórka-komórka. Podobnie, podczas gdy metody ablacji laserowej impulsowej o dużej mocy zapewniają bardzo dobrą kontrolę i penetrację tkanek, wymagają specjalistycznego sprzętu, który może skomplikować wizualizację odpowiedzi komórkowych w czasie rzeczywistym. Opisane tutaj wyrafinowane podejście do ablacji laserem UV pozwala naukowcom na stres lub zabicie pojedynczej komórki w sposób zależny od dawki i czasu przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu konfokalnego wyposażonego w laser o długości fali 405 nm. Metodę tę zastosowano do selektywnej ablacji pojedynczego neuronu w gęstej sieci otaczających komórek w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego. Podejście to ujawniło zależną od dawki odpowiedź neuronów, którym uległa ablacja, powodując fragmentację ciał komórkowych i następczą degenerację wzdłuż aksonu w ciągu kilku minut do kilku godzin. Metoda ta pozwala naukowcom badać los pojedynczej umierającej komórki i, co ważne, natychmiastową reakcję komórek – takich jak mikroglej i astrocyty – otaczających miejsce ablacji.

Wprowadzenie

Mikroskopia fluorescencyjna od dawna jest używana do badania wpływu transgenów na OUN danio pręgowanego, szczególnie ich wpływu na rozwój¹. Mikroskopia o wysokiej rozdzielczości pozwoliła na szczegółowe odwzorowanie procesów komórkowych związanych z rozwojem mózgu, wytwarzaniem mięśni i wieloma innymi zdarzeniami rozwojowymi². Badanie śmierci pojedynczej komórki było trudniejsze, głównie ze względu na trudności techniczne związane z indukowaniem selektywnej śmierci komórki podczas standardowych procedur obrazowania. Jednak połączenie obrazowania w rozdzielczości pojedynczej komórki i wysoce ukierunkowanych technik ablacji pozwala na badanie natychmiastowych reakcji komórek na stres i urazy, a także wynikających z nich interakcji komórka-komórka. Zrozumienie tych procesów ma kluczowe znaczenie, szczególnie w przypadku chorób neurodegeneracyjnych, takich jak choroba neuronu ruchowego (MND), w przypadku których wykazano, że interakcje neuron-glej przyczyniają się do postępu choroby³.

MND, czyli stwardnienie zanikowe boczne (ALS), jest wyniszczającą chorobą neurodegeneracyjną, która atakuje neurony ruchowe w pniu mózgu, korze ruchowej i rdzeniu kręgowym. Utrata tych neuronów prowadzi do utraty mięśni, a pacjenci umierają w ciągu 3 - 5 lat od diagnozy⁴. Neurony ruchowe w rdzeniu kręgowym łączą się z włóknami mięśniowymi i odgrywają istotną rolę w ułatwianiu skurczu mięśni. Niepowodzenie tej komunikacji lub śmierć tych neuronów stopniowo osłabia mięśnie i wpływa na zdolność pacjenta do połykania, chodzenia, mówienia i oddychania. Wizualizacja śmierci neuronu ruchowego i krótkoterminowych konsekwencji u żywego zwierzęcia stanowi doskonałą okazję do lepszego zrozumienia dynamicznych procesów związanych z normalną homeostazą komórek i chorobą.

Danio pręgowany okazał się atrakcyjnym modelowym systemem do badania chorób neurodegeneracyjnych¹. Wynika to z zalet oferowanych przez ten organizm modelowy, takich jak zapłodnienie zewnętrzne, krótki czas rozwoju, optyczny dostęp do układu nerwowego i łatwość transgenezy. Ponadto zdolność do łatwego generowania złożonych transgenicznych danio pręgowanego pozwala na wiele strategii znakowania różnych typów komórek. Metody ablacji genetycznej mające na celu zabicie określonych typów komórek pozwalają na dość szerokie zakłócenia, ale brakuje im precyzyjnej kontroli celowania w pojedyncze komórki⁵. Z drugiej strony techniki wspomagane laserowo zapewniają precyzyjną kontrolę czasową i przestrzenną i były stosowane w przypadku różnych modeli zwierzęcych. Podczas gdy większość podejść wykorzystuje specjalistyczny sprzęt, taki jak lasery impulsowe^6,7,8,9^,10,11,12 lub ustawienia dwufotonowe¹³, inne grupy badawcze niedawno wykorzystały laser UV w konwencjonalnych mikroskopach konfokalnych¹⁴.

Opisana tutaj technika łączy mikroskopię konfokalną o wysokiej rozdzielczości z podejściem za pośrednictwem lasera UV, aby wywołać stres komórkowy lub śmierć w sposób zależny od dawki w wybranych neuronach ruchowych. Opiera się na użyciu powszechnie instalowanego lasera o długości fali 405 nm, został z powodzeniem przetestowany w hodowlach komórkowych i na żywych zwierzętach oraz umożliwia szczegółową charakterystykę interakcji komórkowych, takich jak klirens mikrogleju po śmierci neuronów.

Protokół

UWAGA: Projektowanie, przeprowadzanie i raportowanie eksperymentów na zwierzętach musi uwzględniać aktualne wytyczne¹⁵. Takie prace muszą być wcześniej zatwierdzone przez lokalny organ ds. dobrostanu zwierząt (w naszym przypadku jest to Komisja Etyki Zwierząt Uniwersytetu Macquarie).

1. Przygotuj danio pręgowanego do montażu i ablacji komórkami UV

1. Generuj danio pręgowanego (Danio rerio) wykazującego ekspresję białek fluorescencyjnych.
   1. Aby wyrazić białka fluorescencyjne interesujące u danio pręgowanego, wykonaj iniekcję plazmidu do jednokomórkowego stadium jaja danio pręgowanego (jak opisano w innym miejscu¹⁶) lub użyj fluorescencyjnych linii transgenicznych. Aby oznaczyć wiele typów komórek, utwórz złożone transgeniczne linie danio pręgowanego, krzyżując ustalone linie transgeniczne związane z interesującym nas pytaniem. Umieść po jednym samcu i jednej samicy danio pręgowanego po każdej stronie zbiornika godowego z fałszywym dnem wieczorem i usuń przegrodę wraz z nadejściem światła następnego ranka (jak opisano w innym miejscu¹⁷). Utrzymuj danio pręgowanego w temperaturze 28 °C i obchodź się z nim zgodnie z ustalonymi protokołami^17,18.
   2. Zbierz zarodki po udanym tarle, przecedzając wodę w zbiorniku zawierającym zarodki przez plastikowe sitko do herbaty. Opłucz jajka wodą systemową i przenieś je do wody jajecznej na szalce Petriego.
   3. Zbadaj je pod mikroskopem świetlnym, aby określić zapłodnienie. Przechowuj zapłodnione jaja na szalce Petriego i umieść je w inkubatorze w temperaturze 28 °C¹⁸.
2. Opcjonalnie: Wykonaj mikroiniekcję, aby oznaczyć określone populacje komórek.
   UWAGA: Jest to alternatywna metoda, która pozwala na ekspresję i wizualizację białek, bez konieczności hodowania stabilnych linii transgenicznych. Metoda ta jest również korzystna, gdy białko będące przedmiotem zainteresowania jest toksyczne i uniemożliwia wytwarzanie stabilnych linii transgenicznych.
   1. Wstrzyknąć konstrukty plazmidowe do jednokomórkowego stadium zarodków danio pręgowanego, jak opisano w innym miejscu^19,20,21.
      UWAGA: W wyniku tej metody uzyskuje się mozaikową ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania. Interesujące białko jest sterowane z wybranego promotora (np. islet1²², -3mnx1^23,24, met²⁵, lub mpeg1²⁶) otoczony przez odwrócone powtórzenia Tol2²⁰.
3. Starzej rybę do pożądanego rozmiaru.
   1. Podnieś ryby do 3 - 5 dni po zapłodnieniu (dpf) i umieść je pod mikroskopem związków fluorescencyjnych. Przebadaj zwierzęta pod kątem odpowiedniej ekspresji fluoroforu i wybierz jaskrawo oznakowane ryby. Oddzielić odpowiednie larwy do innego naczynia z wodą jajeczną w celu późniejszego zanurzenia (przechowywać w inkubatorze o temperaturze 28 °C).
      Opcjonalnie: Zarodki można umieścić w 0,2 mM roztworze Ringera 1-fenylo-2-tiorynów (PTU) po 24 godzinach od zapłodnienia (hpf), aby zahamować powstawanie pigmentacji. Należy zachować ostrożność w przypadku PTU, ponieważ jest on toksyczny i może mieć niekorzystne skutki fizjologiczne, genetyczne lub morfologiczne.
   2. W przypadku badań na wczesnym etapie rozwoju (< 2 dpf) należy ręcznie usunąć zarodki za pomocą ostrych kleszczy. Dechorionację enzymatyczną dużej liczby zarodków należy dodać pronazę (2 mg/ml) do wody jajowej i inkubować je przez 10 minut w temperaturze 28 °C.
   3. Okresowo przepuszczaj zarodki przez plastikową pipetę Pasteura, aby ułatwić dechorionację. Zakończ proces, gdy większość zarodków wyłoni się z ich kosmówki, przemywając je kilkakrotnie wodą z jaj.
4. Przygotuj roztwory do osadzania danio pręgowanego w agarozie.
   1. Przygotować roztwór znieczulający, dodając kroplami 4 g/l MS222 (roztwór podstawowy trikainy, pH 7,0) do szalki Petriego zawierającej wodę jajeczną. Dawka 50 mg/l jest zalecanym punktem wyjścia (ryc. 1A).
   2. Przygotuj zapas niskotopliwej agarozy (0,8 - 1,5%) w wodzie jajecznej i podziel go na porcje do 1,5 ml probówek do mikrowirówek. Umieścić podwielokrotność w podgrzanym bloku grzewczym (38 - 40 °C) i pozostawić do osiągnięcia ustawionej temperatury (~ 30 min; Rysunek 1B).
   3. Opcjonalnie: W przypadku obrazowania długoterminowego (> 4 godziny) należy przygotować mały okrąg agarozowy na szalce Petriego o średnicy 35 mm ze szklanym dnem i pozostawić do zastygnięcia (rysunek uzupełniający 1).
      UWAGA: Ten dodatkowy krok skutecznie uniknął jakiegokolwiek ruchu całej kropli agarozy wraz z danio pręgowanym w dłuższych ramach czasowych. >
      1. W tym celu umieść ~ 300 μl agarozy wzdłuż wewnętrznego okręgu naczynia ze szklanym dnem, aby przygotować okrąg w kształcie pączka z małym otworem pośrodku, w którym należy umieścić rybę (krok 1.5.3; Rysunek uzupełniający 1).
5. Zamontuj danio pręgowanego w agarozie do mikroskopii.
   1. Wybierz 1 - 3 wstępnie przesiane ryby do ablacji i znieczul larwy, przenosząc je (za pomocą pipety transferowej) do naczynia z roztworem znieczulającym (krok 1.4.1; Rysunek 1C; około 5 min).
      UWAGA: Ryby są znieczulane, gdy wykazują płytki ruch operkularny i spowolnione tętno i nie wykazują już reakcji ucieczki wywołanej dotykiem (TEER; niemożność odpłynięcia po delikatnym dotknięciu ogona szczotką). Należy zapewnić odpowiednie znieczulenie w celu etycznego traktowania ryb i zapobiec drgawkom po przeniesieniu do agarozy lub wystawieniu na działanie światła fluorescencyjnego.
   2. Po potwierdzeniu znieczulenia należy zassać larwę za pomocą regulowanej pipety (z końcówką odcinającą 200 μL ustawioną na ~ 30 μL) i pozwolić jej opaść na dno końcówki. Przenieś larwę do podgrzanej agarozy (krok 1.4.2), uwalniając kroplę płynu z larwą do agarozy (staraj się zminimalizować ilość wody jajecznej dostającej się do agarozy; Rysunek 1D).
   3. Zassać rybę otoczoną agarozą. Szybko przelej go do wcześniej przygotowanego naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm.
   4. Użyj mikroskopu preparacyjnego i standardowego pędzla (długa wkładka, rozmiar 1), aby ustawić zwierzę w agarozie z boku (głowa w lewo) tak, aby ciało i ogon były płaskie (ryc. 1E). Jeśli pracujesz z wieloma rybami, wyrównaj wszystkie ryby w naczyniu tak, aby można je było później łatwo zlokalizować za pomocą mikroskopu konfokalnego.
      UWAGA: Szybko wykonaj tę procedurę pozycjonowania i wyrównywania (może to wymagać trochę wprawy, ponieważ agaroza zaczyna twardnieć natychmiast po wystawieniu na działanie niższych temperatur).
   5. Pozostaw rybę zanurzoną w agarozie na 10 - 15 minut, aż agaroza mocno się zetnie. Ostrożnie uzupełnij szalkę Petriego o średnicy 35 mm ~ 2 ml wody jajecznej zawierającej trikainę (ryc. 1F).

2. Konfiguracja mikroskopu konfokalnego i parametrów obrazowania

1. Umieść szalkę Petriego z osadzoną larwą na stoliku mikroskopu konfokalnego i skup się na grzbietowej stronie rdzenia kręgowego zwierzęcia (używając jasnego pola). Zbadaj zwierzę w odpowiednim powiększeniu (40X) i ustawieniu fluorescencyjnym i zwizualizuj strukturę będącą przedmiotem zainteresowania (np. intensywność fluorescencji znakowanych neuronów lub ruch mikrogleju), aby potwierdzić, że wszystkie parametry obrazowania są zgodne z potrzebami do późniejszej ablacji (ryc. 2). Rutynowo używamy obiektywu 40X do wykonywania naszych badań poklatkowych.
2. Opcjonalnie: Aby przeprowadzić badanie poklatkowe trwające kilka godzin, zaleca się zarejestrowanie jednego lub kilku punktów czasowych przed ablacją w celu ustalenia niezakłóconej odpowiedzi fizjologicznej komórki i jej otoczenia (np. ruch mikrogleju w celu ustalenia wyjściowej prędkości i ruchliwości).
3. Określ grubość struktury będącej przedmiotem zainteresowania dla ablacji laserem UV.
   1. Korzystając z dysku Z, sprawdź górną i dolną część interesującej nas struktury (np. somę komórkową), ręcznie ustawiając ostrość w górę iw dół. Zanotuj płaszczyznę z, która zostanie poddana ablacji (np. środek komórki).
      UWAGA: Z doświadczenia wynika, że metoda ta była najbardziej skuteczna poprzez celowanie w neurony rdzenia kręgowego, które były jasno oznaczone (wysoki stosunek sygnału do szumu, który umożliwia łatwą wizualizację poklatkową po ablacji; np. Ryc. 4) i poprzez ablację środka somy komórkowej. Fluorescencja jądra komórkowego może być korzystna, aby zapewnić prawidłowe celowanie i wysoką skuteczność ablacji.

3. Wykonaj celową ablację laserową pojedynczych komórek w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego

UWAGA: Do tego podejścia do ablacji i wizualizacji użyto mikroskopu konfokalnego (Leica SP5). Procedura ablacji przy użyciu diody 405 nm do niszczenia specyficznego dla komórki jest szczegółowo opisana w oprogramowaniu (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). Jednak każdy konwencjonalny mikroskop konfokalny, który jest wyposażony w laser 405 nm i FRAP (odzyskiwanie fluorescencji po fotowybielaniu) lub moduł wybielający, pozwoli na wykonywanie tych samych manipulacji komórkami, ale potencjalnie z nieco innymi ustawieniami, parametrami i nazwami.

1. Uruchom kreatora FRAP, klikając menu rozwijane w górnej części menu oprogramowania (Rysunek 3A, 1 i 2). Obserwuj nowe okno z różnymi krokami, które umożliwia ustawienie określonych parametrów ablacji laserowej (Rysunek 3B, 3).
2. Określ parametry obrazu dla metody ablacji, wybierając format, szybkość skanowania (Rysunek 3B, 4) i uśrednianie (Rysunek 3B, 5). Najbardziej odpowiedni był format obrazu 1 024 x 1 024 przy prędkości skanowania 400 Hz i średniej liniowej 4.
   UWAGA: Zasadniczo nie ma potrzeby zmiany detekcji spektralnej (np. parametrów wzbudzenia lub emisji), ponieważ zostały one określone w poprzedniej akwizycji.
   1. Jeśli płaszczyzna Z do ablacji nie została jeszcze wybrana (zgodnie z opisem w kroku 2.4.), naciśnij przycisk "Na żywo" i ustaw ostrość na próbce, aż struktura fluorescencyjna lub żądana płaszczyzna z, która ma zostać poddana ablacji, będzie ostra.
3. Po ustawieniu ogólnych parametrów obrazu przejdź do kroku "Wybielacz" (Rysunek 3C, 6), aby kontrolować określone składniki ablacji.
   UWAGA: Kombinacja intensywności lasera (Rysunek 3C, 8), prędkości skanowania i uśrednienia, które zostało ustawione w kroku 3.2 (Rysunek 3B, 4 i 5), a także liczby powtórzeń, które zostaną ustawione w kroku 3.5 (Rysunek 3E, 12), określi całkowity czas przebywania lasera UV przy ROI, a co za tym idzie, skuteczność wybielania.
   1. Włącz laser 405 nm, aktywując go do procedury wybielania (Rysunek 3C, 8).
      UWAGA: Największy sukces z wyżej wymienionymi ustawieniami został osiągnięty przy intensywności lasera 405 nm między 60 a 80% w naszej eksperymentalnej konfiguracji. Należy pamiętać, że ta moc wyjściowa lasera jest specyficzna dla danego instrumentu i będzie się różnić w zależności od konfiguracji konfokalnej.
   2. Użyj opcji "powiększenia" (Rysunek 3C, 7), aby zmaksymalizować intensywność wybielania przy wybranym ROI, zmniejszając pole skanowania, maksymalizując w ten sposób czas przebywania. Alternatywnie użyj opcji "Punkt wybielania" w wybranym oprogramowaniu do tego procesu.
4. Wybierz jeden lub wiele ROI (Rysunek 3D, 10) dla ablacji za pomocą dowolnego narzędzia do rysowania w oknie akwizycji obrazu (Rysunek 3D, 9). Celuj w wzgórek aksonu, na przykładample, za pomocą okrągłego narzędzia do rysowania o średnicy około 4 - 8 μm.
   UWAGA: Obszar ablacji można regulować od pojedynczego piksela do większego obszaru, w zależności od zastosowania.
5. Po ustaleniu zwrotu z inwestycji wybierz przycisk "Przebieg czasowy" (Rysunek 3E, 11) i potwierdź liczbę cykli, w których ROI zostaną zeskanowane/ablowane (Rysunek 3E, 12). Wybierz odpowiednio klatki "Pre-Bleach" i "Post-Bleach", aby umożliwić przegląd całego obrazu tuż przed i bezpośrednio po procesie wybielania.
6. Po ustaleniu wszystkich niezbędnych parametrów ablacji naciśnij "Uruchom eksperyment" (Rysunek 3E, 13) i monitoruj skuteczność ablacji.
   UWAGA: W naszej konfiguracji FRAP pojedynczy obraz zostanie wykonany przed i po cyklu FRAP z odpowiednim wzbudzeniem laserowym (np. wzbudzenie 488 nm dla komórek wykazujących ekspresję EGFP). Te zdjęcia przed i po ablacji pozwalają szybko ocenić, jak zadowalająco wybielono zwrot z inwestycji i jak skuteczne były wybrane parametry ablacji.
7. Powtórz proces, dostosowując intensywność lasera (Rysunek 3C, 8), prędkość skanowania i uśrednianie (Rysunek 3B, 4 i 5) oraz powtórzenia (Rysunek 3E, 12) w przypadku, gdy wybrany ROI nadal wykazuje wysoką intensywność fluorescencji po zakończeniu cyklu FRAP.

4. Wykonaj procedurę kontrolną, w tym "ratowanie" ryb lub usuwanie

1. Jeśli eksperyment jest nieuleczalny, poddaj zwierzę eutanazji za pomocą przedawkowania tricainy. Usuń wodę z jajka i zastąp ją podstawowym roztworem znieczulenia na 10 minut. Aby zapewnić eutanazję, sprawdź pod mikroskopem, czy bicie serca ustaje.
2. Opcjonalnie: Jeśli eksperyment nie jest nieuleczalny, ostrożnie wyjmij rybę z agarozy za pomocą cienkich kleszczy i szczotki. Umieść rybę w świeżej wodzie z jajami i pozwól jej dojść do siebie pod obserwacją przez 15 minut. Jeśli powróci normalne zachowanie podczas pływania, zwróć rybę do inkubatora.
3. Zwierzęta transgeniczne należy utylizować zgodnie z zatwierdzonym przez instytucję strumieniem odpadów GMO.

Wyniki

Opisana tutaj metoda pozwala na ablację neuronów ruchowych w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego za pomocą modułu FRAP komercyjnego mikroskopu konfokalnego. Wykorzystano transgeniczne linie danio pręgowanego, które wyrażają zielone białko fluorescencyjne w neuronach pod kontrolą określonych promotorów, takich jak -3mnx1, islet1 lub met. Ekspresja GFP sterowana przez promotor neuronu ruchowego (taki jak -3mnx1 lub met) umożliwia wizualizację ciał komórkowych w wysokiej rozdzielczości, głównych aksonów i gałęzi obwodowych rozciągających się do mięśni (ryc. 4 i wideo 1).

Neurony w rdzeniu kręgowym ryb w wieku od 3 do 5 dni zostały pomyślnie usunięte, z ogólnym czasem przebywania 60 - 80 s przy mocy lasera ~ 70% i ogólnych ustawieniach opisanych w kroku 3. Udana ablacja jest osiągana, gdy fluorescencja zanika natychmiast po ablacji i nigdy nie powraca (ryc. 5, C i D). Próby ablacji innymi liniami laserowymi (np. linią laserową 488 nm) nie skutkowały trwałym blaknięciem, a fluorescencja została przywrócona w krótkim czasie. Co ważne, technika ta wykazała charakterystyczne cechy apoptotycznej śmierci komórek w neuronach poddanych ablacji UV, takie jak obecność aneksyny V, konsekwentne zmiany morfologiczne zwyrodnienia somalnego oraz pęcherzyki aksonalne neuronu, któremu podano ablację²⁷.

Specyfika tego podejścia została potwierdzona w eksperymentach z użyciem fotokonwertowalnego fluoroforu Kaede (który zmienia swoją emisję z zielonego na czerwony po ekspozycji na światło UV), gdzie pojedynczy neuron został przekształcony (Rysunek 5, A i B) bez oznak zniszczenia komórek przez kilka godzin. Użycie większej mocy lasera prowadzi do wygaszenia docelowego neuronu (brak fotokonwersji lub ponownego pojawienia się fluorescencji) i fotokonwersji (bez śmierci) komórek znajdujących się w bliskiej odległości (~ 20 μm) od miejsca ablacji (ryc. 5, C i D).

Jedną z ważnych zalet tej techniki ablacji indukowanej laserem jest zależność podejścia od dawki. Aby celować w komórki o różnej intensywności, dostępnych jest wiele warstw dostrajania, dostosowując moc lasera (rysunek 3C, 8), prędkość skanowania i uśrednianie linii (rysunek 3B, 4 i 5), rozmiar ROI, który ma zostać poddany ablacji (rysunek 3D, 10) oraz powtórzenia (rysunek 3E, 12). Warto zauważyć, że podejście to może być również wykorzystane do zastosowania stresu komórkowego do pojedynczych komórek zamiast wywoływania śmierci komórki. Na przykład dostrajanie było bardzo cenne w ocenie procesów komórkowych podczas śmierci neuronu. Neurony ruchowe z długimi wypustkami aksonalnymi, które zostały poddane ablacji laserem UV o mniejszym natężeniu, ujawniły charakterystyczne "pęcherzyki" (tworzenie i fragmentację pęcherzyków komórkowych), które rozpoczynały się w docelowej somie i trwały wzdłuż aksonu w czasie (40 - 90 min; Rysunek 4; Renderowany w 3D film z tej ablacji w filmie 1). W związku z tym modulacja różnych parametrów ablacji laserowej, a tym samym poziomu indukowanego stresu komórkowego i przebiegu śmierci w czasie, pozwala naukowcom na wysoki poziom elastyczności eksperymentalnej.

Rysunek 1: Osadzanie danio pręgowanego do obrazowania na żywo. (A-F) Procedura zatapiania w obrazowaniu na żywo: (A) Trikainę dodaje się do wody z jaj w celu znieczulenia danio pręgowanego przy dawce początkowej 50 mg/l. (B) Niskotopliwą agarozę (0,8 - 1,5%) przygotowuje się i podgrzewa do temperatury 38 - 40 °C. (C) Za pomocą pipety transferowej przesiane i wybrane danio pręgowane przenosi się do naczynia z roztworem tricainy. Po udanej sedacji (płytkie ruchy operkularne, spowolnienie akcji serca, brak reakcji wywołanej dotykiem) ryba jest przenoszona do podgrzanej agarozy (D). Zminimalizuj ilość wody jajecznej, która jest przenoszona do agarozy, aby zapobiec późniejszemu rozcieńczeniu. (E) Przenieść kroplę agarozy (~ 30 - 50 μl) zawierającą danio pręgowanego na szalkę ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Wykonaj to pod mikroskopem preparacyjnym i użyj pędzla, aby delikatnie wyrównać danio pręgowanego do preferowanej orientacji. Odczekaj 10 - 15 minut, aż agaroza się zetnie, a następnie dodaj ~ 2 ml roztworu tricainy do naczynia (F). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 2: Wizualizacja neuronów i mikrogleju w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego z 3 dpf.Wizualizacja mikrogleju i neuronów w rdzeniu kręgowym 3-dniowego transgenicznego danio pręgowanego wykazującego ekspresję (A) neuronów GFP-dodatnich (islet1:GFP) i (B) mCherry-dodatniego mikrogleju (mpeg1:GAL4,UAS:mCherry). (C) Złożony obraz kanału neuronu i mikrogleju wraz z obrazem jasnego pola. Schematyczna wstawka w (C) przedstawia orientację ryby i obrysowuje prezentowany obszar. Podziałka = 30 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Etapy procesu ablacji laserem UV (zgodnie z opisem w protokole, krok 3). Kroki, aby sterować modułem oprogramowania FRAP w oprogramowaniu konfokalnym (Leica Application Suite). (A) Uruchomienie modułu FRAP jako narzędzia do wykonywania ablacji laserem UV. (B) Ustawienie płaszczyzny Z do ablacji i innych ustawień FRAP, takich jak format, prędkość i uśrednianie, które określą czas przebywania lasera. (C) Kontrola intensywności lasera i opcja "zoom in" w celu maksymalizacji wydajności wybielania. (D) Wybór jednego lub wielu regionów zainteresowania (ROI), które zostaną zniesione. (E) Ustawienie przebiegu czasowego wybielania określa cykle wybielania i całkowity czas przebywania lasera przy ROI. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 4: Następcze zwyrodnienie neuronu poddanego ablacji UV. Obrazowanie poklatkowe neurodegeneracji neuronu rdzeniowego poddanego ablacji promieniowaniem UV. (A-F) Naświetlanie promieniami UV pojedynczego neuronu rdzeniowego (met: GAL4, UAS: EGFP; A; koło) spowodowało kurczenie się i zaokrąglanie somy neuronu w czasie (A-C), a następnie fragmentację aksonów (C-F; groty strzał). Zwyrodnienie aksonów rozpoczęło się w somie (miejscu ablacji) i postępowało następczo w kierunku dystalnego końca aksonu, aż w końcu fluorescencja w somie zniknęła, a cały akson wykazywał "pęcherzenie" (D-F). Podziałka = 20 μm. Renderowany w 3D film poklatkowy przedstawiający tę ablację jest pokazany na filmie 1. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rycina 5: Potwierdzenie efektu naświetlania pojedynczych komórek promieniowaniem UV za pomocą fotokonwertowalnego fluoroforu (Kaede) w neuronie ruchowym. Walidacja promieniowania UV pojedynczej komórki poprzez aktywację fotokonwertowalnego fluoroforu Kaede w neuronie. (A-D) Naświetlanie promieniowaniem UV neuronów znakowanych Kaede. (A) Fotokonwersja pojedynczego neuronu (koła) z mocą lasera 30% przez 10 s doprowadziła do fotokonwersji Kaede (z zielonego na czerwony) tylko w docelowym pojedynczym neuronie (B). Należy zauważyć, że przekształcona komórka przetrwała kilka godzin i nie wykazywała żadnych wizualnych oznak pogorszenia, takich jak pęcherzyki lub zaokrąglenia. Ablacja pojedynczego neuronu (C; krąg) z większą mocą lasera (95% przez 10 s) spowodowała natychmiastowy zanik tego neuronu (D) i późniejszą fotokonwersję Kaede w niewielkiej liczbie otaczających neuronów w promieniu około 20 μm. Podziałka = 20 μm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Renderowanie powierzchni 3D (Imaris) neuronu poddanego ablacji UV zilustrowanego na rysunku 4.
Film poklatkowy neuronu przedstawiony na rysunku 4 jest renderowany powierzchniowo za pomocą oprogramowania do wizualizacji (Imaris, Bitplane). Podkreśla proces kurczenia się ablowanej somy, po którym następuje fragmentacja aksonów w kierunku przewodzenia w kierunku dystalnego końca komórki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający 1: Opcjonalny odlew agarozy do długotrwałego obrazowania.
Aby uniknąć przemieszczania się ryby i agarozy podczas długotrwałego pozyskiwania, należy przygotować koło z agarozy w kształcie pączka wzdłuż krawędzi na środku naczynia o szklanym dnie 35 mm (A). Pozostaw agarozę na ~10 minut i przenieś rybę do wewnętrznego kręgu z kroplą agarozy (B). Staraj się zminimalizować ilość agarozy do osadzania (nadmiar agarozy wysmaruj na zewnątrz po zorientowaniu ryby). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Podejścia do ablacji laserowej

Techniki ablacji wspomaganej laserowo pozwalają na precyzyjne celowanie w pojedyncze komórki lub małe grupy komórek. Połączenie tej techniki z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości i manipulacjami genetycznymi na modelach zwierzęcych, takich jak danio pręgowany, pozwala naukowcom na systematyczne badanie losu pojedynczej komórki i interakcji po urazie.

Opisany tutaj protokół ablacji laserowej UV (405 nm) określa, w jaki sposób poszczególne komórki mogą być zestresowane lub zabijane selektywnie (w sposób zależny od dawki), podczas gdy sąsiednie neurony, glej i aksony pozostają nienaruszone. Z powodzeniem wykorzystaliśmy to podejście w eksperymentach z hodowlami komórkowymi i opisujemy tutaj szczegółowe podejście do rdzenia kręgowego danio pręgowanego. Pokazujemy implementację tego podejścia w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego poprzez selektywne obciążanie pojedynczego neuronu w sieci innych komórek (ryc. 5, A i B) lub poprzez natychmiastowe zabijanie pojedynczego neuronu bez odzyskiwania (ryc. 5, C i D).

Wcześniej specjalistyczne systemy laserowe, takie jak laser pulsacyjny azotowy lub systemy laserów dwufotonowych, były wymagane do indukowania uszkodzenia tkanek i transsekcji nerwów ruchowych 10,11,12,13. Te systemy laserowe zostały z powodzeniem wykorzystane do powodowania uszkodzeń komórek, takich jak zakrzepica tętnic i żył⁶, ostre uszkodzenie nerek⁷, uszkodzenie serca⁸ oraz do badania fal wapniowych i odpowiedzi mikrogleju po urazie mózgu⁹. Co więcej, Soustelle i współpracownicy wykorzystali konwencjonalną konfokalną konfokalną konfokalną (lasery UV 351 nm i 364 nm) do wywołania uszkodzenia komórek nabłonka i gleju u Drosophila¹⁴.

Znaczenie modeli danio pręgowanego dla zrozumienia ALS (i innych chorób człowieka)

Danio pręgowany jest szeroko stosowanym organizmem modelowym, zwłaszcza w badaniach rozwojowych 28,29,30. Chociaż mają one pewne ograniczenia, ich potencjał w modelowaniu chorób u ludzi i zrozumieniu patogennych mechanizmów molekularnych jest ogromny. Modele danio pręgowanego są dobrze ugruntowane w badaniach nad MND i doprowadziły do ważnych spostrzeżeń molekularnych 31,32,33,34. Transgeniczne linie zebry pręgowanego mogą być generowane szybko (4 - 5 miesięcy) i umożliwiają selektywne śledzenie określonego typu komórek, co czyni je cennym dodatkiem do obecnych modeli zwierzęcych ALS. Zarodki/larwy danio pręgowanego są optycznie przezroczyste i oferują unikalne korzyści eksperymentalne, które umożliwiają długoterminowe obrazowanie na żywo na poziomie pojedynczej komórki w mózgu lub rdzeniu kręgowym, co nie jest łatwe do osiągnięcia w modelach gryzoni (lub u ludzi). W połączeniu z technikami molekularnymi, takimi jak ablacja pojedynczych komórek, stanowi to unikalną platformę eksperymentalną do badania precyzyjnych mechanizmów molekularnych in vivo.

Neurony ruchowe mogą być selektywnie celowane za pomocą ablacji laserem UV

Neurony rdzeniowe u danio pręgowanego zaczynają rozwijać się w ciągu 10 godzin po urodzeniu i tworzą się po około 48 godzinach^35,36. Ten szybki rozwój pozwala na wizualizację tych neuronów w krótkich ramach czasowych i przy dużej przepustowości. Neurony ruchowe stanowią podstawowe połączenie między mózgiem a mięśniami, a w ALS są uszkodzone w korze ruchowej (górne neurony ruchowe), pniu mózgu i rdzeniu kręgowym (dolne neurony ruchowe). Utrata tych neuronów nieuchronnie prowadzi do zaniku i osłabienia mięśni. Neurony ruchowe w rdzeniu kręgowym danio pręgowanego można zidentyfikować na podstawie ich wyraźnych projekcji i użycia promotorów specyficznych dla neuronów ruchowych, takich jak -3MNX1. Celowanie w somę komórkową takich wystających neuronów ujawniło następcze zwyrodnienie wzdłuż projekcji aksonalnej w czasie (ryc. 4 i wideo 1). Obrazowanie neuronów ruchowych rdzenia kręgowego w rozdzielczości pojedynczej komórki dodatkowo potwierdziło translokację fosfatydyloseryny i w konsekwencji znakowanie literą V aneksyny po ablacji laserowej (patrz ryc. 4 i film uzupełniający 3 w odnośniku 27). Chociaż zgłaszamy aktywację aneksyny V w umierających neuronach po naszym podejściu do ablacji laserem UV, nie możemy być pewni, że kaskada śmierci, która jest wyzwalana podczas tego przyspieszonego procesu, dokładnie odpowiada śmierci neuronów, która występuje podczas neurodegeneracji lub normalnej homeostazy komórek.

Chociaż to podejście do ablacji jest wysoce powtarzalne i specyficzne, różne strategie osadzania mogą również wpływać na skuteczność ablacji UV. Z naszego doświadczenia wynika, że najbardziej skuteczne było zminimalizowanie warstwy agarozy, w której osadzaliśmy nasze ryby. Grubsze warstwy podłoża do zatapiania z dodatkową warstwą wody z jaj mogą zmniejszać moc promieniowania UV ostatecznie odbieraną przez komórkę ze względu na efekty tłumienia i rozpraszania, które występują wzdłuż ścieżki wiązki.

W przyszłości krzyżowanie różnych linii transgenicznych ryb pozwoli na wizualizację natychmiastowych i krótkotrwałych (do 12 godzin) reakcji innych dotkniętych chorobą komórek, takich jak glej, na indukowane laserem niszczenie komórek. Na przykład autonomiczna toksyczność astrocytów i komórek niekomórkowych w zaburzeniach neurodegeneracyjnych, takich jak ALS, znalazła się w centrum badań i jest silnie związana z patogennością sporadycznego i rodzinnego ALS^37,38. Jednak mechanizmy leżące u podstaw toksyczności glejowej i selektywności w stosunku do neuronów ruchowych pozostają niejasne. My i inni niedawno skorzystaliśmy z tego podejścia do zbadania pochłaniania umierających neuronów przez mikroglej i zwizualizowaliśmy usuwanie pozostałości neuronów 27,39,40.

Połączenie techniki ablacji z mikroskopią o wysokiej rozdzielczości i markerami zapalenia nerwów pozwoli naukowcom w przyszłości poszerzyć wiedzę na temat funkcji pojedynczych komórek i połączonych ze sobą systemów komórkowych. Charakterystyka tych procesów w warunkach in vivo ma kluczowe znaczenie nie tylko w warunkach rozwojowych, ale także w modelach chorób neurodegeneracyjnych, w tym MND, w których interakcje komórkowe mogą być upośledzone ^3,41.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agaroza niskotopliwa	Fisher-Scientific		Rozpuścić w wodzie jajecznej z trikainą (0,02%) w 0,8 - 1,5%
Trikainy	Argent Labs	MS-222	0,02%
Standardowa ścianka Harvarda borokrzemian z włóknem Kapilarne Szkło	Precision Instruments, Inc.	GC100F-10 (krótka) GC100F-15 (długa)	Ciąg do oporu 2 - 7 MΩ
Woda jajeczna			0,6 g błyskawicznej soli morskiej oceanicznej, 4 ml 1 mg/ml błękitu metylenowego w 10 l wody dejonizowanej
1-fenylo-2-tiomocznik (PTU)	Sigma	P7629
Pronase	Sigma	10165921001
Blok grzewczy	Select BioProducts	Cyfrowy grzejnik blokowy (SBD110_)
Aparat do mikroiniekcji	World Precision Instruments, Inc.		Mikroiniekcję wykonano ręcznie pod steromikroskopem (Leica) z załadowaną szklaną igłą i Picospritzer II (General Valve corporation)
Stereoskop	Mikroskopia Leica		Bright field illumination została wykonana na stereoskopowym mikroskopie preparacyjnym Leica M165FC (Leica)
Mikroskop	Leica	SP5
35 mm szklana półmisek dolna	MatTek Corporation	P35G-0-20-C