Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego
* These authors contributed equally
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Chociaż dzikie danio pręgowane posiadają system determinacji płci ZZ/ZW, udomowione danio pręgowane utraciły chromosom płciowy. Wykorzystują poligeniczny system determinacji płci, w którym kilka genów rozmieszczonych w całym genomie wspólnie określa tożsamość płciową poszczególnych ryb. Obecnie geny zaangażowane w regulację rozwoju gonad i sposób ich działania pozostają nieuchwytne. Zwykle wyizolowanie tkanki gonadalnej jest pierwszym krokiem do zbadania procesów rozwoju płci. W artykule przedstawiono procedurę izolacji tkanki gonadalnej od larw danio pręgowanego o wartości 17 dpf (dni po zapłodnieniu) i 25 dpf dpf. Wyizolowana tkanka gonadalna może być następnie badana za pomocą morfologii i profilowania ekspresji genów.
Wprowadzenie
Główny determinant płci żeńskiej w chromosomie 4 dzikiego danio pręgowanego został utracony lub zmodyfikowany u udomowionych danio pręgowanych (tj. powszechnych szczepów laboratoryjnych)1. Zamiast tego mają poligeniczny system determinacji płci, któremu towarzyszą czynniki środowiskowe, takie jak temperatura, niedotlenienie, dostępność pożywienia i gęstość zaludnienia. Szczegółowe mechanizmy rozwoju płciowego danio pręgowanego nie są w pełni poznane. Podstawowe pytania, takie jak to, kiedy następuje determinacja płci danio pręgowanego, jakie są główne sygnały determinacji płci i które geny regulują pierwszy etap transformacji gonad, po....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Fudan. Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardowymi procedurami20.
1. Przygotowania
- Hodowla 17 dpf i 25 dpf larw danio pręgowanego
- Późnym popołudniem przed dniem krzyżowania przenieść 2 samce i 2 samice dorosłego danio pręgowanego (zdrowe, w wieku od 3 do 6 miesięcy, laboratoryjny szczep AB) do zbiornika krzyżowego. Oddziel samce i samice barierą. Następnego ranka odśwież wodę w zbiorniku i usuń barierę, aby umożliwić im łączenie się w pary. Jaja zbierać na szal....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Disekcje gonad przeprowadzono na larwach danio pręgowanego szczepu AB. Rycina 1 przedstawia typową tkankę gonad larw danio pręgowanego w 17. i 25. dniu po zapłodnieniu (dpf). Najpierw nacięto skórę i mięśnie jednej strony brzucha, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Po usunięciu masy narządów wewnętrznych, w tułowiu pozostały pęcherz pławny wraz z gonadą. Gonada była przytwierdzona do brzusznej strony pęcherza pławnego (strzałka na Rycina 1B.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Danio pręgowany stał się potężnym modelem i jest szeroko stosowany w badaniach rozwojowych i związanych z chorobami. Metody izolacji narządów u dorosłych ryb danio pręgowanego, takich jak mózg, serce, gonada i nerki, zostały dobrze udokumentowane 23,24,25. Ze względu na mały rozmiar i dynamiczną przebudowę tkanek gonad u larw danio pręgowanego, izolacja tkanki gonad jest trudnym zadaniem. W poprzednich badaniach wykorzystano cał.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Dziękujemy C Zhangowi za opiekę nad rybami. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31171074, 31371099 i 31571067 do GP) oraz przez Pujiang Talent Project (09PJ1401900 do GP).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Naczynie do hodowli komórkowych 100 mm | Corning | 430167 | Do inkubacji zarodków |
| 20x EM | Na 1 L potrzebny: dodać 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl i 2,9 g CaCl· 2H2O; następnie dodać 0,41 g KH2PO4, 0,412 g Na2HPO4 bezwodnego i 4,9 g MgSO4· 7H2O. | ||
| 1x EM | Rozcieńczony 20x EM w wodzie destylowanej | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | Do przygotowania 2% płytek agarowych |
| Odczynnik Trizol | Invitrogen | 15596-026 | Do izolacji RNA |
| Miernik szklany | Shen Bo | 250 ml | Do przygotowania 2% płytek agarowych |
| Kuchenka mikrofalowa | Midea M1-211A | Do podgrzewania AGAR | |
| Pęseta DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | Do preparacji |
| Stereomikroskop | Motic | SMZ168 | Do preparacji |
| Sprzęt do czystej wody | Millipore | ||
| Ringer' s roztwór | Dla 1 l potrzeba: Dodaj 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 i 1,19 g Hepes; następnie napełnij do 1 l; następnie napełnij do 1 l; Dostosuj pH do 7,2. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w autoklawowanym przezroczystym pojemniku z poliwęglanu. | ||
| Pipeta transferowa | Samco | 202, 204 | |
| Wanna metalowa | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Mikroskop | Leica | M205 FA | do mikrofotografii |
| Eppendorf | 5417R | ||
| Zestaw do izolacji RNA w skali mikro | Ambion | AM1931 | Do izolacji RNA z tkanek gonad |
| Dnaza I | Sigma | AMPD1-1KT | Do trawienia DNA w roztworze RNA |
| Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNA | RevertAid Thermo Scientific | #K1631 | Do syntezy pierwszej nici cDNA |
| Rnase | H Thermo Scientific | #EN0202 | Do trawienia resztkowego RNA w roztworze cDNA. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | Ten produkt jest 2x główną mieszanką na bazie polimerazy DNA Taq do PCR w czasie rzeczywistym i ma zastosowanie do testu interkalacyjnego z SYBR Green I. |
| Spektrofotometr | Ne Drop | OD-2000+ | Pomiar stężenia całkowitego RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | profilowanie ekspresji genów |
Bibliografia
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreeniva....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
