Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55294

⸱

26 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Brain Science, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół izolacji tkanki gonad larw danio pręgowanego, który ułatwi badania różnicowania i utrzymania płci danio pręgowanego.

Streszczenie

Chociaż dzikie danio pręgowane posiadają system determinacji płci ZZ/ZW, udomowione danio pręgowane utraciły chromosom płciowy. Wykorzystują poligeniczny system determinacji płci, w którym kilka genów rozmieszczonych w całym genomie wspólnie określa tożsamość płciową poszczególnych ryb. Obecnie geny zaangażowane w regulację rozwoju gonad i sposób ich działania pozostają nieuchwytne. Zwykle wyizolowanie tkanki gonadalnej jest pierwszym krokiem do zbadania procesów rozwoju płci. W artykule przedstawiono procedurę izolacji tkanki gonadalnej od larw danio pręgowanego o wartości 17 dpf (dni po zapłodnieniu) i 25 dpf dpf. Wyizolowana tkanka gonadalna może być następnie badana za pomocą morfologii i profilowania ekspresji genów.

Wprowadzenie

Główny determinant płci żeńskiej w chromosomie 4 dzikiego danio pręgowanego został utracony lub zmodyfikowany u udomowionych danio pręgowanych (tj. powszechnych szczepów laboratoryjnych)1. Zamiast tego mają poligeniczny system determinacji płci, któremu towarzyszą czynniki środowiskowe, takie jak temperatura, niedotlenienie, dostępność pożywienia i gęstość zaludnienia. Szczegółowe mechanizmy rozwoju płciowego danio pręgowanego nie są w pełni poznane. Podstawowe pytania, takie jak to, kiedy następuje determinacja płci danio pręgowanego, jakie są główne sygnały determinacji płci i które geny regulują pierwszy etap transformacji gonad, pozostają bez odpowiedzi2,3.

W procesie rozwoju płci danio pręgowanego rozpoznano kilka ważnych etapów. We wczesnej fazie rozwoju, począwszy od 4 hpf (godzin po zapłodnieniu), pierwotne komórki rozrodcze (PGC) przechodzą specyfikację, migrację do grzbietu narządów płciowych i proliferację. Liczby PGC i wzajemne interakcje między komórkami rozrodczymi a komórkami somatycznymi są ważne dla różnicowania gonad4. Po 13 dpf (dni po zapłodnieniu) gonady są w stadium niezróżnicowanym. Do 17 dpf gonady rozwijają się w jajniki o podwójnym potencjale zarówno u przyszłych samic, jak i mężczyzn. Zależne od apoptozy przejście z jajnika do jądra rozpoczyna się przy 21 do 25 dpf i może trwać kilka tygodni. Do 35 dpf płeć gonady została określona, a produkcja gamet specyficznych dla płci trwa zarówno w jajnikach, jak i jądrach5,6,7.

Do tej pory zaproponowano różne geny kandydujące i mechanizmy determinacji płci. Proteomika i analiza transkryptomiczna wyizolowały wiele genów o ekspresji dymorficznej płciowo, a geny te zostały wykorzystane do badania zróżnicowania płci u danio pręgowanego8,9,10. Na przykład u larw danio pręgowanego gen cyp19a1a ulega specyficznej ekspresji w jajniku, ale nie w jądrze11,12. Ponadto gen amh ulega słabej ekspresji w komórkach ziarnistych pęcherzyka jajnikowego, ale silnie w komórkach Sertoliego jądra13. W przeciwieństwie do tego, gen vasa ulega ciągłej ekspresji w komórkach rozrodczych zarówno samic, jak i samca danio pręgowanego, co czyni go odpowiednim markerem gonad14,15.

Badanie poziomów ekspresji genów gonad jest kluczowe dla zrozumienia molekularnego mechanizmu determinacji i różnicowania płci, zwłaszcza w fazie jajnika o potencjale dwupotencjałowym3,9. Jednak mały rozmiar larw danio pręgowanego i odpowiednio małe gonady komplikują izolację tkanki gonad do dalszej analizy molekularnej. W poprzednich badaniach wykorzystano wypreparowany cały obszar tułowia między wieczkiem a porem odbytu16. Preparat ten, choć zawiera gonady, składa się z wielu tkanek i narządów. Alternatywnie, transgeniczne zwierzęta z ekspresją GFP specyficzną dla gonad, takie jak vasa: EGFP, wykorzystano do izolacji tkanek gonad za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i mikrorozwarstwienia laserowego17,18. Ale ich powszechne zastosowanie jest ograniczone. W tym miejscu opisujemy prostą procedurę izolacji tkanki gonadalnej od larw danio pręgowanego przy 17 dpf i 25 dpf. Pokazujemy położenie gonad w stosunku do innych narządów i izolujemy morfologicznie nienaruszone gonady od otaczających tkanek. Ponadto pokazujemy, że geny specyficzne dla gonad, takie jak vasa i cyp19a1a, są wysoce eksprymowane w izolowanych gonadach w porównaniu z tkanką tułowia za pomocą ilościowej analizy PCR (qPCR). Obecny protokół umożliwia identyfikację, izolację, oczyszczanie RNA i amplifikację genów specyficznych dla gonad od larw danio pręgowanego, umożliwiając w ten sposób późniejszą analizę molekularną tkanki gonad19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Eksperymenty z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Fudan. Danio pręgowany był hodowany i hodowany zgodnie ze standardowymi procedurami20.

1. Przygotowania

  1. Hodowla 17 dpf i 25 dpf larw danio pręgowanego
    1. Późnym popołudniem przed dniem krzyżowania przenieść 2 samce i 2 samice dorosłego danio pręgowanego (zdrowe, w wieku od 3 do 6 miesięcy, laboratoryjny szczep AB) do zbiornika krzyżowego. Oddziel samce i samice barierą. Następnego ranka odśwież wodę w zbiorniku i usuń barierę, aby umożliwić im łączenie się w pary. Jaja zbierać na szalkach Petriego o średnicy 100 mm 1 do 2 godzin po zapłodnieniu.
    2. Przechowywać około 40 zarodków na płytce o średnicy 100 mm z 40 ml pożywki dla zarodków (EM) w temperaturze 28,5 °C we wczesnym okresie rozwoju (4 dni) i odświeżać EM dwa razy dziennie. Przenieść larwy do zbiorników o pojemności 1 litra (40 larw na 300 ml wody systemowej) i karmić żywymi wrotkami (pełna dawka, dwa razy dziennie) po 5 dpf. Karm żywe krewetki solankowe zamiast diety wrotka po 10 dpf. Przenieś rybę do systemu recyrkulacji wody o stężeniu 14 dpf21.
    3. Hodować larwy danio pręgowanego w systemie recyrkulacji wody do 17 dpf lub 25 dpf. Upewnij się, że cykl światło/ciemność wynosi 14/10 godzin, a wartość pH wody systemowej wynosi około 7,2. Zmierz długość ciała larw 17 dpf (5,5 do 6,8 mm) i 25 dpf (8 do 11 mm)22.
  2. Przygotuj 2% płytki agarowe do sekcji.
    1. Dodaj 4 g agaru do 200 ml sterylnej wody. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej, aż stanie się przezroczysta.
    2. Roztwór agaru schłodzić przez około 15 minut, a następnie wlać go do szalek Petriego o średnicy 60 mm (około 1/3 objętości płytki). Przechowywać zestalone płytki agarowe w temperaturze 4 °C.

2. Protokół 1: Rozkrój tkanki gonadalnej larw 17 i 25 dpf

  1. Dodaj pokruszony lód do zbiornika, aby znieczulić larwy 17 dpf. Przenieść znieczulone larwy na schłodzoną 100 mm szalkę Petriego z 30 ml zimnego roztworu Ringera. Trzymaj ryby inkubowane w schłodzonym roztworze Ringera przez co najmniej 15 minut, aby w pełni znieczulić larwy.
  2. Przenieś larwy na wstępnie schłodzoną płytkę agarową za pomocą małej plastikowej łyżki. Zanurz całe ciało ryby w 10 ml schłodzonego roztworu Ringera i delikatnie połóż je na boku.
  3. Wykonaj następujące czynności w polu widzenia mikroskopu stereoskopowego 25X. Zaciśnij pień ryby pęsetą w celu stabilizacji. Rozerwij brzuch wzdłużnie od odbytu do serca za pomocą innej pęsety. Delikatnie usuń skórę i mięśnie po jednej stronie ciała, aby odsłonić narządy wewnętrzne.
  4. Ostrożnie usuń masę narządów brzusznych do pęcherza pławnego. Unikaj uszkodzenia gonady przyczepionej do pęcherza pławnego.
  5. Odetnij połączenie między pęcherzem pławnym a przednim ciałem. Delikatnie wyciągnij cały pęcherz pławny i tkankę gonadalną.
    UWAGA: W większości przypadków tkanka gonad o stężeniu 17 dpf zawiera otaczającą tkankę nabłonkową i protonefrydium. Nie da się ich łatwo oddzielić od siebie, ale przy 25 dpf można je łatwo rozdzielić. Gonada jest również połączona z odbytem. Wyraźnie widoczne będzie połączenie z lewą i prawą gonadą połączoną ze sobą w odbycie.
  6. Za pomocą pęsety ostrożnie oddziel tkankę gonadalną od pęcherza pławnego i oczyść otaczającą tkankę tłuszczową.
  7. Natychmiast przenieś wyizolowaną tkankę gonad do wstępnie schłodzonej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej 200 μl roztworu Ringera. Trzymaj probówkę na lodzie, aż wszystkie tkanki gonad zostaną oddzielone od larw.
  8. Rozciąć gonady larw 25 dpf zgodnie z opisem w krokach 2.1 - 2.7.

3. Protokół 2: Analiza ekspresji genów izolowanych tkanek gonad

  1. Ekstrakcja całkowitego RNA z tkanek larw gonad.
    1. Przenieś izolowane tkanki gonad do nowej probówki 1,5 ml wolnej od RNaz i usuń roztwór Ringera. Dodać 100 μl roztworu do lizy. Wiruj, aż tkanki zostaną całkowicie zlizowane.
    2. Procedurę ekstrakcji całkowitego RNA należy przeprowadzić zgodnie z instrukcjami producenta.
    3. Dodać 1/10 objętości 10x buforu DNazy I i 1 μl DNazy I do roztworu RNA i delikatnie wymieszać. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C.
    4. Dodać odczynnik inaktywacji DNazy o objętości 1/10 do roztworu RNA. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 70 °C. Zmierzyć stężenie całkowitego RNA za pomocą spektrofotometru. Przechowywać w temperaturze -20 °C.
  2. Wykonaj syntezę pierwszej nici cDNA
    1. Użyj startera oligo(dT)-linker, aby przeprowadzić syntezę pierwszej nici cDNA zgodnie z protokołem producenta. Dodać 1 do 2 μg RNA do całkowitej objętości reakcji do 20 μl.
    2. Inkubować roztwór reakcyjny przez 90 minut w temperaturze 45 °C. Zakończyć reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70 °C przez 5 minut.
    3. Dodaj 1 μl RNazy H do roztworu cDNA, aby usunąć resztki RNA. Delikatnie wymieszać i odwirować przez 10 s w temperaturze ~ 13 000 x g. Inkubować przez 20 minut w temperaturze 37 °C. Dodać 20 μl wody wolnej od nukleaz. Przechowywać w temperaturze -70 °C.
  3. Wykonaj fluorescencyjną ilościową reakcję PCR
    1. Wykonaj qPCR na systemie cyklerowym z barwnikiem fluorescencyjnym. Stosować następujące warunki cykliczne PCR: 35 cykli w temperaturze 95 °C przez 15 s, Tm-5 °C przez 15 s, 68 °C przez 30 s. Użyj sekwencji starterów w następujący sposób: amh (fwd: GTGGATGGCAGCAGTACGAC; rev: GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAGAGAATG), cyp19a1a (fwd: GTCCTGTTGTCTCTCTCTGTCG; rev: CATTTGAGTTGAATATGCCCTG), nanos3 (fwd: GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; rev: CCAAGTGAAACACACACAACCAGTGC), vasa (fwd: ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; rev: CCAAGTGAAACACAACAACCAGTGC) i β-aktyna (fwd: AGTGCGACGTGGACATCCGTA; rev: GCACTTCCTGTGGACGATGGA)19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Disekcje gonad przeprowadzono na larwach danio pręgowanego szczepu AB. Rycina 1 przedstawia typową tkankę gonad larw danio pręgowanego w 17. i 25. dniu po zapłodnieniu (dpf). Najpierw nacięto skórę i mięśnie jednej strony brzucha, aby odsłonić narządy wewnętrzne. Po usunięciu masy narządów wewnętrznych, w tułowiu pozostały pęcherz pławny wraz z gonadą. Gonada była przytwierdzona do brzusznej strony pęcherza pławnego (strzałka na Rycina 1B...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Danio pręgowany stał się potężnym modelem i jest szeroko stosowany w badaniach rozwojowych i związanych z chorobami. Metody izolacji narządów u dorosłych ryb danio pręgowanego, takich jak mózg, serce, gonada i nerki, zostały dobrze udokumentowane 23,24,25. Ze względu na mały rozmiar i dynamiczną przebudowę tkanek gonad u larw danio pręgowanego, izolacja tkanki gonad jest trudnym zadaniem. W poprzednich badaniach wykorzystano cał...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

Dziękujemy C Zhangowi za opiekę nad rybami. Praca ta była wspierana przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (31171074, 31371099 i 31571067 do GP) oraz przez Pujiang Talent Project (09PJ1401900 do GP).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie do hodowli komórkowych 100 mmCorning430167Do inkubacji zarodków
20x EMNa 1 L potrzebny: dodać 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl i 2,9 g CaCl· 2H2O; następnie dodać 0,41 g KH2PO4, 0,412 g Na2HPO4 bezwodnego i 4,9 g MgSO4· 7H2O.
1x EMRozcieńczony 20x EM w wodzie destylowanej
AGAROSE G-10Gene121985Do przygotowania 2% płytek agarowych
Odczynnik TrizolInvitrogen15596-026Do izolacji RNA
Miernik szklanyShen Bo250 mlDo przygotowania 2% płytek agarowych
Kuchenka mikrofalowaMidea M1-211ADo podgrzewania AGAR
Pęseta DUMONT#5INOXWorld Precision Instrument500341Do preparacji
StereomikroskopMoticSMZ168Do preparacji
Sprzęt do czystej wodyMillipore
Ringer' s roztwórDla 1 l potrzeba: Dodaj 6,78 g NaCl, 0,22 g KCl, 0,26 g CaCl2 i 1,19 g Hepes; następnie napełnij do 1 l; następnie napełnij do 1 l; Dostosuj pH do 7,2. Sterylizować przez filtrację i przechowywać w autoklawowanym przezroczystym pojemniku z poliwęglanu.
Pipeta transferowaSamco202, 204
Wanna metalowaQiLinbeierModel GL-150
MikroskopLeica M205 FAdo mikrofotografii
Eppendorf5417R
Zestaw do izolacji RNA w skali mikroAmbionAM1931Do izolacji RNA z tkanek gonad
Dnaza ISigmaAMPD1-1KTDo trawienia DNA w roztworze RNA
Zestaw do syntezy pierwszej nici cDNARevertAid Thermo Scientific#K1631Do syntezy pierwszej nici cDNA
RnaseH Thermo Scientific#EN0202Do trawienia resztkowego RNA w roztworze cDNA.
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201Ten produkt jest 2x główną mieszanką na bazie polimerazy DNA Taq do PCR w czasie rzeczywistym i  ma zastosowanie do testu interkalacyjnego z SYBR Green I.
SpektrofotometrNe DropOD-2000+Pomiar stężenia całkowitego RNA
MastercyclerEppendorfAG 22331 Hamburgprofilowanie ekspresji genów
Do wirówki

Bibliografia

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579(2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397(2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Disekcja larw zebrafishizolacja tkanki gonadalnejrozw j p ciowy zebrafishanaliza marker w gonadprotok ekstrakcji RNAqPCR ekspresji gen wdisekcja pod stereomikroskopemprzygotowanie p ytek agarowychroztw r Ringera
Rozwarstwienie larw tkanki gonad danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.