Artykuł metodologiczny

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych

76.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/55398

⸱

4 maja 2017

 ,  ,  , 
1UGent Center for Medical Biotechnology, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University (UGent)

W tym artykule

Podsumowanie

Stan zdrowia płuc jest odzwierciedlony przez typ i liczbę komórek odpornościowych, które są obecne w oskrzelikach płuc. Opisujemy technikę płukania oskrzelowo-pęcherzykowego, która umożliwia izolację i badanie nieprzylegających komórek i rozpuszczalnych czynników z dolnych dróg oddechowych myszy.

Streszczenie

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) to eksperymentalna procedura, która służy do badania komórkowej i bezkomórkowej zawartości światła płuc ex vivo, aby uzyskać wgląd w trwający stan chorobowy.

Tutaj opisana jest prosta i skuteczna metoda wykonywania BAL na płucach myszy bez potrzeby specjalnych narzędzi czy sprzętu. Płyn BAL izoluje się poprzez wprowadzenie cewnika do tchawicy ostatecznie znieczulonych myszy, przez który do oskrzelików wkrapla się roztwór soli fizjologicznej. Wkraplany płyn jest delikatnie wciągany, aby zmaksymalizować pobieranie płynu BAL i zminimalizować siły ścinające. Technika ta pozwala na zachowanie żywotności, funkcji i struktury komórek w drogach oddechowych i płynu BAL.

Liczne techniki mogą być zastosowane w celu uzyskania głębszego zrozumienia stanu chorobowego płuc. W tym miejscu opisano powszechnie stosowaną technikę identyfikacji i liczenia różnych typów komórek odpornościowych, w której cytometria przepływowa jest połączona z wybranym panelem znakowanych fluorescencyjnie markerów specyficznych dla powierzchni komórek. Przedstawiona tutaj procedura BAL może być również wykorzystana do analizy czynników zakaźnych, składników płynów lub cząstek wdychanych w płucach myszy.

Wprowadzenie

Drogi oddechowe napotykają liczne zniewagi, które mogą prowadzić do stanu zapalnego, inwazji patogenów lub złośliwej transformacji. Komórki nabłonkowe wyściełające światło płuc stanowią jedną z głównych barier organizmu ssaków. Wraz z makrofagami pęcherzykowymi zapobiegają przedostawaniu się zagrożeń środowiskowych do układu ogólnoustrojowego przez drogi oddechowe. Przykładami takich zagrożeń są organiczne i nieorganiczne chemikalia, bakterie i wirusy. Podobnie, specyficzne szczepienia lub interwencje terapeutyczne mogą być zaprojektowane tak, aby były ukierunkowane na płuca. We wszystkich tych przypadkach szczegółowa analiza wywołanej reakcji jest ważna, aby zrozumieć, interweniować lub zapobiec procesom biologicznym zachodzącym w układzie oddechowym.

Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe (BAL) jest nieocenioną metodą analizy takich odpowiedzi, ponieważ otrzymane próbki zawierają ważne informacje o reakcjach zapalnych, mechanizmach immunologicznych i postępie choroby zakaźnej, które mogą wystąpić w drogach oddechowych płuc1,2. Za pomocą BAL możliwe jest badanie komórek naciekających. Kontrastuje to z trawionymi płucami, które dają "brudniejszą" populację komórek, z wieloma martwymi i lepkimi komórkami. BAL wykonuje się poprzez wprowadzenie roztworu soli fizjologicznej do końcowych oskrzelików, a następnie odzyskanie tego roztworu. Pobrany roztwór można następnie wykorzystać do ilościowego i fenotypowego analizy rezydentnych komórek płucnych i naciekających komórek zapalnych. Metoda ta jest często stosowana do badania napływu komórek w modelach chorobowych dróg oddechowych, takich jak astma, przewlekła obturacyjna choroba płuc (POChP) i modele chorób zakaźnych. Oprócz składu komórkowego, skład molekularny płucnych dróg oddechowych znajduje również odzwierciedlenie w płynie BAL. Aby to przeanalizować, można przeprowadzić test immunoenzymatyczny (ELISA), immunoblot i jednoczesną analizę wielu cytokin za pomocą układu kulek cytokin w celu oceny obecności cytokin i chemokin.

BAL to sprawdzona metoda badania napływu komórek zapalnych w modelach zwierzęcych zapalnych chorób układu oddechowego. Obserwacja zmienionego napływu komórek (np. zwiększony poziom limfocytów, eozynofili lub neutrofili) może prowadzić do lepszego wglądu w chorobę i może być obiektywnym parametrem do oceny skuteczności interwencji terapeutycznej.

Dokładna i powtarzalna interpretacja analizy komórkowej BAL wymaga, aby BAL była wykonywana poprawnie, a pobrany płyn był prawidłowo obsługiwany i przetwarzany. Termin "płukanie oskrzeli" został wprowadzony ponad osiemdziesiąt lat temu przez Stitt3. W 1961 roku Myrvik uzyskał makrofagi pęcherzykowe z płynu płucnego królika3. BAL jest obecnie powszechnie stosowaną metodą analizy i monitorowania płuc w modelu mysim, jednak w literaturze naukowej nadal nie ma raportu na temat ustandaryzowanej procedury BAL4,5. Co więcej, istnieje prawdopodobnie tyle sposobów na wykonanie BAL, ile jest laboratoriów badawczych wykorzystujących technikę3,6,7,8,9,10,11. Ważne jest, aby dane uzyskane z BAL reprezentowały całe płuco myszy, a nie tylko część płuca. Ten rodzaj zmienności komplikuje interpretację i porównywanie wyników między różnymi badaniami.

Tutaj opisana jest podstawowa, niedroga i powtarzalna procedura BAL, która pozwala na zebranie komórkowej i rozpuszczalnej frakcji obecnej w świetle dróg oddechowych myszy. Krótko mówiąc, cewnik umieszcza się w odsłoniętej tchawicy nieuleczalnie znieczulonej myszy. Do cewnika podłącza się strzykawkę, a do płuc wprowadza się buforowany roztwór soli fizjologicznej zawierający kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Próbki światła płuc pobiera się poprzez delikatne, wielokrotne przepłukiwanie roztworu soli fizjologicznej za pomocą tłoka. Podciśnienie stosowane na tym etapie jest minimalne, aby zapobiec zapadnięciu się dróg oddechowych. Po pobraniu uzyskany BAL należy poddać dalszej obróbce w celu zliczenia i identyfikacji komórek za pomocą cytometrii przepływowej.

Protokół

Wszystkie doświadczenia na zwierzętach opisane w niniejszym badaniu zostały przeprowadzone zgodnie z krajowym prawodawstwem (belgijskie ustawy z 14/08/1986 i 22/12/2003, belgijski dekret królewski z 06/04/2010) oraz prawodawstwem europejskim (dyrektywy UE 2010/63/EU i 86/609/EEC). Wszystkie eksperymenty na myszach oraz wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez komisję etyczną Uniwersytetu w Gandawie (numery pozwoleń LA1400091 i EC2016-027).

1. Przygotowanie

  1. Płyn do płukania
    1. Przygotować zrównoważony roztwór soli z dodatkiem 100 µM kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA).
      UWAGA: Aby zmierzyć poziom białek w płynie BAL, zaleca się dodanie inhibitorów proteaz w celu zapobiegania aktywności proteaz w płynie BAL.
  2. Cewnik
    1. Wykonać cewnik poprzez wprowadzenie igły 23 G do przezroczystej plastikowej rurki polietylenowej 21 G (średnica wewnętrzna: 0,58 mm, średnica zewnętrzna: 0,965 mm, długość: 0,5 cm). Można również zastosować gotowe cewniki.
  3. Środki znieczulające
    1. Przygotować środek do znieczulenia terminalnego, najlepiej taki, który powoduje zatrzymanie oddechu (np. barbituran, taki jak roztwór pentobarbitalu sodu (>100 mg/kg) w soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS)).
      UWAGA: Zaleca się stosowanie znieczulenia wstrzykiwanego zamiast inhalacyjnego, ponieważ znieczulenie inhalacyjne może wpływać na skład płynu BAL. Na przykład CO2 wpływa na pH krwi, a w konsekwencji na redystrybucję różnych związków12.
  4. Bufor do lizy erytrocytów chlorek amonu-potas (ACK)
    1. Przygotować bufor do lizy ACK, rozpuszczając 8,29 g NH4Cl i 1 g KHCO3 w 1 L H2O z dodatkiem 100 µM EDTA; bufor do lizy erytrocytów można również nabyć z zewnętrznego źródła.

2. Wykonywanie płukania oskrzelowo-pęcherzykowego (BAL)

  1. Wprowadzanie cewnika do tchawicy
    1. Uśmierć mysz poprzez podanie dootrzewnowe śmiertelnej dawki krótko działającego anestetyku barbituranowego za pomocą igły 26 G. Aby potwierdzić prawidłową znieczulenie prowadzące do śmierci, uciśnij tylną łapę myszy pęsetą, aby sprawdzić odruch stopy.
    2. Umieść zwierzę na plecach na płycie chirurgicznej i unieruchom mysz, przypinając kończyny.
    3. Spryskaj szyję 70% etanolem w celu dezynfekcji. Za pomocą skalpela wykonaj nacięcie skóry szyi w pobliżu tchawicy.
    4. Rozchyl skórę, aby odsłonić gruczoły ślinowe. Rozsuń gruczoły ślinowe za pomocą pęsety, aby odsłonić mięsień mostkowo-gnykowy. Nacinając mięsień wokół tchawicy za pomocą pęsety, odsłoń tchawicę.
    5. Za pomocą pęsety umieść bawełnianą nitkę pod tchawicą.
    6. Ostrożnie nakłuj środek odsłoniętej tchawicy pomiędzy dwoma pierścieniami chrzęstnymi za pomocą igły 26 G. Należy uważać, aby nie uszkodzić bardziej tchawicy.
    7. Wprowadź cewnik na około 0,5 cm do tchawicy. Upewnij się, że cewnik nie został wprowadzony zbyt głęboko do tchawicy, ponieważ może to prowadzić do uszkodzenia struktury płuc.
    8. Ustabilizuj cewnik, obwiązując tchawicę wokół cewnika bawełnianą nitką umieszczoną w kroku 2.1.5. Jeśli cewnik nie zostanie wystarczająco zawiązany, wstrzyknięty zrównoważony roztwór soli może spłynąć w górną część dróg oddechowych zamiast w dół do płuc.
  2. Zbieranie płynu z płukania
    1. Napełnij strzykawkę 1 mL ilością 1 mL sterylnego zrównoważonego roztworu soli z 100 µM EDTA.
    2. Podłącz strzykawkę 1 mL do cewnika i delikatnie wstrzyknij roztwór soli/EDTA do płuca.
    3. Delikatnie odessij roztwór, masując klatkę piersiową myszy. Jeśli aspirat nie jest widoczny w strzykawce, ostrożnie przesuń cewnik nieco niżej lub wyżej w tchawicy.
    4. Zdejmij strzykawkę z igły i przenieś odzyskany płyn z płukania do probówki 15 mL umieszczonej w lodzie. Normalnie odzyskuje się 700 - 900 µL BAL z 1 mL wstrzykniętego roztworu.
    5. Powtórz kroki 2.2.1 - 2.2.4 jeszcze dwa razy.
      UWAGA: Jeśli celem jest analiza zawartości niekomórkowej, zaleca się zagęszczenie połączonych próbek w przypadku problemów z czułością.

3. Zbieranie składników komórkowych i niekomórkowych płynu BAL

  1. Wirować płyn z płukania przez 7 min przy 400 x g i 4 °C.
  2. Zebrać nadsącz i niezwłocznie wykorzystać go do dalszych analiz (np. ELISA) lub zamrozić w temperaturze -80 °C. Osad komórkowy zachować w celu analizy napływu komórek do płuc.
  3. Resuspender osad komórkowy w 200 µL buforu lizującego ACK.
    UWAGA: Krok ten zapewnia lizę erytrocytów przy jednoczesnym zachowaniu nienaruszonego stanu białych krwinek.
  4. Inkubować przez 2 min w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Aby zmniejszyć zmienność spowodowaną lizą czerwonych krwinek, ten krok nie powinien trwać dłużej niż 2 min.
  5. Dodać 1 mL zimnego PBS, aby rozcieńczyć bufor lizujący ACK.
  6. Wirować przez 7 min przy 400 x g i 4 °C. Odrzucić nadsącz i resuspender komórki w odpowiedniej objętości PBS do dalszych analiz (patrz poniżej).
    UWAGA: Objętość PBS zależy od planowanego rodzaju dalszych badań.

4. Analiza różnych typów komórek w płynie z BAL za pomocą cytometrii przepływowej

UWAGA: Jedną z możliwości jest analiza bezwzględnego i względnego składu komórkowego płynu BAL poprzez wykonanie cytometrii przepływowej. Celem niniejszej pracy jest szczegółowe omówienie techniki BAL. Cytometria przepływowa jest samodzielną, specjalistyczną techniką. Zaleca się zapoznanie z publikacjami specjalistycznymi dotyczącymi techniki cytometrii przepływowej13,14,15,16,17. Stosuje się przeciwciała sprzężone z fluoroforem, które rozpoznają antygeny powierzchniowe (patrz Tabela 1) specyficzne dla konkretnego typu lub typów komórek. Dzięki zastosowaniu strategii bramkowania możliwe jest zidentyfikowanie limfocytów T, makrofagów, komórek dendrytycznych, limfocytów B, eozynofili oraz neutrofili w frakcji komórkowej BAL.

AntygenTyp komórki
Klastra różnicowania 3 (CD3)Ekspresowane na limfocytach T 
Klastra różnicowania 11c (CD11c)Wysoka ekspresja na większości komórek dendrytycznych, ale także na monocytach, makrofagach, neutrofilach i niektórych limfocytach B.
Klastry różnicowania 11b (CD11b)Wyrażane na powierzchni wielu leukocytów, w tym monocytów, neutrofili, komórek natural killer, granulocytów i makrofagów.
SiglecFMakrofagi pęcherzykowe i eosinofile.
MHC klasy IIZazwyczaj występują wyłącznie na komórkach prezentujących antygen, takich jak komórki dendrytyczne, fagocyty jednojądrowe i limfocyty B. 
CD19antygen limfocytów B
Ly-6GMarker monocytów, granulocytów i neutrofili

Tabela 1: Wybór antygenów powierzchniowych komórek odpornościowych. Tabela ta zawiera listę epitopów powierzchniowych wykorzystywanych do charakterystyki różnych typów komórek. Do wiarygodnego zdefiniowania konkretnego typu komórek wymagane będą kombinacje kilku markerów.

Próbki
ProbówkaAntygen-fluorofor dodawany do komórekStężenie roztworu przeciwciał (mg/mL)Rozcieńczenie przeciwciałObjętość całkowita (µL)
Barwnik żywotności do utrwalania0.21/100050
CD11c0.21/80050
SiglecF0.21/10050
próbka XMHCII0.21/20050
CD30.21/20050
CD190.21/20050
CD11b0.21/20050
Ly6G0.21/20050
Kontrole napięcia
ProbówkaAntygen-fluorofor dodawany do komórekStężenie roztworu przeciwciał (mg/mL)Rozcieńczenie przeciwciałObjętość całkowita (µL)
Komórki niebarwione///50
Komórki barwione pojedynczoBarwnik żywotności do utrwalania0.21/100050
Komórki barwione pojedynczoCD11c0.21/80050
Komórki barwione pojedynczoSiglecF0.21/10050
Komórki barwione pojedynczoMHCII0.21/20050
Komórki barwione pojedynczoCD30.21/20050
Komórki barwione pojedynczoCD190.21/20050
Komórki barwione pojedynczoCD11b0.21/20050
Komórki barwione pojedynczoLy6G0.21/20050
Kontrole kompensacji
ProbówkaAntygen-fluorofor dodawany do kulekStężenie roztworu przeciwciał (mg/mL)Rozcieńczenie przeciwciałObjętość całkowita (µL)
Kuleczki niebarwione///200
Kuleczki barwione pojedynczoCD11c0.21/2000200
Kuleczki barwione pojedynczoSiglecF0.21/2000200
Kuleczki barwione pojedynczoMHCII0.21/200200
Kuleczki barwione pojedynczoCD30.21/2000200
Kuleczki barwione pojedynczoCD190.21/2000200
Kuleczki barwione pojedynczoCD11b0.21/400200
Kuleczki barwione pojedynczoLy6G0.21/200200

Tabela 2. Lista kontroli, które należy uwzględnić. Tabela ta przedstawia wszystkie niezbędne kontrole dla dokładnej interpretacji uzyskanych wyników.

  1. Barwienie powierzchni komórek
    UWAGA: Ważne jest uwzględnienie wszystkich kluczowych kontroli dla analizy cytometrycznej. Potrzebne są trzy zestawy probówek (patrz Tabela 2): (1) probówki zawierające próbki; (2) probówki z komórkami BAL dla każdego przeciwciała-fluoroforu do wykonania barwień pojedynczych; pozwala to na określenie napięć dla każdego kanału w cytometrze przepływowym; oraz (3) probówki z kuleczkami dla każdego przeciwciała-fluoroforu do wykonania barwień pojedynczych; służy to określeniu macierzy kompensacji.
    1. Przygotować mieszaninę przeciwciał i bloker Fc (anty-CD16/CD32) w PBS w odpowiednich rozcieńczeniach (patrz Tabela 2). Przed eksperymentem konieczne jest określenie optymalnego rozcieńczenia roboczego dla każdego przeciwciała.
    2. Resuspendować komórki w 50 µL mieszaniny przeciwciał dla próbki i dodać 50 µL odpowiednio rozcieńczonego przeciwciała do kluczowych kontroli.
      UWAGA: Barwienie można przeprowadzić w 96-dołkowej płytce o dnie w kształcie litery U. Umożliwia to łatwe zmniejszenie objętości barwnika i analizę znacznej liczby próbek.
    3. Inkubować przez 30 min w ciemności w temperaturze 4 °C.
    4. Wirować przez 7 min przy 400 x g i 4 °C. Odrzucić nadsącz.
    5. Resuspendować komórki w PBS do końcowej objętości 200 µL.
      UWAGA: Końcowa objętość zależy od minimalnej objętości, jaką może pobrać cytometr przepływowy. Może się ona nieco różnić w zależności od urządzenia. Ponadto objętość odczytu zależy od liczby komórek i/lub czasu, jaki próbka będzie analizowana w cytometrze.
    6. Wykorzystać próbki i kontrole do analizy cytometrycznej.
      UWAGA: Aby określić absolutną liczbę komórek w różnych populacjach, należy dodać kuleczki liczące. Do każdej próbki, tuż przed pomiarem, dodać taką samą liczbę kuleczek (± 25 000 kuleczek). Wykorzystując rozproszenie przednie i boczne (FSC i SSC), kuleczki liczące można zidentyfikować za pomocą cytometrii przepływowej (patrz Rysunek 1). Następnie absolutną liczbę komórek w próbce można obliczyć, porównując stosunek zdarzeń kuleczek do zdarzeń komórek. Można zastosować następujący wzór:
      Wzór cytometrii przepływowej: absolutna liczba komórek z użyciem dodanych kuleczek; eksperymentalna metoda obliczeniowa.
  2. Analiza cytometryczna
    UWAGA: Analizę cytometryczną należy przeprowadzić niezwłocznie po zakończeniu protokołu barwienia. Należy użyć cytometru przepływowego z odpowiednimi laserami i filtrami do detekcji sygnału. Tabela 3 przedstawia zestawienie laserów i filtrów potrzebnych do badania opisanego w niniejszym artykule. Więcej informacji na temat analizy cytometrycznej znajduje się w pracy Adan et al.18.
    1. Ustawić bramki podstawowe na podstawie rozproszenia przedniego i bocznego, wykluczając zanieczyszczenia i dublety (patrz Rysunek 1).
    2. Dostosować napięcie oraz kompensację nakładania się widm z pomocą komórek i kuleczek barwionych pojedynczo.
      UWAGA: Ustawienia te różnią się dla każdego cytometru przepływowego i muszą być sprawdzane przed każdym eksperymentem. Dla poprawnej analizy przepływowej krytyczne są napięcia rozproszenia przedniego i bocznego. Prawidłowe rozproszenie przednie i boczne może pomóc w identyfikacji i potwierdzeniu tożsamości analizowanych komórek. Aby określić te napięcia, w pierwszej kolejności należy przeanalizować próbkę niebarwioną.
    3. Ustawić bramki fluorescencji dla antygenu powierzchniowego (patrz Rysunek 1) i przeanalizować próbki.
Typ laseraKonfiguracja filtrów
505 LP525/50
Niebieski (488 nm) 550 LP575/26
100 mW670 LP685/35
750 LP780/60
fioletowy 405 nm450/50
100 mW
czerwony 633 nm660/20
70 mW750 LP780/60

Tabela 3: Przegląd laserów i filtrów cytometru przepływowego użytego w niniejszym badaniu.

Wyniki

Po przeprowadzeniu BAL przy użyciu 3x 1 mL buforowego roztworu soli, należy odzyskać objętość od 2 do 3 mL. Płyn BAL może być następnie analizowany w celu scharakteryzowania zawartości komórkowej i niekomórkowej. Aby zbadać obecność cytokin i chemokin, można przeprowadzić test ELISA19, immunoblotting20 oraz jednoczesną analizę wielu cytokin za pomocą macierzy koralików cytokinowych (cytokine bead array)21. Dodatkowo można oznaczyć zawartość albumin i białka całkowitego w tym płynie22.

Przykładowo, niniejszy artykuł opisuje sposób analizy zawartości komórkowej płynu z BAL za pomocą cytometrii przepływowej. Analizowany płyn z BAL pobrano od samic myszy Balb/cAnNCrl (wiek: 7 tygodni) 24 h po intratrachealnym podaniu lipopolisarydu. Do identyfikacji różnych typów komórek wykorzystano następujące przeciwciała sprzężone z fluoroforem: CD11c, SiglecF, MHCII, CD3ε, CD19, Ly6g oraz CD11b (patrz Tabela 1 i Tabela Materiałów). Zastosowano również barwnik do oceny żywotności komórek (fixable viability dye). Dzięki zastosowaniu strategii bramkowania opartej na różnicowej ekspresji antygenów na powierzchniach poszczególnych populacji komórek (Rycina 1), możliwe było zidentyfikowanie makrofagów, komórek dendrytycznych, limfocytów B, limfocytów T, neutrofili oraz eozynofili.

W pierwszej kolejności, na podstawie parametrów rozpraszania światła w przodzie i z boku, wykluczono z analizy zanieczyszczenia (debris) oraz dublety. Zastosowanie barwnika żywotności umożliwiło wyselekcjonowanie żywych komórek. Następnie zidentyfikowano komórki CD11c high oraz komórki CD11c low. W populacji CD11c high makrofagi i komórki dendrytyczne zidentyfikowano odpowiednio na podstawie ekspresji MHCII i SiglecF. W populacji CD11c low limfocyty T i limfocyty B zidentyfikowano odpowiednio na podstawie ekspresji CD3ε i CD19. W pozostałej populacji komórek neutrofile i eozynofile zidentyfikowano odpowiednio na podstawie ekspresji markerów CD11b i Ly-6G.

W celu określenia bezwzględnej liczby komórek w różnych populacjach komórkowych dodano koraliki liczące, porównując stosunek zdarzeń koralików do zdarzeń komórek23. Koraliki liczące zidentyfikowano na podstawie ich właściwości rozpraszania światła w przodzie i z boku (Rycina 1). Tabela 4 przedstawia zestawienie bezwzględnych liczb komórek w różnych populacjach komórkowych w płyku BAL myszy naiwnej oraz myszy stymulowanej przez 24 h za pomocą 5 µg lipopolisacharydu.

Wykres danych z cytometrii przepływowej, proces różnicowania komórek i bramkowania komórek odpornościowych, analiza leukocytów.
Rysunek 1: Strategia bramkowania dla cytometrycznego wykrywania makrofagów, komórek dendrytycznych, limfocytów T, limfocytów B, neutrofili i eozynofili w płycie BAL.Komórki BAL zostały wyizolowane zgodnie z opisanym protokołem BAL. Komórki pobrano od myszy 24 h po intratrachealnej instylacji lipopolisacharydu. Kulek liczących oraz komórki zidentyfikowano na podstawie właściwości rozproszenia światła w przód (forward scatter) i z boku (side scatter). W bramce komórkowej zidentyfikowano pojedyncze komórki, korzystając z rozproszenia w przód i z boku. W tej ostatniej populacji wyłoniono komórki żywe. Następnie zidentyfikowano komórki CD11chigh oraz CD11clow. W populacji CD11chigh makrofagi i komórki dendrytyczne zidentyfikowano odpowiednio na podstawie ekspresji MHCII oraz SiglecF. W populacji CD11clow limfocyty T i limfocyty B zidentyfikowano odpowiednio na podstawie ekspresji CD3ε oraz CD19. W pozostałej populacji komórek neutrofile i eozynofile zidentyfikowano odpowiednio na podstawie ekspresji CD11b oraz Ly-6G. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

populacja komórekbezwzględna liczba komórek u myszy naiwnych bezwzględna liczba komórek u myszy stymulowanych LPS
makrofagi79,61225,439
komórki dendrytyczne495671
limfocyty T45,27128,089
limfocyty B4,1642,926
neutrofile632566,716
eosinofile3,4834,332

Tabela 4: Reprezentatywne wyniki analizy cytometrii przepływowej płynu BAL myszy naiwnych i stymulowanych LPS.

Dyskusja

BAL jest przydatną techniką uzyskiwania informacji cytologicznych i biochemicznych w odpowiedzi na infekcje lub leki. Początkowo BAL był stosowany do kontrolowania nadmiernej produkcji śluzu u pacjentów cierpiących na toksyczność fosgenu3. Obecnie technika ta jest stosowana u ludzi do badania patogenezy płuc, diagnostyki i leczenia chorób 3,24. U zwierząt laboratoryjnych BAL jest powszechnie stosowany do monitorowania reakcji zapalnych, mechanizmów immunologicznych i procesów chorób zakaźnych, które zachodzą w płucnych drogach oddechowych 1,2.

Aby zbadać zapalny wzorzec komórkowy w modelach chorób układu oddechowego, po BAL należy przeprowadzić bezwzględne i różnicowe zliczanie komórek. Oprócz bezwzględnej liczby komórek interesujące są również względne numery komórek. Na przykład modele naprawcze i nowotworowe wykazują bardzo mały lub zerowy wzrost liczby komórek BAL. W tym modelu przydatna jest ocena składu komórkowego. Stosując barwienie komórek w połączeniu z mikroskopią świetlną, można zidentyfikować różne typy komórek, takie jak eozynofile, neutrofile, makrofagi i limfocyty, na podstawie morfologii 25,26,27,28,29,30. Cytometria przepływowa może być stosowana do specyficznych ocen, takich jak identyfikacja różnych fenotypów limfocytów T 7,31. Oprócz identyfikacji różnych populacji komórek naciekających, skład niekomórkowy płuc można badać za pomocą BAL. Metody takie jak ELISA, immunoblot, układ kulek cytokin, immunohistochemia i ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy są wykonywane na płynie BAL w celu określenia cytokin, czynników wzrostu i innych składników zapalnych. Aby określić uszkodzenie płuc, można również zmierzyć całkowity poziom dehydrogenazy białkowej i mleczanowej w płynie BAL32,33.

Dzięki opracowaniu nowych narzędzi diagnostycznych, w niedalekiej przyszłości możliwa będzie genomiczna i proteomiczna charakterystyka składników BAL. Połączenie rosnących możliwości obliczeniowych i wysokoprzepustowych technologii ekspresji genów umożliwi zdefiniowanie określonych profili ekspresji genów dla różnych stanów chorobowych. Wykonanie tych technik na płynie BAL może dostarczyć wzorców ekspresji genów i białek w celu identyfikacji ważnych cząsteczek zaangażowanych w różne fazy chorób płuc.

Głównym ograniczeniem danych uzyskanych z płynu BAL jest brak porównywalności między różnymi badaniami naukowymi 3,9. Istnieje duży stopień zmienności w technice płukania i późniejszej obróbki płynu BAL. Aby móc porównać każdą próbę BAL, konieczna jest standaryzacja rodzaju wstrzykiwanego płynu z płukania, miejsca wkraplania oraz frakcji, która ma być analizowana pod kątem składu komórkowego i niekomórkowego. Istnieją znaczne różnice w liczbie frakcji płukania między różnymi próbami, wahające się od 1 do 14 razy 34,35,36. Różnica ta może mieć wpływ na szacowaną całkowitą liczbę komórek w płucach. Ważne jest, aby wiedzieć, która frakcja płynu BAL zawiera większość komórek. Song i wsp. wykazali, że około 70% całkowitej liczby komórek zostało pobranych we frakcji od 1 do32. Jednak inne doniesienia sugerowały, że drugie płukanie zawierało więcej komórek niż pierwsze37,38. Z tych badań możemy wywnioskować, że płukanie z tylko jedną frakcją nie reprezentuje całego płuca, co prowadzi do błędnej interpretacji wyników.

Skład niekomórkowy płynu BAL zawiera cenne informacje na temat stanu zdrowia płuc 33,39,40. Różnice w rozcieńczeniu płynu BAL przyczyniają się do różnicy w oznaczaniu ilościowym frakcji rozpuszczalnej, a w konsekwencji do różnic w wynikach między próbami. Song i wsp. Porównano poziomy dehydrogenazy białkowej i mleczanowej w każdej frakcji płukania i stwierdzono, że pierwsza frakcja płukania zawierała dwa do trzech razy więcej niż druga frakcja.

Aby pobrać reprezentatywną próbkę BAL do analizy, kluczowe są pewne względy techniczne. Jednym z nich jest wykonanie odpowiedniego znieczulenia. Bardzo ważne jest, aby sprawdzić odruch stopy myszy, aby zapewnić końcowe uspokojenie. Jest to ważne nie tylko ze względów etycznych, ale także dlatego, że trudno jest umieścić i utrzymać cewnik we właściwej pozycji, jeśli mysz nie jest odpowiednio znieczulona.

Drugą ważną kwestią techniczną jest położenie cewnika w tchawicy. Gdy cewnik zostanie wprowadzony zbyt głęboko, może uszkodzić strukturę płuc. Dystalny koniec cewnika nie powinien sięgać do płuc podczas zabiegu BAL. Cewnik powinien być również ustabilizowany i przewiązany bawełnianą nicią. Jeśli cewnik nie jest ustabilizowany, wstrzyknięty roztwór soli fizjologicznej może spływać w górę do jamy nosowej zamiast w dół do płuc. Podczas wstrzykiwania i zasysania roztworu soli fizjologicznej ważne jest, aby cewnik był stabilnie trzymany.

Dane uzyskane z płynu BAL muszą reprezentować całe płuco myszy. Dlatego ważne jest, aby wkroplić odpowiednią objętość buforu soli fizjologicznej (tj. 3 ml, podzielone na 3 porcje po 1 ml każda). Nie ma liniowej zależności między wydajnością ogniw a wydajnością płynu BAL. Ważne jest, aby delikatnie zebrać roztwór, masując klatkę piersiową myszy. Jeśli siły ścinające są zbyt duże, żywotność, funkcja i struktura komórek w drogach oddechowych i płynie BAL mogą być zagrożone. Jeśli zasysany płyn nie jest widoczny w strzykawce, ostrożnie wsuń cewnik głębiej lub wyżej w tchawicy.

Szczególną uwagę należy zwrócić na szczególne aspekty przetwarzania i analizy BAL. Pozwoli to zmaksymalizować informacje zachowane z próbek BAL. Po BAL komórki znajdują się w pożywce ubogiej w składniki odżywcze. Dlatego bardzo ważne jest, aby przetworzyć próbki w ciągu 1 godziny po pobraniu próbek BAL. Jeśli konieczne jest długotrwałe przechowywanie, wymagane jest użycie pożywki uzupełnionej składnikami odżywczymi.

Aby zachować żywotność komórek, unikaj rurek, które sprzyjają przyleganiu komórek do powierzchni. Należy unikać wirowania zawiesin komórek z prędkościami, które mogą zagrozić integralności komórkowej lub uniemożliwić równomierne ponowne zawieszenie pobranych komórek BAL. Płyn BAL zawierający komórki należy odwirowywać w temperaturze 400 x g i temperaturze 4 °C przez 7 minut. Należy pamiętać, że zawiesiny komórek powinny być przechowywane w temperaturze 4 °C podczas przetwarzania.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

L.V.H. jest asystentem naukowym na Wydziale Biomedycznej Biologii Molekularnej Uniwersytetu w Gandawie. E.R.J. jest wspierany przez UniVacFlu, numer grantu 607690. K.R. jest wspierany przez projekt EC-FP7 FLUNIVAC.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Zrównoważony roztwór soli Hanksa (HBSS)Thermo Fisher Scientific14175-129
kwas etyleno-endiaminotetraoctowy (EDTA)Sigma-AldrichE6511drażniący
23 G x 1 1/4 igłyHenke Sass Wolf4710006030rozmiar: 0,60 x 30 mm
Igła 26 G x 1/2Henke Sass Wolf47100045120,45 x 12 mm
BD medical technology427411Rurki polietylenowe, ID 0,58 mm (0,023") OD 0,965 mm (0,38") 30,5 m (100')
pentobarbital soduKela NV514
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)LonzaBE17-516FPBS bez Ca2+ Mg2+ lub czerwieni fenolowej; sterylne filtrowane
strzykawki 1 mlHenke Sass Wolf5010.200V0niepirogenne i nietoksyczne
kleszczeFine Science Tools GmbH 91197-00
Nożyczki chirurgiczneFine Science Tools GmbH 91460-11
probówka wirówkowa 50 mlTH. Geyer7696705Nie zawiera Rnazy/Dnazy/endotoksyny
w probówce wirówkowej 15 mlTH. Geyer7696702Wolna od Rnazy/Dnazy/endotoksyny
mikrowirówka 1,5 mlSigma-Aldrich0030 120.094Mikrowirówka polipropylenowa
Wirówka Sigma-Aldrich5415R
Thermo Fisher Scientific75004030
Ammonowo-Chlorkowo-Potasowy (ACK) bufor lizującyLonza10-548Esterylnie filtrowany
żywy/martwy - Efluor 506eBioscience65-0866-18  Możliwy do naprawienia barwnik żywotności
CD11c-PE-CY7eBiosciences25-0114-81
SiglecF-PEBD Pharmingen 552126 
MHCII-APCefluor780Biolegend107628 
CD3-PE-CY5VWR55-0031-U100 
CD19-PE-cy5eBiosciences15-0193-83 
CD11B-V450BD Pharmingen 560455 
Ly6G-AF700Biolegend127621
Absolutne koraliki do liczeniaLife Technologies Europe B.V. C36950
anty-CD16/CD32BD Pharmingen553142
96-dołkowy 340 & mikro; l płyta do przechowywaniaFalcon353263V-dolny, naturalny polipropylenowy
cytometr przepływowy CewnikBD Biosciences
BD Biosciences393202
rozmiar: rurka z tworzywa sztucznego

Bibliografia

  1. Stankunas, K., et al. Conditional protein alleles using knockin mice and a chemical inducer of dimerization. Mol Cell. 12 (6), 1615-1624 (2003).
  2. Hunninghake, G. W., Gadek, J. E., Kawanami, O., Ferrans, V. J., Crystal, R. G. Inflammatory and immune processes in the human lung in health and disease: evaluation by bronchoalveolar lavage. Am J Pathol. 97 (1), 149-206 (1979).
  3. Gee, J. B., Fick, R. B. Bronchoalveolar lavage. Thorax. 35 (1), 1-8 (1980).
  4. Tornling, G., et al. Hyaluronic acid in bronchoalveolar lavage in rats exposed to quartz. Br J Ind Med. 44 (7), 443-445 (1987).
  5. Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect respiratory tract toxicity of inhaled material. Exp Toxicol Pathol. 57, Suppl 1. 155-159 (2005).
  6. Morris, A., et al. Longitudinal analysis of the lung microbiota of cynomolgous macaques during long-term SHIV infection. Microbiome. 4 (1), 38(2016).
  7. Naessens, T., et al. GM-CSF treatment prevents respiratory syncytial virus-induced pulmonary exacerbation responses in postallergic mice by stimulating alveolar macrophage maturation. J Allergy Clin Immunol. 137 (3), 700-709 (2016).
  8. Chockalingam, A., Duraiswamy, R., Jagadeesan, M. Bronchoalveolar lavage cellular analyses in conjunction with high-resolution computed tomography imaging as a diagnostic intervention for patients with suspected interstitial lung disease. Lung India. 33 (3), 287-291 (2016).
  9. Crystal, R. G., Reynolds, H. Y., Kalica, A. R. Bronchoalveolar lavage. The report of an international conference. Chest. 90 (1), 122-131 (1986).
  10. Baughman, R. P. The uncertainties of bronchoalveolar lavage. Eur Respir J. 10 (9), 1940-1942 (1997).
  11. Singletary, M. L., et al. Modification of a common BAL technique to enhance sample diagnostic value. J Am Assoc Lab Anim Sci. 47 (5), 47-51 (2008).
  12. Angus, D. W., Baker, J. A., Mason, R., Martin, I. J. The potential influence of CO2, as an agent for euthanasia, on the pharmacokinetics of basic compounds in rodents. Drug Metab Dispos. 36 (2), 375-379 (2008).
  13. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  14. Inglis, H., Norris, P., Danesh, A. Techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry. J Vis Exp. (97), (2015).
  15. Rubio-Navarro, A., et al. Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry. J Vis Exp. (116), (2016).
  16. Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas. J Vis Exp. (53), (2011).
  17. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. J Vis Exp. (82), e51105(2013).
  18. Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. , 1-14 (2016).
  19. Database, J. S. E. The ELISA method. J Vis Exp. , (2016).
  20. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  21. Wunderlich, M. L., Dodge, M. E., Dhawan, R. K., Shek, W. R. Multiplexed fluorometric immunoassay testing methodology and troubleshooting. J Vis Exp. (58), (2011).
  22. Song, J. A., et al. Standardization of bronchoalveolar lavage method based on suction frequency number and lavage fraction number using rats. Toxicol Res. 26 (3), 203-208 (2010).
  23. Seliger, C., et al. A rapid high-precision flow cytometry based technique for total white blood cell counting in chickens. Vet Immunol Immunopathol. 145 (1-2), 86-99 (2012).
  24. Daniele, R. P., Elias, J. A., Epstein, P. E., Rossman, M. D. Bronchoalveolar lavage: role in the pathogenesis, diagnosis, and management of interstitial lung disease. Ann Intern Med. 102 (1), 93-108 (1985).
  25. Delayre-Orthez, C., Becker, J., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Exposure to endotoxins during sensitization prevents further endotoxin-induced exacerbation of airway inflammation in a mouse model of allergic asthma. Int Arch Allergy Immunol. 138 (4), 298-304 (2005).
  26. Delayre-Orthez, C., et al. PPARalpha downregulates airway inflammation induced by lipopolysaccharide in the mouse. Respir Res. 6, 91(2005).
  27. Delayre-Orthez, C., de Blay, F., Frossard, N., Pons, F. Dose-dependent effects of endotoxins on allergen sensitization and challenge in the mouse. Clin Exp Allergy. 34 (11), 1789-1795 (2004).
  28. Hachet-Haas, M., et al. Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. J Biol Chem. 283 (34), 23189-23199 (2008).
  29. Ble, F. X., et al. Activation of the lung S1P(1) receptor reduces allergen-induced plasma leakage in mice. Br J Pharmacol. 158 (5), 1295-1301 (2009).
  30. Ble, F. X., et al. Allergen-induced lung inflammation in actively sensitized mice assessed with MR imaging. Radiology. 248 (3), 834-843 (2008).
  31. Reber, L. L., et al. A dissociated glucocorticoid receptor modulator reduces airway hyperresponsiveness and inflammation in a mouse model of asthma. J Immunol. 188 (7), 3478-3487 (2012).
  32. Drent, M., Cobben, N. A., Henderson, R. F., Wouters, E. F., van Dieijen-Visser, M. Usefulness of lactate dehydrogenase and its isoenzymes as indicators of lung damage or inflammation. Eur Respir J. 9 (8), 1736-1742 (1996).
  33. Henderson, R. F. Use of bronchoalveolar lavage to detect lung damage. Environ Health Perspect. 56, 115-129 (1984).
  34. Forget, G., et al. An adherent cell perifusion technique to study the overall and sequential response of rat alveolar macrophages to toxic substances. Environ Health Perspect. 51, 131-140 (1983).
  35. Sung, J. H., et al. Recovery from welding-fume-exposure-induced lung fibrosis and pulmonary function changes in sprague dawley rats. Toxicol Sci. 82 (2), 608-613 (2004).
  36. Majetschak, M., Sorell, L. T., Patricelli, T., Seitz, D. H., Knoferl, M. W. Detection and possible role of proteasomes in the bronchoalveolar space of the injured lung. Physiol Res. 58 (3), 363-372 (2009).
  37. Rehn, B., Bruch, J., Zou, T., Hobusch, G. Recovery of rat alveolar macrophages by bronchoalveolar lavage under normal and activated conditions. Environ Health Perspect. 97, 11-16 (1992).
  38. Kelly, C. A., Ward, C., Stenton, S. C., Hendrick, D. J., Walters, E. H. Assessment of pulmonary macrophage and neutrophil function in sequential bronchoalveolar lavage aspirates in sarcoidosis. Thorax. 43 (10), 787-791 (1988).
  39. Eklund, A., Tornling, G., Blaschke, E., Curstedt, T. Extracellular matrix components in bronchoalveolar lavage fluid in quartz exposed rats. Br J Ind Med. 48 (11), 776-782 (1991).
  40. Olsen, G. N., Harris, J. O., Castle, J. R., Waldman, R. H., Karmgard, H. J. Alpha-1-antitrypsin content in the serum, alveolar macrophages, and alveolar lavage fluid of smoking and nonsmoking normal subjects. J Clin Invest. 55 (2), 427-430 (1975).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

cytometria przep ywowamarkery powierzchniowe kom rekpobieranie p ynu BALkaniulacja tchawicybufor lizuj cy ACKidentyfikacja kom rek odporno ciowychmacierz kuleczkowa cytokin
Płukanie oskrzelowo-pęcherzykowe płuc myszy w celu analizy nacieku komórek zapalnych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.