Artykuł metodologiczny

Synteza biokompatybilnych pianek elastomerowych ciekłokrystalicznych jako rusztowań komórkowych do przestrzennych hodowli komórkowych 3D

DOI:

10.3791/55452

⸱

11 kwietnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Liquid Crystal Institute, Kent State University, 2Chemical Physics Interdisciplinary Program, Liquid Crystal Institute, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie przedstawia metodologię przygotowania 3D, biodegradowalnych, pianopodobnych rusztowań komórkowych opartych na biokompatybilnych elastomerach ciekłokrystalicznych o łańcuchu bocznym (LCE). Eksperymenty z mikroskopią konfokalną pokazują, że podobne do piany LCE pozwalają na przyłączanie komórek, proliferację i spontaniczne ustawianie mioblastów C2C12.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj prezentujemy krok po kroku przygotowanie 3D, biodegradowalnego, piankowego rusztowania komórkowego. Rusztowania te zostały przygotowane przez sieciowanie kopolimerów w bloku gwiaździstym zawierających jednostki cholesterolu jako grupy wiszące łańcucha bocznego, w wyniku czego powstały elastomery ciekłokrystaliczne (LCE) smektyczne-A (SmA). Rusztowania przypominające piankę, przygotowane przy użyciu metalowych szablonów, posiadają połączone ze sobą mikrokanały, dzięki czemu nadają się jako rusztowania do hodowli komórkowych 3D. Połączone właściwości regularnej struktury pianki metalowej i elastomeru skutkują uzyskaniem rusztowania komórkowego 3D, które sprzyja nie tylko większej proliferacji komórek w porównaniu z konwencjonalnymi porowatymi foliami szablonowymi, ale także lepszemu zarządzaniu transportem masowym (tj. składnikami odżywczymi, gazami, odpadami itp.). Charakter metalowego szablonu pozwala na łatwą manipulację kształtami pianki (tj. rolkami lub foliami) oraz na przygotowanie rusztowań o różnych rozmiarach porów do różnych badań komórkowych, przy jednoczesnym zachowaniu połączonej porowatej natury szablonu. Proces trawienia nie wpływa na skład chemiczny elastomerów, zachowując ich biokompatybilny i biodegradowalny charakter. Wykazaliśmy, że te smektyczne LCE, gdy są hodowane przez długi czas, umożliwiają badanie klinicznie istotnych i złożonych konstruktów tkankowych, jednocześnie promując wzrost i proliferację komórek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Istnieje kilka przykładów biologicznych i biokompatybilnych materiałów syntetycznych przeznaczonych do zastosowań w badaniach komórkowych i do regeneracji tkanek, mających na celu przyczepianie i proliferację komórek1,2,3,4,5. Istnieje kilka przykładów materiałów biokompatybilnych, znanych jako elastomery ciekłokrystaliczne (LCE), które mogą reagować na bodźce zewnętrzne za pomocą anizotropowego uporządkowania molekularnego6,7. LCE to materiały reagujące na bodźce, które łączą właściwości mechaniczne i sprężyste elastomerów z funkcjonalnością optyczną i porządkowaniem molekularnym ciekłych kryształów8,9. LCE mogą doświadczać zmian kształtu, odkształceń mechanicznych, zachowania sprężystego i właściwości optycznych w odpowiedzi na bodźce zewnętrzne (np. ciepło, naprężenie, światło itp.)10,11,12,13,14,15,16. Wcześniejsze badania wykazały, że ciekłe kryształy (LC) mogą wykrywać wzrost i orientację komórek4,17. Można zatem założyć, że LCE mogą być odpowiednie do zastosowań istotnych biologicznie i medycznie, w tym do rusztowania i wyrównywania komórek. Wcześniej informowaliśmy o przygotowaniu smektycznych biokompatybilnych, biodegradowalnych, formowanych i cienkich folii LCE o porowatej morfologii "typu sera szwajcarskiego"6,18. Przygotowaliśmy również nematyczne biokompatybilne LCE o morfologii kulistej jako rusztowania do wzrostu komórek19,20. Nasze prace miały na celu dostrojenie właściwości mechanicznych materiałów tak, aby odpowiadały właściwościom tkanki będącej przedmiotem zainteresowania21. Ponadto badania te koncentrują się na zrozumieniu interakcji elastomer-komórka, a także odpowiedzi komórkowej, gdy elastomery są poddawane bodźcom zewnętrznym.

Głównym wyzwaniem było częściowo dostosowanie porowatości LCE, aby umożliwić przyłączanie i przenikanie komórek przez matrycę elastomerową oraz lepszy transport masowy. Porowatość tych cienkich warstw6 pozwalała na przenikanie komórek przez większą część matrycy, ale nie wszystkie pory były w pełni połączone ze sobą lub miały bardziej regularny (jednorodny) rozmiar porów. Następnie opisaliśmy biokompatybilne nematyczne elastomery LCE o morfologii kulistej. Te nematyczne elastomery pozwalały na przyczepianie się i proliferację komórek, ale wielkość porów wahała się tylko od 10 do 30 μm, co uniemożliwiało lub ograniczało stosowanie tych elastomerów z szerszą gamą linii komórkowych19,20.

Poprzednia praca Künga i in. dotycząca tworzenia pianek grafenowych za pomocą "ofiarnego" metalowego szablonu wykazała, że uzyskana pianka grafenowa miała bardzo regularną porowatą morfologię podyktowaną przez wybrany metalowy szablon22. Metodologia ta zapewnia pełną kontrolę nad porowatością i wielkością porów. Jednocześnie plastyczność i elastyczność metalowego szablonu pozwala na tworzenie różnych kształtów szablonów przed przygotowaniem pianki. Inne techniki, takie jak ługowanie materiałów23, gas templating24 lub electro-spun fibers25,26 również oferują potencjał przygotowania materiałów porowatych, ale są bardziej czasochłonne, a w niektórych przypadkach rozmiar porów jest ograniczony do zaledwie kilku mikrometrów. Piankowe LCE 3D przygotowane przy użyciu metalowych szablonów pozwalają na większe obciążenie ogniw; poprawa tempa proliferacji; kokultura; i wreszcie, co nie mniej ważne, lepsze zarządzanie transportem masowym (tj. składnikami odżywczymi, gazami i odpadami) w celu zapewnienia pełnego rozwoju tkanek27. Wydaje się, że podobne do pianki LCE 3D również poprawiają wyrównanie komórek; jest to najbardziej prawdopodobne w odniesieniu do wisiorków LC wykrywających wzrost komórek i orientację komórek. Obecność ugrupowań LC w LCE wydaje się poprawiać wyrównanie komórek w odniesieniu do lokalizacji komórek w rusztowaniu LCE. Komórki wyrównują się w rozpórkach LCE, podczas gdy nie obserwuje się wyraźnej orientacji w miejscu, w którym rozpórki łączą się ze sobą (skrzyżowania)27.

Ogólnie rzecz biorąc, nasza platforma rusztowań komórkowych LCE jako nośnik do podtrzymywania komórek oferuje możliwości dostrojenia morfologii elastomeru i właściwości elastycznych oraz specyficznego kierowania wyrównaniem (indywidualnych) typów komórek w celu stworzenia uporządkowanych, przestrzennych układów komórek podobnych do żywych systemów. Oprócz zapewnienia rusztowania zdolnego do podtrzymywania i kierowania długoterminowym wzrostem i proliferacją komórek, LCE pozwalają również na dynamiczne eksperymenty, w których orientacja komórek i interakcje mogą być modyfikowane na bieżąco.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

UWAGA: Następujące kroki dla przygotowania pianki 3D LCE przy użyciu 3-ramiennego kopolimeru bloku gwiaździstego są pokazane na rysunku 1. W celu scharakteryzowania magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR) widma są rejestrowane w deuterowanym chloroformie (CDCl3) w temperaturze pokojowej na instrumencie Bruker DMX 400 MHz i wewnętrznie odnoszone piki szczątkowe przy 7,26. Widma w podczerwieni z transformacją Fouriera (FT-IR) są rejestrowane za pomocą spektrometru FT-IR Bruker Vector 33 w trybie tłumienia całkowitego odbicia. Na każdym etapie poniższego protokołu ważne jest noszenie odpowiedniej odzieży ochronnej (PPE).

1. Synteza α-chloro-ε-kaprolaktonu (monomeru) (zgodnie z procedurą w Jérôme et al.28)

  1. Przed rozpoczęciem syntezy należy oczyścić 27 g kwasu 3-chloroperbenzoesowego w następujący sposób:
    1. W 800 ml wody destylowanej dodać 1,28 g jednowodnego fosforanu sodu jednowodnego i 8,24 g dwuwodnego fosforanu sodu. Doprowadzić pH do 7,4 (używając wodorotlenku sodu lub kwasu solnego) i zachować 30 ml tego roztworu; To jest roztwór buforowy.
    2. Za pomocą rozdzielacza rozpuścić kwas 3-chloroperbenzoesowy w 35 ml eteru dietylowego. Przemyć roztwór organiczny 10 ml roztworu buforowego (przygotowanego w kroku 1.1.1.). Powtórz pranie trzy razy.
    3. Dodać 3 g siarczanu sodu bezpośrednio do roztworu organicznego; ten środek osuszający absorbuje wodę z roztworu organicznego.
    4. Przefiltrować roztwór, aby usunąć środek suszący. Zagęścić filtrat pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej przy ciśnieniu 850 mbar i temperaturze 40 °C.
  2. Rozpuścić 18,5 g oczyszczonego kwasu 3-chloroperbenzoesowego w 150 ml suchego dichlorometanu przez mieszanie w łaźni ultradźwiękowej; proces ten trwa zwykle 20 minut. Umieść roztwór w rozdzielaczu.
  3. Wewnątrz kolby okrągłodennej z dwiema szyjkami rozpuścić 13,1 g 2-chlorocykloheksanonu w 15 ml suchego dichlorometanu za pomocą mieszadła magnetycznego pod gazowym azotem. Mieszaj dalej.
  4. Umieścić rozdzielacz zawierający roztwór kwasu 3-chloroperbenzoesowego (z etapu 1.2) do kolby dwuszyjkowej z krokiem 1.3. Przepłukać układ azotem gazowym. Ustawić otwór rozdzielacza w taki sposób, aby roztwór kwasu chloroperbenzoesowego wpadał kroplami do roztworu 2-chlorocykloheksanonu (1 kropla co drugą sekundę) i kontynuować mieszanie mieszaniny pod wpływem azotu przez 96 godzin.
  5. Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury -20 °C przez 1 godzinę w celu wytrącenia produktu ubocznego kwasu m-chlorobenzoesowego (m-CBA).
  6. Przefiltrować kwas m-chlorobenzoesowy (m-CBA) i przemyć pozostały roztwór nasyconymi roztworami tiosiarczanu sodu, wodorowęglanu sodu i chlorku sodu.
  7. Usunąć rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej o ciśnieniu 850 mbar i temperaturze 40 °C. Oczyść bladożółtą, lepką ciecz przez destylację pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 2,3 Torr i temperaturze 96 °C.
  8. Monitoruj powodzenie syntezy przy użyciu następujących pików 1H NMR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ[ppm]): 4,75-4,68 (m, 1H, CHClCO), 4,37-4,26 (m, 1H, CH2O), 4,18-4,05 (m, 1H, CH2O) i 2,06-1,58 (m, 6H, −CH2−)6,27.

2. Synteza α-trójramiennego kopolimeru bloku gwiazdowego (SBC-αCl) metodą kopolimeryzacji z otwarciem pierścienia (Sharma et al.6 oraz Amsden et al.29)

  1. Przed syntezą należy sylianizować ampułkę o pojemności 20 ml, wypełniając ją 2% (v/v) roztworem 1H,1H, 2H,2H-perfluorooktylotrietoksysilanu w toluenie i mieszając przez około 24 godziny. Spłukać alkoholem izopropylowym i wysuszyć, umieszczając w piekarniku w temperaturze 140 °C na 30 min.
  2. Do ampułki dodać 3,64 g destylowanego ε-kaprolaktonu, 0,5 g α-chloro-ε-kaprolaktonu i 0,25 ml glicerolu. Mieszaj za pomocą wiru przez 1 min.
  3. Dodać 4,90 g D,L-laktydu do ampułki i przepłukać ją azotem. Umieścić ampułkę w piekarniku w temperaturze 120 °C, aby stopić D,L-laktyd; Proces ten trwa zwykle około 2 godzin. Wymieszaj ponownie za pomocą wiru, aby upewnić się, że cała zawartość jest dobrze wymieszana i dodać 66 μl cyny(II)2-etyloheksanianu (Sn(Oct)2) do ampułki.
    UWAGA: D,L-laktyd ostygnie podczas tego procesu i będzie musiał zostać ponownie podgrzany w piekarniku, aby się stopić.
  4. Energicznie wymieszaj po raz ostatni za pomocą wiru i przepłucz azotem.
  5. Zamknąć ampułkę gumowym korkiem. Umieść igłę podłączoną do rurki próżniowej (zwykle wystarcza próżnia domowa) przez gumowy korek. Włącz odkurzacz i za pomocą płomienia rozpuść długą szyjkę szkła, powoli skręcając, aż szklanka zapadnie się na siebie. Uważaj, aby nie stopić gumowego korka. Po zgrzaniu płomienia ampułkę umieść ją w łaźni piaskowej, piekarniku lub odpowiednim elemencie grzejnym w temperaturze 140 °C na 48 godzin.
  6. Wyjmij ampułkę i pozwól jej ostygnąć w temperaturze pokojowej.
  7. Rozbić ampułkę w miejscu zapieczętowania i rozpuścić ciecz o dużej lepkości, dodając 10 ml dichlorometanu. Przenieść roztwór do rozdzielacza.
  8. Przygotować kolbę zawierającą 100 ml zimnego metanolu (schłodzonego przy użyciu kąpieli suchego lodu i acetonu w temperaturze około -78 °C). Zamocować lejek separatora (krok 2.7) na górze kolby. Wyreguluj otwór lejka separacyjnego tak, aby co drugą sekundę (kroplami) spadały około dwóch kropli.
  9. Zebrać biały osad przez filtrację (przy użyciu filtra papierowego) i wysuszyć go w piecu próżniowym w temperaturze od 50 do 60 °C.
  10. Monitoruj powodzenie syntezy przy użyciu następujących pików 1H NMR i FT-IR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 5,29-5,03 (m, COCHCH 3), 4,43-4,25 (m, CHCl), 4,24-4,12 (m, CH2O), 4,11-4,03 (t, J = 4,6 Hz, CH2O), 3,80-3,68 (m, CHC H2), 3,09-2,64 (szeroki, s, OH), 2,39 (t, J = 4,5 Hz, α-H), 2,33 (t, J = 5,1 Hz, α-H) i 1,77-1,25 (m, CH2, CH3); FT-IR (1/λ [cm-1]): 2,932 (s), 2,869 (m), 1,741 (s), 961 (s), 866 i 735 (m)6,27.
    Uwaga: Aby przygotować bardziej hydrofilowy LCE 3D, należy przygotować liniowy kopolimer blokowy (LBC) zamiast SBC, postępując zgodnie z opisaną powyżej procedurą kopolimeryzacji z otwarciem pierścieniowym (ROP).
    1. Dodać 0,3 g glikolu polietylenowego (PEG), 3,15 g ε-kaprolaktonu, 1,0 g α-chloro-ε-kaprolaktonu i 5,0 g D,L-laktydu do silanizowanej mieszanki fiolki.

3. Syntetyczna modyfikacja α-Cl-Three Arm SBC na α-N3-Three Arm SBC (SBC-αN3) (Według Sharma et al.6)

  1. W kolbie okrągłodennej i pod azotem rozpuścić 5 g SBC-αCl w 30 ml suchego N,N'-dimetyloformamidu.
  2. Dodać 0,22 g azydku sodu i pozostawić do reakcji na noc w temperaturze pokojowej.
    Uwaga: Azydek sodu jest toksyczny; nosić odpowiednią odzież ochronną (PPE).
  3. Usunąć N,N'-dimetyloformamid pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej o ciśnieniu 11 mbar i temperaturze 40 °C. Rozpuścić mieszaninę w 30 ml toluenu. Odwirować roztwór trzykrotnie przy sile 2 800 x g przez 15 minut, aby usunąć powstałą sól. Odparować toluen pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej o ciśnieniu 77 mbar i temperaturze 40 °C.
  4. Monitoruj powodzenie podstawiania azydku za pomocą pików 1H NMR i FT-IR.
    UWAGA: Widmo 1H NMR było podobne do macierzystego SBC-αCl, z wyjątkiem pojawienia się piku przy 3,90 ppm związanego z grupą azydkową; FT-IR (1/λ [cm-1]): 2,928, 2,108 (s, azydek), 1,754 (s), 1,450 (s), 960 (m), 865 (s), 733 (s) i 696 (m).

4. Synteza 5-heksynianu cholesrylu (LC Moiety) (Według Sharma et al.6 oraz Donaldson i wsp. 30)

  1. W kolbie okrągłodennej wymieszać 3 g kwasu 5-heksynowego i 130 ml dichlorometanu. Schłodzić do temperatury 0 °C w łaźni lodowej.
  2. W innej kolbie okrągłodennej wymieszać 8,28 g N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu, 10,3 g cholesterolu i 0,2 g 4-dimetyloaminopirydyny.
  3. Przenieść roztwór kwasu 5-heksynowego kroplami do kolby zawierającej mieszaninę cholesterolu i utrzymywać końcową mieszaninę w temperaturze 0 °C przez 1 godzinę.
  4. Pozwól mieszaninie ogrzać się do temperatury pokojowej przez noc.
  5. Usunąć powstały osad dicykloheksylomocznika przez filtrację za pomocą filtra papierowego klasy 415 i wyrzucić go.
  6. Zagęścić filtrat pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej o ciśnieniu 850 mbar i temperaturze 40 °C. Zebraną pozostałość rozpuścić w 150 ml heksanu.
  7. Odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej o ciśnieniu 335 mbar i temperaturze 40 °C. Dodać 350 ml etanolu do oleistej pozostałości w celu zebrania produktu końcowego. Umyć białawą substancję stałą uformowaną etanolem i wysuszyć stały produkt w próżni w temperaturze 50 °C.
  8. Monitoruj syntezę przy użyciu następujących pików 1H NMR i FT-IR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 5,39 (d, J = 4,7 Hz, 1H, CH=C), 4,70-4,58 (m, 1H, CHOCO), 2,44 (t, J = 2,5 Hz, 2H, CH2CO), 2,34 (m, 2H, CH2-C H=), 2,31 (m, 2H, CH2C H2-COO), 2,28 (s, 1H, HC≡C), 2,27 (d, J = 2,3 Hz, 2H, ≡C-CH2), 2,07-1,06 (m, 2H, CH2, CH), 0,94 (s, 3H, CH3), 0,89 (d, J = 1,8 Hz, 3H, CH3CH) i 0,88 (d, J = 1,8 Hz, 6H, CH3-C H), 0,67 (s, 3H, CH3). FT-IR (1/λ [cm-1]): 2,830-2,990 (szeroki i silny szczyt), 2,104 (m), 1,695 (s), 1,428 (m), 1,135 (m), 999 (s), 798 (s) i 667 (s).

5. Syntetyczna modyfikacja 3-trójramiennego SBC α-N do α-Cholesteryl-Three Arm SBC (SBC-αCLC) poprzez reakcję cykloaddycji azydowo-alkinowej Huisgen ("reakcja kliknięcia") w celu uzyskania SBC-Chol (według Sharma et al.6)

  1. W kolbie okrągłodennej rozpuścić 1 molowy odpowiednik SBC-αN3 (1,5 g) w 100 ml świeżo destylowanego tetrahydrofuranu (THF). Dodać 1,2-molowy ekwiwalent 5-heksynianu cholesterolu (1,94 g), 0,1-molowy ekwiwalent jodku miedzi(I) (0,06 g) i 0,1-molowy ekwiwalent trietyloaminy (0,03 g). Mieszaninę mieszać przez noc w temperaturze 35 °C pod azotem.
  2. Odparować rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej o ciśnieniu 357 mbar i temperaturze 40 °C.
  3. Rozpuścić pozostałą mieszaninę w 80 ml dichlorometanu i odwirować przez 5 minut przy 2 800 x g w temperaturze pokojowej w celu usunięcia nieprzereagowanych materiałów i produktów ubocznych.
  4. Monitoruj syntezę przy użyciu następujących pików 1H NMR i FT-IR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 7,54 (s, CH=C-triazol), 5,43-5,34 (m, C=CH cholesterol), 5,10-5,06 (m, COCHCH3), 4,68-4,55 (m, O-CH cholesterolu), 4,24-4,19 (m,CH2O), 4,18-4,13 (t, J=5,0 Hz,CH2O), 4,11-4,05 (t, J=4,4 Hz,CH2O), 2,47-2,41 (t, J=4,9 Hz, COCH2), 2,31-2,25 (m, COCH2), 2,07-1,02 (m, CH2, CH3), 1,05-1,03 (s, CH2, CH3), 0,96-0,92 (d, J=3,3 Hz, CH2, CH3), 0,91-0,87 (dd, J=1,9 Hz, J=1,8 Hz, CH3) i 0,71-0,68 (s, CH3). FT-IR (1/λ [cm-1]): 3,260 (s), 2,920 (s), 1,710 (s), 1,460 (s), 1,370 (s), 1,240 (m), 1,190 (s), 733 (s) i 668 (s).

6. Synteza 2,2-bis(1-kaprolakton-4-ylo)propanu (Środek sieciujący, BCP) (Według Gao et al.27 oraz Albertsson et al.31)

  1. W kolbie okrągłodennej przygotować roztwór zawierający 10,8 g 2-bis(4-hydroksy-cykloheksylo)propanu i 52 ml kwasu octowego.
  2. Przygotować roztwór zawierający 11 g trójtlenku chromu w 50 ml kwasu octowego i 8 ml wody destylowanej. Dodawać ten roztwór kroplami do roztworu przygotowanego w kroku 6.1, utrzymując temperaturę mieszaniny między 17 a 20 °C (np. w łaźni wodnej); Ten proces kroplowy trwa 2 godziny. Po zakończeniu procesu pozostaw roztwór do mieszania przez około 30 minut.
  3. Dodaj 50 ml 2-propanolu. Mieszaj roztwór przez noc w temperaturze pokojowej.
  4. Zatężyć ciemnofioletowy roztwór pod zmniejszonym ciśnieniem za pomocą wyparki obrotowej o ciśnieniu 137 mbar i temperaturze 40 °C. Dodać 300 ml wody destylowanej do wytrącenia; osad powinien być jasnofioletowy
    5. .
  5. Przefiltrować surowy produkt za pomocą filtra bibułowego klasy 415. Umyj materiał stały ~ 250 ml wody destylowanej lub do momentu, gdy ciało stałe stanie się białe.
  6. Rozpuścić materiał stały w 15 ml benzenu w temperaturze 40 °C i pozostawić do rekrystalizacji w temperaturze 25 °C.
  7. Dodać do kolby 8,34 g suchego diketonu rozpuszczonego w suchym dichlorometanie i roztwór zawierający 6,0 g kwasu 3-chloroperbenzoesowego w 75 ml dichlorometanu.
  8. Roztwór należy przepłukać przełącznikiem zwrotnym w temperaturze 40 °C przez 24 godziny.
  9. Schłodzić mieszaninę reakcyjną do temperatury -20 °C przez 10 minut w celu wytrącenia produktu ubocznego kwasu m-chlorobenzoesowego.
  10. Usunąć kwas m-chlorobenzoesowy przez filtrację (za pomocą filtra papierowego) i zagęścić roztwór pod zmniejszonym ciśnieniem.
  11. Umyć surowy produkt wiskozowy 200 ml 2-heptanonu i wysuszyć osad w próżni w temperaturze 50 °C przez noc.
  12. Monitoruj syntezę przy użyciu następujących pików 1H NMR i FT-IR. 1H NMR (400 MHz, CDCl3, δ [ppm]): 4,42-4,37 (dd, J = 14,2, 7,4 Hz, 2H, CH2OC=O), 4,21-4,15 (t, 2H, J = 11,3 Hz, CH2OC=O), 2,80-2,75 (ddt, J = 14,3, 6,5, 1,6 Hz, 2H, CH2COO), 2,63-2,57 (tt, J = 13,3, 2,1 Hz, 2H, CH2COO), 2,04-1,93 (M, 4H, -CH2CH2OC=O), 1,70-1,56 (m, 4H, -CH2 CH2COO), 1,48-1,38 (m, 2H, -CHC(CH3)2) i 0,84 (s, 6H, CH3C-).

7. Tworzenie porowatego rusztowania elastomerowego 3D przy użyciu diizocyjanianu heksametylenu (HDI) lub 2,2-bis(1-kaprolakton-4-ylo)propanu (BCP)27 jako środków sieciujących (według Gao et al.27)

  1. Przygotować trójramienną mieszaninę elastomerów przy użyciu 0,75 g SBC-αCLC, dodając 0,25 ml HDI (lub 0,45 ml BCP) i 0,24 ml destylowanego monomeru ε-kaprolaktonu. Dodać 60 μl Sn(Oct)2. W przypadku stosowania BCP zamiast HDI, wymieszaj SBC-αCLC i BCP za pomocą wiru i umieść je w piecu w temperaturze 140 °C, aż BCP całkowicie się rozpuści i rozpuści (ten krok może potrwać do 2 godzin). Po rozpuszczeniu BCP wyjmij go z piekarnika, a następnie Sn(Oct)2 i odwiruj.
  2. Przygotuj "ofiarny" szablon z pianki niklowej, wycinając metalowy kawałek o wymiarach 1 x 4 cm. Zwiń go z jednego z krótszych końców tak, aby końcowa rolka składała się z kawałka metalu o wymiarach około 1 x 1 cm (patrz Rysunek 4).
  3. Umieść piankę niklową w szklanej fiolce lub opakowaniu z folii aluminiowej i wlej mieszaninę przygotowaną w kroku 7.1, aby całkowicie pokryć pianę na 2 minuty. Usuń nadmiar mieszaniny za pomocą pipety Pasteura. Pozostaw na noc w piekarniku w temperaturze 80 °C.
  4. Zdejmij folię aluminiową lub rozbij szkło. Za pomocą żyletki ogol elastomer wokół metalowej pianki, aby odsłonić nikiel.
  5. Przygotować 1 M roztwór chlorku żelaza(III) (FeCl3) w 100 ml wody. Umieść pianę w kolbie i dodaj 70 ml roztworu FeCl3. Mieszaj przez trzy dni w temperaturze pokojowej i codziennie zmieniaj roztwór FeCl3. Przed każdą zmianą pianę mieszać z wodą jonizowaną przez 0,5 h,
    UWAGA: Proces trawienia jest zwykle zakończony po trzech dniach. Aby upewnić się, że proces trawienia został zakończony, wykonuj testy ucisku dotykowego, aż pianki będą miękkie. Odporność pianki na dotykowe testy ściskania wskazuje na obecność resztkowego metalowego szablonu.
  6. Piankę elastomerową przepłukać etanolem i wstawić na noc do pieca próżniowego w temperaturze 40 °C.
  7. Scharakteryzuj materiały za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM), różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC), testów ściskania mechanicznego i termicznej analizy grawimetrycznej (TGA)27.
    UWAGA: Aby przygotować bardziej hydrofilowy LCE 3D, zastąp SBC LBC LBC (upewniając się, że LBC zawiera również ugrupowanie LC), postępując zgodnie z krokami opisanymi w kroku 7.5.

8. Wysiewanie rusztowania elastomerowego komórkami nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y i hodowla przy użyciu sterylnych technik

  1. Wysterylizuj elastomer, przemywając go dwukrotnie 1 ml 70% etanolu. Wykonaj naświetlanie UV przez 10 minut i umyj 1 ml 70% etanolu. Przepłucz go dwukrotnie 1 ml sterylnej wody i 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Umieść elastomery w 24-dołkowych płytkach hodowlanych.
  2. Przygotuj pożywkę do wzrostu komórek dla SH-SY5Y zawierającą 90% Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnioną 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (Pen-Strep).
  3. Po zliczeniu komórek za pomocą hematocytometru należy przygotować 1,5 x 105 komórek SH-SY5Y zawieszonych w 100 μl pożywki wzrostowej (roztworu nasiennego). Dodaj roztwór na wierzch elastomerów, upewniając się, że utworzyła się kropla.
  4. Inkubować wysiane elastomery w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 2 godziny, aby pobudzić adhezję komórek. Dodaj 0,5 ml pożywki wzrostowej. Ponownie inkubować w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
  5. Zmieniaj podłoże co drugi dzień po umyciu 1 ml PBS.

9. Obrazowanie mikroskopowe konstrukcji elastomerowej

  1. Utrwalić komórki wyhodowane na elastomerach z 4% paraformaldehydem (PFA) w PBS przez 15 minut. Przepłukać 3 ml PBS trzy razy przez 5 minut każde i umieścić elastomer z utrwalonymi komórkami w naczyniu hodowlanym z dołączonym szkiełkiem nakrywkowym.
    Uwaga: PFA jest toksyczny. Nosić odpowiednią odzież ochronną (PPE).
  2. Zabarwić utrwalone próbki 0,1% 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI) w 500 μl PBS przez 10 minut i płukać dwukrotnie 1 ml PBS przez 5 minut.
  3. Natychmiast zobrazuj elastomery za pomocą mikroskopii konfokalnej z fluorescencją DAPI, uzyskując stosy obrazów, które obejmują próbkę.
    UWAGA: W tym przypadku stosy obrazów zostały uzyskane przy użyciu obiektywu 20X i obiektywu 60X.
  4. Przeanalizuj stosu obrazów konfokalnych za pomocą klasy ImageJ32.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy raport przedstawia metodę przygotowania porowatego 3D LCE jako rusztowania do hodowli komórkowych z wykorzystaniem niklowego szablonu metalicznego. Otrzymany 3D LCE wykazuje złożoną sieć połączonych kanałów, która umożliwia łatwą infiltrację komórek, a także bardziej odpowiedni transport masy27. Stwierdzono, że komórki są w stanie w pełni przeniknąć przez sieć połączonych kanałów i mogą również orientować się wewnątrz LCE. W tej pracy wybrano metalową pia...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Elastomery ciekłokrystaliczne zostały ostatnio przebadane jako biokompatybilne rusztowania komórkowe ze względu na ich reakcję na bodźce. Udowodniono, że są idealnymi platformami jako rusztowania komórkowe. Jednak ważnym czynnikiem, o którym należy pamiętać podczas przygotowywania i projektowania nowego rusztowania LCE, jest porowatość. Wprowadzanie wymywalnych ciał stałych23 lub gazów nie zawsze prowadzi do uzyskania jednorodnej porowatości lub w pełni połączonych porów. Zastosowanie metalowego s...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować Kent State University (wspólny grant badawczy i wsparcie dla Inicjatywy Medycyny Regeneracyjnej w Kent State − ReMedIKS) za wsparcie finansowe tego projektu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooktyltrietoksysilanAlfa AesarL16606Środek silanizujący
2-bis(4-hydroksy-cykloheksyl)propanTCIa href="http://www.tcichemicals.com/eshop/en/us/commodity/B0928/">B0928Odczynnik
2-chloroheksanon AlfaAesar A18613Odczynnik
2-heptanon Sigma AldrichW254401Rozpuszczalnik
2-propanol Sigma Aldrich278475Rozpuszczalnik
Kwas 3-chloroperbenzoesowy, m-CPBASigma Aldrich273031Odczynnik
4-dimetyloaminopirydynaAlfaAesar A13016Odczynnik
4',6-diamidyn-2-fenyloindol, DAPI InvitrogenD1306Barwnik jądrowy
Kwas 5-heksynowy Alfa AesarB25132-06Odczynnik
Kwas octowyVWR36289Rozpuszczalnik
AcetonSigma Aldrich34850
Rozpuszczalnik Alkohol 200 proof ACS Klasa VWR71001-866Odczynnik
BenzenAlfa AesarAA33290Solvent
ε-kaprolakton Odczynnik Alfa AesarA10299-0E
ChloroformVWRBDH1109Rozpuszczalnik
CholesterolSigma AldrichC8503Odczynnik
Tlenek chromu(VI)Sigma Aldrich232653Odczynnik
Jodek miedzi(I)Strem Chemicals100211-060Odczynnik
D,L-Laktyd Alfa AesarL09026Odczynnik
DichlorometanSigma Aldrich320269Rozpuszczalnik
Eter dietylowy Emd MilliporeEX0190Rozpuszczalnik
N,N,N-dimetyloformamidSigma Aldrich270547Rozpuszczalnik
Dulbecco" s zmodyfikowany Eagle średni, DEME CORNING Cellgo10-013Media komórkowe
EtanolAlfa Aesar33361Rozpuszczalnik
Formaldehyd SIGMA Life ScienceF8775Utrwalająca
płodowa surowica bydlęca, FBS HyCloneSH30071.01Media Component
Bibuła filtracyjna, klasa 415, jakościowa, krepaVWR28320Filtracja
GlicerolSigma AldrichG5516Węzeł centralny (3-ramienny)
Diizocyjanian heksametylenu, HDISigma Aldrich52649Środek sieciujący
Chlorek żelaza(III) Alfa Aesar12357Środek trawiący
Alkohol izopropylowyVWRBDH1133Rozpuszczalnik
MetanolAlfa AesarL13255Rozpuszczalnik
N,N'-dicyclohexylcarbodiimideAldrichD80002Rozpuszczalnik
N,N,N-dimetyloformamidSigma Aldrich270547Solvent
Szablon niklowo-metalicznyAmericanElements Ni-860Szablon piankowy
Komórki nerwiaka zarodkowego (SH-SY5Y)ATCC CRL-2266Linia komórkowa
Penicylina streptomycyna Thermo SCIENTIFIC15140122Antybiotyki
Glikol polietylenowy 2000, PEGAlfa AesarB22181Odczynnik
Azydek sodu VWR97064-646Odczynnik
Wodorowęglan soduAMRESCO865Sól susząca
Chlorek soduBDHBDH9286Sól susząca
Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodnyFisher ScientificS-374Sól susząca
Fosforan sodu jednozasadowyjednowodny Sigma AldrichS9638Sól susząca
Siarczan soduSigma Aldrich239313Sól susząca
TetrahydrofuranAlfa Aesar41819Rozpuszczalnik
Tiosiarczan de soduAMRESCO393Sól susząca
Cyna(II) 2-etyloheksanianAldrichS3252Odczynnik
ToluenAlfa Aesar22903Rozpuszczalnik
TrietyloaminaSigma Aldrich471283Odczynnik
Hyklon trypsynySH30042.01Odłączanie komórek
Olympus FV1000
<

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Khor, E., Lim, L. Y. Implantable applications of chitin and chitosan. Biomaterials. 24 (13), 2339-2349 (2003).
  2. Chung, H. J., Park, T. G. Surface engineered and drug releasing pre-fabricated scaffolds for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 59 (4-5), 249-262 (2007).
  3. Yakacki, C. M., Gall, K. Shape-Memory Polymers for Biomedical Applications. Shape-Memory Polymers. 226, 147-175 (2010).
  4. Agrawal, A., et al. Stimuli-responsive liquid crystal elastomers for dynamic cell culture. J. of Mat. Res. 30 (4), 453-462 (2015).
  5. Agrawal, A., Yun, T. H., Pesek, S. L., Chapman, W. G., Verduzco, R. Shape-responsive liquid crystal elastomer bilayers. Soft Matter. 10 (9), 1411-1415 (2014).
  6. Sharma, A., et al. Biodegradable and Porous Liquid Crystal Elastomer Scaffolds for Spatial Cell Cultures. Macromol. Biosci. 15 (2), 200-214 (2015).
  7. Yakacki, C. M., et al. Tailorable and programmable liquid-crystalline elastomers using a two-stage thiol-acrylate reaction. RSC Adv. 5 (25), 18997-19001 (2015).
  8. deGennes, P. G., Hebert, M., Kant, R. Artificial muscles based on nematic gels. Macromolecular Symposia. 113, 39-49 (1997).
  9. Fleischmann, E. -K., Zentel, R. Liquid-Crystalline Ordering as a Concept in Materials Science: From Semiconductors to Stimuli-Responsive Devices. Angew. Chem. Int. Ed. 52 (34), 8810-8827 (2013).
  10. Finkelmann, H., Kim, S. T., Munoz, A., Palffy-Muhoray, P., Taheri, B. Tunable mirrorless lasing in cholesteric liquid crystalline elastomers. Adv. Mater. 13 (14), 1069-1072 (2001).
  11. Artal, C., et al. SHG characterization of different polar materials obtained by in situ photopolymerization. Macromolecules. 34 (12), 4244-4255 (2001).
  12. Camacho-Lopez, M., Finkelmann, H., Palffy-Muhoray, P., Shelley, M. Fast liquid-crystal elastomer swims into the dark. Nat. Mater. 3 (5), 307-310 (2004).
  13. Yamada, M., et al. Photomobile polymer materials: Towards light-driven plastic motors. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (27), 4986-4988 (2008).
  14. Ohm, C., Brehmer, M., Zentel, R. Liquid Crystalline Elastomers as Actuators and Sensors. Adv. Mater. 22 (31), 3366-3387 (2010).
  15. Fleischmann, E. -K., et al. One-piece micropumps from liquid crystalline core-shell particles. Nat. Commun. 3, (2012).
  16. Herzer, N., et al. Printable Optical Sensors Based on H-Bonded Supramolecular Cholesteric Liquid Crystal Networks. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7608-7611 (2012).
  17. Lockwood, N. A., et al. Thermotropic liquid crystals as substrates for imaging the reorganization of matrigel by human embryonic stem cells. Adv. Funct. Mater. 16 (5), 618-624 (2006).
  18. Sharma, A., et al. Effects of structural variations on the cellular response and mechanical properties of biocompatible, biodegradable, and porous smectic liquid crystal elastomers. Macromol. Biosci. , In press (2016).
  19. Bera, T., et al. Liquid Crystal Elastomer Microspheres as Three-Dimensional Cell Scaffolds Supporting the Attachment and Proliferation of Myoblasts. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (26), 14528-14535 (2015).
  20. Bera, T., Malcuit, C., Clements, R. J., Hegmann, E. Role of Surfactant during Microemulsion Photopolymerization for the Creation of Three-Dimensional Liquid Crystal Elastomer Microsphere Spatial Cell Scaffolds. Front. Mater. 3 (31), (2016).
  21. McKee, C. T., Last, J. A., Russell, P., Murphy, C. J. Indentation Versus Tensile Measurements of Young's Modulus for Soft Biological Tissues. Tissue Eng. Part B Rev. 17 (3), 155-164 (2011).
  22. Kung, C. -C., et al. Preparation and characterization of three dimensional graphene foam supported platinum-ruthenium bimetallic nanocatalysts for hydrogen peroxide based electrochemical biosensors. Biosens. Bioelectron. 52, 1-7 (2014).
  23. Amsden, B. Curable, biodegradable elastomers: emerging biomaterials for drug delivery and tissue engineering. Soft Matter. 3 (11), 1335-1348 (2007).
  24. Sinturel, C., Vayer, M., Morris, M., Hillmyer, M. A. Solvent Vapor Annealing of Block Polymer Thin Films. Macromolecules. 46 (14), 5399-5415 (2013).
  25. Riboldi, S. A., et al. Skeletal myogenesis on highly orientated microfibrous polyesterurethane scaffolds. J. Biomed. Mater. Res. A. 84 (4), 1094-1101 (2008).
  26. Chung, S., Moghe, A. K., Montero, G. A., Kim, S. H., King, M. W. Nanofibrous scaffolds electrospun from elastomeric biodegradable poly(L-lactide-co-epsilon-caprolactone) copolymer. Biomed. Mater. 4 (1), 9(2009).
  27. Gao, Y. X., et al. Biocompatible 3D Liquid Crystal Elastomer Cell Scaffolds and Foams with Primary and Secondary Porous Architecture. ACS Macro Lett. 5 (1), 14-19 (2016).
  28. Lenoir, S., et al. Ring-opening polymerization of alpha-chloro-is an element of-caprolactone and chemical modification of poly(alpha-chloro-is an element of-caprolactone) by atom transfer radical processes. Macromolecules. 37 (11), 4055-4061 (2004).
  29. Younes, H. M., Bravo-Grimaldo, E., Amsden, B. G. Synthesis, characterization and in vitro degradation of a biodegradable elastomer. Biomaterials. 25 (22), 5261-5269 (2004).
  30. Donaldson, T., Henderson, P. A., Achard, M. F., Imrie, C. T. Chiral liquid crystal tetramers. J. Mater. Chem. 21 (29), 10935-10941 (2011).
  31. Palmgren, R., Karlsson, S., Albertsson, A. C. Synthesis of degradable crosslinked polymers based on 1,5-dioxepan-2-one and crosslinker of bis-epsilon-caprolactone type. J. Pol. Sci. A Polym. Chem. 35 (9), 1635-1649 (1997).
  32. Rasband, W. S. ImageJ. , National Institutes of Health. Bethesda, Maryland, USA. Available from: http://imagej.nih.gov/ij/ (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biokompatybilne rusztowanietr jwymiarowa hodowla kom rkowaszablon z pianki metaloweja cuch boczny cholesterolufaza smektyczna Arusztowanie o strukturze piankiproliferacja kom rekmikroskopia konfokalnatest kompresji dotykowej

Powiązane artykuły