En Face Przygotowanie naczyń krwionośnych myszy

Podsumowanie

Opisano procedurę przygotowania en face tętnicy szyjnej i aorty myszy. Takie preparaty, po immunofluorescencyjnym wybarwieniu specyficznymi przeciwciałami, umożliwiają badanie lokalizacji białek i identyfikację typów komórek w obrębie całej ściany naczyniowej za pomocą mikroskopii konfokalnej.

Streszczenie

Skrawki tkanek zatopionych w parafinie są rutynowo wykorzystywane do badania histologii tkanek i histopatologii. Trudno jednak określić, jaka jest trójwymiarowa morfologia tkanek na podstawie takich odcinków. Ponadto badane skrawki tkanek mogą nie zawierać obszaru w tkance, który jest niezbędny do celów trwającego badania. To ostatnie ograniczenie utrudnia badania histopatologiczne naczyń krwionośnych, ponieważ zmiany naczyniowe rozwijają się w sposób ogniskowy. Wymaga to metody, która pozwoli nam zbadać szeroki obszar ściany naczynia krwionośnego, od jej powierzchni do głębszych obszarów. Przygotowanie naczyń krwionośnych przez cały montaż en face spełnia ten wymóg. W tym artykule pokażemy, jak przygotować en face aortę i tętnicę szyjną myszy oraz wybarwić je immunofluorescencyjnie do mikroskopii konfokalnej i innych rodzajów obrazowania opartego na fluorescencji.

Wprowadzenie

Dla badań histopatologicznych za pomocą mikroskopii świetlnej, trójwymiarowe fragmenty tkanek biologicznych są rutynowo przetwarzane do zatopienia parafiny, a następnie cięcia i barwienia. Próbka tkanki, która została zatopiona w parafinie, może mieć kilka milimetrów we wszystkich trzech wymiarach. Jednak do celów mikroskopii świetlnej należy go najpierw przeciąć, aby światło mogło przez niego przejść, a następnie zabarwić, aby cienki wycinek dawał wystarczający kontrast do obrazowania. Ponieważ pokrojone próbki mają zwykle grubość 5-10 μm, widzi się tylko bardzo mały ułamek całego okazu w dwóch wymiarach jednocześnie. Możliwe jest zbieranie sekwencyjnych skrawków i po zobrazowaniu każdego przekroju z osobna wykonywanie komputerowej rekonstrukcji obrazów 3D, ale jest to naprawdę żmudna praca. Histopatologia naczyń krwionośnych, zwłaszcza w celu badania patogenezy miażdżycy, stwarza wyjątkowe problemy. Miażdżyca jest chorobą ogniskową, która rozwija się miejscowo w miejscach, w których występuje zaburzony przepływ krwi. Ponadto choroba rozpoczyna się w błonie wewnętrznej, cienkiej tkance składającej się z monowarstwy komórek śródbłonka i macierzy zewnątrzkomórkowej dużych tętnic. Z tych powodów wyzwaniem jest zlokalizowanie i zbadanie wczesnych zmian za pomocą wyciętych naczyń krwionośnych, ponieważ łatwo można przegapić przecięcie zmiany. Nawet jeśli sekcja zawiera chory obszar, zobaczysz tylko część 5-10 μm zawierającą komórki śródbłonka i inne komórki ściany naczyniowej w pożywce i przydankach.

Całe przygotowanie do montażu en face (wymawiane än ˈfäs) pozwala nam zbadać szeroki obszar powierzchni naczynia krwionośnego, taki jak cała aorta od korzenia aorty aż do tętnic biodrowych wspólnych. Korzystając z takiej próbki barwionej specyficznymi przeciwciałami i innymi specyficznymi sondami, można wskazać lokalizację zmian, a także miejsce, w którym zachodzą różne zdarzenia molekularne w komórkach śródbłonka w połączeniu z miażdżycą, takie jak zmiany w ekspresji, lokalizacji i modyfikacjach potranslacyjnych białek. Oprócz badania miażdżycy, kształt komórek śródbłonka obserwowany w preparatach en face jest wykorzystywany jako wskaźnik regionalnego uśrednionego w czasie wzorca przepływu krwi. Takie dane są ważne dla badania mechanosygnalizacji komórek śródbłonka in situ. W tym celu rutynowe histologiczne naczynia krwionośne o przekroju poprzecznym nie są przydatne. Dlatego dla medycyny i biologii naczyniowej szczególnie ważne jest nabycie techniki wytwarzania en face preparatów naczyń krwionośnych, która pozwala obserwować szeroki obszar powierzchni naczynia, a także głębsze obszary podpowierzchniowe naczynia.

Jak sprawdzili Jelev i Surchev¹, biolodzy naczyniowi opracowali różne metody obserwacji wyściółki naczyń krwionośnych en face. W latach czterdziestych i pięćdziesiątych XX wieku opracowano kilka genialnych metod. Korzystając z tych metod, byli w stanie zbadać podstawową organizację komórek śródbłonka, które wyściełają wewnętrzną powierzchnię naczyń krwionośnych. Jednak ze względu na sposób, w jaki te preparaty en face są przygotowywane (tzw. metoda Hautchen^2,3,4 lub odklejanie się od powierzchni naczynia⁵) oraz sposób barwienia próbki, nie zawsze było możliwe uzyskanie nieprzerwanych informacji morfologicznych z powierzchni naczynia do głębszych obszarów ściany naczynia krwionośnego. Przygotowanie całego naczynia en face w połączeniu z barwieniem immunofluorescencyjnym pozwoliło nam nie tylko na zbadanie morfologii komórek śródbłonka oraz ekspresji i lokalizacji białek w tych komórkach, ale także na rozszerzenie takich badań na obszar podśródbłonkowy ściany naczynia. Wczesne badania z użyciem preparatów naczyń krwionośnych i twarzy barwionych immunologicznie zaczęły pojawiać się w latach 80-tych^6,7. Wraz z pojawieniem się laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej, a ostatnio mikroskopii wielofotonowej, można teraz uzyskać wyraźne, ostre obrazy struktury ściany naczynia krwionośnego w immunofluorescencyjnie barwionych próbkach naczyń en face, a także sieci naczyniowej u żywych zwierząt^8,9,10,11. Te techniki obrazowania komputerowego tworzą ostre obrazy przekrojów optycznych, a poprzez układanie takich obrazów można uzyskać zrekonstruowane obrazy 3D ściany naczynia i sieci naczyniowej w tkankach. Dodatkowo można wygenerować obrazy przekroju wykonanego wzdłuż osi Z zrekonstruowanego obrazu^12,13.

W tym artykule przedstawimy metodę przygotowania en face aorty myszy i tętnicy szyjnej do barwienia immunofluorescencyjnego. Preparaty en face mogą być wykonywane nawet po eksperymentalnej manipulacji tymi naczyniami. Na przykład tętnica szyjna może być częściowo podwiązana, a następnie po takiej operacji wykonuje się preparat en face. Z tego powodu w tym artykule opiszemy również, w jaki sposób wykonujemy częściowe podwiązanie tętnicy szyjnej. W porównaniu z wytwarzaniem podobnych preparatów z większych zwierząt, takich jak szczury, króliki i ludzie, naczynia myszy są małe i bardziej kruche, co wymaga dodatkowej ostrożności podczas chirurgicznej izolacji naczyń i przygotowania ich do barwienia przeciwciał i mikroskopii. Ponieważ najczęściej używanym modelem zwierzęcym do modyfikacji genetycznej jest mysz, dla wielu badaczy kluczowe staje się obchodzenie się z naczyniami myszy bez ich uszkadzania. W tym manuskrypcie opiszemy, jak obchodzić się z naczyniami krwionośnymi myszy podczas wykonywania en face preparacji aorty myszy i tętnicy szyjnej. Do celów demonstracyjnych użyjemy myszy typu dzikiego C57/b6.

Protokół

Protokoły częściowego podwiązania tętnicy szyjnej myszy oraz izolacji aorty myszy i tętnicy szyjnej do barwienia immunologicznego en face są zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IBT 2014-9231).

1. Podwiązanie lewej częściowej tętnicy szyjnej

1. Przygotuj przestrzeń operacyjną, umieszczając na stole poduszkę grzewczą o wymiarach 12 cali x 14 cali i przykryj podkładkę i blat stołu dużą, czystą zasłoną chirurgiczną. Wyreguluj ramię stojaka wysięgnika tak, aby pole widzenia mikroskopu stereoskopowego znajdowało się w środkowej części poduszki grzewczej.
2. Włącz poduszkę grzewczą na stole i ustaw 3-stopniowe pokrętło sterujące na średni poziom grzania. Przy tym ustawieniu temperatury powierzchnia deski chirurgicznej (patrz 1.6.1) będzie miała temperaturę 38-40 °C.
   1. Umieść czystą klatkę na innej poduszce grzewczej. Włącz poduszkę grzewczą jak powyżej. Klatka ta będzie używana do rekonwalescencji po operacji (patrz 1.16), jak również do pomieszczeń mieszkalnych.
3. Na stole operacyjnym umieść autoklawowaną saszetkę sterylizacyjną zawierającą nożyczki do tęczówki (1 para), kleszczyki do tkanek (1 para), kleszczyki do super uchwytów (2 pary), nożyczki sprężynowe (1 para), zwijacz (1 para; szerokość 2,5 mm), uchwyt na igłę z okrągłą rękojeścią (1), sterylizowany jedwabny szew 6-0, aplikatory z bawełnianą końcówką, mini aplikatory z bawełnianą końcówką, serwety chirurgiczne i gąbki z gazy 2 x 2 cale. Na stole operacyjnym umieść również butelkę do wyciskania zawierającą 70% etanolu i drugą zawierającą peeling chirurgiczny z chlorheksydyną.
4. Zważ mysz. Masa ciała jest potrzebna do określenia odpowiedniej ilości środka przeciwbólowego, który zostanie zastosowany bezpośrednio przed zabiegiem.
5. Umieść mysz w komorze indukcyjnej.
6. Włącz butlę z tlenem i parownik znieczulający, aby znieczulić mysz w komorze indukcyjnej. Utrzymuj poziom izofluranu na poziomie 2%. Mija 3-5 minut, zanim mysz przestanie się poruszać.
   1. Podczas znieczulania myszy umieść mniejszy kawałek sterylnej serwety chirurgicznej (24 cale x 24 cale) pod mikroskopem stereoskopowym, aby stworzyć powierzchnię chirurgiczną. Następnie umieść akrylową deskę chirurgiczną (która została oczyszczona 70% alkoholem) na udrapowanej powierzchni. Tablica chirurgiczna powinna zatem znajdować się na poduszce grzewczej, ale oddzielona dwiema warstwami obłożeni chirurgicznych.
7. Gdy mysz przestanie się poruszać w komorze indukcyjnej, przenieś ją do obszaru przygotowania przedoperacyjnego i umieść jej nos w stożku nosowym połączonym z parownikiem (2% izofluranu). Usuń włosy wokół szyjki macicy za pomocą elektrycznego trymera lub płynu do usuwania włosów. Zalecamy balsam do depilacji, ponieważ ta metoda nie spowoduje powstania luźnych kawałków włosów, które są trudne do całkowitego usunięcia z obszaru operacyjnego.
8. Mając stożek nosowy na miejscu, przesuń mysz na deskę chirurgiczną.
   1. Przyklej prawą i lewą przednią łapę do deski chirurgicznej. Przyklej do siebie obie tylne nogi po prawej stronie myszy. Powoduje to nieznaczne obrócenie korpusu myszy, tak że lewa strona szyi myszy staje się lepiej ustawiona do operacji.
9. Zdezynfekuj miejsce nacięcia 70% alkoholem, peelingiem chirurgicznym z chlorheksydyną i ponownie 70% alkoholem. Przykryj mysz wysterylizowaną serwetą chirurgiczną, z wyjątkiem obszaru nacięcia szyjki macicy.
10. Potwierdź szczyptaniem palca, że mysz jest w pełni znieczulona i podaj środek przeciwbólowy (Caprofen 3-5 mg/kg) we wstrzyknięciu dootrzewnowym lub podskórnym.
11. Pod mikroskopem preparacyjnym wykonaj brzuszne nacięcie linii środkowej wokół szyjki macicy za pomocą skalpela lub nożyczek do tęczówki.
    UWAGA: Używamy nożyczek, ponieważ odległość robocza mikroskopu stereoskopowego jest ograniczona, co utrudnia użycie skalpela.
12. Odsłoń lewą tętnicę szyjną wspólną (LCCA), odsuwając na bok i zmieniając położenie gruczołów ślinowych pokrywających naczynia krwionośne po lewej stronie zwierzęcia.
13. Zidentyfikuj wszystkie naczynia krwionośne w polu operacyjnym (ryc. 1). LCCA rozdziela się na lewą tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA) i lewą tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA). Tętnica tarczycowa powierzchowna (STA) powstaje z ECA po stronie przyśrodkowej. Tętnica potyliczna (OA) zwykle powstaje z ECA, ale u niektórych myszy powstaje z ICA.
14. Podwiązać wszystkie gałęzie tętnic z wyjątkiem choroby zwyrodnieniowej stawów za pomocą wysterylizowanego jedwabnego szwu 6-0. Aby to osiągnąć, wykonaj następujące dwie ligacje.
    1. Delikatnie usuń tkankę łączną wokół i poniżej lewej tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA). Chwyć kawałek wstępnie przyciętego jedwabnego szwu 6-0 (~2,5 cm) za pomocą kleszczy i przełóż go pod tętnicą. Za pomocą innej pary kleszczy pociągnij szew mniej więcej do 1/3 jego długości i podwiąż tętnicę.
    2. Usuń tkankę łączną wokół lewej tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) w taki sam sposób, jak opisano powyżej, i wykonaj podwiązanie proksymalnie do lewej tętnicy tarczycy górnej (STA) (ryc. 1). Należy uważać, aby nie uszkodzić włókien nerwowych biegnących w obrębie pola operacyjnego.
15. Po wykonaniu tych podwiązaniów przywróć gruczoły ślinowe do pierwotnej pozycji i nawodnij pole operacyjne, umieszczając 2-3 krople sterylnej soli fizjologicznej. Zamknij skórę za pomocą szwów vicryl powlekanych 6-0.
16. Po zabiegu umieść mysz w ogrzanej klatce (patrz 1.2.1). Mysz powinna obudzić się w ciągu 5 minut i zacząć chodzić. Po potwierdzeniu, że mysz zachowuje się normalnie, przynieś klatkę do pomieszczenia dla zwierząt.
17. Obserwuj mysz codziennie przez pierwsze 3 dni rekonwalescencji. Mysz może być trzymana tak długo, jak wymaga tego eksperyment, w różnych warunkach, których wymaga protokół eksperymentalny. Preparat en face można wykonać w dowolnym momencie po zabiegu.

2. Barwienie immunologiczne na twarz

1. Poddaj mysz eutanazji za pomocą CO₂ przez przedawkowanie wziewne.
2. Przyklej mysz w pozycji leżącej (brzuchem do góry) na desce sekcyjnej.
3. Odsłoń jamę brzuszną, wykonując nacięcie w linii środkowej za pomocą nożyczek do tęczówki.
4. Odsłoń klatkę piersiową, przecinając żebra bocznie do mostka.
5. Zrób nacięcie w żyle głównej lub przetnij jedną z tętnic udowych w celu odprowadzenia krwi.
6. Wbić igłę 26 G przymocowaną do zestawu do perfuzji grawitacyjnej (ciśnienie wody 120 cm) do wierzchołka lewej komory i przepłukać układ krążenia roztworem soli fizjologicznej zawierającym heparynę (40 U/ml). Kontynuuj perfuzję, aż sól fizjologiczna wypływająca z nacięcia stanie się czysta.
7. Zmień system perfuzyjny z soli fizjologicznej na roztwór utrwalający zawierający 4% paraformaldehydu w PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanem) i kontynuuj perfuzję przez kolejne 5 minut.
8. Pobrać aortę oraz lewą i prawą tętnicę szyjną za pomocą nożyczek i kleszczy, a następnie umieścić w stożkowej probówce o pojemności 50 ml zawierającej utrwalacz na lodzie.
9. Przenieść naczynie na szalkę Petriego zawierającą PBS pod mikroskopem preparacyjnym i ostrożnie usunąć tłuszcz i tkankę łączną przyczepioną do aorty i tętnic szyjnych. Oddziel i podziel aortę i tętnice szyjne wzdłużnie, aby odsłonić śródbłonek (ryc. 2).
10. Przenieść każde naczynie oddzielnie do studzienki zawierającej 12-dołkową płytkę zawierającą 0,5 ml roztworu przepuszczalnego (0,1% Triton X-100 w PBS) na studzienkę. Przepuszczalność naczyń krwionośnych przez 10 minut z kołysaniem w temperaturze pokojowej (RT).
11. Umyj krótko PBS.
12. Aby zablokować nieswoiste miejsca wiązania przeciwciał, inkubuj naczynia krwionośne w 10% normalnej surowicy od gatunku zwierząt, u którego wytworzono przeciwciała drugorzędowe, w TTBS (sól fizjologiczna buforowana trisem (TBS) z 2,5% Tween 20) przez 30 minut z kołysaniem w temperaturze pokojowej.
13. Inkubować naczynia z pierwszorzędowymi przeciwciałami odpowiednio rozcieńczonymi w TTBS z 10% normalną surowicą (jak opisano powyżej) przez noc z kołysaniem w temperaturze 4 °C. Poziom rozcieńczenia należy określić dla każdego przeciwciała.
14. Wykonaj następujące barwienie kontrolne.
    1. Inkubować naczynia z TTBS zamiast przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym.
    2. Inkubować naczynia z TTBS zawierające nieimmunologiczną (lub przedimmunologiczną) surowicę lub Ig tego samego zwierzęcia (gatunku), w którym wytworzono przeciwciała pierwszorzędowe, a następnie inkubować z przeciwciałem drugorzędowym.
    3. Pomiń inkubację z przeciwciałem drugorzędowym. Z tymi próbkami kontrolnymi należy obchodzić się w ten sam sposób i w tym samym czasie, gdy przeprowadza się barwienie specyficznymi przeciwciałami.
15. Przemyj naczynia krwionośne 3 razy za pomocą TTBS po 10 minut, każdy z kołysaniem w temperaturze RT.
16. Inkubować z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi odpowiednio rozcieńczonymi w TTBS z 10% normalną surowicą (jak opisano powyżej) przez 1 godzinę z kołysaniem w temperaturze RT. Barwienie jądrowe DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol) można przeprowadzić jednocześnie na tym etapie, dodając 1/5,000 objętości roztworu podstawowego DAPI, który zawiera 5 mg/ml DAPI w H₂O.
17. Umyj 3 razy z TTBS przez 10 minut, każdy z kołysaniem w temperaturze RT.
18. Spłucz krótko w PBS.
19. Umieść jedną kroplę odczynnika zapobiegającego blaknięciu na szkle nakrywkowym (22 mm x 50 mm) i umieść naczynie krwionośne na szkle nakrywkowym śródbłonkiem skierowanym w dół.
20. Umieść szkiełko szkiełkowe (22 mm x 75 mm) na naczyniu krwionośnym, unikając zatrzymywania pęcherzyków.
21. Umieść szkiełko na czystej chusteczce laboratoryjnej (np. Kimwipe) i przykryj szkiełko dwoma kawałkami chusteczki laboratoryjnej. Delikatnie umieść 3,5 kg ciężarka (np. użyj butelki wody na grubej książce) na szkiełku na maksymalnie 5 minut, aby spłaszczyć próbkę naczynia krwionośnego na powierzchni.
22. Usuń ciężarek i zetrzyj nadmiar roztworu z okolic szkiełka nakrywkowego.
23. Nałóż lakier do paznokci w 4 rogach szkiełka nakrywkowego, umieść szkiełka w pudełku na szkiełka, szkiełkiem nakrywkowym do góry i trzymaj w ciemności w temperaturze RT (lub 4 °C) przez noc. Proces ten jeszcze bardziej spłaszcza tkankę i ułatwia wykonywanie mikroskopii przy dużych powiększeniach.
24. Całkowicie uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą lakieru do paznokci.
25. Wykonaj mikroskopię, gdy tylko lakier do paznokci wyschnie.
26. W razie potrzeby przechowywać szkiełka w temperaturze -20 °C.

Wyniki

Typowy obraz immunofluorescencji śródbłonka w widoku en face przedstawiono na Rysunku 3. Obraz ten przedstawia pojedynczy przekrój optyczny aorty mysiej wykonany w pobliżu ujścia tętnicy międzyżebrowej (duży, ciemny obszar w kształcie jajowatym). Aortę poddano podwójnemu barwieniu przeciwciałami anty-VE-cadherin (zielony) oraz anty-VCAM-1 (cząsteczka adhezyjna komórek naczyniowych-1) (czerwony). Każda komórka śródbłonka jest obrysowana zielonym liniowym barwieniem na pozi...

Dyskusja

Podczas obchodzenia się z naczyniami krwionośnymi myszy należy pamiętać, że śródbłonek jest delikatny i każda nadmierna siła mechaniczna uszkodzi komórki śródbłonka. Na przykład komórki śródbłonka pękają lub odrywają się od ściany naczynia, jeśli naczynie jest perfundowane zbyt mocno, co może się łatwo zdarzyć, gdy naczynia krwionośne są ukrwione za pomocą ręcznej strzykawki.

Aby uzyskać stałe ciśnienie perfuzji, stosujemy system perfuzji grawitacyjnej o ciśnieniu 120 cm słupa wody. Doniesiono...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
0,9% roztwór chlorku sodu do wstrzykiwań USP 500 ml worek	Fisher Scientific	NC9788429
12-dołkowe płytki	Fisher Scientific 12556005
6-0 powlekany szew vicryl	Ethicon	J833G
AF488 kozia antyszczurza IgG	Life Technologies	A11006
AF546 kozia anty-królicza IgG	Life Technologies	A11035
Anti-CD144 (Ve-Cad)	BD Biosciences	BD555289
Anti-VCAM-1 (H-276) Królik poliklonalny IgG	Santa Cruze Biotechnology	Sc-8304
Aoto Flow System	Braintree Scientific	EZ-AF9000
Autoklaw do owijania. 24 cale x 24 cale	Cardinal Health	4024
Blunt Retraktory, Narzędzia	do nauki o	18200-10
Kaprofen (Rimadyl)	zoetis	NADA#141-199
Peeling z chlorheksydyną, 2%	Med-Vet International	RXCHLOR2-PC
Gąbki z gazy Curity 2 x 2	Cardinal Health	KC2146
Elektryczna poduszka grzewcza, 12 x 14	Fisher Scientific	NC0667724
Ekstra cienkie kleszcze Graefe	Fine Science Tools	11152-10
Nożyczki do tęczówki	Fine Science Tools	14090-11
Szkło nakrywkowe z mikro 22 mm x 50 mm		VWR
	Fisher Scientific	12-550-18
normalna surowica kozia	Equitech-Bio	GS05
Roztwór paraformaldehydu 4% w PBS	Santa Cruze Biotechnology	SC-281692
Szalki Petriego 100 mm x 15 mm	Fisher Scientific	FB0875713
Prolong Gold Mocowanie zapobiegające blaknięciu z DAPI	Life Technologies	P-36935
Purytańskie waciki cortton	VWR	10806-005
Puritan Mini aplikatory z bawełnianą końcówką	VWR	82004-050
Uchwyt na igłę z okrągłym uchwytem	Fine Science Tools	12076-12
Jedwabny szew 6/0	Fine Science Narzędzia	18020-60
Nożyczki sprężynowe	ROBOZ	RS-5601
Nożyczki do zeza	Narzędzia do nauki	14075-09
Kleszcze Super Grip	Narzędzia do nauki o naprawie	00649-11
Przezroczysty opatrunek	Cardinal Health	TD-26C
Triton X-1000	Fisher Scientific	AC327371000

szerokości 2,5 mm Szkiełka mikroskopowe 48393059