Zautomatyzowana synteza radiochemiczna [18F]3F4AP: nowy znacznik PET do obrazowania chorób demielinizacyjnych

Podsumowanie

Demonstrujemy półautomatyczną syntezę radiochemiczną [¹⁸F]3F4AP i procedury kontroli jakości.

Streszczenie

3-[¹⁸F]fluoro-4-aminopirydyna, [¹⁸F]3F4AP, jest radiofluorowanym analogiem zatwierdzonego przez FDA leku na stwardnienie rozsiane 4-aminopirydyny (4AP). Związek ten jest obecnie badany jako znacznik PET do demielinizacji. Niedawno opisaliśmy nową reakcję chemiczną mającą na celu wytworzenie metafluorowanych pirydyn, polegającą na bezpośrednim fluorowaniu N-tlenku pirydyny i wykorzystaniu tej reakcji do radiochemicznej syntezy [¹⁸F]3F4AP. W tym artykule pokazujemy, jak wyprodukować ten znacznik za pomocą zautomatyzowanego syntezatora i własnego reaktora uwodornienia przepływowego. Pokazujemy również standardowe procedury kontroli jakości wykonywane przed uwolnieniem radioznacznika do przedklinicznych badań obrazowych na zwierzętach. Ta półautomatyczna procedura może posłużyć jako podstawa do przyszłej produkcji [¹⁸F]3F4AP do badań klinicznych.

Wprowadzenie

Zdolność do nieinwazyjnego śledzenia małocząsteczkowego leku w ludzkim ciele ma ogromny potencjał dla medycyny precyzyjnej. Wśród technik obrazowania molekularnego pozytonowa tomografia emisyjna (PET) ma wiele korzystnych cech: wysoka czułość detektorów PET pozwala na wykrywanie i ilościowe oznaczanie bardzo małych ilości materiału promieniotwórczego, a charakterystyka skanerów pozwala na dokładne mapowanie przestrzenne lokalizacji leku^1,2,3. Na przykład PET umożliwia wykrywanie i lokalizację nowotworów i przerzutów w oparciu o poziom wychwytu radioaktywnego analogu glukozy, [¹⁸F]FDG⁴. PET może również zapewnić lokalizację i kwantyfikację określonych receptorów mózgowych i ich zajętości, co może być cenne dla diagnozowania i zrozumienia zaburzeń neurologicznych i psychiatrycznych⁵. Aby opracować małocząsteczkowy znacznik PET, interesujący go związek musi być oznakowany izotopem emitującym pozytony, zwykle ¹¹C lub ¹⁸F. Pomiędzy tymi dwoma radioizotopami, ¹⁸F ma dłuższy okres półtrwania (109 min vs. 20,3 dla ¹¹C), co pozwala na produkcję wielodawkową i poza miejscem produkcji. Niemniej jednak dodanie ¹⁸F do cząsteczki może być trudne. ^{Rozdział 18}Znakowanie F wymaga szybkich reakcji zgodnych z automatyzacją, co zwalnia chemika z bezpośredniego zajmowania się aktywnością i otrzymywania wysoko pochłanianych dawek promieniowania.

Niedawno opisaliśmy użycie N-tlenków pirydyny jako prekursorów do fluorowania pirydyn oraz użycie tej chemii w radiochemicznej syntezie [¹⁸F]3F4AP⁶, radiofluorowanego analogu zatwierdzonego przez FDA leku na stwardnienie rozsiane, 4-aminopirydyny (4AP)^7,8,9. Ten nowy radioznacznik jest obecnie badany jako znacznik PET do demielinizacji^10,11,12. W tym artykule wideo demonstrujemy półautomatyczną syntezę tego związku przy użyciu jednostki syntezy IBA Synthera (zwanej dalej "syntezatorem") i własnego urządzenia do uwodornienia przepływowego. Synteza opiera się na reakcji pokazanej na rysunku 1. Przygotowanie do zabiegu trwa około 1 godziny, znakowanie radioizotopem i oczyszczanie 1,5 godziny, a procedury kontroli jakości 0,5 godziny.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury związane z użyciem materiałów radioaktywnych muszą być zatwierdzone przez lokalne Biuro Bezpieczeństwa Radiologicznego. Podczas pracy z materiałami radioaktywnymi należy nosić fartuch laboratoryjny i osobiste plakietki radiacyjne. Przez cały czas używaj dwóch warstw rękawiczek i sprawdzaj ręce za pomocą licznika Geigera po każdym kroku, który wiąże się z radioaktywnością. Jeśli rękawice są skażone radioaktywnością, należy je wyrzucić i wymienić na rękawice zewnętrzne. Stosuj odpowiednie ekranowanie, minimalizuj czas kontaktu ze źródłem promieniowania i maksymalizuj odległość.

1. Tydzień przed eksperymentem: Przygotowanie materiałów

1. Pobierz sekwencję [¹⁸F]3F4AP: Użytkownicy Synthera mogą zalogować się do bazy danych użytkowników (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) i pobrać plik sekwencji dla 3F4AP. Użytkownicy innych syntezatorów mogą być zmuszeni do napisania własnego skryptu na podstawie sekwencji kroków. Przejrzyj sekwencję z adnotacjami, aby zapoznać się z krokami związanymi z syntezą.
2. Upewnij się, że jest wystarczająca ilość gazu do syntezy. Syntezator wymaga sprężonego gazu, helu lub azotu. Wymaga również sprężonego powietrza >75 psi. Upewnij się, że ciśnienia mieszczą się w zakresie zalecanym przez producenta.
3. Przygotować fazę ruchomą HPLC: przygotować 1 l 50 mM fosforanu sodu i 10 mM trietyloaminy. Za pomocą pH-metru dostosuj pH do 8,0 ±0,1, dodając kroplami nasycony wodorotlenek sodu, mieszając. Przefiltruj roztwór przez filtr butelkowy 0,22 μm i dodaj 5% objętości etanolu.
4. Suszyć szklane naczynia w piekarniku przez noc.

2. Dzień eksperymentu: Przed przybyciem fluoru-18

1. Używając strzykawek o pojemności 1 ml, napełnij fiolki z odczynnikami odpowiednimi odczynnikami. W przypadku fiolek 2 i 3 należy używać fiolek suszonych w piecu i bezwodnych rozpuszczalników przechowywanych w argonie. Uszczelnić fiolki za pomocą zaciskarki.
   1. Napełnij fiolkę 1 (fiolka o średnicy 11 mm / objętości 2 ml) 400 μl TBA-HCO₃ + 800 μl acetonitrylu (MeCN).
   2. Napełnij fiolkę 2 (fiolka 13 mm / 4 ml) 50 μl roztworu prekursora 1,0 mg/ml + 450 μl MeCN.
   3. Napełnij fiolkę 3 (fiolka 11 mm / 2 ml) 500 μl MeCN.
   4. Napełnić fiolkę 4 (fiolka 13 mm / 4 ml) 4 ml 0,2% kwasu szczawiowego w metanolu (MeOH).
2. Kondycjonuj wkłady ekstrakcyjne QMA (silna wymiana anionowa) i tlenek glinu-N. Za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml przepuść kroplami 5 ml 8,4% NaHCO₃ przez QMA, a następnie 5 ml ultraczystej dejonizowanej wody typu I (18,2 ΜΩ•cm w temperaturze 25 ºC). Przepuść kroplami 5 ml ultraczystej wody przez wkład Alumina-N, a następnie 5 ml MeOH + 0,2% kwasu szczawiowego.
3. Włączyć HPLC i kondycjonować kolumnę C-18 w ilości 4 ml na minutę fazy ruchomej przez 30 minut.
4. Załaduj nowy wkład katalizatora do uchwytu wkładu wodorogeneratora i rozpocznij przepływ 0,5 ml/min 100% MeOH. Ustaw regulator wodoru na 50 psi i kondycjonuj wkład przez 15 minut (rysunek 2).
5. Zmontować zintegrowany procesor płynów (IFP), umieszczając fiolki od 1 do 4 w ich pozycjach, mocując wkłady i fiolkę do pobierania zgodnie z ilustracją 3. Podłączyć fiolkę zbiorczą z igłą odpowietrzającą do przewodu wyjściowego wodorodawcy.
6. Uruchom oprogramowanie syntezatora. Podaj login i hasło. Wykonaj testy syntezatora przed uruchomieniem zgodnie z instrukcjami producenta.
7. Kliknij "Sekwencje", a następnie "Otwórz", aby załadować sekwencję 3F4AP.
8. Załaduj interaktywny, klikając przycisk "Załaduj" na ekranie. Wpisz nazwę pliku dla przebiegu i rozpocznij sekwencję, klikając "Start". (Automatyczny syntezator automatycznie zatrzyma się przed krokiem ładowania ¹⁸F.)
9. Zobacz, jak syntezator przechodzi przez rutynowe etapy samokontroli (część pierwsza sekwencji). Spójrz na ekran, aby upewnić się, że nie ma żadnych ostrzeżeń ani alarmów. Zwróć uwagę na dźwięki, gdy syntezator przepłukuje linie i podgrzewa naczynie reakcyjne w ramach przygotowań do biegu. Wskaźnik temperatury powinien wzrosnąć i pozostać na poziomie 65 ºC. Poczekaj na sygnał (sygnał dźwiękowy) wskazujący, że syntezator jest gotowy na transfer ¹⁸F.

3. Dzień eksperymentu: ¹⁸F Etykietowanie

1. Zdalnie przenieś żądaną ilość ¹⁸F wytworzonego przez cyklotron z tarczy cyklotronowej do fiolki ¹⁸F. Sprawdź ilość radioaktywności i zapisz ją wraz z czasem dostawy.
   UWAGA: Jeśli nie używasz linii bezpośredniej do transferu ¹⁸F^, użyj ampułkostrzykawki z dołączoną igłą, aby przenieść aktywność do fiolki przez przegrodę. Ilość promieniotwórczości wyjściowej zależy od limitów ustalonych przez Biuro Bezpieczeństwa Radiologicznego i pożądanej ilości końcowego znacznika. Typowa ilość waha się od 50 do 500 mCi.
2. Wznów sekwencję na syntezatorze, naciskając "Resume". Spowoduje to rozpoczęcie transferu ¹⁸F do QMA.
3. Monitoruj postęp syntezy w całej automatycznej sekwencji na ekranie komputera.
   1. Obserwuj, jak przenosi ¹⁸F z fiolki do QMA przez 90 sekund. Po uwięzieniu ¹⁸F^- na QMA eluuje roztworem TBA-HCO₃ (fiolka 1). (Część druga sekwencji)
   2. Monitoruj ślady ciśnienia i temperatury na syntezatorze, podczas gdy TBA¹⁸F jest suszony pod zmniejszonym ciśnieniem (5 kPa) i ogrzewaniem (100 ºC), po którym następują dodatkowe etapy suszenia i schładzania. (Część 3 sekwencji)
   3. Obserwuj transfer bezwodnego MeCN (fiolka 3) i roztworu prekursora (fiolka 2) do reaktora i jak reaguje przez 1 minutę w temperaturze pokojowej. Roztwór powinien być bezbarwny lub bardzo słabo żółty. (Część 4 sekwencji)
   4. Obserwuj przenoszenie roztworu kwasu szczawiowego (fiolka 4) do reaktora. Obserwuj, jak roztwór jest przenoszony pod ciśnieniem z reaktora przez wkład z tlenku glinu-N do fiolki z produktem końcowym. (Część 5 sekwencji)
4. Na końcu sekwencji wydrukuj raport, wysuń monitor interaktywny, wyłącz zbiorniki gazu i zamknij oprogramowanie.
5. Ustalając najpierw procedurę, należy zmierzyć radioaktywność we wkładzie z tlenku glinu-N i w fiolce do pobierania poprzez oddzielne wprowadzenie wkładu i fiolki do kalibratora dawki. Rejestruj aktywność i czas pomiaru. Umieść zużyty wkład w ołowiowym pojemniku na odpady. Umieścić fiolkę do pobierania w osłoniętym pojemniku w celu transportu do następnego etapu.
6. Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z dołączoną igłą 2" ręcznie przenieść około 100 μl próbki roztworu produktu pośredniego do standardowej fiolki HPLC w celu kontroli jakości w trakcie procesu. Wstrzyknąć 10 μl tej próbki do HPLC w celu oceny czystości i tożsamości związku pośredniego.
   UWAGA: Warunki HPLC: XDB 5 μm, kolumna C18 9,4 x 250 mm. Przepływ 4 ml/min. Faza ruchoma (50 mM Na₂HPO₄, 10 mM TEA, 5% EtOH). Izokratyczny 15 min.

4. Dzień eksperymentu: Uwodornienie

UWAGA: Wstrzykiwanie produktu do wodorowodornika musi odbywać się przy użyciu odpowiednich środków ochrony przed uszkodzeniem. Wodór gazowy musi być odpowiednio obsługiwany i odpowietrzany.

UWAGA: reaktor uwodornienia może być podłączony zamiast kolumny HPLC na syntezatorze i sterowany za pomocą oprogramowania syntezatora.

1. Ustaw przepływ wodorogeneratora na 0,5 ml/min, uruchamiając sekwencję HPLC syntezatora. Ręcznie ustaw ciśnienie wodoru na 50 psi.
   1. Po zakończeniu etapów etykietowania i hartowania syntezator przeniesie roztwór produktu pośredniego do pętli wodorogeneratora/HPLC.
2. Gdy pik radioaktywny pojawi się w oprogramowaniu HPLC, przełącz zawór zbiorczy, aby zebrać produkt. Zmierzyć radioaktywność produktu naftowego za pomocą kalibratora dawki.
   UWAGA: Surowy produkt powinien być wstrzykiwany do zautomatyzowanego systemu HPLC wewnątrz gorącej komórki. Po oczyszczeniu produkt końcowy jest następnie zbierany i dozowany do aseptycznej gorącej komory z laminarnym przepływem powietrza klasy 5 ISO zgodnie z przepisami USP i FDA.

5. Dzień eksperymentu: Oczyszczanie i przygotowanie dawki

1. Wprowadzić produkt surowy do HPLC i użyć automatycznego kolektora frakcji do zebrania frakcji odpowiadających pikowi produktu końcowego. Każda probówka zawiera 0,66 ml roztworu.
   UWAGA: Warunki HPLC: XDB 5 μm, kolumna C18 9,4 x 250 mm. Przepływ 4 ml/min. Faza ruchoma (50 mM Na₂HPO₄, 10 mM TEA, 5% EtOH). Izokratyczny 15 min. Zbieraj 4-15 min.
2. Zmierzyć radioaktywność każdej frakcji za pomocą kalibratora dawki i zapisać ją. Połącz frakcje o największych ilościach radioaktywności (zwykle probówki 14-18).
3. Pobrać roztwór produktu za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml i przepuścić próbkę przez filtr 0,22 μm do sterylnej fiolki. Zapisać ilość radioaktywności, czas zakończenia syntezy i objętość roztworu na etykiecie fiolki. Jest to ostatnia dawka do wstrzykiwań. Odłóż ~0,8 ml roztworu do testów kontroli jakości.

6. Dzień eksperymentu: Testy kontroli jakości (QC)

1. Przed wydaniem dawki:
   Sprawdzić dawkę przez szkło osłonięte ołowiem. Roztwór musi być klarowny, bezbarwny i wolny od cząstek stałych.
2. Tożsamość radiochemiczna:
   1. W przypadku RadioTLC: narysować kroplę próbki na płytce do chromatyki TLC obok wzorca odniesienia. Uruchom płytkę TLC na komorze TLC, używając 95% MeOH: 5% kwasu octowego. Wizualizuj wzorzec odniesienia w oświetleniu UV i zaznacz jego położenie ołówkiem.
   2. Przyklej płytkę TLC do stopnia skanera radioTLC i zarejestruj czas szczytu. Wartości R_f wzorca odniesienia i piku promieniotwórczego muszą mieścić się w granicach 5%.
   3. W przypadku radioHPLC: uruchomić 10 μl dawki z wzorcem odniesienia i bez wzorca na HPLC. Czas retencji wzorca odniesienia i piku promieniotwórczego muszą być zgodne. Pojedynczy pik koelucji musi być widoczny na próbce wzbogaconej.
3. W celu zapewnienia czystości radiochemicznej: należy zmierzyć obszar pod krzywą dla docelowych pików radioHPLC i radioTLC. Obszar docelowego piku musi wynosić >95% obszaru dla wszystkich pików promieniotwórczych łącznie.
4. Dla promieniotwórczości specyficznej: promieniotwórczość właściwą oblicza się jako wielkość promieniotwórczości w piku (mierzoną na kroku 5.2) w stosunku do wielkości masowej wyznaczonej na podstawie obszaru pod krzywą śladu UV HPLC przy użyciu wcześniej ustalonej krzywej kalibracyjnej. Promieniotwórczość właściwa musi być wyższa niż 50 mCi/μmol.
5. Do analizy pozostałości rozpuszczalnika: zmierzyć ilość pozostałości rozpuszczalników (MeCN, MeOH) w dawce za pomocą chromatografii gazowej. Poziomy rozpuszczalników muszą wynosić < 0,04% dla acetonitrylu i <3 000 ppm dla metanolu. Ilość EtOH musi być mniejsza niż 10% w/v.
6. W celu przeprowadzenia testu integralności filtra sterylnego (punkt pęcherzykowy): podłączyć filtr użyty w kroku 5.3 do źródła azotu wyposażonego w regulator ciśnienia i zanurzyć igłę w wodzie. Stopniowo otwieraj zawór gazu, obserwując manometr. Filtr powinien wytrzymać ciśnienie do 50 psi bez pękania, o czym świadczy brak strumienia pęcherzyków z igły. Zwiększ ciśnienie powyżej 50 psi, aż z igły wydostanie się strumień bąbelków. Zapisz to ciśnienie, jest to ciśnienie rozrywające i musi wynosić >50 psi.
7. Dla okresu półtrwania radionuklidów: zmierzyć radioaktywność produktu w dwóch punktach czasowych w odstępie ≥10 minut w kalibratorze dawki. Oblicz okres półtrwania, korzystając z poniższego równania. Okres półtrwania musi odpowiadać ¹⁸F z dokładnością do 5 minut (109 ±5 min):
   t_1/2^obliczone = 0,693 t ÷ ln (A₁/A₂)
   gdzie t jest odstępem między pomiarami, a A ₁, A ₂ aktywnością mierzoną w każdym punkcie czasowym.
8. W celu określenia tożsamości i czystości radionuklidów: uzyskać widmo promieniowania γ próbki produktu za pomocą licznika promieniowania gamma. Widmo powinno wykazywać pojedynczy foto-pik przy energii 511 keV. W widmie nie powinno być żadnych innych foto-szczytów.
9. Do analizy endotoksyn: zmierz poziom endotoksyn za pomocą testu ilościowego chromogennej endotoksyny LAL. Poziom endotoksyn musi wynosić <1,75 EU/ml dla produktu rozcieńczonego w stosunku 1:10 o objętości produktu końcowego 10 ml.
10. Udokumentuj wyniki każdego testu kontroli jakości. Dawkę należy zwolnić w przypadku badań na zwierzętach tylko wtedy, gdy wszystkie testy zakończyły się pomyślnie.
11. Uwalnianie po dawce:
    Do badania sterylności: dodać próbkę dawki zarówno do płynnego tioglikolanu, jak i bulionu sojowego z tryptykazą. Po 14 dniach na nośnikach nie musi być widoczny żaden wzrost.

7. Dzień eksperymentu: obliczenia (Tabela 1)

1. Dla nieuległej rozpadowi wydajności radiochemicznej (ndc RCY): należy obliczyć NDC RCY jako ilość promieniotwórczości w produkcie końcowym w stosunku do promieniotwórczości wyjściowej.
2. W celu uzyskania skuteczności znakowania radioizotopowego: obliczyć wydajność znakowania jako stosunek radioaktywności w fiolce do radioaktywności we wkładzie z tlenku glinu-N (niewbudowanym [¹⁸F]F^-) i w fiolce do pobierania promieni
.
3. W odniesieniu do wydajności uwodornienia: obliczyć wydajność uwodornienia jako ilość promieniotwórczości w pożądanym piku w stosunku do promieniotwórczości wstrzykniętej do HPLC.
4. Dla strat filtracyjnych: oblicz straty filtrowania jako radioaktywność pozostałą w filtrze i strzykaj nad radioaktywnością przed filtrowaniem.

Wyniki

Radiochemiczna synteza [¹⁸F]3F4AP składa się z dwóch etapów (Rysunek 1). Pierwszy etap jest przeprowadzany w pełni automatycznie przy użyciu modułu syntezy (Rysunek 3). Ten system oparty na kasetach wykorzystuje cztery fiolki z odczynnikami i jedną fiolkę reaktora oraz posiada sterowane komputerowo zawory, które umożliwiają transfer i mieszanie odczynników, a także ogrzewanie, zwiększanie ciśnienia i ewakuację reaktora. Ponadto obsługuje on standardowe wkłady do ekstrakcji w fazie stałej służące do rozdzielania odczynników. Interfejs komputerowy pozwala użytkownikom na pisanie i modyfikowanie skryptów w celu przeprowadzania własnych syntez. W przypadku [¹⁸F]3F4AP procedura syntezy składa się z pięciu podstawowych części. W pierwszej części syntezator wykonuje kroki autotestu, wstępnie ogrzewa reaktor i czeka na sygnał operatora, że ¹⁸F jest gotowy. Podczas drugiej części [¹⁸F]fluorek jest przenoszony z fiolki ¹⁸F do wkładu wymiany anionowej, a następnie eluowany z wkładu do reaktora przy użyciu roztworu wodorowęglanu tetrabutylammonium. W trzeciej części syntezator osusza azeotropowo [¹⁸F]fluorek pod próżnią, aby uczynić go reaktywnym w kierunku podstawienia nukleofilowego. W czwartej części prekursor jest automatycznie dodawany do reaktora, gdzie reaguje z ¹⁸F^- w celu wytworzenia związku znakowanego. Na koniec reakcję przerywa się poprzez dodanie 0,2% kwasu szczawiowego w metanolu, co zapobiega rozkładowi produktu promowanemu przez zasady, a końcowy roztwór jest przenoszony pod ciśnieniem do fiolki zbiorczej po przejściu przez wkład z tlenkiem glinu-N, który wyłapuje wszelki niezreagowany fluorek.

Po zakończeniu etapu znakowania można pobrać niewielką próbkę do kontroli jakości. Analiza próbki za pomocą HPLC zapewnia potwierdzenie poprawności etapu znakowania oraz pozwala na oszacowanie czystości radiochemicznej (Rysunek 4). Ponadto, na podstawie śladu UV w analizie HPLC można obliczyć masową ilość produktu, korzystając z wcześniej opracowanej krzywej kalibracyjnej.

Podczas gdy trwa kontrola jakości procesu za pomocą HPLC, przeprowadza się drugi etap reakcji, czyli redukcję grup N-tlenkowych i nitrowych. W tym celu znakowany produkt jest automatycznie wstrzykiwany do wewnętrznego urządzenia do uwodornienia, opracowanego na podstawie metody opublikowanej przez Yoswathananont et al.¹³ (Rycina 2). Urządzenie to składa się z pompy HPLC oraz zbiornika ze sprężonym wodorem, połączonych z urządzeniem do uwodornienia przepływowego za pomocą linii wyposażonych w zawory zwrotne zapobiegające cofaniu się strumienia. Produkt jest tłoczony przez pompę HPLC i mieszany z wodorem w mieszalniku w kształcie litery T. Mieszanina ta przechodzi następnie przez mały wkład zawierający katalizator 10% Pd/C na nośniku stałym. Po przejściu przez katalizator zredukowany produkt jest zbierany w małych frakcjach.

Po uwodornieniu surowy produkt jest transportowany i ręcznie wstrzykiwany do układu HPLC w celu oczyszczenia produktu końcowego (Rysunek 5). Fazę ruchomą HPLC dobrano tak, aby była ona kompatybilna z podawaniem zwierzętom. Następnie zbiera się piki odpowiadające produktowi i poddaje je sterylizacji przez filtrowanie, aby uzyskać dawkę końcową.

Przed podaniem dawki w badaniach obrazowych PET przeprowadza się testy kontroli jakości. Testy te są wykonywane w celu upewnienia się, że znacznik jest właściwym związkiem chemicznym i że jest bezpieczny do wstrzyknięcia. Niektóre z tych testów mogą nie być wymagane w przypadku podawania zwierzętom, jednak zazwyczaj zaleca się stosowanie wytycznych dotyczących użycia u ludzi. Takie podejście zapewnia jakość produktu, co zwiększa pewność co do wyników i znacznie ułatwia przyszłe przejście do produkcji preparatu przeznaczonego do wstrzykiwania ludziom.

Tabela 1 zawiera typowe parametry syntezy, w tym początkową aktywność promieniotwórczą, początkową ilość prekursora, wydajność każdego etapu, aktywność właściwą, straty przy filtrowaniu itp. Parametry te są pomocne w rozwiązywaniu problemów w przypadku sporadycznych niepowodzeń oraz w przyszłej optymalizacji procedury.

Rysunek 1. Schemat reakcji. Synteza radiochemiczna polega na znakowaniu poprzez wymianę ¹⁹F/¹⁸F, a następnie uwodornieniu katalizowanym palladem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. System uwodornienia. Schemat urządzenia. Urządzenie to oparto na publikacji Yoswathananont et al. (ref 13). 

Rycina 3. Schemat zintegrowanego procesora fluidycznego (IFP) syntezatora oraz odczynników. IFP zawiera cztery fiolki z odczynnikami, wkład QMA oraz jedną fiolkę reaktora. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.
 

Rycina 4. Ślady UV i radioHPLC dla produktu pośredniego. 3-fluoro-4-nitropyrydyna N-tlenek wykazuje charakterystyczne pochłanianie przy 313 nm. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina 5. Ślady UV i radioHPLC dla produktu końcowego. 3-fluoro-4-aminopirydyna absorbuje przy 254 nm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Koncepcja	Średnia (n = 4)	odchylenie standardowe	Komentarze
Wstępny 18Aktywność F (mCi)	148.0	44.9	Rozpoczęcie syntezy
Ilość prekursora (μg)	50		Zastosowanie 50 μL stoku o stężeniu 1,0 mg/ml
Aktywność pozostała w QMA (mCi)	3.0	1.7	Pomiar wykonano po zakończeniu etapu znakowania
Wydajność znakowania radioizotopowego	29.7%	6.3%	Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN)
Czystość radiochemiczna (HPLC-1)	> 98%		Z HPLC-1 QC
Spec. akt. produktu pośredniego (mCi/μmol)	122.9	29.7	Z HPLC-1 przy użyciu krzywej kalibracyjnej
Odzysk w procesie uwodornienia (prąd stały)	74%	9.0%	Skorygowano o rozpad
Czystość radiochemiczna w technice HPLC (HPLC-2)	90.7%	2.9%	Obliczone na podstawie HPLC-2
Wydajność suszenia	> 98%		Skorygowano o rozpad
Odzyskiwanie poprzez filtrowanie	93.5%	1.7%	Skorygowano o rozpad
Objętość dawki (ml)	3.3		Zebrać frakcje o najwyższej radioaktywności
Aktywność właściwa produktu końcowego (mCi/µmol)	75.5	30.0	Z HPLC-3 przy użyciu krzywej kalibracyjnej
Wydajność syntezy	8.5%	3.6%	Bez korekty o rozpad
Czas syntezy (min)	104	11.2

Tabela 1. Parametry syntezy radiochemicznej.

Typowe problemy	Potencjalne przyczyny i rozwiązania
[18Fluoryd nie jest efektywnie eluowany z QMA	· TBA-HCO3 nie został przygotowany prawidłowo. Należy upewnić się, że stężenie jest odpowiednie.
	· Występują nieszczelności w TBA-HCO3 fiolka. Przed zamontowaniem na IFP należy upewnić się, że zamknięcie zaciskowe jest szczelne, a septum nie zostało przebite.
	· TBA-HCO3 jest w złym stanie. Należy zamówić nową partię.
Wydajność znakowania jest niska	· W roztworze prekursora znajduje się wilgoć. Należy osuszyć prekursor oraz rozpuszczalniki.
	· Temperatura jest zbyt niska.
Roztwór reakcyjny ma kolor żółty	· Produkt ulega rozkładowi pod wpływem zasady. Należy użyć mniejszej ilości TBA-HCO.3.
	· Ilość prekursora jest zbyt duża. Należy użyć mniejszej ilości prekursora.
	· Ilość rozpuszczalnika jest zbyt mała w stosunku do ilości 18F-Użyć większej ilości rozpuszczalnika.
Dodatkowe piki w radioHPLC	· Zachodzi substytucja grupy nitrowej: należy obniżyć temperaturę reakcji lub skrócić czas reakcji.
Reakcja uwodornienia nie zachodzi	· Katalizator jest zużyty. Należy użyć nowej kolumny.
	Przepływ jest zbyt szybki i nie zapewnia wystarczającego kontaktu między katalizatorem a substratem. Zmniejszyć przepływ.
	· Ciśnienie wodoru jest zbyt niskie. Zwiększyć H22 ciśnienie
Ciśnienie wodoru gwałtownie wzrasta podczas procedury	· Szczelność kartridża została naruszona, a nośnik stały zapycha linie. Przerwać przepływ i zakręcić dopływ gazu. Odczekać do rozpadu radioaktywności. Wyjąć kartridż z katalizatorem i przepłukać układ. Włożyć nowy kartridż.
Wydajność uwodornienia jest niska	· Zbyt duża ilość zanieczyszczeń konkurujących o katalizator (MeCN, kwas szczawiowy). Należy zmniejszyć ilość zanieczyszczeń lub zwiększyć masę prekursora (Ostrzeżenie: zwiększenie ilości prekursora spowoduje obniżenie aktywności właściwej).
Odzysk radioaktywności z etapu uwodornienia jest niski	· W układzie występuje wyciek. Należy sprawdzić szczelność i przeprowadzić płukanie wsteczne do linii wodoru.
	· Związek ulega defluorynacji w reaktorze. Należy ocenić różne warunki reakcji (ciśnienie, temperaturę, przepływ, itp.).
Zbyt duża ilość radioaktywności jest tracona podczas filtracji	· Przed użyciem należy zwilżyć filtr.
	· Należy użyć filtra o mniejszej objętości martwej.
Peak produktu końcowego w analizie HPLC jest szeroki	· Wstrzyknięto zbyt dużą objętość. Należy wstrzyknąć mniejszą ilość. Należy użyć kolumny o większej średnicy.
	· Kolumna nie została odpowiednio przygotowana. Przeprowadzić kondycjonowanie kolumny przez co najmniej 30 objętości kolumny.
	· pH fazy ruchomej jest zbyt niskie. Należy upewnić się, że pH ≥ 8.
	· Kolumna nie jest w dobrym stanie. Należy wymienić kolumnę. Należy użyć kolumny kompatybilnej z pH zasadowym.

Tabela 2. Przewodnik rozwiązywania problemów.

Dyskusja

Przygotowanie znaczników PET wymaga wydajnego etykietowania przy minimalnej interwencji użytkownika w celu zminimalizowania narażenia na promieniowanie¹⁴. Tutaj opisaliśmy pierwszą półautomatyczną procedurę radiochemicznej syntezy [¹⁸F]3F4AP, znacznika PET, który jest obecnie badany pod kątem obrazowej demielinizacji. Ta półautomatyczna metoda wytwarza radioznacznik o wysokiej czystości i wystarczającej aktywności swoistej do badań na zwierzętach. Wcześniejsze metody syntezy tego związku opierały się na ręcznej syntezie⁶, co znacznie ograniczało ilość radioaktywnego znacznika, który można wyprodukować. Zautomatyzowana metoda syntezy zapewnia również bardziej powtarzalne wyniki i ułatwia przeniesienie procedury do innych laboratoriów dysponujących podobnym sprzętem. Przyszłe wysiłki zmierzające do pełnej automatyzacji procedury będą miały zasadnicze znaczenie dla produkcji znacznika w dużych ilościach do badań na dużych zwierzętach lub ludziach.

Ta procedura wykorzystuje wymianę nukleofilową ¹⁹F na ¹⁸F w celu włączenia radioizotopu do cząsteczki będącej przedmiotem zainteresowania. Zaletą tej reakcji jest to, że jest szybka i wytwarza prawie wyłącznie pożądany produkt bez konieczności wykonywania potencjalnie długiego etapu oczyszczania w celu usunięcia nadmiaru prekursora. Jednym z ograniczeń stosowania reakcji znakowania fluorykowymiennego, takich jak ta zastosowana tutaj, jest to, że ze względu na początkową masę zimnego związku, końcowa aktywność właściwa zdefiniowana jako ilość promieniotwórczości w mCi nad ilością związku w μmol może być ograniczona. W naszych standardowych warunkach, zaczynając od 100-200 mCi ^{18 F i} 50 μg prekursora, typowa aktywność swoista pod koniec syntezy wynosi do 100-200 mCi/μmol, co wydaje się wystarczające do przedklinicznych badań obrazowych PET. Niemniej jednak specyficzna aktywność może ulec poprawie poprzez zwiększenie ilości wyjściowej dla ¹⁸F^- przy jednoczesnym utrzymaniu niskiej ilości masy. Pojawiło się kilka doniesień o wytwarzaniu radioligandów na drodze wymiany fluorków o wysokiej aktywności właściwej (1-3 Ci/μmol), zaczynając od wysokiej aktywności i niskich ilości prekursorów^15,16.

Podobnie jak w przypadku wszystkich syntez radiochemicznych znaczników PET, bardzo ważne jest, aby działać szybko, aby zminimalizować rozpad promieniotwórczy. Ważne jest również, aby zminimalizować czas obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi, stosować odpowiednie ekranowanie i maksymalizować odległość między materiałem radioaktywnym a użytkownikiem, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie. Aspekty te są szczególnie ważne podczas drugiej połowy protokołu (oczyszczanie i kontrola jakości), w której użytkownik musi ręcznie wstrzyknąć roztwór do HPLC, zebrać frakcje i przefiltrować produkt końcowy.

Podobnie jak w przypadku wszystkich syntez radiochemicznych znaczników PET, bardzo ważne jest, aby działać szybko, aby zminimalizować rozpad promieniotwórczy. Ważne jest również, aby zminimalizować czas obchodzenia się z materiałami radioaktywnymi, stosować odpowiednie ekranowanie i maksymalizować odległość między materiałem radioaktywnym a użytkownikiem, aby zminimalizować narażenie na promieniowanie. Aspekty te są szczególnie ważne w drugiej połowie protokołu (uwodornienie i oczyszczanie), w której użytkownik musi ręcznie wstrzyknąć roztwór do wodorowody, zebrać frakcje, ustawić procedurę suszenia, ponownie rozpuścić produkt w buforze i przefiltrować go. Na etapie filtrowania łatwo jest stracić dużą ilość materiału radioaktywnego w ściankach fiolek. Dlatego ważne jest, aby spróbować zebrać całą ciecz przed filtrowaniem. Użycie większej ilości buforu do rozpuszczenia może poprawić wydajność odzysku, ale jego stosowanie jest odradzane, ponieważ będzie wymagało wstrzyknięcia większej objętości do HPLC, powodując rozszerzenie piku i zwiększenie objętości dawki końcowej.

Aby rozwiązać problemy i zoptymalizować procedurę, ważne jest, aby śledzić wydajność każdego kroku. W przypadku większości etapów odbywa się to po prostu poprzez pomiar ilości radioaktywności przed i po każdym kroku. W przypadku reakcji uzysk można obliczyć poprzez ilościowe określenie pików HPLC. Tabela 1 w sekcji wyników przedstawia typowe plony dla każdego etapu. W poniższej tabeli 2 wymieniono wiele często występujących awarii wraz z potencjalnymi przyczynami awarii i sposobami ich usunięcia.

Wreszcie, mimo że przedstawiona tutaj procedura jest specyficzna dla syntezy [¹⁸F]3F4AP, ogólny przebieg pracy i wiele indywidualnych etapów jest wspólnych dla syntezy innych związków¹⁷. W tym artykule zademonstrowaliśmy również typowe testy kontroli jakości wykonywane na dowolnym znaczniku PET.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Cyklotron produkowany [18F]fluorek	Dostarczony/Zevacor	IBA Cyclone 18	100-200 mCi
Zintegrowany procesor płynów do produkcji FLT/FDG	ABX	K-2715SYN	Kaseta używana do substytucji nukleofilowej
Bezwodny acetonitryl	Janssen	36431-0010	Transfer pod
azotem Metanol	Janssen	67-56-1
ultraczysta woda	dostarczana		przez dom Millipore System MilliQ
TBA-HCO3	ABX	808.0000.6	abx.de
QMA	Waters	WAT023525	Czwartorzędowy metyloamonianek: Wkład ekstrakcyjny do fazy stałej z anionowymiennością do wychwytywania i uwalniania 18F- z wody docelowej
Wodorowęglan sodu	ABX	K-28XX.03	Wstępnie napełnione strzykawki 5 ml
Tlenek glinu-N	Wody	WAT020510	Tlenek glinu-N do ekstrakcji fazy stałej (do wychwytywania nieprzereagowanego 18F-)
3-fluoro-4-nitropirydyny N-tlenek	Synthonix	76954-0	Przechowywać w eksykatorze. Prekursor
3-fluoro-4-aminopirydyna	Sigma Aldrich	704490-1G	Wzorzec odniesienia
Kwas szczawiowy	Sigma Aldrich	75688-50G
Fosforan sodu jednozasadowy	Fisher Scientific	S80191-1
Trietyloamina	Fisher Scientific	04885-1
Etanol	Decon Labs	DSP-MD.43	USP
Fiolka produktu końcowego	ABX	K28XX.04
Strzykawka z filtrem Millex	Millex	SLGVR04NL
10% wkład Pd/C	Sigma Aldrich	THS-01111-12EA
Fiolki 11 mm + uszczelki zaciskane	Fisher Scientific	03-250-618, 06-451-117 lub równoważne
fiolki 13 mm + uszczelki zaciskane	Fisher Scientific	06-718-992, 06-718-643 lub równoważne
fiolki HPLC	Fisher Scientific	03-391-16, 03-391-17 lub równoważne
SEMIPREP C18 kolumna	Agilent	990967-202
V-fiolki	Alltech
Strzykawki: 1, 3, 10 ml	Fisher Scientific	14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G lub równoważne
Sprężone gazy: N2, He, H2	Airgas	UHP N300, UHP HE300, UHP H300 lub równoważne
płytki TLC	Sigma Aldrich	Z193275 lub odpowiednik
Nazwa	Company	Catalog Numer	Komentarze
Equipment
Synthera automatyczny syntezator	IBA SA, Belgia, iba-worldwide.com	Synthera, 250.001	Automatyczna jednostka syntezy
Własny hydrogenator	Zobacz zdjęcie		Zobacz opis tekstowy
Gorące ogniwa	Comecer		Dla manipulowanie materiałami promieniotwórczymi
Skaner RadioTLC	Eckert and Ziegler		Do pracy z materiałami sterylnymi
HPLC	Dionex	Ultimate 3000
Kalibrator dawki	Capintec	CRC15	Lub równoważny
Licznik gamma	Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932	CRC 15, PET-CRC25 lub równoważny	Do pomiaru promieniotwórczości
Dozymetry osobiste	Packard	Cobra II	Do pomiaru widma gamma
Osobiste odznaki i pierścienie promieniowania	Atlantic Nuclear	Rados Rad-60 Elektroniczny dozymetr lub odpowiednik
Rotavap + pompa próżniowa	Landauer
Tłoki ołowiane + osłony strzykawek	Heidolph		Lub odpowiednik
Licznik Geigera	Pinestar
Licznik Geigera	Ludlum	Model 3 + wykrywacz Pancake GM, 4801605, 47-1539 lub równoważny