Niekontrolowany krwotok, ważna przyczyna śmiertelności wśród pacjentów po urazach, może być modelowany za pomocą standardowego uszkodzenia wątroby w modelu mysim. Model ten skutkuje konsekwentną utratą krwi, przeżywalnością i pozwala na testowanie środków hemostatycznych. Ten artykuł zawiera krok po kroku proces wykonywania tego cennego modelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Niekontrolowany wstrząs krwotoczny modelowany za pomocą uszkodzenia wątroby u myszy z monitorowaniem hemodynamicznym w czasie rzeczywistym
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Niekontrolowany krwotok jest ważną przyczyną możliwych do uniknięcia zgonów wśród pacjentów po urazach. Opracowaliśmy mysi model niekontrolowanego krwotoku poprzez uszkodzenie wątroby, które powoduje stałą utratę krwi, zmiany hemodynamiczne i przeżycie.
Myszy przechodzą standaryzowaną resekcję lewego środkowego płata wątroby. Mogą krwawić bez ingerencji mechanicznej. Środki hemostatyczne mogą być podawane jako terapia wstępna lub doraźna, w zależności od zainteresowania badacza. W czasie krwotoku przeprowadza się monitorowanie hemodynamiczne w czasie rzeczywistym za pośrednictwem linii lewej tętnicy udowej. Myszy są następnie składane w ofierze, określa się ilościowo utratę krwi, pobiera się krew do dalszej analizy, a narządy są pobierane w celu analizy urazów. Opisano projekt eksperymentalny, który pozwala na jednoczesne testowanie wielu zwierząt.
Krwotok wątrobowy jako model niekontrolowanego krwotoku występuje w literaturze, głównie w modelach szczurzych i świńskich. Niektóre z tych modeli wykorzystują monitorowanie hemodynamiczne lub ilościowo określają utratę krwi, ale brakuje im spójności. Obecny model obejmuje kwantyfikację utraty krwi, monitorowanie hemodynamiczne w czasie rzeczywistym w modelu mysim, który oferuje zaletę wykorzystania linii transgenicznych i mechanizmu o wysokiej przepustowości do dalszego badania mechanizmów patofizjologicznych w niekontrolowanym krwotoku.
Wprowadzenie
Trauma jest główną przyczyną śmierci i niepełnosprawności wśród młodych ludzi na całym świecie. 1 Niekontrolowany krwotok pozostaje główną przyczyną śmiertelności wśród ciężko rannych pacjentów. 2 Postępowanie z pacjentem po urazie krwotoku jest dwojakie: kontrola krwawienia chirurgicznego oraz resuscytacja i uzupełnienie utraconej krwi.
Zwierzęce modele wstrząsu krwotocznego były kamieniem węgielnym w badaniach nad traumą i mogą być używane do oceny patofizjologii i leczenia wstrząsu pourazowego/krwotocznego. 3,4 Wstrząs w modelach zwierzęcych można osiągnąć na dwa sposoby: kontrolowany krwotok i niekontrolowany krwotok. 5,6 Kontrolowany krwotok jest wykonywany przez usunięcie ustalonej objętości krwi lub przez usunięcie krwi w celu osiągnięcia określonego ciśnienia krwi (stałe ciśnienie). Chociaż modele te są przydatne w ocenie mechanizmów i zmian immunologicznych we wstrząsie krwotocznym, nie mają zastosowania do testowania środków hemostatycznych i nie naśladują klinicznego scenariusza krwotoku po urazie. W tym celu staraliśmy się opracować model niekontrolowanego krwotoku, który pozwoliłby nam przetestować zmiany hemostatyczne i czynniki prokoagulacyjne w modelu mysim. Wątroba jest atrakcyjną opcją w przypadku niekontrolowanego krwotoku, częściowo ze względu na podwójny dopływ krwi do wątroby i jest jednym z najczęściej uszkadzanych narządów wewnątrzbrzusznych, zarówno w przypadku, jak i penetrującego urazu. Biorąc pod uwagę wysokie znaczenie kliniczne, wątroba została wykorzystana jako model niekontrolowanego krwotoku, najczęściej w modelach szczurzych i świńskich, ale ostatnio także u naczelnych. 7,8,9,10,11,12 Modele mysie mają również uwzględnione uszkodzenia wątroby, takie jak model zmiażdżenia lub uraz; Jednak modele te nie powodują wstrząsu krwotocznego wtórnego do uszkodzenia wątroby. 13,14
Szczurze i świńskie modele niekontrolowanego krwotoku z wątroby, choć cenne w analizie praktyk resuscytacyjnych i monitorowania hemodynamicznego, są mniej korzystne niż model mysi z różnych powodów, takich jak koszt, liczba wykorzystanych zwierząt i co ważne względny brak linii transgenicznych dostępnych do analizy specyficznej sygnalizacji komórkowej i molekularnej. Obecny model mysi ma istotne podobieństwa do istniejących modeli krwotoku wątrobowego, w tym standaryzowane uszkodzenia wątroby, kwantyfikację utraty krwi, monitorowanie hemodynamiczne i możliwość przeprowadzenia analizy przeżycia. Wiele istniejących modeli uwzględnia tylko niektóre z tych aspektów, podczas gdy nasz model został opracowany do pomiaru wielu zmiennych fizjologicznych jednocześnie i u wielu myszy. Opracowanie mysiego modelu otwiera również drzwi do badań wykraczających poza resuscytację i do zwiększenia mechanizmów patofizjologii w niekontrolowanym krwotoku z potencjałem opłacalnego, wysokoprzepustowego modelu wykorzystującego zaawansowane techniki molekularne.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Myszy były trzymane zgodnie z University of Pittsburgh (Pittsburgh, PA, USA) i National Institutes of Health (NIH; Bethesda, MD, USA) wytyczne dotyczące opieki nad zwierzętami w określonych warunkach wolnych od patogenów z 12-godzinnymi cyklami światła i ciemności oraz swobodnym dostępem do standardowej paszy i wody. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Komitet ds. Badań i Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie w Pittsburghu.
1. Pole operacyjne i ustawienie narzędzi
- Przed zabiegiem wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, szewy, gazę, aplikatory z bawełnianymi końcówkami, rurki i łączniki rurek.
- Sterylizuj narzędzia chirurgiczne, szwy, gazę i aplikatory z bawełnianymi końcówkami w autoklawie. Sterylizuj rurki i łączniki przewodów tlenkiem etylenu.
- Pole operacyjne
- Włącz poduszkę grzewczą z cyrkulacją wody i ustaw ją na 37 °C. Umieść na niej niebieską podkładkę chirurgiczną, a następnie sterylną serwetkę na niebieskiej podkładce chirurgicznej.
- Otwórz wszystkie wysterylizowane narzędzia na sterylnym serwecie. Używaj sterylnych rękawiczek, aby uniknąć zerwania sterylności na tym etapie.
- Napełnij miskę ze stali nierdzewnej 70% etanolem i odstaw na bok. Będzie on służył do czyszczenia narzędzi między zwierzętami.
- Włącz sterylizator z mikrogranulkami i pozwól mu nagrzać się do 150 °C. Będzie to również wykorzystywane do czyszczenia narzędzi między zwierzętami. Jeśli wykonujesz operację na więcej niż 5 myszach, pamiętaj o wymianie narzędzi na nowy sterylny zestaw.
- Konfiguracja przetwornika
- Podłącz sterylny przetwornik, rurkę PE-50, dwie igły 23G i męsko-męski luer oraz trójdrożny kran odcinający. 6
- Skalibruj i wyzeruj przetwornik zgodnie z instrukcjami producenta.
2. Zabieg chirurgiczny uszkodzenia wątroby
- Indukcja i pozycjonowanie znieczulenia
- Pentobarbital sodu należy wstrzykiwać dootrzewnowo w dawce 70 mg/kg. Znieczulenie powinno działać w ciągu 5-10 minut; Oceń głębokość znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi. Jeśli mysz reaguje na uszczypnięcie palca, potrzebny jest dodatkowy czas lub znieczulenie. Jeśli podczas zabiegu potrzebne jest dodatkowe znieczulenie, uzupełnij pentobarbital sodu. Nie należy podawać suplementów w ilościach większych niż 0,05 ml, aby zapobiec przedawkowaniu.
- Po tym, jak mysz jest całkowicie pod narkozą, połóż mysz na wznak na desce chirurgicznej. Przymocuj wszystkie cztery kończyny myszy do tablicy za pomocą taśmy.
- Ogol brzuch i obustronne pachwiny brzytwą.
- Namocz sterylną gazę betadyną i nałóż na brzuch i obustronne pachwiny w celu operacji. W przypadku eksperymentów przetrwania przygotuj brzuch i pachwiny betadyną, a następnie etanolem, w sumie przez trzy cykle przygotowawcze.
- Włóż sondę temperatury doodbytniczą, aby monitorować temperaturę rdzenia przez cały czas trwania zabiegu. Utrzymuj temperaturę rdzenia w zakresie 35-37 °C.
- Tętnica udowa i kaniulacja żylna
- W przypadku założenia cewnika dożylnego: napełnij rurkę PE-10, igłę 30 G i trójdrożny kran roztworem Ringera z mleczanami z worka dożylnego.
- W przypadku założenia cewnika tętniczego: napełnij rurkę PE-10 i igłę 30G heparynizowaną solą fizjologiczną (rozcieńczenie 1:10 heparyny 1,000 j). Heparyna-sól fizjologiczna jest wymagana, aby zapobiec krzepnięciu.
- Umieść mysz pod mikroskopem preparacyjnym.
- Wykonaj 4-5 mm podłużne nacięcie nad mięśniem pachwiny za pomocą chirurgicznych nożyczek tęczówki. Za pomocą kleszczy Dumonta chwyć tkankę tłuszczową połączoną z mięśniem przywodziciela i pociągnij na boki, aby uzyskać czyste odsłonięcie pęczka udowego. Nie należy przeprowadzać sekcji przez tkankę tłuszczową, ponieważ doprowadzi to do uszkodzenia naczyń krwionośnych.
- Ostrożnie wypreparuj nerw z dala od tętnicy i żyły za pomocą kleszczy Dumonta. Do nerwu przylega poduszeczka tłuszczowa. Chwyć to jednym kleszczem Dumonta i pociągnij na boki; To odciąga nerw od tętnicy, tworząc płaszczyznę do rozwarstwienia. Za pomocą innych kleszczy Dumonta tępo wypreparuj tkankę łączną między nerwem a tętnicą.
- Nie chwytaj za nerw podczas tej części sekcji.
- Zapętl trzy jedwabne szwy 6-0 wokół tętnicy i żyły proksymalnie do profunda femoris zdejmij.
- Umieść szew 1 najbardziej proksymalnie i pozostaw luźny.
- Założyć szew 2 najbardziej dystalnie i natychmiast zawiązać.
- Umieść szew 3 między szwem 1 i 2 i pozostaw luźny.
- Wykonaj arteriotomię na brzusznej powierzchni naczynia. Do wykonania arteriotomii zaleca się stosowanie nożyczek mikronaczyniowych, aby uniknąć przecięcia naczynia.
- Włóż cewnik trójdrożny do tętnicy. Natychmiast zawiąż szew 1 i 2, aby zabezpieczyć cewnik na miejscu.
- Podłącz cewnik trójdrożny do głowicy i zbierz dane dotyczące wyjściowego ciśnienia krwi.
- Powtórz kroki 2.2.4 - 2.2.6 na przeciwległej pachwinie. Kanniulować żyłę udową w podobny sposób jak tętnicę. Wykonaj janotomię na brzusznej powierzchni naczynia, a następnie wprowadź cewnik. Ten cewnik może być używany do podawania płynów lub leków.
- Radana wątroba
- Wstępnie zważ probówkę zawierającą 0,5 ml PBS, trzy trójkąty absorpcyjne i jedną łódkę wagową na mysz.
- Wykonaj nacięcie laparotomii brzusznej linii środkowej, zaczynając od wyrostka mieczykowatego i rozciągając się doogonowo, aby umożliwić całkowite odsłonięcie wątroby.
- Umieść jeden trójkąt absorpcyjny w jamie brzusznej przy prawej ścianie brzucha. Powtórz po lewej stronie.
- Upewnij się, że trójkąt absorpcyjny znajduje się z dala od wątroby, aby uniknąć efektu hemostatycznego pakowania po uszkodzeniu wątroby.
- Ostrożnie chwyć lewy środkowy płat wątroby i rozerwij 75% płata chirurgicznymi nożyczkami do tęczówki. Umieścić uszkodzony segment w probówce zawierającej PBS.
- Zamknij ścianę brzucha zszywkami za pomocą aplikatora ze zszywkami. Chwyć skórę i mięśnie razem i wystrzel zszywkę. Zrób to tak szybko, jak to możliwe po uszkodzeniu wątroby, aby uniknąć utraty krwi poza jamą brzuszną. W eksperymentach survivalowych brzuch jest zamknięty w dwóch warstwach. Biegnący wchłanialny szew dla mięśnia, a następnie biegnąca warstwa niewchłanialnego szwu dla skóry zapewnia odpowiednie zamknięcie.
- W przypadku myszy, u których punkty czasowe przeżycia są dłuższe niż 30 minut, cewniki udowe należy usunąć, tętnicę i żyłę związać szwem 3 z kroku 2.2.6. Obustronne pachwiny są następnie zamykane w dwóch warstwach, jak opisano w poprzednim kroku.
- Po upływie określonego czasu na krwotok (30 min do 72 godzin) usuń zszywki. Usunąć trójkąty absorpcyjne i umieścić w odpowiednich wstępnie zważonych łodziach wagowych. Użyj dodatkowych trójkątów absorpcyjnych, aby wchłonąć niewchłoniętą krew.
- Zważ filtry absorpcyjne, aby obliczyć całkowitą utratę krwi.
- Opieka pooperacyjna
- Myszy, które mają zostać uśmiercone w ciągu 30 minut, należy pozostawić na tablicy operacyjnej i pod stałym nadzorem oraz w pełnej narkozy aż do czasu złożenia ofiary. Myszy są poddawane eutanazji poprzez połączenie nakłucia serca i przedawkowania wziewnego izofluranu.
- Umieść myszy, które mają dłuższy czas przetrwania, w klatce regeneracyjnej na poduszce grzewczej z cyrkulacją wody. Stale monitoruj myszy podczas rekonwalescencji i nie pozostawiaj ich bez opieki, dopóki nie odzyskają przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Przywróć mysz do klatki z innymi myszami dopiero po wyzdrowieniu ze znieczulenia.
- Analgezję pooperacyjną należy podawać w dawce 0,1 mg/kg bupreneksu we wstrzyknięciu podskórnym po wybudzeniu ze znieczulenia i co 12 godzin po jego zakończeniu, aż do momentu złożenia ofiary.
- Pozwól myszom na swobodny dostęp do jedzenia i wody po powrocie do normalnych klatek po operacji.
- W momencie składania ofiary dla myszy przeżywających, znieczulenie odbywa się za pomocą wziewnego izofluranu. Po znieczuleniu krew jest pobierana przez nakłucie serca prawego serca, odnotowuje się utratę krwi zgodnie z powyższym opisem, a na koniec eutanazja jest ubezpieczona w przypadku przedawkowania izofluranu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Model przerwania ciągłości tkanki wątroby skutkuje powtarzalną i spójną utratą krwi u myszy. Rysunek 1A wykazuje stałą masę usuniętej tkanki wątroby, którą można uzyskać przy odchyleniu standardowym wynoszącym zaledwie 0.02 g. Taka spójność masy usuniętej tkanki wątroby umożliwia powielenie modelu u różnych myszy oraz w różnych układach eksperymentalnych, takich jak odmienne protokoły resuscytacyjne. Ponadto powtarzalna masa usuniętej tkanki wątroby, przy błędzie standard...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisany tutaj mysi model uszkodzenia wątroby zapewnia wiarygodny, spójny model niekontrolowanego krwotoku. Ten model jest prosty do wykonania, ale istnieją ważne kroki, które wymagają skrupulatnego rozważenia. Najtrudniejszą technicznie częścią modelu jest kaniulacja naczyń udowych w celu monitorowania hemodynamicznego i podawania płynów/leków. Należy zachować ostrożność podczas preparacji nerwu i arteriotomii/wenotomii. Ważne jest, aby nie dotykać nerwu podczas rozwarstwiania naczyń, aby uniknąć wynikającego z tego uszk...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych konkurencyjnych interesów finansowych.
Podziękowania
Praca nad tym rękopisem była wspierana przez fundusze dla dr Neala przez Vascular Medicine Institute Pilot Project Program in Hemostasis and Vascular Biology (P3HVB) oraz AAST Research Fellowship. Prace te są wspierane przez granty Narodowych Instytutów Zdrowia Stanów Zjednoczonych 1 R35 GM119526-01 i UM1HL120877-01.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| SS/45 dumonts | Fine Science Tools | 11203-25 | |
| nożyczki chirurgiczne | Fine Science Tools | 14068-12 | |
| hemostats | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| mikronożyczki | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Kleszczyki zakrzywione 0,8 mm | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| szpilka do szwów 6-0 | Fine Science Tools | 18020-60 | |
| szew 4-0 jedwab z igłą | Gaza Owens Minor | K188H | |
| 4 x 4 | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| aplikator z bawełnianą końcówką | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Igła 30 G | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Igła | 23 Gmożna kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Strzykawkę o pojemności 10 ml | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Rurkę stożkową o pojemności 50 ml | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Strzykawka 1 cc z igłą 25G | Fisher Scientific | 14-826-88 | |
| Rurka polietylenowa 10 100' (PE-10) | Fisher Scientific | 14-170-12P | |
| Rurka polietylenowa 50 100' (PE-50) | Fisher Scientific | 14-170-12B | |
| 3-drogowy kran | Fisher Scientific | NC9779127 | |
| niebieska podkładka chirurgiczna | Fisher Scientific | 50-7105 | |
| Sterylne opatrunki polowe | Fisher Scientific | NC9517505 | |
| rolki taśmy 1" | Corporate Express | MMM26001 | |
| słoiki z prostymi bokami z szerokimi otworami | VWR | 159000-058 | |
| taca ze stali nierdzewnej 8" x 11" | VWR | 62687-049 | |
| męsko-męska blokada leur 3-drożna | Worek sterylizacyjny VWR | 20068-909 | |
| 3" x 8" | VWR | 24008 | |
| worek sterylizacyjny 5" x 10" | VWR | 24010 | |
| trójkąty absorpcyjne | Fine Science Tools | 18105-03 | |
| Aplikator do spinania ran 7 mm | Fisher Scientific E0522687 | ||
| 1,000 klipsów do ran 7 mm | Fisher Scientific | E0522687 | |
| betadyna (4 uncje) | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| sterylne rękawice | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| eppendorfs | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Strzykawka insulinowa 1/2 cc Lo-Dose | Fisher Scientific | 12-826-79 | |
| można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | |||
| Dzwonki mleczanowe | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| roztwór soli fizjologicznej w roztworze hepranizowanej (.1 µL; hep + 9.9 µL; NaCl) | można nabyć za pośrednictwem dowolnego globalnego dostawcy | ||
| soli fizjologicznej buforowanej fosforanami | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Pentobarbital | można kupić u dowolnego globalnego dostawcy | ||
| Mikroskop Wild M650 ze stojakiem na wysięgnik | Analizator i | ||
| Digi-Med BPA-400 | Micro-Med | SYS-400 | |
| TXD-310 (przetwornik Digi-Med) | Micro-Med | TXD-300 | |
| Komputerowy sterylizator narzędzi | |||
| Maszynki do strzyżenia Oster A5 z ostrzem o rozmiarze 40 | VWR | 10749-020 | |
| 18 x 26 | Harvard | py872-5272 | |
| termometr doodbytniczy | Kent Scientific | RET-3 | |
Bibliografia
- Chang, R., Cardenas, J. C., Wade, C. E., Holcomb, J. B. Advances in the understanding of trauma-induced coagulopathy. Blood. 128 (8), 1043-1049 (2016).
- Kutcher, M. E., et al. A paradigm shift in trauma resuscitation: evaluation of evolving massive transfusion practices. JAMA surgery. 148 (9), 834-840 (2013).
- Tsukamoto, T., Pape, H. C. Animal Models for Trauma Research. Shock. 31 (1), 3-10 (2009).
- Darwiche, S. S., et al. Pseudofracture: an acute peripheral tissue trauma model. J Vis Exp. (50), (2011).
- Lomas-Niera, J. L., Perl, M., Chung, C. -S., Ayala, A. Shock and Hemorrhage: an Overview of Animal Models. Shock. 24, Suppl 1. 33-39 (2005).
- Kohut, L. K., Darwiche, S. S., Brumfield, J. M., Frank, A. M., Billiar, T. R. Fixed volume or fixed pressure: a murine model of hemorrhagic shock. J Vis Exp. (52), (2011).
- Matsuoka, T., Hildreth, J., Wisner, D. H. Liver injury as a model of uncontrolled hemorrhagic shock: resuscitation with different hypertonic regimens. J Trauma. 39 (4), 674-680 (1995).
- Komachi, T., et al. Adhesive and Robust Multilayered Poly(lactic acid) Nanosheets for Hemostatic Dressing in Liver Injury Model. J. Biomed. Mater. Res. Part B Appl. Biomater. , (2016).
- Orfanos, N. F., et al. The effects of antioxidants on a porcine model of liver hemorrhage. J Trauma Acute Care Surg. 80 (6), 964-971 (2016).
- Morgan, C. E., Prakash, V. S., Vercammen, J. M., Pritts, T., Kibbe, M. R. Development and validation of 4 different rat models of uncontrolled hemorrhage. JAMA Surgery. 150 (4), 316-324 (2015).
- Rosselli, D. D., Brainard, B. M., Schmiedt, C. W. Efficacy of a topical bovine-derived thrombin solution as a hemostatic agent in a rodent model of hepatic injury. Can J Vet Res. 14 (14), 303-308 (2015).
- Sheppard, F. R., et al. Development of a Nonhuman Primate (Rhesus Macaque) Model of Uncontrolled Traumatic Liver Hemorrhage. Shock. 44, 114-122 (2015).
- Nemzek-Hamlin, J. A., Hwang, H., Hampel, J. A., Yu, B., Raghavendran, K. Development of a murine model of blunt hepatic trauma. Comp Med. 63 (5), 398-408 (2013).
- Vogel, S., et al. Platelet-derived HMGB1 is a critical mediator of thrombosis. J Clin Invest. 125 (12), (2015).
- Modery-Pawlowski, C. L., Tian, L. L., Ravikumar, M., Wong, T. L., Sen Gupta, A. In vitro and in vivo hemostatic capabilities of a functionally integrated platelet-mimetic liposomal nanoconstruct. Biomaterials. 34 (12), 3031-3041 (2013).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
