Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego

10.5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56014

⸱

25 października 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1German Centre for Neurodegenerative Diseases (DZNE) Dresden within Helmholtz Association, 2B CUBE, Center for Molecular Bioengineering, Technische Universität Dresden, 3Center for Regenerative Therapies Dresden (CRTD), TU Dresden

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje syntezę, charakterystykę i wstrzykiwanie monomerycznych peptydów amyloidu-β42 do generowania toksyczności amyloidu u dorosłych ryb pręgowanego w celu stworzenia modelu choroby Alzheimera, a następnie analizy histologiczne i wykrywanie agregacji.

Streszczenie

Choroba Alzheimera (AD) jest wyniszczającą chorobą neurodegeneracyjną, w której nagromadzenie toksycznych peptydów amyloidu-β42 (Aβ42) prowadzi do degeneracji synaptycznej, stanów zapalnych, śmierci neuronów i deficytów w uczeniu się. Ludzie nie mogą zregenerować utraconych neuronów w przypadku choroby Alzheimera, częściowo z powodu upośledzonej zdolności proliferacyjnej nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych (NSPC) i zmniejszonej neurogenezy. Dlatego skuteczne terapie regeneracyjne powinny również zwiększyć proliferację i zdolność neurogenną NSPC. Danio pręgowany (Danio rerio) jest organizmem regeneracyjnym i możemy nauczyć się podstawowych programów molekularnych, za pomocą których możemy zaprojektować podejścia terapeutyczne do walki z AD. Z tego powodu konieczne było wygenerowanie modelu podobnego do AD u danio pręgowanego. Korzystając z naszej metodologii, możemy wprowadzić syntetyczne pochodne peptydu Aβ42 ze zdolnością przenikania do tkanek do mózgu dorosłego danio pręgowanego i przeanalizować patologię choroby i odpowiedź regeneracyjną. Przewagą nad istniejącymi metodami lub modelami zwierzęcymi jest to, że danio pręgowany może nas nauczyć, w jaki sposób mózg kręgowców może się naturalnie regenerować, a tym samym pomóc nam lepiej leczyć ludzkie choroby neurodegeneracyjne poprzez celowanie w endogenne NSPC. W związku z tym model toksyczności amyloidu opracowany w mózgu dorosłego osobnika danio pręgowanego może otworzyć nowe możliwości badań w dziedzinie neuronauki i medycyny klinicznej. Dodatkowo, proste wykonanie tej metody pozwala na opłacalną i wydajną ocenę eksperymentalną. Manuskrypt ten opisuje syntezę i wstrzykiwanie peptydów Aβ42 do mózgu danio pręgowanego.

Wprowadzenie

AD jest przewlekłą postępującą chorobą charakteryzującą się utratą neuronów i synaps w korze mózgowej1,2,3,4,5. Klasycznymi neuropatologicznymi cechami charakterystycznymi AD są odkładanie się peptydów amyloidowych i tworzenie się splątków neurofibrylarnych (NFT)6. Blaszki starcze, znane również jako blaszki amyloidowe, składają się z peptydów β amyloidu (Aβ), które tworzą β-plisowane struktury w miąższu mózgu5. Akumulacja Aβ42 u pacjentów z chorobą Alzheimera odgrywa wczesną i kluczową rolę w postępie choroby. AD uruchamia kaskadę zdarzeń prowadzących do dysfunkcji synaptycznych, upośledzenia plastyczności i utraty neuronów7,8,9,10.

Dorosły mózg danio pręgowanego teleost służy jako doskonały model do badania regulacji plastyczności komórek macierzystych11,12,13,14,15,16,17,18,19,20 i różne choroby ośrodkowego układu nerwowego (OUN), w tym AD21,22,23,24. Dzięki szerokiej gamie dostępnych metod eksperymentalnych19,20,25,26,27,28,29,30,31, badania te mają charakter informacyjny i są wykonalne. Danio pręgowany może uzupełnić CNS13,15,32,33,34,35,36,37,38, częściowo za pomocą programów molekularnych aktywowanych po utracie neuronów19, 39,40,41,42,43,44. W związku z tym stworzenie modelu choroby neurodegeneracyjnej u ryb danio pręgowanego może pomóc w rozwiązaniu nowych problemów dotyczących zdolności regeneracyjnych i biologii komórek macierzystych w mózgach kręgowców.

Ostatnio opracowaliśmy model toksyczności amyloidu w mózgu dorosłego danio pręgowanego, wstrzykując syntetyczne peptydy Aβ42 (Tabela 1)39. To wstrzyknięcie spowodowało fenotypy neurodegeneracji przypominające patologię ludzkiego mózgu (np. śmierć komórki, aktywacja mikrogleju, degeneracja synaps i deficyty pamięci), co wskazuje, że danio pręgowany może być używany do wywoływania neurodegeneracji w mózgu danio pręgowanego, peptydy Aβ42 można wykryć za pomocą barwień immunohistochemicznych, a molekularne mechanizmy regeneracji w OUN dorosłego danio pręgowanego można zidentyfikować39. W tym protokole demonstrujemy wstrzyknięcie syntetycznych peptydów amyloidowych do mózgu danio pręgowanego przy użyciu metody iniekcji komorowej mózgu (CVMI)27,39,45,46 w celu naśladowania osadzania się amyloidu (Rysunek 1). CVMI zapewnia nowatorski sposób dostarczania peptydów, które agregują się po wstrzyknięciu jako struktury β-arkuszowe i wywierają toksyczność. Peptydy są równomiernie rozmieszczone w mózgu, celując w obszar komorowy wzdłuż całej osi ogonowo-ogonowej45. Dodatkowo metoda ta pozwala na analizę morfologicznej i molekularnej odpowiedzi NSPC w mózgu dorosłego danio pręgowanego po inkluzjach amyloidu. Takie badania dostarczą nam informacji na temat skutecznej naprawy mózgu u ssaków. Nasza metoda może być wykorzystana do zrozumienia niezbędnego mechanizmu molekularnego skutecznej reakcji regeneracyjnej po objawach podobnych do choroby Alzheimera w celu wywołania uzupełnienia utraconych neuronów i powrotu do funkcjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Ten protokół jest standardową procedurą sugerowaną przez wytyczne UE (2010/63) oraz Europejskie Towarzystwo Modeli Ryb w Biologii i Medycynie (EuFishBioMed) w Karlsruhe Insitute of Technology (KIT). Wszystkie opisane poniżej metody zostały zatwierdzone przez komisję etyki (Landesdirektion Dresden; dokument nr TVV-52/2015).

1. Przygotowanie peptydu Aβ42

  1. Zsyntetyzować peptydy (patrz Tabela 1) przy użyciu standardowej chemii 9-fluorenylometoksykarbonylowej (Fmoc) z 2-(1H-benzotriazolo-1-ylem)-1,1,3,3-tetramethyluronoiumhexafluorphosphat (HBTU) jako odczynnikiem sprzęgającym na zautomatyzowanym syntezatorze peptydów w fazie stałej52. Skala syntezy wynosiła 100 μmol.
  2. Załaduj do automatycznego syntezatora peptydów 500 mg żywicy chronionej Fmoc jako fazę stałą (zdolność ładowania 0,2 mmol/g). Załadować rozpuszczone aminokwasy chronione Fmoc w stężeniu 0,5 M w wymaganej objętości i obliczonej dla odpowiedniego syntezatora.
    UWAGA: Obliczenia są wykonane tak, aby umożliwić dwukrotne sprzężenie każdego aminokwasu chronionego przez Fmoc z 5-krotnym nadmiarem każdego elementu budulcowego do żywicy47.
  3. Rozpuścić odczynniki wymagane do syntezy peptydów w dimethlyformamide (DMF). Na przykład należy przygotować aktywator HBTU o stężeniu 0,48 M, 45% v/v N-metylomorfoliny (NMM) (zasada) i 5% v/v bezwodnik octowy (mieszanina zamykająca), aby przykryć nieprzereagowane grupy aminowe.
  4. Rozszczepić wszystkie peptydy z żywicy, mieszając w sposób ciągły stałe podłoże za pomocą mieszadła w świeżo przygotowanej mieszaninie rozszczepienia składającej się z kwasu trifluorooctowego (TFA): Triizopropylosilian (TIS): woda: Ditiotreitol (DTT) w 90 (v/v): 5 (v/v): 2,5 (v/v): 2,5 (m / v), przez 4 godziny. Użyj 10 ml dla skali syntezy 100 μmol.
  5. Wytrącić rozszczepiony produkt, dodając mieszaninę rozszczepienia do 100 ml lodowatego eteru dietylowego. Przepuścić przez jednostkę filtracyjną zawierającą filtr z politetrafluoroetylenu (PTFE) o wielkości porów 0,45 μm i przemyć 20 ml lodowatego eteru dietylowego.
  6. Zebrać przefiltrowany peptyd z bibuły filtracyjnej i rozpuścić 100 mg wytrąconego peptydu w 5 ml destylowanej wody dejonizowanej: acetonitryl w stosunku 1:1.
  7. Oczyszczać za pomocą wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) z odwróconymi fazami na półpreparatywnej HPLC wyposażonej w porowatą kolumnę polistyrenową diwinylobenzenu o wielkości kulki 10 μm.
    1. Wstępnie podgrzać kolumnę i utrzymywać w temperaturze 50 °C za pomocą urządzenia grzewczego kolumny. Zebrać wszystkie główne frakcje za pomocą automatycznego kolektora frakcji, stosując gradient od 5% do 100% rozpuszczalnika B przez 25 minut przy 4 ml/min.
      UWAGA: Rozpuszczalnik A to 0,1% TFA w wodzie, a rozpuszczalnik B to 0,1% TFA w acetonitrylu52.
    2. Monitorować chromatogram przy długości fali 220 nm, zebrać odpowiednie piki i przeprowadzić analizę za pomocą LC-MS.
  8. Potwierdzić czystość za pomocą analitycznej ultrawysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (UPLC) z odwróconymi fazami przy długości fali 220 nm, monitorując za pomocą detektora UV, przepuszczając próbkę przez analityczną kolumnę C18 (wielkość kulki 1,7 μm). Potwierdzić produkt peptydowy za pomocą spektrometrii mas.
    UWAGA: UPLC jest sprzężony ze spektrometrią mas z jonizacją elektrorozpylania (ESI-MS) i tandemowym detektorem kwadrupolowym.
  9. Liofilizuj odpowiednie frakcje pożądanego peptydu w kolbie okrągłodennej, stosując próżnię 0,052 mbar do puszystego proszku. Podłączyć pompę próżniową do urządzenia zamrażającego utrzymywanego w temperaturze -78 °C. Przechowywać w temperaturze -80 °C, przez czas nieokreślony.
  10. Użyć liofilizowanego peptydu do przygotowania roztworu podstawowego 1 mM w mieszaninie acetonitrylu: DMF: woda o czystości analitycznej w stosunku 1:1:1 do eksperymentów. Roztwór ten można przechowywać przez co najmniej 6 miesięcy, ponieważ peptydy nie agregują się w tym roztworze.

2. Przygotowanie mieszaniny iniekcyjnej

  1. Przygotować sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4) do rozcieńczenia liofilizowanych peptydów.
  2. Rozpuścić peptyd do końcowego stężenia 20 μM w PBS. Przygotuj ten roztwór na świeżo. Dobrze wymieszać i przechowywać na lodzie do momentu wstrzyknięcia. Nie należy przekraczać 30 minut, aby zapobiec agregacji w roztworze.

3. Znieczulenie

  1. Przygotować roztwór podstawowy środków znieczulających, 0,1% metanosulfonianu etylu m-aminobenzoesanu (MESAB), w zwykłej wodzie dla ryb z układu krążenia. Przygotować roztwór znieczulający do końcowego stężenia 0,0025% (v/v).
  2. Wyjmij żądaną liczbę ryb z ich zbiorników do pojemnika transportowego z 5 litrami wody systemowej.
  3. Napełnij do połowy plastikową szalkę Petriego (90 mm) 40 ml środków znieczulających. Używaj tego naczynia do wstrzykiwań.
  4. Inkubować ryby w środkach znieczulających, aż ruch operkularny ustanie.

4. Mikroiniekcja komorowa mózgu

  1. Przygotowanie aparatu iniekcyjnego
    1. Przygotować szklane kapilary iniekcyjne za pomocą ściągacza igłowego o następujących parametrach: cykl nagrzewania, 537; cykl ciągnięcia, 250; prędkość, 1,5 s; czas, 80 ms.
    2. Ustaw ciśnienie w źródle ciśnienia na 25 psi.
    3. Ustaw parametry mikrowtryskiwacza na następujące: ciśnienie podtrzymania 20 psi; ciśnienie wyrzutu 10 psi; wartość okresu 2,5; wartość bramkowania 100 ms.
    4. Napełnić szklaną kapilarnę roztworem do wstrzykiwań. Włożyć szklaną kapilę do uchwytu do mikroiniekcji. Ustaw kąt wtrysku na 45°.
      UWAGA: Bardziej szczegółowe protokoły można znaleźć zgodnie z opisem w references27,46.
  2. Umieścić jedną rybę na nowej szalce Petriego wypełnionej roztworem znieczulającym (jak w kroku 3.3).
  3. Chwyć rybę kleszczami i ustaw się do wstrzyknięcia.
  4. Za pomocą końcówki igły 30 G należy wykonać szczelinę w czaszce nad powierzchnią nerwu wzrokowego, w miejscu, w którym spotykają się dwie boczne płytki. Nie wkładaj końcówki do tkanki mózgowej, może to spowodować krwawienie i uszkodzenie. Zobacz referencje27,45,46, aby uzyskać więcej informacji.
  5. Włóż szklaną kapilarnę do szczeliny.
    1. Używać tylko końcówki igły i nie przebijać czaszki na więcej niż 1 mm. Trzymaj rybę i włóż końcówkę szklanej kapilary przez miejsce nacięcia.
    2. Ustaw końcówkę szklanej kapilary w kierunku kresomózgowia pod kątem 45°. Wstrzyknąć 1 μl roztworu. Ciecz rozprasza się natychmiast po wstrzyknięciu.

5. Odzyskiwanie

  1. Umieść rybę z powrotem w pojemniku transportowym, aż wyzdrowieje. Podłącz pojemnik do regularnie krążącej wody dla ryb, aby zapewnić optymalną jakość wody.
    UWAGA: Rekonwalescencja powinna zwykle trwać 1 minutę. Jeśli trwa to dłużej, ryba musi być trzymana w znieczuleniu przez krótszy czas (musi to być zoptymalizowane przez eksperymentatora).

6. Przygotowanie tkanek i ich sekcjonowanie

  1. Odczekaj żądany okres czasu przed złożeniem ryby w ofierze.
    UWAGA: To zależy od pytania eksperymentalnego. Odkładanie się amyloidu można zauważyć już po 1 dniu od wstrzyknięcia.
  2. Rybę należy złożyć w ofierze przy użyciu odpowiedniej metody w zależności od przepisów etycznych (np. rybę należy potraktować 0,1 M MESAB).
  3. Rozetnij czaszkę powyżej tektum wzrokowego za pomocą spiczastego kleszcza po stronie grzbietowej i rozetnij głowę tuż za płetwą piersiową za pomocą skalpela.
  4. Utrwalić głowice za pomocą 2% paraformaldehydu (PFA) przez noc w temperaturze 4 °C. Użyj 3 ml PFA na głowę w plastikowej tubie z zakręcaną pokrywką.
    UWAGA: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.
  5. W celu krioprotekcji i odwapnienia umyj głowy trzykrotnie w 0,1 M buforze fosforanowym (pH 7,4), a następnie przenieś je do 20% roztworu sacharozy/20% etylenodiaminotetraoctu (EDTA) i inkubuj przez noc w temperaturze 4 °C.
  6. Aby zatopić tkankę w żywicy sekcyjnej, zamroź główki w 7,5% roztworze żelatyny/20% sacharozy w plastikowych formach histologicznych na suchym lodzie (około 3-5 minut w celu zamrożenia bloku). Przechowywać próbki w temperaturze -80 °C lub przejść do następnego etapu (kriosekcji).
  7. Podziel głowy na kriosekcje o grubości 12 μm za pomocą kriostatu zgodnie z opisem28,42. Kriosekcje należy przenieść bezpośrednio na szkiełka podstawowe i przechowywać w temperaturze -20 °C do długotrwałego stosowania.

7. Barwienie immunohistochemiczne i mikroskopia

UWAGA: Wykonaj wszystkie etapy inkubacji w wilgotnej komorze. Wszystkie etapy prania trwają 10 minut każdy.

  1. Suszyć sekcje przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po rozmrożeniu skrawki umyć dwukrotnie w PBS i raz w PBSTx (PBS z 0,03% Triton-X-100).
  2. Inkubować z przeciwciałem pierwszorzędowym (przeciwciało anty-Aβ42; rozcieńczenie 1:500 w PBSTx) w temperaturze 4 °C przez noc. Następnego dnia przemyć raz w PBS i dwa razy w PBSTx.
  3. Inkubować skrawki z przeciwciałem drugorzędowym (detekcja sprzężona z fluorescencją, rozcieńczenie 1:500) wraz z DAPI (1 μg/ml) w PBSTx przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.
  4. Umyj trzy razy w PBSTx. Po końcowym umyciu zamontuj szkiełka z szkiełkiem nakrywkowym przy użyciu 100 μL 70% glicerolu.
  5. Uzyskiwanie obrazów fluorescencyjnych za pomocą mikroskopu konfokalnego (na przykład za pomocą obiektywu 20X PL APO N.A. 0,7 o zakresie wzbudzenia 488 i standardowym filtrze zielonym; Rysunek 2)39.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Do oczyszczania syntetycznego peptydu wykorzystano HPLC, a do charakterystyki oczyszczonych peptydów amyloidu β zastosowano spektrometrię mas. Kolumnę HPLC podgrzano do 50 °C, aby poprawić rozdzielczość peptydów Aβ, a następnie zebrano wszystkie frakcje. W celu zidentyfikowania prawidłowo zsyntetyzowanego peptydu przeprowadzono analizę spektrometrii mas dla wszystkich frakcji. Chromatogram UPLC obrazuje czystość związku. Frakcja HPLC, w której uzyskano jeden pik w UPLC (tzn. praw...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Peptydy amyloidowe mogą być modyfikowane tak, aby zawierały zmiany sekwencji lub różne znaczniki. Na przykład można wygenerować zaszyfrowany peptyd amyloidowy, a peptydy można znakować znacznikami fluorescencyjnymi na N-końcu końca peptydu lub znakować peptydami nośnikowymi39. Podobnie, w tym protokole, peptydem nośnikowym jest peptyd penetrujący komórki TR ze względu na jego skuteczność w transporcie ładunku w głąb tkanki mózgowej39. Dodatkowo nasza metoda pozwala na wstrz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez DZNE i Stowarzyszenie Helmholtza (VH-NG-1021), CRTD, TU Dresden (FZ-111, 043_261518) i DFG (KI1524/6) (C.K.); oraz przez Stowarzyszenie Leibniza (SAW-2011-IPF-2) i BMBF (BioLithoMorphie 03Z2E512) (Y.Z.). Chcielibyśmy również podziękować Ulrike Hofmann za syntezę peptydów oraz Nandini Asokan, Prayag Murawala i Elly Tanaka za pomoc podczas filmowania zabiegu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Aminokwasy chronione FmocIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)Aminokwasy na bazie Fmoc do syntezy peptydów w fazie stałej (SPPS)
N,N,N′,N′-tetrametylo-O-(1H-benzotriazol-1-ylo)uron heksafluorofosforan (HBTU)IRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)RL-1030Aktywator
OxymaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)RL-1180Tłumik racemii
N,N-diizopropyloetyloaminaIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)SOL-003Zasada
dimetyloformamiduIRIS Biotech GmbH (Marktredwitz, Niemcy)SOL-004Rozpuszczalnik
N-metylomorfolinaThermo Fisher (Kandel) GmbH, NiemcyA12158
Hydrat 1-hydroksybenzotriazolu (HOBT)Sigma-Aldrich Co. LLC. ( St. Louis, MO, USA)157260 ALDRICHAktywator
PiperydynaMERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)822299Odczynnik deprotekcyjny Fmoc
Dichlormetan (DCM)MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)106050Rozpuszczalnik
Kwas mrówkowy (FA)MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)100264Składnik buforowy do HPLC
Kwas trifluorooctowy (TFA)MERCK KGaA ( Darmstadt, Niemcy)808260Odczynnik do mieszaniny do przelewów
Triizopropylosilan (TIS)MERCK KGaA (Darmstadt, Niemcy)233781 ALDRICHOdczynnik do mieszaniny kolców
Acetonitryl (do UPLC/LCMS)Sigma-Aldrich Laborchemikalien GmbH34967-1LRozpuszczalnik
Acetonitryl (do HPLC)VWR International Ltd, Anglia83639.320Rozpuszczalnik
DietylletherVWR International Ltd, Anglia23811.326Rozpuszczalnik do wytrącania peptydów
Ditiotritol (DTT)VWR International Ltd, Anglia0281-25GOdczynnik do mieszaniny kłębów
TentaGel S RAM Fmoc rinkżywica amidowa Rapp Polymere GmbH (Tuebingen, Niemcy)S30023Faza stała do
syntezy peptydów SPPS Strzykawki 5 ml z dołączonymi filtramiIntavis AG (Kolonia, Niemcy)34.274Rurka reakcyjna do SPPS i do pakowania z filtra
politetrafluoroetylenu (PTFE)Sartorius Stedtim (Aubagne, Francja)11806-50-NFiltracja wytrąconych peptydów
Filtr strzykawkowy z polifluorku winylidenu (PVDF)Carl Roth GmbH + Co. KG KarlsruheKC78.1Filtracja wstępna do
syntezatora peptydówIntavis, Kolonia, NiemcyResPep SLZautomatyzowany syntezator peptydów w fazie stałej
Water Alliance HPLCWaters, Milford Massachusetts, USAWaters 2998, Waters e2695Półpreparatywna wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa z odwróconymi fazami (HPLC)
PolymerX, wielkość kulek 10μ m, 250x10 mmPhenomenex Ltd. Niemcy00G-4328-N0Porowata kolumna HPLC z polistyrenu diwinylobenzenu
Milli-Q Advantage A10, z filtrem Milli-QEMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USALCPAK0001System oczyszczania wody
Jednostka filtracyjnaSartorius Stedtim (Aubagne, Francja)16307Jednostka filtracyjna do wytrącania peptydów
UPLC Aquity z detektoremUVWaters, Milford, Massachusetts, USAM09UPA 664MAnalityczny ultra HPLC z odwróconą fazą do LC-MS
ACQUITY UPLC BEH C18, rozmiar koralików 1,7 i mu; m, 50x2.1 mmWaters, Milford Massachusetts, Stany Zjednoczone186002350Kolumna analityczna C18
ACQUITY TQ DetectorWaters, Milford Massachusetts, Stany ZjednoczoneQBB908Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpylaną (ESI-MS)
CHRIST ALPHA 2-4 LD plus + vacuubrand RZ6Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, Niemcy16706, 101542Liofilizator z pompą próżniową
Czytnik płytek ParadygmatBeckman Coulter
MESAB (metanosulfonian etylo-m-aminobenzoesanu)Sigma-AldrichA5040
SzalkiPetriego Sarstedt821.472
Sól fizjologiczna buforowana fosforanamiLife Technologies, GIBCO10010-056
IgłaBecton-Dickinson305178
Mikroskop preparacyjnyOlympus, Leica, Zeissróżni się w zależności od producenta
Pęseta DumontWorld Precision Instruments501985
Gillies Kleszcze preparacyjneWorld Precision Instruments 501265
Szklane kapilary iniekcyjneWorld Precision InstrumentsTWF10
PicoNozzleWorld Precision Instruments5430-12
Pneumatyczny PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820
Oświetlacz pierścieniowy; Przewodnik po lampach pierścieniowychParkland ScientificILL-RLG
CryostatLeicaCM1950
z w fazie stałej HPLC

Bibliografia

  1. LaFerla, F. M., Green, K. N. Animal models of Alzheimer disease. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (11), (2012).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease: genes, proteins, and therapy. Physiol Rev. 81 (2), 741-766 (2001).
  3. Serpell, L. C. Alzheimer's amyloid fibrils: structure and assembly. Biochim Biophys Acta. 1502 (1), 16-30 (2000).
  4. Beyreuther, K., Masters, C. L. Alzheimer's disease. The ins and outs of amyloid-beta. Nature. 389 (6652), 677-678 (1997).
  5. Glenner, G. G., Wong, C. W. Alzheimer's disease: initial report of the purification and characterization of a novel cerebrovascular amyloid protein. Biochem Biophys Res Commun. 120 (3), 885-890 (1984).
  6. Blennow, K., de Leon, M. J., Zetterberg, H. Alzheimer's disease. Lancet. 368 (9533), 387-403 (2006).
  7. Hardy, J. The amyloid hypothesis for Alzheimer's disease: a critical reappraisal. J Neurochem. 110 (4), 1129-1134 (2009).
  8. McGowan, E., et al. Abeta42 is essential for parenchymal and vascular amyloid deposition in mice. Neuron. 47 (2), 191-199 (2005).
  9. Hardy, J., Selkoe, D. J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science. 297 (5580), 353-356 (2002).
  10. Tincer, G., Mashkaryan, V., Bhattarai, P., Kizil, C. Neural stem/progenitor cells in Alzheimer's disease. Yale J Biol Med. 89 (1), 23-35 (2016).
  11. Diotel, N., et al. Effects of estradiol in adult neurogenesis and brain repair in zebrafish. Horm Behav. 63 (2), 193-207 (2013).
  12. Grandel, H., Brand, M. Comparative aspects of adult neural stem cell activity in vertebrates. Dev Genes Evol. 223 (1-2), 131-147 (2013).
  13. Kizil, C., Kaslin, J., Kroehne, V., Brand, M. Adult neurogenesis and brain regeneration in zebrafish. Dev Neurobiol. 72 (3), 429-461 (2012).
  14. Diotel, N., et al. Cxcr4 and Cxcl12 expression in radial glial cells of the brain of adult zebrafish. J Comp Neurol. 518 (24), 4855-4876 (2010).
  15. Zupanc, G. K. Adult neurogenesis and neuronal regeneration in the brain of teleost fish. J Physiol Paris. 102 (4-6), 357-373 (2008).
  16. Adolf, B., et al. Conserved and acquired features of adult neurogenesis in the zebrafish telencephalon. Dev Biol. 295 (1), 278-293 (2006).
  17. Grandel, H., Kaslin, J., Ganz, J., Wenzel, I., Brand, M. Neural stem cells and neurogenesis in the adult zebrafish brain: origin, proliferation dynamics, migration and cell fate. Dev Biol. 295 (1), 263-277 (2006).
  18. Kaslin, J., Ganz, J., Brand, M. Proliferation, neurogenesis and regeneration in the non-mammalian vertebrate brain. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363 (1489), 101-122 (2008).
  19. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  20. Than-Trong, E., Bally-Cuif, L. Radial glia and neural progenitors in the adult zebrafish central nervous system. Glia. 63 (8), 1406-1428 (2015).
  21. Santana, S., Rico, E. P., Burgos, J. S. Can zebrafish be used as animal model to study Alzheimer's disease? Am J Neurodegener Dis. 1 (1), 32-48 (2012).
  22. Newman, M., Verdile, G., Martins, R. N., Lardelli, M. Zebrafish as a tool in Alzheimer's disease research. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 346-352 (2010).
  23. Paquet, D., et al. A zebrafish model of tauopathy allows in vivo imaging of neuronal cell death and drug evaluation. J Clin Invest. 119 (5), 1382-1395 (2009).
  24. Xi, Y., Noble, S., Ekker, M. Modeling neurodegeneration in zebrafish. Curr Neurol Neurosci Rep. 11 (3), 274-282 (2011).
  25. Barbosa, J. S., et al. Live imaging of adult neural stem cell behavior in the intact and injured zebrafish brain. Science. 348 (6236), 789-793 (2015).
  26. Dray, N., et al. Large-scale live imaging of adult neural stem cells in their endogenous niche. Development. 142 (20), 3592-3600 (2015).
  27. Kizil, C., Brand, M. Cerebroventricular microinjection (CVMI) into adult zebrafish brain is an efficient misexpression method for forebrain ventricular cells. PLoS One. 6 (11), e27395(2011).
  28. Chapouton, P., Godinho, L. Neurogenesis. Methods Cell Biol. 100, 73-126 (2010).
  29. Chen, C. H., Durand, E., Wang, J., Zon, L. I., Poss, K. D. zebraflash transgenic lines for in vivo bioluminescence imaging of stem cells and regeneration in adult zebrafish. Development. 140 (24), 4988-4997 (2013).
  30. McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), (2016).
  31. Mokalled, M. H., et al. Injury-induced ctgfa directs glial bridging and spinal cord regeneration in zebrafish. Science. 354 (6312), 630-634 (2016).
  32. Kishimoto, N., Shimizu, K., Sawamoto, K. Neuronal regeneration in a zebrafish model of adult brain injury. Dis Model Mech. 5 (2), 200-209 (2012).
  33. Fleisch, V. C., Fraser, B., Allison, W. T. Investigating regeneration and functional integration of CNS neurons: lessons from zebrafish genetics and other fish species. Biochim Biophys Acta. 1812 (3), 364-380 (2010).
  34. Chapouton, P., Jagasia, R., Bally-Cuif, L. Adult neurogenesis in non-mammalian vertebrates. Bioessays. 29 (8), 745-757 (2007).
  35. Becker, T., et al. Readiness of zebrafish brain neurons to regenerate a spinal axon correlates with differential expression of specific cell recognition molecules. J Neurosci. 18 (15), 5789-5803 (1998).
  36. Rothenaigner, I., et al. Clonal analysis by distinct viral vectors identifies bona fide neural stem cells in the adult zebrafish telencephalon and characterizes their division properties and fate. Development. 138 (8), 1459-1469 (2011).
  37. Marz, M., Schmidt, R., Rastegar, S., Strahle, U. Regenerative response following stab injury in the adult zebrafish telencephalon. Dev Dyn. 240 (9), 2221-2231 (2012).
  38. Kroehne, V., Freudenreich, D., Hans, S., Kaslin, J., Brand, M. Regeneration of the adult zebrafish brain from neurogenic radial glia-type progenitors. Development. 138 (22), 4831-4841 (2011).
  39. Bhattarai, P., et al. IL4/STAT6 signaling activates neural stem cell proliferation and neurogenesis upon Amyloid-β42 aggregation in adult zebrafish brain. Cell Reports. 17 (4), 941-948 (2016).
  40. Cosacak, M. I., Papadimitriou, C., Kizil, C. Regeneration, Plasticity, and Induced Molecular Programs in Adult Zebrafish Brain. Biomed Res Int. , (2015).
  41. Kizil, C., et al. The chemokine receptor cxcr5 regulates the regenerative neurogenesis response in the adult zebrafish brain. Neural Dev. 7, 27(2012).
  42. Kizil, C., et al. Regenerative neurogenesis from neural progenitor cells requires injury-induced expression of Gata3. Dev Cell. 23 (6), 1230-1237 (2012).
  43. Kyritsis, N., et al. Acute inflammation initiates the regenerative response in the adult zebrafish brain. Science. 338 (6112), 1353-1356 (2012).
  44. Katz, S., et al. A Nuclear Role for miR-9 and Argonaute Proteins in Balancing Quiescent and Activated Neural Stem Cell States. Cell Rep. 17 (5), 1383-1398 (2016).
  45. Kizil, C., et al. Efficient cargo delivery using a short cell-penetrating peptide in vertebrate brains. PLoS One. 10 (4), e0124073(2015).
  46. Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of gene expression in the adult zebrafish brain using cerebroventricular microinjection of morpholino oligonucleotides. J Vis Exp. (75), e50415(2013).
  47. Sewald, N., Jakubke, H. Peptides: Chemistry and Biology. , Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA. (2009).
  48. Beyer, I., et al. Solid-Phase Synthesis and Characterization of N-Terminally Elongated Abeta-3-x -Peptides. Chemistry. 22 (25), 8685-8693 (2016).
  49. Zheng, Y., et al. Kinesin-1 inhibits the aggregation of amyloid-beta peptide as detected by fluorescence cross-correlation spectroscopy. FEBS Lett. 590 (7), 1028-1037 (2016).
  50. Balducci, C., Forloni, G. In Vivo Application of Beta Amyloid Oligomers: a Simple Tool to Evaluate Mechanisms of Action and New Therapeutic Approaches. Curr Pharm Des. 20 (15), 2491-2505 (2013).
  51. Schiffer, N. W., et al. Identification of anti-prion compounds as efficient inhibitors of polyglutamine protein aggregation in a zebrafish model. J Biol Chem. 282 (12), 9195-9203 (2007).
  52. Wieduwild, R., Tsurkan, M., Chwalek, K., Murawala, P., Nowak, M., Freudenberg, U., Neinhuis, C., Werner, C., Zhang, Y. Minimal peptide motif for non-covalent peptide-heparin hydrogels. Journal of the American Chemical Society. 135 (8), 2919-2922 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Beta-amyloid 42synteza peptydówtechnika mikrowstrzykiwaniamikroskopia konfokalnaneuralne komórki macierzystemodel choroby Alzheimeraoczyszczanie metodą HPLCprotokół liofilizacjibarwienie fluorescencyjne
Modelowanie toksyczności i neurodegeneracji amyloidu-β42 w mózgu dorosłego danio pręgowanego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.