Ocena właściwości przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych komórek śródbłonka z wykorzystaniem hodowli komórkowej 3D i nieantykoagulowanej krwi pełnej

Podsumowanie

Prezentujemy model in vitro, który pozwala na badanie i analizę krzepnięcia w pełnej, nieantykoagulowanej krwi. Antykoagulacja w ustroju zależy od naturalnego działania przeciwzakrzepowego zdrowych komórek śródbłonka, a aktywacja komórek śródbłonka spowoduje krzepnięcie.

Streszczenie

In vivo, komórki śródbłonka są kluczowe dla naturalnej antykoagulacji krążącej krwi. W konsekwencji aktywacja komórek śródbłonka prowadzi do krzepnięcia krwi. Zjawisko to obserwuje się w wielu sytuacjach klinicznych, takich jak przeszczepianie narządów w obecności wstępnie uformowanych przeciwciał anty-donorowych, w tym ksenotransplantacja, a także w przypadku uszkodzenia niedokrwiennego/reperfuzyjnego. W celu ograniczenia eksperymentów na zwierzętach zgodnie ze standardami 3R (redukcja, zastąpienie i udoskonalenie), wysoce pożądane byłyby modele in vitro do badania wpływu aktywacji komórek śródbłonka na krzepnięcie krwi. Jednak powszechne płaskie systemy hodowli komórek śródbłonka zapewniają stosunek powierzchni do objętości wynoszący 1 - 5^cm2 śródbłonka na ml krwi, co nie jest wystarczające do naturalnej antykoagulacji za pośrednictwem śródbłonka. Hodowla komórek śródbłonka na kulkach mikronośnika może zwiększyć stosunek powierzchni do objętości do 40 - 160 cm²/ml. Ten zwiększony stosunek jest wystarczający, aby zapewnić "naturalną" antykoagulację krwi pełnej, dzięki czemu można uniknąć stosowania antykoagulantów. W tym artykule opisano system oparty na mikronośnikach in vitro w celu zbadania wpływu modyfikacji genetycznej komórek śródbłonka świń na krzepnięcie całej, nieantykoagulowanej krwi ludzkiej. W opisanym teście pierwotne komórki śródbłonka aorty świń, typu dzikiego (WT), lub transgeniczne dla ludzkiego CD46 i trombomoduliny, hodowano na kulkach mikronośnika, a następnie wystawiono na działanie świeżo pobranej krwi ludzkiej niezakrzepowej. Model ten pozwala na pomiar i kwantyfikację uwalniania cytokin, a także markerów aktywacji dopełniacza i krzepnięcia w osoczu krwi. Ponadto za pomocą mikroskopii konfokalnej wykonano obrazowanie aktywowanych komórek śródbłonka oraz odkładanie immunoglobulin, białek dopełniacza i białka krzepnięcia na śródbłonkowych kulkach. Test ten może być również wykorzystany do testowania leków, które mają zapobiegać aktywacji komórek śródbłonka, a tym samym krzepnięciu. Oprócz możliwości zmniejszenia liczby zwierząt wykorzystywanych do takich badań, opisany test jest łatwy do wykonania i konsekwentnie powtarzalny.

Wprowadzenie

Śródbłonek naczyniowy składa się z monowarstwy komórek śródbłonka (EC), które wyściełają światło naczyń krwionośnych. W stanie fizjologicznym spoczynkowe EC są odpowiedzialne za utrzymanie środowiska przeciwzakrzepowego i przeciwzapalnego. ¹ Odbywa się to za pośrednictwem ekspresji białek przeciwzakrzepowych i przeciwzapalnych na powierzchni EC. Na przykład aktywacja EC spowodowana uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym lub odrzuceniem naczyniowym (kseno)przeszczepionych narządów powoduje zmianę powierzchni śródbłonka ze stanu przeciwzakrzepowego i przeciwzapalnego na stan prokoagulacyjny i prozapalny. ¹

Aby zbadać fascynującą i złożoną interakcję między śródbłonkiem a czynnikami krzepnięcia, wysoce pożądane są modele in vitro, które jak najwierniej naśladują sytuację in vivo. Powszechnym ograniczeniem charakteryzującym konwencjonalne testy krzepnięcia in vitro jest stosowanie krwi przeciwzakrzepowej, co sprawia, że analiza efektów za pośrednictwem krzepnięcia jest uciążliwa, a nawet ponowne zwapnienie cytrynianu krwi pełnej nie może odtworzyć wyników możliwych do uzyskania przy użyciu świeżej, nieantykoagulowanej krwi. ² Poza tym, w tradycyjnych systemach hodowli komórkowych z płaskim łożem niemożliwe jest wykorzystanie właściwości przeciwzakrzepowych śródbłonka, ponieważ nie można osiągnąć wystarczającej powierzchni komórek śródbłonka na objętość krwi. Prezentowany tutaj model pokonuje te ograniczenia poprzez hodowlę EC na powierzchni sferycznych kulek mikronośnika, dzięki czemu można osiągnąć stosunek powierzchni EC do krwi wynoszący >16 cm²/ml, co jest podobne do sytuacji w małych tętniczkach lub żyłach, i które zostało opisane jako wystarczające, aby umożliwić "naturalną" antykoagulację krwi przez powierzchnię EC. ^3,4 W tym ustawieniu można używać krwi pełnej bez dodatku antykoagulantów. Podczas eksperymentu można pobrać próbki krwi, a cytokiny, czynniki krzepnięcia i rozpuszczalne markery aktywacji dopełniacza mogą być wykryte i określone ilościowo. Ponadto kulki mikronośnikowe pokryte EC mogą być analizowane pod kątem odkładania się dopełniacza i immunoglobuliny, a także ekspresji markerów aktywacji EC za pomocą mikroskopii konfokalnej. Innym ciekawym zastosowaniem jest testowanie leków, które mają zapobiegać aktywacji komórek śródbłonka, a co za tym idzie krzepnięcia. ⁵ Chociaż ten model nie może całkowicie zastąpić eksperymentów na zwierzętach, oferuje metodę testowania konkretnych hipotez funkcjonalnych ex vivo przy użyciu komórek, a tym samym zmniejsza liczbę zwierząt wykorzystywanych w podstawowych badaniach nad uszkodzeniem niedokrwiennym/reperfuzyjnym lub (kseno)transplantacją.

Opisany model został użyty do naśladowania warunków ksenotransplantacji, w których komórki śródbłonka aorty świńskiej (PAEC) są hodowane na mikronośnikach i inkubowane z całą, nieantykoagulowaną ludzką krwią. Różne transgeniczne PAEC, zawierające kilka ludzkich genów, takich jak CD46 do regulacji układu dopełniacza i/lub trombomodulina (hTBM) do regulacji układu krzepnięcia, analizowano pod kątem ich właściwości przeciwzakrzepowych. Systemy aktywacji komórek śródbłonka, dopełniacza i krzepnięcia są ściśle kontrolowane i wzajemnie połączone. ⁶ Dlatego ważne jest zrozumienie, jak zachowują się różne komórki transgeniczne po ekspozycji na ludzką krew w odniesieniu do ekspresji cząsteczek adhezyjnych i uwalniania cytokin, zrzucania glikokaliksu i utraty białek przeciwzakrzepowych. ⁷

Protokół

Niemieckie świnie rasy lokalnej (dziki typ wyhodowany w lokalnym gospodarstwie i transgeniczny wyhodowany w Instytucie Molekularnej Hodowli Zwierząt i Biotechnologii, Uniwersytet Ludwika i Maksymiliana, Monachium, Niemcy), o wadze od 30 kg do 40 kg, zostały użyte w tym badaniu. Wszystkie zwierzęta były trzymane w standardowych warunkach, z wodą i jedzeniem ad lib. Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z brytyjską ustawą o zwierzętach (procedury naukowe) oraz Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, a także szwajcarskim prawem ochrony zwierząt. Wszystkie badania na zwierzętach były zgodne z wytycznymi ARRIVE. Komitet ds. Doświadczeń na Zwierzętach Kantonalnej Służby Weterynaryjnej (Kanton Berno, Szwajcaria) zatwierdził wszystkie procedury na zwierzętach, nr zezwolenia. BE70/14. Protokoły eksperymentalne zostały dopracowane zgodnie z zasadami 3R i zastosowano najnowocześniejsze znieczulenie i leczenie bólu w celu zminimalizowania liczby zwierząt i zmniejszenia narażenia zwierząt na stres i ból podczas eksperymentów.

Krew została pobrana od zdrowych osób za pomocą nakłucia żyły w systemie zamkniętym, zgodnie ze szwajcarską jurysdykcją i wytycznymi etycznymi Szpitala Uniwersyteckiego w Bernie. Wyrażenie "krew niezakrzepliwa" oznacza, że krew nie była leczona żadnym antykoagulantem.

Następujące kroki są wykonywane w sterylnych warunkach. Wymagana jest znajomość podstawowej techniki sterylnej hodowli komórkowych.

1. Izolacja PAEC

UWAGA: Segmenty aorty piersiowej o długości od 6 do 10 cm zostały pobrane od poddanych eutanazji niemieckich świń rasy Landrace w wieku od 3 do 6 miesięcy (używane do innych eksperymentów in vivo) i natychmiast przeniesione do szklanej butelki o pojemności 500 ml zawierającej pożywkę transportową (DMEM + 1% penicyliny/streptomycyny).

1. Wstępnie pokryć 6-dołkową płytkę fibronektyną 12,5 μg/ml w PBS 1x i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
2. Wstępnie podgrzany sterylny PBS 1x i pożywka do hodowli komórkowych (DMEM).
3. Wyjmij aortę świni z podłoża transportowego.
4. Umieść aortę na płytce styropianowej.
5. Wcześniej delikatnie spłucz ciepłym PBS.
6. Przetnij aortę wzdłuż i przymocuj ją igłami.
7. Dodaj ciepłą pożywkę do hodowli komórkowych na wewnętrznej powierzchni naczynia.
8. Odessać pożywkę do hodowli komórek fibronektyny i dodać świeżą pożywkę do hodowli komórkowych (DMEM uzupełniony 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka).
9. Namocz jeden wacik w pożywce do hodowli komórkowych. Przetrzyj wacik na samej górze wewnętrznej powierzchni naczynia delikatnie i powoli w tym samym kierunku.
10. Przetrzyj komórki w jednym dołku z 6-dołkową płytką runda po rundzie.
11. Zrób to samo z pozostałymi studzienkami.
12. Sprawdzić komórki pod mikroskopem i umieścić 6-dołkową płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO₂ .
13. Zmień podłoże drugiego dnia i zmieniaj je ponownie co 2 - 3 dni.
14. Kiedy komórki mają się zlewać, trypsynizuj komórki i umieszczaj je w kolbie T75 (PAEC P1).

2. Charakterystyka PAEC

1. Wstępnie pokryć 8-dołkowe szkiełko domowe fibronektyną 12,5 μg/ml w PBS 1x i umieścić w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 1 godzinę.
2. Wysiać 5 x 10⁴ komórek/basenik i inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C.
3. Przemyć komórki dwukrotnie PBS⁺⁺ (PBS uzupełniony o CaCl₂ i MgCl₂), 300 μL/studzienkę.
4. Utrwal komórki za pomocą 3,7% paraformaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej, 200 μl/studzienkę.
5. Umyj komórki 3 razy PBS⁺⁺, 300 μL/studzienkę.
6. Dodać 300 μL PBS 1x-3% BSA (bufor blokujący) i pozostawić na 30 minut w temperaturze pokojowej.
7. Zastosować przeciwciała pierwszorzędowe (anty-VE-kadheryna, anty-CD31, anty-vWF) rozcieńczone w detergentzie PBS 1x-1%BSA-0,05%, 160 μL/basenik i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
8. Przemyć 3 razy preparatem PBS⁺⁺ (200 μL/dołek).
9. Zastosować przeciwciała drugorzędowe i DAPI rozcieńczone w detergentzie PBS 1x-1%BSA-0,05%, 160 μL/studzienkę i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
10. Przemyć 3 razy preparatem PBS⁺⁺ (200 μL/dołek).
11. Zamontuj szkiełka z podłożem montażowym na bazie glicerolu i sprawdź ekspresję markerów komórek śródbłonka pod mikroskopem fluorescencyjnym.
    UWAGA: Hodować komórki śródbłonka aorty świń w kolbie T175 (pożywka DMEM o niskiej zawartości glukozy + 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny i 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka) aż do osiągnięcia 90% konfluencji. (gęstość wysiewu 1 x 10⁶ komórek, 90% konfluencji odpowiada w przybliżeniu 5 x 10⁶ komórek).

3. Powlekanie kulek Microcarrier

1. Wymieszaj 7 ml kulek mikronośnikowych z 42 ml roztworu kolagenu w probówce o pojemności 50 ml (100 μg/ml, rozcieńczony w 0,2% roztworze kwasu octowego) i inkubuj przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
2. Przemyć kulki dwa razy 25 ml PBS o pH 7,4 (dodać 25 ml PBS, dobrze wymieszać pipetą i poczekać, aż kulki się osiajdą, a następnie odrzucić supernatant i powtórzyć) i jeden raz 25 ml pożywki DMEM.
3. Przykryj kulki w probówce o pojemności 50 ml 10 ml pożywki 199 uzupełnionej 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i 25 μl heparyny (5000 IU / ml) i pozostaw równowagę przez 10 minut przed dalszym użyciem.

4. Zbieranie komórek

1. Usunąć pożywkę do hodowli komórkowych z kolby T175 zawierającej PAEC i dodać 5 ml PBS o pH 7,4.
2. Usunąć PBS z kolby T175.
3. Dodać 5 ml trypsyny-0,05% EDTA i inkubować przez 3 - 4 minuty w temperaturze 37 °C.
4. Zebrać komórki, przepłukując kolbę 15 ml pożywki do hodowli komórkowych i przenieść zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml.
5. Odwirować komórki przy 1 200 x g przez 8 minut w temperaturze pokojowej, usunąć nadmiar pożywki i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki do hodowli komórkowych.

5. Umieszczanie komórek w kolbie mieszadła

1. Dodać 20 ml pożywki do hodowli komórkowych do zawiesiny komórek i ponownie zawiesić.
2. Dodać 20 ml pożywki do hodowli komórkowych (bez komórek) do kolby z mieszadłem magnetycznym o pojemności 500 ml.
3. Dodaj komórki do umytych kulek mikronośnika z kroku 3.3 i dokładnie wymieszaj za pomocą pipety serologicznej o pojemności 25 ml.
4. Przenieść mieszaninę kulek/komórek do magnetycznej kolby obrotowej.
5. Przepłucz probówkę o pojemności 50 ml 10 ml pożywki do hodowli komórkowych, aby zebrać pozostałe komórki.
6. Dodać dodatkowe 85 ml pożywki do hodowli komórkowych do kolby przędzalniczej i umieścić ją na noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (100 x g, odstęp między mieszaniami: 3 minuty co 45 minut).
7. Dodać 50 ml pożywki do hodowli komórkowych (całkowita objętość 200 ml) i kontynuować mieszanie przez dodatkowe 24 godziny w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (100 x g, odstęp między mieszaniami: 3 minuty co 45 minut).
8. Dodawać bezbarwną pożywkę RPMI (uzupełnioną 10% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1% L-glutaminy, 0,4% mieszanki suplementów pożywki do wzrostu komórek śródbłonka i 25 μl heparyny), aż do osiągnięcia 320 ml całkowitej objętości.
9. Wymieniaj pożywkę co 48 godzin: Usuń 100 ml starej pożywki i dodaj 100 ml świeżej, uzupełnionej bezbarwnej pożywki RPMI.
10. Hoduj komórki przez 5 do 7 dni. Czas zależy od stanu konfluencji koralików pokrytych komórkami.

6. Weryfikacja konfluencji

1. Za pomocą pipety zbierz 200 μl kulek pokrytych komórkami i przenieś je do probówki polipropylenowej.
2. Umyj kulki 3 razy 600 μL PBS 1x (dodaj PBS, przechyl probówkę i delikatnie wymieszaj, aby uniknąć oderwania się komórek, poczekaj, aż kulki się uspokoją, wyrzuć PBS i powtórz).
3. Utrwal kulki na 10 minut, dodając 200 μl kwasu parapikrynowego.
4. Przemyć 3 razy 600 μl PBS 1x.
5. Dodać DAPI rozcieńczony w PBS 1x i inkubować przez 10 min.
6. Przenieś koraliki na szkiełko podstawowe i nałóż szkiełko nakrywkowe za pomocą medium montażowego na bazie glicerolu.
7. Wizualizuj koraliki pod mikroskopem konfokalnym.

7. Procedura eksperymentalna

1. Usunąć kulki pokryte komórkami z kolby mieszadła magnetycznego (procedury nie muszą być wykonywane w sterylnych warunkach) za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml i przenieść je do okrągłodennych probówek polipropylenowych o pojemności 12 ml.
2. Pozwól kulkom osiąść (około 1 - 2 minut) i usuń nadmiar podłoża.
3. Dodaj więcej koralików do probówek, aż każda probówka będzie zawierała dokładnie 2 ml kulek.
4. Dodaj 5 ml przezroczystego RPMI do każdej probówki i dokładnie wymieszaj za pomocą 10 ml pipety serologicznej.
5. Pozwól koralikom się uspokoić i usuń nadmiar medium.
6. Powtórz procedurę prania jeszcze raz z RPMI i usuń cały nadmiar medium.

8. Inkubacja z krwią niezakrzepłą

1. Ostrożnie i powoli (bez użycia dyszy lub odkurzaczy) pobierz krew od zdrowego ochotnika i zbierz ją do 9 ml neutralnych probówek polipropylenowych (bez antykoagulantu).
2. Powoli przenieś 8 ml krwi za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml do każdej z probówek polipropylenowych zawierających 2 ml kulek pokrytych komórkami (całkowita objętość wyniesie 10 ml). Zawsze unikaj nieostrożnego obchodzenia się z krwią lub kulkami, aby uniknąć przedwczesnej aktywacji EC. Zabieg trwa 1 - 2 min.
3. Ostrożnie przechyl mieszaninę krwi i kulek, aby zapewnić równomierne wymieszanie i uszczelnij nakrętkę folią parafinową.
4. Umieść probówki na poziomym stole uchylnym (tylko z delikatnymi ustawieniami przechylania) w inkubatorze o temperaturze 37 °C i zapisuj czasy krzepnięcia.
   1. W ustalonych odstępach czasu, np. po 10, 20, 30, 50, 70, 90 minutach, należy usunąć co najmniej 1,5 - 2 ml mieszaniny krwi-granulek do analizy surowicy lub osocza.
      UWAGA: dla 6 punktów czasowych sugerujemy posiadanie więcej niż 3 powtórzeń w jednej grupie komórek, ponieważ pobieranie krwi będzie wykonywane w różnych probówkach.
   2. W celu zebrania surowicy pozostaw krew do krzepnięcia. Aby pobrać osocze, dodaj EDTA lub cytrynian do probówek o pojemności 2 ml przed dodaniem próbek krwi.
   3. Przechowywać probówki na lodzie, odwirowywać przy 2 500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i przechowywać surowicę/osocze w temperaturze 80 °C do momentu użycia.
      UWAGA: Szczegółowe informacje na temat materiałów znajdują się w Tabeli materiałów

Wyniki

Po 7 – 10 dniach hodowli w kolbie z mieszadłem (Rysunek 1) komórki osiągnęły konfluencję, pokrywając całą powierzchnię mikronośników (Rysunek 2). Weryfikacja stanu konfluencji jest istotnym etapem, ponieważ niekonfluencyjna warstwa EC na mikrokulkach doprowadzi do wyraźnego skrócenia czasu krzepnięcia, gdyż powierzchnia mikronośników jest silnie prokoagulacyjna (czas krzepnięcia: 4 ± 1 min) (Rysunek 3

Dyskusja

Przedstawiony tutaj model nadaje się do badań związanych z krzepnięciem, umożliwiając analizę różnych aspektów krzepnięcia i jego interakcji z ^EC.8 W badaniach nad ksenotransplantacją jest to użyteczny system do testowania właściwości przeciwzakrzepowych różnych genetycznie zmodyfikowanych EC świń po inkubacji z ludzką krwią ⁹.

Najbardziej krytycznymi krokami protokołu są te zapewniające pełne pokrycie komórek (zbieganie się) mikrogranulkami prze...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
PAEC			Wyizolowany z aorty świni w naszym laboratorium
Kulki Microcarrier (Biosilon)	Thermo Fisher Scientific	160-250
Collagen I, bydlęcy	Gibco	A10644-01
DMEM	Gibco	21885-025
Medium 199	Sigma	M7528
RPMI	Gibco	32404-014
Rurki neutralne	Sarstedt	02.1726.001
Rurki polipropylenowe	Simport	T406-2A
Mieszadło	Tecnomara
Mieszadło biologiczne	Brouwer	MCS-104S
Rat anty CD31	R& Systemy D	MAB33871	Rozcieńczenie 1:100
Kozia anty-szczurza IgG-Cy3	Jackson Immuno Research	112-166-003	Rozcieńczenie 1:500
Kozia anty VE-kadheryna	Santa Cruz	sc-6458	Rozcieńczenie 1:100
Królik anty vWF	DAKO	A0082	Rozcieńczenie 1:100
Dk anty Gt IgG – Sondy	molekularne	A11055	Rozcieńczenie 1:500
Koza anty Królik - FITC	Southern Biotech	4050-02	Rozcieńczenie 1:500
DAPI	Sigma	32670-25MG-F	Rozcieńczenie 1 i mikro; g / ml
0,05% Trypsyna-EDTA	Gibco	25300-054
FBS	Gibco	10270-106	Stężenie: 10% w pożywce do hodowli komórkowych
Adapter	Sarstedt	14.1205
Mikroskop konfokalny	Carl Zeiss	LSM 710
Oprogramowanie do analizy obrazu	Obraz J		Dostępne bezpłatnie pod adresem: https://imagej.net
Pożywka do wzrostu komórek śródbłonka SupplementMix	PromoCell	C-39216	2 ml w 500 ml DMEM
Penicylina Streptomycyna	Gibco	15140-122	Stężenie: 1% w pożywce do hodowli komórkowych
L-glutamina	Gibco	25030-024	Stężenie: 1% w pożywce do hodowli komórkowych
Heparinun natricum	Drossa Pharm AG		Stężenie magazynowe: 5000 U.I./ ml
Zjeżdżalnie komorowe	Bioswisstec AG	30108
CaCl2 x 2H2O	Merck	2382.0500
MgCl2 x6 H2O	Merck	1.5833.1000
Tween 20	Axon Lab AG	9005-64-5
Albumina surowicy bydlęcej (BSA)	Sigma	A7030
Podłoże montażowe do gliceryny	Dako	C0563

Alexa 488