Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeciwciała odgrywają kluczową rolę w łączeniu wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogenom wirusowym poprzez ich domeny wiążące antygen i regiony Fc. W tym miejscu opisujemy, jak mierzyć aktywację funkcji efektorowych Fc przez przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko hemaglutyninę wirusa grypy przy użyciu genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej Jurkat wyrażającej aktywujący typ 1 Fc-FcγR. Za pomocą tej metody można określić udział specyficznych interakcji Fc-FcγR nadawanych przez immunoglobuliny za pomocą testu in vitro.
Wprowadzenie
Odporność zapewniana przez szczepionkę przeciwko grypie sezonowej była tradycyjnie oceniana za pomocą testu hamowania hemaglutynacji (HI)1, który mierzy obecność przeciwciał celujących w miejsce wiązania receptora hemaglutyniny. Te wysoce aktywne przeciwciała mogą nadawać odporność sterylizującą, ale na ogół mają wąski zakres ochrony, zapewniając odporność tylko na kilka wybranych szczepów wirusa grypy. Izolacja i charakterystyka szeroko reaktywnych przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają hemaglutyninę (HA), sugerują, że opracowanie uniwersalnej szczepionki przeciw grypie jest w zasięgu ręki2,3,4,5,6,7,8. Jednym z głównych celów uniwersalnej szczepionki przeciw grypie jest wywołanie silnej odpowiedzi przeciwciał w kierunku konserwatywnych regionów wirusa grypy9,10,11,12,13,14,15,16. Wykazano, że szeroko reaktywne przeciwciała, które rozpoznają te konserwatywne epitopy, składające się zarówno z przeciwciał neutralizujących, jak i nieneutralizujących17,18, wymagają interakcji Fc-FcγR w celu uzyskania optymalnej ochrony in vivo i podkreślają wkład odporności za pośrednictwem Fc w ogólną odpowiedź immunologiczną na wirusa grypy19,20.
Korelaty ochrony są kluczowe w ocenie odporności na infekcje. Wskaźniki te pozwalają naukowcom i klinicystom oszacować skuteczność szczepionek, znaczenie danych i przebieg leczenia. Jedynym ustalonym korelatem ochrony przed zakażeniem wirusem grypy jest test hamowania hemaglutynacji. Miano 1:40 wiąże się z 50% zmniejszeniem ryzyka choroby1,21 – i odzwierciedla obecność przeciwciał, które hamują aglutynację poprzez celowanie w miejsce wiązania receptora znajdujące się na głowie kulistej HA. Należy jednak również zauważyć, że odpowiedzi limfocytów T mogą być lepszym korelatem ochrony przed zakażeniem wirusem grypy u osób starszych. Co ciekawe, niedawny raport sugeruje, że aktywność hamująca neuraminidazę może być lepszym predyktorem odporności na grypę22. Na szczęście typowe testy in vitro, takie jak neutralizacja lub testy hamowania neuraminidazy, mogą mierzyć przeciwciała swoiste dla łodygi HA lub neuraminidazy. Większość z tych konwencjonalnych testów in vitro bierze jednak pod uwagę tylko funkcję regionu wiążącego antygen przeciwciała i nie mierzy roli regionu Fc. Ponadto nie wykrywa się udziału przeciwciał nieneutralizujących, które chronią poprzez zaangażowanie receptora Fc in vivo17,18. Aby zmierzyć ochronę zapewnianą przez przeciwciała, które indukują odporność za pośrednictwem Fc, taką jak cytotoksyczność komórkowa zależna od przeciwciał (ADCC), potrzebny jest solidny test in vitro.
Metoda opisana poniżej ocenia zdolność mysich przeciwciał monoklonalnych do indukowania funkcji za pośrednictwem Fc poprzez użycie genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej Jurkat wyrażającej aktywujący mysi typ 1 FcR, FcγRIV. Zaangażowanie przeciwciał w FcγR transdukuje sygnalizację wewnątrzkomórkową, która wyzwala czynnik jądrowy aktywowanej lucyferazy za pośrednictwem komórek T. Test ma kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi technikami, które wymagają izolacji i hodowli pierwszorzędowych komórek efektorowych oraz zastosowania cytometrii przepływowej do wykrywania aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc19,23,24,25,26. Po pierwsze, opisany tutaj protokół można łatwo dostosować do włączenia różnych celów wirusowych, FcγR i przeciwciał od różnych gatunków (ludzkich i mysich). Po drugie, zastosowanie zmodyfikowanej linii komórkowej Jurkat wyrażającej FcγR z genem reporterowym lucyferazy pod czynnikiem jądrowym aktywowanych limfocytów T (NFAT) pozwala na przeprowadzenie testu wielkoformatowego, który można łatwo analizować za pomocą czytnika płytek mierzącego luminescencję. W tym przypadku tradycyjna aktywacja pierwotnych komórek efektorowych zostaje zastąpiona indukcją lucyferazy NFAT po zaangażowaniu przeciwciała FcγR na powierzchni komórki Jurkata. Ten 96-dołkowy test w formacie płytki pozwala na pomiar do czterech różnych próbek w trzech egzemplarzach z siedmioma rozcieńczeniami – liczba próbek, która może być kłopotliwa przy użyciu tradycyjnych technik. W przypadku tego testu należy wziąć pod uwagę dodatkowe punkty, które mogą mieć wpływ na projekt eksperymentów i interpretację danych. Cel wirusa musi być wyrażony na powierzchni komórki w celu rozpoznania przeciwciał. Aby temu zapobiec, docelowy antygen (np. wewnętrzne białko wirusowe) może być bezpośrednio pokryty na powierzchni płytki. Nie zostało to jednak jeszcze rygorystycznie przetestowane. Dodatkowo, zmodyfikowana linia komórkowa Jurkat wyraża tylko jeden typ aktywującego FcγR i nie wyraża żadnych hamujących FcγR, podczas gdy pierwszorzędowe linie komórkowe wyrażają wszystkie receptory w kontekście fizjologicznym.
Wcześniej używaliśmy tego testu, aby wykazać, że specyficzność epitopów w kontekście poliklonalnym odgrywa kluczową rolę w regulacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc i że optymalna aktywacja zależnej od przeciwciała odpowiedzi komórkowej wymaga dwóch punktów kontaktu27,28. W tym miejscu opisujemy metodę, która ocenia zdolność przeciwciał monoklonalnych specyficznych dla łodygi do angażowania i aktywacji mysiego FcγRIV. Chociaż istnieją wyjątki29,30, duża liczba szeroko reaktywnych przeciwciał celuje w antygenowo konserwatywny region łodygi hemaglutyniny i tym samym odgrywa ważną rolę w rozwoju uniwersalnej szczepionki przeciw grypie.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty przedstawione w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnym kodeksem etycznym i regulacjami Icahn School of Medicine.
1. Ekspresja hemaglutyniny wirusa grypy poprzez transfekcję lub infekcję
Transfekcja:
- Umieścić komórki ludzkiej nerki embrionalnej (HEK 293T) o gęstości 2 x 104 komórek/basenik na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu białej kultury tkankowej i pozostawić na 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C (z 5% CO2 ).
- Komórki transfekcyjne ze 100 ng DNA kodującego hemaglutyninę wirusową i 0,2 μl odczynnika do transfekcji na studzienkę w całkowitej objętości 50 μL.
UWAGA: Zarówno odczynnik plazmidowy, jak i transfektancki rozcieńcza się w 1x pożywce o zmniejszonej zawartości surowicy Opti-Minimum Essential Media (MEM). - Po inkubacji płytek w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 18 godzin, usunąć pożywkę transfekcyjną.
2. Infekcja
- Płytka A549 lub komórki nerkowe psów Madina Darby'ego o gęstości 2 x 104 komórki/basenik na białej kulturze tkankowej na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu białej kultury tkankowej i rosnące przez co najmniej 18 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
- Rozcieńczyć wirusa w 1x MEM i zainfekować komórki przy wielokrotności infekcji 3, 1 lub 0,33 przez 1 godzinę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 . Całkowita objętość powinna wynosić 100 μL.
UWAGA: 10x MEM rozcieńcza się wodą, aby uzyskać 1x MEM zapas roboczy do rozcieńczenia wirusa, o którym mowa powyżej. - Po zakażeniu usunąć inokulum i dodać 100 μL 1x MEM do płytki w przypadku braku trypsyny.
- Hodować zakażone komórki przez 18 do 24 godzin w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 .
3. Ocena aktywacji aktywności lucyferazy za pośrednictwem FcRg/NFAT przez przeciwciała monoklonalne lub surowice
- Po pierwsze, zastąp pożywkę wzrostową transfekowanych lub zakażonych komórek 25 μl pożywki testowej (1x RPMI 1640 uzupełniony 4% (vol/vol) płodową surowicą bydlęcą o niskiej zawartości IgG).
- Na oddzielnej 96-dołkowej płytce przeprowadzić czterokrotne rozcieńczenie badanych przeciwciał, zaczynając od 30 μg/ml przy użyciu pożywki testowej. Wykonaj rozcieńczenia w trzech egzemplarzach, a przykładowy układ płytki jest zilustrowany na Rysunek 1A. Upewnij się, że dołączono kontrolę, która wyklucza przeciwciała (brak kontroli przeciwciał), a także kontrolę tła (sam bufor testowy).
UWAGA: Zarówno w przypadku "braku przeciwciał", jak i kontroli tła, zamiast przeciwciała dodać 25 μl buforu do oznaczania. - Przenieść 25 μl seryjnie rozcieńczonych przeciwciał z etapu 3.2 do odpowiednich studzienek na płytce transfekowanych komórek lub zakażonych komórek.
- Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C (z 5% CO2 ) przez 15 minut.
- Dodać 25 μl odpowiedniej zmodyfikowanej efektorowej komórki Jurkat eksprymującej mysi FcgRIV lub ludzką FcgRIIIa (75 000 komórek/dołek). Całkowita objętość dla każdej studzienki powinna wynosić 75 μl, a początkowe końcowe stężenie przeciwciała wynosi 10 μg/ml (Rysunek 1B).
UWAGA: Do kontroli tła dodaj 25 μl buforu testowego zamiast komórek efektorowych. Do zbadania fagocytozy komórkowej zależnej od przeciwciał można użyć zmodyfikowanej komórki Jurkat wyrażającej ludzką FcgRIIa. - Inkubować płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C z 5% CO2 przez 6 godzin.
- Przed użyciem rozmrozić i ogrzać bufor substratu lucyferazy w wodzie o temperaturze 37 °C przez około 1 godzinę.
UWAGA: Aby wytworzyć bufor substratu lucyferazy, należy rozpuścić liofilizowany substrat do oznaczania lucyferazy w dostarczonym buforze testowym. Odtworzony bufor substratu może być przechowywany w temperaturze od -30 °C do -10 °C przez okres do sześciu tygodni. - Dodać 75 μl / studzienkę buforu substratu lucyferazy do wszystkich studzienek z wyjątkiem kontroli w tle.
- Czytaj na luminometrze.
- Oblicz indukcję krotności za pomocą następującego równania: Indukcja krotności = (Wartość indukowana-Wartość tła) / (Brak wartości mAb-Wartość tła).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykazaliśmy, że mAb specyficzny dla trzonka, 6F12, a nie mAb specyficzny dla główki, PY102, był w stanie aktywować pierwotne komórki natural killer poprzez upregulację CD107a i interferonu γ19. Aby zamodelować zdolność przeciwciała specyficznego dla trzonka do aktywacji pierwotnych ludzkich komórek NK, pokazujemy, że mAb specyficzny dla trzonka, 6F12, może silnie aktywować zmodyfikowane komórki Jurkat wykazujące ekspresję mysiego FcγRIV, zwiększając aktywność około 14-krotnie. Z kolei mAb specyfic...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda pozwala użytkownikowi zmierzyć zdolność przeciwciała monoklonalnego swoistego dla HA do angażowania mysiego FcγRIV. Antygen docelowy, hemaglutynina wirusa grypy, ulega ekspresji na powierzchni komórek po zakażeniu wirusem lub transfekcji plazmidowego DNA. Test jest ponadto podatny na wykorzystanie różnych białek wirusowych o ekspresji powierzchniowej w połączeniu z innymi FcγR (ludzkimi lub mysimi). Dodatkowo wykorzystaliśmy próbki surowic do oceny zdolności przeciwciał w kontekście poliklonalnym do ...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ten projekt został częściowo sfinansowany z funduszy federalnych z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, na podstawie umowy CEIRS P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ogniwa A549 | ATCC | CCL-185 | Adenokoraksynomiczne ludzkie komórki podstawne nabłonka pęcherzyków płucnych |
| Komórki HEK 293T | ATCC | CRL-3216 | Ludzkie embrionalne komórki nerkowe |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668019 | Odczynnik do transfekcji |
| 1X Opti-MEM Zredukowana surowica | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| Biała kultura tkankowa traktowana 96-dołkową płytką | Corning, Inc. | 3917 | Płytki testowe |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Zestaw Jurkat z ekspresją mysich komórek FcgRIV | Promega | M1201 | zawiera komórki, system oznaczania lucyferazy Bio-Glo, 1X RPMI i surowicę o niskiej IgG Jurkat |
| ekspresją ludzkiej FcgRIIIa | Zestaw Promega | G7010 | zawiera komórki, system oznaczania lucyferazy Bio-Glo, 1X RPMI i surowicę |
| o niskiej zawartości IgGZestaw Jurkat | Promega | G9901 | komórki, system oznaczania lucyferazy Bio-Glo, 1X RPMI i luminometr surowicy o niskiej IgG |
| Czytnik | BioTek Synergy H1 Multi-Mode | Czytnik płytek luminescencyjnych | |
| Bio-Glo Lucyferazy Promega | G7940 | Zawiera bufor do oznaczania lucyferazy i substrat do oznaczania lucyferazy | |
| Komórki | nerkowe psów Madin DarbyATCC | CCL-34 | Komórki nerkowe psów |
Bibliografia
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al. Heterosubtypic neutralizing monoclonal antibodies cross-protective against H5N1 and H1N1 recovered from human IgM+ memory B cells. PloS One. 3 (12), e3942(2008).
- Ekiert, D. C., et al. Antibody recognition of a highly conserved influenza virus epitope. Science. 324 (5924), 246-251 (2009).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Tan, G. S., et al. A pan-H1 anti-hemagglutinin monoclonal antibody with potent broad-spectrum efficacy in vivo. J Virol. 86 (11), 6179-6188 (2012).
- Tan, G. S., et al. Characterization of a Broadly Neutralizing Monoclonal Antibody That Targets the Fusion Domain of Group 2 Influenza A Virus Hemagglutinin. J Virol. 88 (23), 13580-13592 (2014).
- Friesen, R. H. E., et al. A common solution to group 2 influenza virus neutralization. PNAS. 111 (1), 445-450 (2014).
- Dreyfus, C., et al. Highly Conserved Protective Epitopes on Influenza B Viruses. Science. 337 (6100), 1343-1348 (2012).
- Krammer, F., Palese, P., Steel, J. Advances in Universal Influenza Virus Vaccine Design and Antibody Mediated Therapies Based on Conserved Regions of the Hemagglutinin. Curr Top Microb and Immunol. , Chapter 408 (2014).
- Impagliazzo, A., et al. A stable trimeric influenza hemagglutinin stem as a broadly protective immunogen. Science. , (2015).
- Nachbagauer, R., Krammer, F. Clinical Microbiology and Infection. Clin Microb Infect. , 1-7 (2017).
- Krammer, F. Novel universal influenza virus vaccine approaches. Current opinion in virology. 17, 95(2016).
- Steel, J., et al. Influenza virus vaccine based on the conserved hemagglutinin stalk domain. mBio. 1 (1), (2010).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Margine, I., Palese, P. Chimeric hemagglutinin influenza virus vaccine constructs elicit broadly protective stalk-specific antibodies. J Virol. 87 (12), 6542-6550 (2013).
- Krammer, F., Pica, N., Hai, R., Tan, G. S., Palese, P. Hemagglutinin Stalk-Reactive Antibodies Are Boosted following Sequential Infection with Seasonal and Pandemic H1N1 Influenza Virus in Mice. J Virol. 86 (19), 10302-10307 (2012).
- Hai, R., et al. Influenza viruses expressing chimeric hemagglutinins: globular head and stalk domains derived from different subtypes. J Virol. 86 (10), 5774-5781 (2012).
- Dunand, C. J. H., et al. Both Neutralizing and Non-Neutralizing Human H7N9 Influenza Vaccine-Induced Monoclonal Antibodies Confer Protection. Cell Host and Microbe. 19 (6), 800-813 (2016).
- Tan, G. S., et al. Broadly-Reactive Neutralizing and Non-neutralizing Antibodies Directed against the H7 Influenza Virus Hemagglutinin Reveal Divergent Mechanisms of Protection. PLoS Path. 12 (4), e1005578(2016).
- DiLillo, D. J., Tan, G. S., Palese, P., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing hemagglutinin stalk-specific antibodies require FcγR interactions for protection against influenza virus in vivo. Nat Med. 20 (2), 143-151 (2014).
- DiLillo, D. J., Palese, P., Wilson, P. C., Ravetch, J. V. Broadly neutralizing anti-influenza antibodies require Fc receptor engagement for in vivo protection. J Clin Invest. 126 (2), 605-610 (2016).
- Potter, C. W., Oxford, J. S. Determinants of immunity to influenza infection in man. Brit Med Bull. 35 (1), 69-75 (1979).
- Memoli, M. J., et al. Evaluation of Antihemagglutinin and Antineuraminidase Antibodies as Correlates of Protection in an Influenza A/H1N1 Virus Healthy Human Challenge Model. mBio. 7 (2), e00417(2016).
- Jegaskanda, S., et al. Age-associated cross-reactive antibody-dependent cellular cytotoxicity toward 2009 pandemic influenza A virus subtype H1N1. J Infect Dis. 208 (7), 1051-1061 (2013).
- Jegaskanda, S., et al. Cross-Reactive Influenza-Specific Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Antibodies in the Absence of Neutralizing Antibodies. J Immunol. 190 (4), 1837-1848 (2013).
- Jegaskanda, S., Wheatley, A. K., Kent, S. J. ScienceDirectAntibody-dependent cellular cytotoxicity and influenza virus. Curr Opin Virol. 22 (C), 89-96 (2017).
- Srivastava, V., et al. Identification of Dominant Antibody-Dependent Cell-Mediated Cytotoxicity Epitopes on the Hemagglutinin Antigen of Pandemic H1N1 Influenza Virus. J Virol. 87 (10), 5831-5840 (2013).
- He, W., et al. Epitope specificity plays a critical role in regulating antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity against influenza A virus. PNAS. 113 (42), 11931-11936 (2016).
- Leon, P. E., et al. Optimal activation of Fc-mediated effector functions by influenza virus hemagglutinin antibodies requires two points of contact. PNAS. , 201613225(2016).
- Benjamin, E., et al. A Broadly Neutralizing Human Monoclonal Antibody Directed against a Novel Conserved Epitope on the Influenza Virus H3 Hemagglutinin Globular Head. J Virol. 88 (12), 6743-6750 (2014).
- Ekiert, D. C., Kashyap, A. K., et al. Cross-neutralization of influenza A viruses mediated by a single antibody loop. Nature. 488 (7417), 526-532 (2013).
- He, W., et al. Broadly Neutralizing Anti-Influenza Virus Antibodies: Enhancement of Neutralizing Potency in Polyclonal Mixtures and IgA Backbones. J Virol. 89 (7), 3610(2015).
- Kristensen, A. B., et al. Antibody Responses with Fc-Mediated Functions after Vaccination of HIV-Infected Subjects with Trivalent Influenza Vaccine. J Virol. 90 (12), 5724-5734 (2016).
- Greenberg, S. B., Criswell, B. S., Six, H. R., Couch, R. B. Lymphocyte cytotoxicity to influenza virus-infected cells. II. Requirement for antibody and non-T lymphocytes. J Immunol (Baltimore, Md. : 1950). 119 (6), 2100-2106 (1977).
- Corrales-Aguilar, E., Trilling, M., et al. A novel assay for detecting virus-specific antibodies triggering activation of Fcγ receptors. J Immunol Meth. 387 (1-2), 21-35 (2013).
- de Vries, R. D., et al. Influenza virus-specific antibody dependent cellular cytoxicity induced by vaccination or natural infection. Vaccine. 35 (2), 238-247 (2017).
- Cheng, Z., et al. Development of a robust reporter-based ADCC assay with frozen, thaw-and-use cells to measure Fc effector function of therapeutic antibodies. J Immunol Meth. 414 (1), 69-81 (2014).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
