Opisujemy metodę pomiaru aktywacji funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc przez przeciwciała skierowane przeciwko hemaglutyniny wirusa grypy. Test ten można również dostosować do oceny zdolności przeciwciał monoklonalnych lub surowic poliklonalnych ukierunkowanych na inne glikoproteiny powierzchniowe wirusa do indukowania odporności zależnej od Fc.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Metoda oceny funkcji efektorowych za pośrednictwem Fc indukowanych przez przeciwciała specyficzne dla hemaglutyniny grypy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Przeciwciała odgrywają kluczową rolę w łączeniu wrodzonych i adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych przeciwko patogenom wirusowym poprzez ich domeny wiążące antygen i regiony Fc. W tym miejscu opisujemy, jak mierzyć aktywację funkcji efektorowych Fc przez przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko hemaglutyninę wirusa grypy przy użyciu genetycznie zmodyfikowanej linii komórkowej Jurkat wyrażającej aktywujący typ 1 Fc-FcγR. Za pomocą tej metody można określić udział specyficznych interakcji Fc-FcγR nadawanych przez immunoglobuliny za pomocą testu in vitro.
Wprowadzenie
Odporność zapewniana przez szczepionkę przeciwko grypie sezonowej była tradycyjnie oceniana za pomocą testu hamowania hemaglutynacji (HI)1, który mierzy obecność przeciwciał celujących w miejsce wiązania receptora hemaglutyniny. Te wysoce aktywne przeciwciała mogą nadawać odporność sterylizującą, ale na ogół mają wąski zakres ochrony, zapewniając odporność tylko na kilka wybranych szczepów wirusa grypy. Izolacja i charakterystyka szeroko reaktywnych przeciwciał monoklonalnych, które rozpoznają hemaglutyninę (HA), sugerują, że opracowanie uniwersalnej szczepionki przeciw grypie jest w zasięgu ręki2,
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Eksperymenty przedstawione w tym manuskrypcie zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnym kodeksem etycznym i regulacjami Icahn School of Medicine.
1. Ekspresja hemaglutyniny wirusa grypy poprzez transfekcję lub infekcję
Transfekcja:
- Umieścić komórki ludzkiej nerki embrionalnej (HEK 293T) o gęstości 2 x 104 komórek/basenik na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu białej kultury tkankowej i pozostawić na 4 godziny w inkubatorze o temperaturze 37 °C (z 5% CO2 ).
- Komórki transfekcyjne ze 100 ng DNA kodującego hemaglutyninę wirusową i....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Wykazaliśmy, że mAb specyficzny dla trzonka, 6F12, a nie mAb specyficzny dla główki, PY102, był w stanie aktywować pierwotne komórki natural killer poprzez upregulację CD107a i interferonu γ19. Aby zamodelować zdolność przeciwciała specyficznego dla trzonka do aktywacji pierwotnych ludzkich komórek NK, pokazujemy, że mAb specyficzny dla trzonka, 6F12, może silnie aktywować zmodyfikowane komórki Jurkat wykazujące ekspresję mysiego FcγRIV, zwiększając aktywność około 14-krotnie. Z kolei mAb specyfic.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisana tutaj metoda pozwala użytkownikowi zmierzyć zdolność przeciwciała monoklonalnego swoistego dla HA do angażowania mysiego FcγRIV. Antygen docelowy, hemaglutynina wirusa grypy, ulega ekspresji na powierzchni komórek po zakażeniu wirusem lub transfekcji plazmidowego DNA. Test jest ponadto podatny na wykorzystanie różnych białek wirusowych o ekspresji powierzchniowej w połączeniu z innymi FcγR (ludzkimi lub mysimi). Dodatkowo wykorzystaliśmy próbki surowic do oceny zdolności przeciwciał w kontekście poliklonalnym do .......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.
Podziękowania
Ten projekt został częściowo sfinansowany z funduszy federalnych z National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, Department of Health and Human Services, na podstawie umowy CEIRS P01AI097092-04S1 (P.E.L.).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Ogniwa A549 | ATCC | CCL-185 | Adenokoraksynomiczne ludzkie komórki podstawne nabłonka pęcherzyków płucnych |
| Komórki HEK 293T | ATCC | CRL-3216 | Ludzkie embrionalne komórki nerkowe |
| Lipofectamina 2000 | Life Technologies | 11668019 | Odczynnik do transfekcji |
| 1X Opti-MEM Zredukowana surowica | ThermoFisher Scientific | 51985-034 | |
| Biała kultura tkankowa traktowana 96-dołkową płytką | Corning, Inc. | 3917 | Płytki testowe |
| 10X MEM | Gibco | 11430-030 | |
| Zestaw Jurkat z ekspresją mysich komórek FcgRIV | Promega | M1201 | zawiera komórki, system oznaczania lucyferazy Bio-Glo, 1X RPMI i surowicę o niskiej IgG Jurkat |
| ekspresją ludzkiej FcgRIIIa | Zestaw Promega | G7010 | zawiera komórki, system oznaczania lucyferazy Bio-Glo, 1X RPMI i surowicę |
| o niskiej zawartości IgGZestaw Jurkat | Promega | G9901 | komórki, system oznaczania lucyferazy Bio-Glo, 1X RPMI i luminometr surowicy o niskiej IgG |
| Czytnik | BioTek Synergy H1 Multi-Mode | Czytnik płytek luminescencyjnych | |
| Bio-Glo Lucyferazy Promega | G7940 | Zawiera bufor do oznaczania lucyferazy i substrat do oznaczania lucyferazy | |
| Komórki | nerkowe psów Madin DarbyATCC | CCL-34 | Komórki nerkowe psów |
Bibliografia
- Hobson, D., Curry, R. L., Beare, A. S., Ward-Gardner, A. The role of serum haemagglutination-inhibiting antibody in protection against challenge infection with influenza A2 and B viruses. J Hygiene. 70 (04), 767-777 (1972).
- Throsby, M., et al.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
