Prądy całokomórkowe wywołane przez zaciągnięcie GABA w wycinkach mózgu

Podsumowanie

Opisujemy technikę zaciągania się, za pomocą której odczynniki farmakologiczne mogą być podawane podczas rejestracji krostek na całe komórki, i podkreślamy różne aspekty cech, które są kluczowe dla jej sukcesu.

Streszczenie

Podawanie farmakologiczne jest powszechnie stosowane podczas prowadzenia rejestracji krostek na całe komórki w wycinkach mózgu. Jedną z najlepszych metod aplikacji leków podczas zapisu elektrofizjologicznego jest technika zaciągnięcia, która może być wykorzystana do badania wpływu odczynników farmakologicznych na aktywność neuronów w wycinkach mózgu. Największą zaletą zaciągania się jest to, że stężenie leku wokół miejsca rejestracji gwałtownie wzrasta, zapobiegając w ten sposób odczuleniu receptorów błonowych. Skuteczne zastosowanie aplikacji zaciągnięcia się wymaga zwrócenia szczególnej uwagi na następujące elementy: stężenie leku, parametry mikropipety zaciągającej się, odległość między końcówką mikropipety zaciągającej się a zarejestrowanym neuronem oraz czas trwania i ciśnienie napędzające zaciągnięcie (funty na cal kwadratowy, psi). W tym artykule opisano krok po kroku procedurę rejestrowania prądów całych komórek wywołanych przez wdychanie kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) na neuron wycinka kory przedczołowej. Warto zauważyć, że tę samą procedurę można zastosować z niewielkimi modyfikacjami w innych obszarach mózgu, takich jak hipokamp i prążkowie, oraz w różnych preparatach, takich jak hodowle komórkowe.

Wprowadzenie

Technika patch-clamp, podstawowe narzędzie do badania sygnałów elektrycznych w neuronach, została opracowana w latach siedemdziesiątych^1,2. Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarcza wiedzy na temat tego, w jaki sposób określone terapie (np. farmakologiczne) mogą zmieniać funkcje neuronów lub kanały w czasie rzeczywistym³. Farmakologiczna ocena funkcji neuronów podczas zapisu całej komórki w wycinku mózgu wymaga zastosowania leków, takich jak agoniści lub antagoniści określonych receptorów, do rejestrowanych neuronów. Metoda ta pozwala na identyfikację zmian neuronalnych, które zachodzą po zastosowaniu określonego leku, prowadząc w ten sposób do lepszego zrozumienia fizjologicznych i patologicznych właściwości neuronów⁴. Chociaż podawanie farmakologiczne może być prowadzone za pomocą perfuzji⁵ lub puff⁶, ta druga technika jest lepsza. W szczególności: (i) zaciągnięcie się szybko zwiększa stężenie leku wokół zarejestrowanego neuronu do poziomu, który zapobiega odczulaniu receptorów błonowych; (ii) objętość wstrzykiwanego leku jest bardzo mała, tak że wpływ na roztwór do kąpieli jest niewielki, co w związku z tym zmniejsza wszelkie niepożądane skutki podawanych substancji chemicznych na wycinki mózgu; (iii) Protokół Puff można ustawić i zapisać, dzięki czemu eksperyment jest bardzo precyzyjnie powtarzalny; (iv) Stosowanie zaciągania się stanowi ekonomiczne stosowanie agonistów/antagonistów, szczególnie w przypadku, gdy takie odczynniki są drogie lub trudne do uzyskania.

Tutaj skupimy się na rejestrowaniu prądów całokomórkowych indukowanych przez zaciąganie GABA w starannie przygotowanych wycinkach mózgu, preparacji, która ma tę zaletę, że ma stosunkowo dobrze zachowane obwody mózgowe. W tym artykule opiszemy, w jaki sposób przeprowadzamy prądy hamujące wywołane zaciągnięciem⁷. Stosując wewnętrzne roztwory oparte na cezie (Cs⁺) i utrzymując neurony na poziomie 0 mV, wprowadzimy hamujące prądy postsynaptyczne wywołane GABA-puff (eIPSC) z odpowiednimi szczegółami technicznymi. Korzystając z mysiego modelu depresji wywołanej wstrzyknięciem lipopolisacharydu (LPS) ⁸, pokazujemy, że amplituda eIPSC wywołana przez zaciągnięcie GABA jest znacznie zmniejszona w plasterkach myszy z wstrzyknięciem LPS w porównaniu z kontrolami nośnika. Naszą intencją jest, aby ten artykuł pokazał, w jaki sposób technika zaciągania się jest szeroko stosowana w badaniach mających na celu ocenę wpływu wszelkich chemikaliów, związków lub leków na aktywność neuronalną w wycinkach mózgu.

Protokół

Trzymanie zwierząt i wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z procedurami zatwierdzonymi przez Komitet Etyki ds. Badań na Zwierzętach na Uniwersytecie Normalnym Południowych Chin, zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami ustanowionymi przez Narodowy Instytut Zdrowia.

1. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 500 ml standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego składniki opisane w naszym opublikowanym work⁷, jak wymieniono w Tabeli 1.
   1. Użyj czystych szklanych zlewek z wodą dejonizowaną, aby przygotować świeży roztwór ACSF. Wyczyść szpatułki wodą dejonizowaną i wysusz przed użyciem, aby dodać NaCl, KCl, NaH₂PO₄, NaHCO₃, MgSO₄, D-glukozę i dodać CaCl₂ po bąbelkowaniu roztworu mieszaniną 95% O₂ / 5% CO₂ przez ~ 20 minut (jak wyszczególniono w Tabeli 1) do 500 ml wody dejonizowanej. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
   2. Upewnij się, że ACSF jest całkowicie przezroczysty bez żadnych opadów. Następnie dostosuj pH do 7,2-7,4. Bąbelek z mieszaniną gazów o składzie 95%_O2 i 5% CO₂ przez ~20 min.
2. Przygotować 250 ml roztworu do krojenia plastrów zawierającego substancje chemiczne⁷ opisane w Tabeli 2.
   1. Dodać KCl, MgCl₂, NaH₂PO₄, NaHCO₃, cholinę ·Cl, D-glukozę i dodać CaCl₂ na końcu, jak wskazano w 1.1.1, do 250 ml wody dejonizowanej i rozpuścić zgodnie z opisem w 1.1.1 i 1.1.2.
   2. Po bulgotaniu 95% O₂/5% CO_{2 umieścić} roztwór w zamrażarce na 15-20 minut, aby roztwór do krojenia stał się lodowaty i częściowo zamrożony.
      UWAGA: Używamy tego roztworu do krojenia podczas robienia plastrów z 1-2 miesięcznych myszy; Formuła może się różnić w przypadku myszy starszych niż 2 miesiące.
   3. Przygotować roztwór LPS, rozpuszczając go w sterylnej, wolnej od endotoksyn soli fizjologicznej (0,9% NaCl). LPS podaje się dootrzewnowo (0,5 mg/kg) i rozpoczyna zapis po 2 godzinach.

2. Przygotowanie warstwy kory przedczołowej

1. Wyjmij roztwór do krojenia z zamrażarki i homogenizuj, aby uzyskać błoto pośniegowe. Umieść roztwór na lodzie i stale bąbelkuj 95% O₂/5% CO_{2 .}
2. Używając dużych, ostrych nożyczek, szybko odetnij głowę myszy zgodnie z opisem⁹ i natychmiast włóż głowę do zlewki wypełnionej lodowatym (0-4°C) roztworem do cięcia.
3. Przetnij górną część czaszki wzdłuż linii środkowej w kierunku od ogona do nosa cienkimi nożyczkami i usuń boczne części czaszki. Usuń mózg cienką szpatułką i wrzuć do lodowatego roztworu do cięcia.
   UWAGA: Kroki 2.2-2.3 należy wykonać szybko (najlepiej < 1 minutę).
4. Umieść mózg na pokrywie 9-centymetrowej szalki Petriego wypełnionej lodem. Opłucz mózg lodowatym roztworem do cięcia. Odetnij móżdżek i opuszkę węchową żyletką.
5. Nałóż klej cyjanoakrylowy na uchwyt próbki wibratomu. Ostrożnie umieść blok mózgu na kropli kleju, rostralną stroną do góry i natychmiast zanurz w lodowatym roztworze do cięcia.
6. Ustaw uchwyt ostrza wibratomu pod kątem 15° w stosunku do płaszczyzny poziomej i przygotuj 350-μm koronalne wycinki mózgu (częstotliwość wibracji ostrza = 85 Hz, prędkość = 0,1 mm/s).
7. Za pomocą pipety przenieść plastry do komory odzysku wypełnionej ACSF, inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) przy stałym bulgotaniu 95% O₂/5% CO_{2 .}

3. Nagrywanie całej komórki

1. Szklane mikropipety borokrzemianowe należy wykonać do użytku jako elektrody rejestrujące lub mikropipety do zaciągania się zgodnie ze szczegółowymi wytycznymi zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza. Do rejestracji elektrod rezystancje końcówek mieszczą się w zakresie 4-6 MΩ, natomiast mikropipety zaciągowe mają średnice końcówek w zakresie 2-5 μm.
2. Dodać bloker kanału Na⁺ (TTX, 1 μM), aby zablokować szybki kanał Na⁺, a tym samym potencjały czynnościowe, do ACSF i utrzymać stałe natężenie przepływu tego roztworu na poziomie 2-3 ml/min w komorze rejestracyjnej, poprzez pompę perystaltyczną do komory i zasysanie z niej. Stale bąbelkować ACSF 95% O₂/5% CO₂, aby zapewnić żywotność plastrów.
3. Przenieś wycinek mózgu do komory nagraniowej za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura, której cienka końcówka została przycięta tak, aby pasowała do rozmiaru wycinka. Przykryj plasterek platynową kotwą z równoległymi nylonowymi nitkami w odstępach ≥2 mm, aby utrzymać plasterek na platformie.
4. Napełnić mikropipetę rejestrującą roztworem wewnętrznym⁷ (Tabela 3), a następnie napełnić mikropipety zaciągnięte GABA o stężeniach 10 μM, 50 μM i 100 μM (rozpuszczonych w ACSF) lub ACSF jako kontrola nośnika.
5. Aby zapobiec zablokowaniu przez zanieczyszczenia, przed zanurzeniem elektrody rejestrującej w ACSF należy zastosować lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Za pomocą mikromanipulatora pod mikroskopem (soczewka obiektywu 4x) ustaw elektrodę rejestrującą i mikropipetę zaciągania się tak, aby końcówki pojawiły się w środku obrazu wideo na monitorze (Rysunek 1A).
6. Wyreguluj ostrość mikroskopu (soczewka obiektywu 40x), stopniowo obniżając mikropipetę puff i umieść ją nad neuronem rejestrującym pod kątem 45°. Utrzymuj odległość między końcówką mikropipety do zaciągania się a neuronem zapisaną w granicach 20-40 μm (Rysunek 1B). Powoli i ostrożnie zbliż się do neuronu z elektrodą rejestrującą, a następnie zwolnij nadciśnienie. Zastosuj słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu elektrody, aby uzyskać uszczelnienie giga-omowe.
7. Utrzymuj napięcie na poziomie 0 mV. Po utworzeniu uszczelki giga-omowej należy skompensować szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Następnie zastosuj krótkie i mocne ssanie przez wspomniane powyżej rurki, aby przejść w tryb całej komórki.
8. Nagrywaj eIPSC w trybie cęgów napięciowych. Zastosuj niskie ciśnienie gazu (azot, 4 - 6 psi) do mikropipety puff za pomocą Picospritzera sterowanego przez generator krokowy napięcia Master 8, aby dostarczyć pojedyncze lub sparowane zaciągnięcia GABA (Rysunek 2).
9. Zmień czas trwania zaciągnięcia, aby uzyskać najlepsze wyniki eIPSC (Rysunek 3) i zmierz eIPSC w modelu depresji wywołanej LPS ( Rysunek 4).

Wyniki

Technika zaciągania się pozwala badaczom badać wpływ leków na poszczególne receptory na powierzchni danego neuronu. W tym artykule skupimy się na prądach, w których pośredniczą receptory GABA. Rysunek 1 pokazuje zaciągnięcie i rejestrację mikropipet. Aby wyeliminować jakikolwiek wpływ na zarejestrowane neurony ciśnienia fizycznego generowanego przez zaciągnięcie, ACSF i zaciągnięcia sacharozy (Rysunek 2A) są używane jako k...

Dyskusja

Aplikacja Puff jest szeroko stosowana do oceny funkcji receptora postsynaptycznego ^3,4,7, ale wymaga precyzyjnej kontroli w każdym eksperymencie. Opisujemy tutaj procedurę polegającą na zaciskaniu łat na całych komórkach, która demonstruje IPSC indukowane przez GABA (tj. eIPSC) w wycinkach mózgu kory przedczołowej. Rezystancja elektrody rejestrującej wynosi około 5 MΩ, natomiast średnica końcówki mikropipet puffowych wynosi okoł...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szklane mikropipety borokrzemianowe	Instrumenty migawkowe	BF150-86-10	Średnica zewnętrzna 1,50 mm; Średnica wewnętrzna 0,86 mm
Ściągacz do mikropipet	Instrumenty żaluzjowe	MODEL P-97	Ściągacz do mikropipet płonących/brwiowych
Mikromanipulatory	Przyrządy migawkowe	MP-285
Wzmacniacz sterowany komputerowo	Urządzenia molekularne	Multiclamp 700B
Cyfrowy system akwizycji	Urządzenia molekularne	Digidata 1440A Kamera
do obrazowania Nikon		2115001	Aparatura inspekcyjna
Mikroskopia	Nikon	Zaćmienie FN1
Mistrz 8	A.M.P.I.		pulsu Master-8
Krajalnica wibratomowa	Leica	VT 1000S
Żyletka	Gillette	74-S	FLYING EAGLE
Monitor wideo	Panasonic	WV-BM 1410
502 Klej	Deli	7146	Klej cyjanoakrylowy Pompa
perystaltyczna	Shanghai JIA PENG Corporation	BT100-1F
Kamera wideo	Olympus America Medical	OLY-150
Pipety transferowe	Biologix	30-0138A1