Artykuł metodologiczny

Badanie in vivo Dwukolorowa metoda obrazowania dynamiki naczyń krwionośnych po kontuzyjnym urazie rdzenia kręgowego

12.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56565

⸱

31 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Spinal Cord and Brain Injury Research Group, Stark Neurosciences Research Institute, and Department of Neurological Surgery, Indiana University School of Medicine, 2Program in Medical Neuroscience, Stark Neurosciences Research Institute, Indiana University School of Medicine, 3Norton Neuroscience Institute, Norton Healthcare, 4Department of Human Anatomy & Histoembryology, School of Basic Medical Sciences, Fudan University, 5Department of Neurological Surgery, University of Louisville School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Wprowadzamy metodę obrazowania in vivo przy użyciu dwóch różnych barwników fluorescencyjnych do śledzenia dynamicznych zmian naczyniowych kręgosłupa po kontuzji rdzenia kręgowego u dorosłych szczurów Sprague-Dawley.

Streszczenie

Uraz rdzenia kręgowego (SCI) powoduje znaczne zakłócenia naczyń krwionośnych w miejscu urazu. Patologia naczyniowa występuje natychmiast po SCI i trwa przez całą fazę ostrego urazu. W rzeczywistości komórki śródbłonka wydają się być pierwszymi, które umierają po stłuczonym SCI. Wczesne zdarzenia naczyniowe, w tym zwiększona przepuszczalność bariery krew-rdzeń kręgowy (BSCB), wywołują obrzęk naczyniopochodny i przyczyniają się do szkodliwych wtórnych urazów spowodowanych złożonymi mechanizmami urazów. Ukierunkowanie na zaburzenia naczyniowe może być zatem kluczową strategią zmniejszania kaskad wtórnych urazów, które przyczyniają się do upośledzenia histologicznego i funkcjonalnego po SCI. Wcześniejsze badania były prowadzone głównie na próbkach pośmiertnych i nie były w stanie uchwycić dynamicznych zmian sieci naczyniowej. W tym badaniu opracowaliśmy metodę dwukolorowego obrazowania dwufotonowego in vivo w celu monitorowania ostrych zmian dynamicznych naczyń krwionośnych po stłuczonym SCI. Takie podejście pozwala na wykrycie przepływu krwi, średnicy naczyń i innych patologii naczyniowych w różnych miejscach tego samego szczura przed i po urazie. Ogólnie rzecz biorąc, metoda ta stanowi doskonałe miejsce do badania dynamiki naczyń krwionośnych.

Wprowadzenie

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI) jest częstym urazem prowadzącym do upośledzenia funkcji motorycznej, czuciowej i autonomicznej. Według National Spinal Cord Injury Statistical Center (NSCISC) w 2016 roku około 282 000 osób zostało dotkniętych tym problemem, a 69% z nich było głównie spowodowanych wypadkami drogowymi lub upadkami1. Pacjenci ci często wymagają intensywnej terapii; Jednak obecnie nie jest dostępne żadne skuteczne leczenie. W związku z tym pilnie potrzebne są nowe, skuteczne strategie na rzecz inicjatywy dotyczącej łańcucha dostaw.

SCI dzieli się głównie na dwie fazy: uraz pierwotny i uraz wtórny. Pierwotny uraz składa się z fizycznego uszkodzenia powodującego krwotoczną martwicę w miejscu uderzenia2, po którym następuje seria wtórnych zdarzeń urazowych, takich jak zapalenie, apoptoza komórek i demielinizacja pozostałych aksonów, które stopniowo prowadzą do ekspansji deficytów morfologicznych i funkcjonalnych3,4,5,6. Krwotok jest pierwszą widoczną oznaką urazu, wskazującą na natychmiastowe zaburzenie naczyń krwionośnych w ostrej fazie SCI7,8. Strategia neuroprotekcyjna mająca na celu zmniejszenie wczesnych uszkodzeń naczyń krwionośnych może poprawić powrót pacjentów do zdrowia, ale wymaga to lepszego zrozumienia patofizjologicznego mechanizmu wczesnych pourazowych zdarzeń naczyniowych.

Pomimo wcześniejszych badań wykorzystujących różne metody do badania unaczynienia rdzenia kręgowego, nadal istnieją znaczne ograniczenia. Najbardziej powszechną wadą jest badanie tylko próbek pośmiertnych, na przykład klirens wodorowy9, autoradiographia10, microangiogram8, odlewy korozji naczyniowej11 i immunohistochemistry12,13. Chociaż laserowa przepływomierz dopplerowska zapewnia nieinwazyjne monitorowanie przepływu krwi w rdzeniu kręgowym w czasie rzeczywistym14, nie jest w stanie rozróżnić układów naczyniowych i wykryć zmian morfologicznych naczyń. Dynamiczny rezonans magnetyczny ze wzmocnionym kontrastem (DCE-MRI) jest również nieinwazyjny, ale generuje obrazy o niskiej rozdzielczości i wymaga kosztownej infrastruktury15.

Chociaż obrazowanie in vivo za pomocą 2-fotonowej laserowej mikroskopii skaningowej (2P-LSM) zostało opracowane do badania wazodynamiki w korze mózgowej16,17,18, ograniczona liczba badań wykazała zmiany naczyniowe po SCI. Tang i wsp. wykazali zmiany w przepływie krwi na krawędzi miejsca zmiany w modelu hemisekcji19, ale obrazowanie po kontuzji jest trudniejsze z dwóch powodów. Po pierwsze, tradycyjne szklane okienko optyczne nad miejscem urazu nie wytrzymałoby uderzeń mechanicznych i pozostałoby funkcjonalne do obrazowania. Po drugie, wyciek znacznika do miąższu z powodu krwotoku stwarza trudności w obrazowaniu po urazie.

Tutaj prezentujemy nowatorską metodę obrazowania dwukolorowego, która pozwala na obrazowanie tych samych pojedynczych naczyń w punktach czasowych przed i po urazie. Ponadto zapewnia czasowo-przestrzenny profil dynamicznych zmian naczyniowych po stłuczonym rdzeniu kręgowym. Ma również potencjał do obrazowania w wielu punktach czasowych po urazie. Protokół ten można bezpośrednio zastosować do zwierząt transgenicznych w celu zbadania interakcji nerwowo-naczyniowych.

Protokół

Wszystkie procedury chirurgiczne i związane ze zwierzętami zostały wykonane zgodnie z Przewodnikiem po opiece i użytkowaniu zwierząt laboratoryjnych (National Research Council) oraz wytycznymi Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie chirurgiczne

  1. Wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne, w tym stabilizator kręgosłupa. Oczyść stół chirurgiczny i całe otoczenie 70% etanolem. W celu przygotowania zabiegu chirurgicznego, który nie daje szansy na przeżycie, umieść czystą podkładkę chirurgiczną na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C.
  2. Do tego badania wykorzystano sześciotygodniowego szczura Sprague Dawley (SD). Zważyć i znieczulić szczura za pomocą dootrzewnowego wstrzyknięcia mieszaniny ketaminy (87,7 mg/kg) i ksylazyny (12,3 mg/kg). Potwierdź prawidłowy etap znieczulenia, gdy zwierzę przestaje reagować na bodziec szczypania palca. Przed zabiegiem należy wstrzyknąć podskórnie 0,01-0,05 mg/kg buprenorfiny i 5 mg/kg karprofenu.
  3. Ogol szczura w 2 obszarach: okolicy kręgosłupa szyjnego na grzbiecie i okolicy szyi po stronie piersi. Przetrzyj obszary skóry peelingiem chirurgicznym betadine i chusteczkami nasączonymi 70% alkoholem. Nałóż maść do oczu, aby zapobiec suchości oka podczas zabiegu. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na czystej podkładce chirurgicznej.

2. Cewnikowanie żyły szyjnej zewnętrznej

  1. Zlokalizuj żyłę szyjną zewnętrzną, znajdując punkt tętna w pobliżu obojczyka i przetnij parą małych nożyczek sprężynowych, aby wykonać pionowe nacięcie w miejscu, które jest punktem krzyżowym 3 punktów anatomicznych: ramus ogonowy prawej żuchwy, większy guzek kości ramiennej i manubrium (Ryc. 1A). Odizoluj naczynie za pomocą nożyczek sprężynowych i drobnych kleszczy. Zawiąż dystalny koniec za pomocą 1 sterylnej linii szwów chirurgicznych ( Rysunek 1C) < klasa sup = "xref">20.
  2. Przygotuj jedną strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną solą fizjologiczną i połączoną ze specjalistycznym cewnikiem wykonanym z igły o rozmiarze 21 (Ryc. 1B). Wykonaj małe nacięcie za pomocą mikronożyczek na naczyniu i wsuń cewnik do naczynia.
    1. Zabezpiecz igłę, wiążąc zarówno proksymalny, jak i dystalny koniec (Rysunek 1C). Specjalistyczny cewnik wykonany jest z igły o rozmiarze 21. Zeszlifuj końcówkę na płasko i przyspawaj 2-milimetrowym kawałkiem końcówki odciętym od innej igły o rozmiarze 21. Może to zapobiec wysuwaniu się cewnika na zewnątrz.
      nuta: Niewielka ilość krwi wpływająca do igły wskazuje, że igła pomyślnie weszła do naczynia krwionośnego.

3. Stabilizacja kręgosłupa i laminektomia C5-C7

  1. Ułóż zwierzę w pozycji leżącej. Przetnij skórę wzdłuż linii środkowej ostrzem skalpela nr 15 na żądanych poziomach kręgosłupa. Wypreparuj warstwy mięśni od 5 do 7 kręgu szyjnego (C5-C7) obustronnie, aby odsłonić boczne fasety (Rysunek 2A)21.
    nuta: Zlokalizuj drugi kręg piersiowy (T2), znajdując kolec między łopatkami. Policz w górę od kręgu T2, aby znaleźć kręg C721,22,23,24.
  2. Ustabilizuj kręgosłup szczura za pomocą zmodyfikowanego aparatu stabilizującego. Wykonaj szczelinę po obu stronach bocznej kości kręgowej. Wsuń ramiona ze stali nierdzewnej pod odsłonięte poprzeczne fasety procesu i dokręć, aby zapewnić stabilność (Rysunek 2B).
  3. Ostrożnie usuń blaszki C5-C7 (laminektomia, Rysunek 2C).
  4. Umieść mały kawałek nasączonej solą fizjologiczną pianki żelowej na odsłoniętej oponie twardej, aby utrzymać ją nawilżoną (Rysunek 2D).

4. Instalacja okna obrazowania dwufotonowego (2P)

  1. Wepchnij małe kawałki pianki żelowej w szczelinę między mięśniami a kośćmi kręgów, a także umieść cienką linię pianki żelowej między rdzeniem kręgowym a kośćmi kręgowymi, a następnie użyj kleju do tkanek, aby uszczelnić otaczający obszar mięśni i kości. Odczekaj 5 minut do całkowitego wyschnięcia (Rysunek 2E).
    nuta: Ten krok skutecznie zapobiega przyszłemu wyciekaniu do okna i nieszczelności roztworów zanurzeniowych.
  2. Przygotuj 4% agar z ddH2O w kuchence mikrofalowej. Po całkowitym rozpuszczeniu agaru poczekaj, aż powróci do temperatury dotykowej. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem agaru i wyciśnij ją na krawędź okna, aby zbudować ścianę (Rysunek 2E). Roztwór szybko krzepnie i pozostaje elastyczny, aby umożliwić swobodny ruch soczewki lub obiektywu.
  3. Gdy będziesz gotowy do obrazowania, usuń piankę żelową i umieść płyn zanurzeniowy w okienku do obrazowania 2P (Rysunek 2F). Przenieś ustabilizowane zwierzę do ciemnej komory mikroskopu 2-fotonowego i umieść okienko obrazowania 2P bezpośrednio pod soczewką. Ostrożnie opuść obiektyw do okienka obrazowania.

5. Wstrzyknięcie pierwszego barwnika fluorescencyjnego i obrazowanie bazowe

  1. Przygotuj 0,5 ml izotiocyjanianu rodaminy B-dekstranu (4 mg/ml średniej masy cząsteczkowej ~70 kDa) w soli fizjologicznej. Napełnij sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml roztworem i podłącz strzykawkę do wcześniej zainstalowanego cewnika.
    nuta: Zaleca się przygotowanie roztworu barwnika fluorescencyjnego przed użyciem.
  2. Wstrzyknąć pierwszy barwnik, bardzo powoli wciskając strzykawkę (Rysunek 3B). Najpierw użyj okularu, aby zidentyfikować obszar zainteresowania. Użyj kamery z urządzeniem sprzężonym z ładunkiem (CCD), aby uzyskać obraz w jasnym polu wzorów naczyń krwionośnych na powierzchni przy mniejszym powiększeniu jako obraz przełomowy. Przełącz się w tryb skanowania laserowego, a następnie otwórz oprogramowanie do obrazowania 2P, aby zbierać zarówno obrazy, jak i dane skanowania liniowego.
  3. Wybierz odpowiednią długość fali wzbudzenia laserem 2P, moc i kanał fluorescencyjny (czerwony kanał dla pierwszego barwnika), aby dopasować je do fluoroforów użytych w obrazowanej tkance, a następnie wykonaj obrazowanie in vivo (Rysunek 3E). Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej podczas całego procesu.

6. C7 Kontuzja kontuzyjna przy użyciu urządzenia LISA

  1. Wykonaj kontuzję linii środkowej C7 za pomocą urządzenia Louisville Injury System Apparatus (LISA) zgodnie z wcześniej ustalonym protokołem25,26.
    1. Krótko mówiąc, umieść zwierzę na LISA stage po kalibracji. Po wybraniu ustawienia punktu zerowego i dostosowaniu przemieszczenia tkanki (w tym przypadku 0,800 mm), kliknij przycisk "Uruchom eksperyment" w oprogramowaniu, aby wyzwolić zwolnienie impaktora i spowodować uraz.
    2. Po urazie umieść kolejny mały kawałek pianki żelowej nasączonej solą fizjologiczną na odsłoniętej oponie twardej, aby ją nawilżyć.
  2. Powtórz krok 4.3 i ponownie wykonaj obrazowanie in vivo na tym samym obszarze widocznym za pomocą wcześniej wstrzykniętego czerwonego barwnika (Rysunek 3C i F).
  3. Przenieś zwierzę z powrotem na stół chirurgiczny i utrzymuj zwierzę w sedacji za pomocą odpowiedniego znieczulenia zgodnie z protokołem IACUC-IUSM.

7. Wstrzyknięcie drugiego barwnika fluorescencyjnego i obrazowanie po urazie

  1. Przygotować 0,5 ml izotiocyjanianu fluoresceiny-dekstranu (4 mg/ml, średnia masa cząsteczkowa ~70 kDa) w roztworze soli fizjologicznej, tak jak w ppkt. 5.1. Wlej roztwór do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml i połącz z wcześniej zainstalowanym cewnikiem.
  2. Przenieś ustabilizowane zwierzę z powrotem do ciemnej komory mikroskopu 2P i ponownie zobrazuj ten sam obszar z czerwonym kanałem dla pierwszego barwnika i zielonym kanałem dla drugiego barwnika (ryc. 3D i G).
  3. Pod koniec obrazowania uwolnij szczura z urządzenia do stabilizacji kręgosłupa i oczyść ścianę agaru.

8. Ofiarowanie ze zwierząt

  1. Po obrazowaniu należy złożyć szczura w ofierze zgodnie z protokołem perfuzji przezsercowej27. Zbierz próbki rdzenia kręgowego i utrwal je w 4% PFA.

9. Analiza danych offline: kwantyfikacja średnic naczyń

  1. Przenieś pliki obrazów do stacji roboczej w celu analizy off-line.
  2. Otwórz ImageJ i wybierz "plik", a następnie wybierz wcześniej zapisane surowe dane i otwórz powiązany plik z pojedynczym obrazem (Rysunek 4B).
  3. Skalibruj obraz, wybierając "Analizuj", a następnie "Ustaw skalę" (Rysunek 4C). Wartość umieszczona w polu "Odległość w pikselach" jest obliczana za pomocą równania wyświetlanego w Rysunek 4A. Kalibracja 2-fotonowej soczewki optycznej określa domyślną wartość równania. Wartość "opticalZoom" znajduje się w pliku Excel Extensible Markup Languagefile (plik XML) powiązanym z pojedynczym plikiem obrazu (Rysunek 4B).
  4. Narysuj linię prostopadłą do długiej osi naczynia (Rysunek 4D1 i E1) i wybierz "Analizuj", a następnie "Zmierz". Pomiar średnicy naczynia jest wyświetlany w oknie wyników (Rysunek 4D2 & E2). Powtórz 3 razy w poprzek naczynia, aby uzyskać średnią wartość.

10. Analiza danych offline: Kwantyfikacja prędkości czerwonych krwinek (RBC)

  1. Prześlij pliki skanowania liniowego do stacji roboczej w celu analizy.
  2. Uruchom oprogramowanie ImageJ i wybierz "plik", a następnie wybierz wcześniej zapisane surowe dane i otwórz wszystkie powiązane pliki skanowania liniowego o rozszerzeniu ".ome".
  3. Otwórz "Obraz" i wybierz "Stosy", a następnie "obrazy do ułożenia w stos". Konwertuj wszystkie pliki OME na pojedynczy plik TIFF stosu obrazów.
  4. Uruchom oprogramowanie Matlab i kliknij "Otwórz", wybierz plik kodu "LSPIV_parallel.m". Uwaga: Kod Matlab dla LS-PIV można pobrać pod adresem https://sourceforge.net/projects/lspivsupplement/files/18
  5. Wybierz następujące kolejność: "Uruchom">"Zmień folder">"tętnica". Wybierz plik TIFF stosu obrazów wygenerowany w wersji 10.3.
  6. Wpisz "Y" i naciśnij Enter.
  7. Umieść kursor odpowiednio po lewej i prawej stronie obrazu, a program rozpocznie przetwarzanie danych.
  8. Na końcu programu wprowadź 2 wartości, aby obliczyć końcowy odczyt: "wartość konwersji pixel_meter" i "wartość konwersji w czasie skanowania". Oba te elementy można znaleźć w pliku XML powiązanym z danymi skanowania liniowego. Wartość końcowa jest wyrażona jako średnia i odchylenie standardowe prędkości w jednostkach milimetr na sekundę (mm/s).

Wyniki

Metoda ta umożliwia monitorowanie dynamicznych zmian naczyniowych rdzenia kręgowego in vivo w poszczególnych naczyniach przed i po urazie rdzenia kręgowego (SCI). W pierwszej kolejności, poprzez zewnętrzną żyłę szyjną, instalowany jest cewnik w celu zapewnienia dostępu do późniejszych iniekcji barwników fluorescencyjnych (Rysunek 1A-C, Rysunek 3). W drugim kroku stosowany jest specjalistyczny aparat do stabilizacji odsłoniętego odcinka C5-C7 (Rysunek 1D-F, Rysunek 2A-B). Etap stabilizacji ten pozwala wyeliminować artefakty oddechowe i zapewnić stabilne obrazowanie. Po laminektomii (Rysunek 2C), kolejnym krokiem jest instalacja okna obrazowania 2P nad odcinkiem C5-C7 (Rysunek 2D-F). Minimalizacja krwawienia tkanek obwodowych wokół okna obrazowania rdzenia jest kluczowa dla pomyślnego obrazowania naczyniowego. Następnym krokiem jest wstrzyknięcie fluorescencyjnego barwnika rodamina-dekstran (czerwony) poprzez wspomniany cewnik w celu wyznaczenia punktów orientacyjnych i zmapowania sieci naczyniowej jako poziomu bazowego (Rysunek 3A-B, E). Po wywołaniu kontuzyjnego urazu w linii środkowej na poziomie C7 o umiarkowanym nasileniu, w wybranych punktach czasowych po urazie wprowadza się FITC-dekstran (zielony) (Rysunek 3A oraz D). Zaletą metody dwukolorowej jest możliwość wykrycia struktury naczyniowej przy użyciu drugiego barwnika, nawet gdy pierwszy barwnik wyciekł już do miąższu w wyniku urazu (Rysunek 3G).

Podczas sesji obrazowania zaleca się utrzymywanie zwierzęcia na podgrzewaczce w celu zachowania temperatury wewnętrznej ciała po indukcji znieczulenia.

Zastosowanie naszej metody dwukolorowej pozwala na pomiar i obliczenie średnicy oraz prędkości erytrocytów (prędkość RBC) w poszczególnych naczyniach. W celu wyznaczenia średnicy można wykorzystać program ImageJ do pomiaru naczynia w jego najszerszym miejscu w trzech powtórzeniach po uprzedniej kalibracji (Rysunek 4). Prędkość oblicza się na podstawie obrazów z liniowego skanowania, wykorzystując program Matlab (MATLAB R2013a), aby wyznaczyć prędkość RBC (Rysunek 5)18. Na podstawie morfologii, prędkości przepływu krwi oraz średnicy naczynia, naczynia można podzielić na dwie kategorie: tętnice i żyły (patrz Tabela 1).

Schematy procedury chirurgicznej; umiejscowienie igły, zastosowanie cewnika, konfiguracja stabilizatora kręgosłupa, odsłonięcie kręgów.
Rysunek 1. Kanulacja żyły szyjnej i stabilizacja kręgosłupa.
(A) Schemat lokalizacji zewnętrznej żyły szyjnej. (B) Specjalistyczny cewnik wykonany z igły 21G. Końcówka została oszlifowana na płasko i zespawana z odciętym 2 mm fragmentem grota innej igły 21G. (C) Schemat kanulacji. W pierwszej kolejności podwiązuje się koniec dystalny, następnie stabilizuje cewnik proksymalnie, kończąc na przymocowaniu igły wraz z naczyniem (podwiązanie naczynia, niebieskie groty strzałek). (D) Zdjęcie zmodyfikowanego stabilizatora kręgosłupa. Przedstawiono okno C5-C7 przed laminektomią (E) oraz po laminektomii i urazie stłuczeniowym rdzenia kręgowego (SCI) (F). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat etapów mikrochirurgii rdzenia kręgowego z opisami: skóra, mięśnie, gelfoam, agaroza, płyn imersyjny.
Rycina 2. Schematyczny rysunek krok po kroku procesu instalacji okna optycznego.
(A) Krok 1: odsłonięcie kręgu poprzez nacięcie skóry i mięśni wzdłuż linii środkowej. (B) Krok 2: stabilizacja kręgosłupa. (C) Krok 3: laminektomia. (D) Krok 4: utrzymanie wilgotności rdzenia kręgowego poprzez umieszczenie kawałka gelfoamu nasączonego solą fizjologiczną. (E) Krok 5: uszczelnienie szczelin za pomocą sterylnego gelfoamu i kleju Vetbond. Po wyschnięciu na krawędzi okna tworzy się warstwa z agaru. (F) Krok 6: po przygotowaniu do obrazowania, usunięcie gelfoamu i wprowadzenie płynu imersyjnego do okna obrazowania 2P. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces wizualizacji naczyń krwionośnych rdzenia kręgowego z wykorzystaniem rodamina-dekstranu i FITC-dekstranu; wyniki mikroskopowe.
Rysunek 3. The in vivo procedura metody dwukolorowej krok po kroku.
Cała procedura składa się z 5 etapów (A)Po wykonaniu kroku 1 i kroku 2, stosuje się parę znaczników dekstranowych o masie około 70 kDa. wstrzyknięte sekwencyjnie w celu oznakowania naczyń krwionośnych rdzenia kręgowego przed (B i C) oraz po kontuzyjnym SCI (D). (E)-(G) reprezentatywne obrazy 2P przedstawiają unaczynienie rdzenia kręgowego od kroku 3 do kroku 5. Białe strzałki wskazują obszary wycieku czerwonego barwnika z pierwszej fali (F i G), turkusowe groty strzałek wskazują wyciek zielonego barwnika z drugiej fali (G)Pasek skali = 50 µm. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Proces kalibracji konwersji piksel-mikron przy użyciu analizy skanowania linii mikroskopowej, wyniki danych.
Rysunek 4. Pozyskiwanie i kwantyfikacja średnic naczyń rdzeniowych.
Po przygotowaniu, za pomocą mikroskopii 2P pozyskiwane są pojedyncze pliki obrazów wraz z plikami XML zawierającymi skalibrowane wartości (B). (A) Równanie przedstawia obliczenie „pikseli na mikron” w oparciu o wartości powiększenia optycznego. Po kalibracji w programie ImageJ (C), średnice naczyń są mierzone w 3 punktach wzdłuż osi podłużnej przed (D1) i po (E1) urazie. (D2) oraz (E2) prezentują zmierzone wartości. (F) Kwantyfikacja średnic naczyń w stanie wyjściowym i 30 min po urazie. Pasek skali = 50 µm. Dane przedstawiono jako średnia ± SD, ***p<0.0001, dwustronny test t dla par. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Schemat laserowej welocymetrii dopplerowskiej, obliczanie prędkości (V=Δx/Δt), wykresy przepływu w tętnicy i żyle.
Rycina 5Pozyskiwanie i ilościowe określanie prędkości przepływu w naczyniach kręgosłupa.
Pliki obrazów z mapowania liniowego (line-scan) są pozyskiwane przy użyciu mikroskopii dwufotonowej (2P) w celu obliczenia prędkości przepływu w pojedynczych naczyniach. (A) Przykład wybranego naczynia oraz metoda oceny prędkości krwinek czerwonych w naczyniu krwionośnym. (B) Przykład obrazu z szybkiego skanowania liniowego (line-scan) tętnicy i odpowiadający mu plik wykresu do obliczania prędkości, a także przykład żyły (C). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

TętnicaŻyła
MorfologiaProsta, gładka, gruba ściana naczyniaRozgałęzienia, poszarpane krawędzie
Prędkość przepływu krwiSzybkoPowolne, lecz zmienne
Średnica30-80 µm100-250 µm

Tabela 1: Kryteria identyfikacji typów naczyń

Dyskusja

Jednym z wyzwań związanych z badaniami naczyniowymi po SCI jest ograniczenie techniczne, ponieważ tradycyjne techniki są w dużej mierze ograniczone do zmian struktury naczyniowej w próbkach pośmiertnych. Ta nowatorska metoda obrazowania in vivo opisana powyżej umożliwia dynamiczny pomiar przepływu krwi i powiązanych parametrów (prędkości i średnicy naczynia) przy użyciu 2P-LSM u żywych szczurów. Pozwala również na wielokrotne badanie w tych samych zestawach naczyń w różnych punktach czasowych po stłuczeniu SCI. Poprzednie techniki obrazowania za pomocą mikroskopii 2-fotonowej nie były w stanie uchwycić pourazowych struktur naczyniowych z powodu nieszczelności pojedynczego znacznika. Nasza dwukolorowa konstrukcja umożliwia dynamiczne obrazowanie naczyń krwionośnych w modelach urazowych. Ponadto elastyczność tej metody daje możliwość wygenerowania profilu czasowo-przestrzennego ostrych zmian naczyniowych po SCI.

Nasza metoda obrazowania dwukolorowego in vivo składa się z kilku kluczowych etapów. Po pierwsze, fundamentalne znaczenie ma zapewnienie fizycznej stabilności rdzenia kręgowego przed obrazowaniem poklatkowym, w szczególności zmniejszenie artefaktu ruchu oddechowego. Zaprojektowaliśmy kształt klamer kręgosłupa tak, aby nieznacznie podnieść wysokość kręgu kręgowego podczas stabilizacji. W ten sposób ruch rdzenia kręgowego skorelowany z oddychającym zwierzęciem może być znacznie zmniejszony (ryc. 1D-F, 2B). Zaleca się sprawdzenie stabilności rdzenia kręgowego przed rozpoczęciem każdej sesji obrazowania. Jeśli rdzeń kręgowy nie osiąga stabilności, należy dokonać regulacji ustawienia i szczelności zacisków rdzenia kręgowego. Po drugie, krwawienie tkanek obwodowych (kości, warstwy mięśniowej i skóry) do okienka obrazowania może grozić zanieczyszczeniem obrazu. Aby sesja obrazowania przebiegła sprawnie, na otaczającą tkankę należy nałożyć piankę żelową i klej do tkanek, aby zapewnić skuteczną profilaktykę. Po trzecie, wybrane przez nas barwniki fluorescencyjne mają podobny rozmiar jak albumina (66 kDa), która jest głównym białkiem osocza krwi o dużej masie cząsteczkowej. W warunkach homeostatycznych barwniki były w dużej mierze zatrzymywane wewnątrz naczynia, podobnie jak albumina28. Po urazie barwniki przeszły przez zaburzoną strukturę śródbłonka i przeciekały do miąższu, powodując znaczny wzrost intensywności fluorescencji w obwodowym obszarze naczyń krwionośnych (ryc. 3F-G). Ponadto istnieją dwa powody, dla których decydujemy się na cewnikowanie żyły szyjnej zewnętrznej. Po pierwsze, może zapewnić spójną trasę dostawy w dowolnym momencie eksperymentu. Po drugie, może być stosowany jako droga do wstrzyknięcia w przyszłości leczenia.

Chociaż nasza metoda duo-color in vivo jest w stanie zapewnić nowe miejsce do badań traumatycznego obrazowania naczyń krwionośnych, należy odnieść się do pewnych zastrzeżeń dotyczących tej techniki. Obecnie technika ta ma na celu ocenę zmian naczyniowych w 2 punktach czasowych (punkt wyjściowy i 1 punkt czasowy po urazie), ale możliwe jest przełączenie na wiele punktów czasowych, jeśli dostępne są dodatkowe barwniki i kanały fluorescencyjne. Chociaż istnieje kilka badań wykorzystujących wszczepione szklane okienko do przewlekłego obrazowania przyżyciowego, żadne z nich nie może dostarczyć podstawowych informacji na temat tego samego naczynia po urazie urazowym 19,29,30,31,32. W przeciwieństwie do tych badań, nasze okno jest oknem bez szkła. Jest to wygodne w przypadku obrazowania przed i po urazie, ale może być trudne do przywrócenia okna dla długoterminowej obserwacji. Nasze przyszłe badania pracują nad technicznym ulepszeniem obrazowania przewlekłego. Układ naczyniowy składa się z kilku typów naczyń (tętnica, żyła i naczynia włosowate), a każde z nich różni się pod względem morfologii i funkcji. Różnicowanie typów naczyń podczas obrazowania może pomóc w wyodrębnieniu wyraźnego wzorca zmian naczyniowych. Powyższy protokół zależy od tego, czy obserwator identyfikuje naczynia na podstawie morfologii i prędkości; Jednak barwnik specyficzny dla tętnic można łatwo dodać, aby uzyskać bardziej ostateczną klasyfikację między typami naczyń33.

Technika ta nie ogranicza się tylko do oceny modeli stłuczeń i innych urazów, takich jak uraz zmiażdżenia i uraz popromienny, ale także do badań koncentrujących się na zakłóceniu BSCB, a także na zmianach przepuszczalności naczyń. Oprócz SCI może być stosowany do badania zmian naczyniowych po innych chorobach neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe boczne (ALS) i stwardnienie rozsiane (SM). Co więcej, można go przenieść do transgenicznego modelu zwierzęcego w celu zbadania dynamicznej interakcji nerwowo-naczyniowej. Jako potężne narzędzie przesiewowe, przyszłe badania mogą wykorzystywać opisaną tutaj technikę obrazowania do oceny skuteczności leczenia urazów rdzenia kręgowego.

Podsumowując, metoda duo-color in vivo jest niezawodnym narzędziem do oceny dynamicznych zmian naczyniowych w czasie rzeczywistym do oceny dynamicznych zmian naczyniowych, które idealnie nadaje się do charakterystyki czasowo-przestrzennego profilu naczyniowego i badań przesiewowych w celu leczenia w celu zmniejszenia wtórnych uszkodzeń po SCI.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była częściowo wspierana przez NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562, Merit Review Award I01 BX002356 od Departamentu Spraw Weteranów Stanów Zjednoczonych, Fundacji Craiga H. Neilsena 296749, Indiana Spinal Cord and Brain Injury Research Foundation (ISCBIRF) Departamentu Zdrowia Stanu Indiana (019919) oraz Mari Hulman George Endowment Funds.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Purdue Products Betadine Peeling chirurgicznyFisher Scientific19-027132Sterylizacja skóry
Ketamina (87,7 mg / kg) / Ksylazyna (12,3 mg / kg)Patterson Weterynarz 07-881-9413, 07-890-5745Środek znieczulający
Buprenorfina (0,03 mg / ml) Weterynarz Patterson 07-891-9756Środek przeciwbólowy
CarprofenPatterson Veterinary07-844-7425Niesteroidowy lek przeciwzapalny
Gąbki z gazy Dukal Fisher Scientific22-415-490Sterylizacja skóry
Decon Etanol 200 ProofFisher Scientific04-355-450Sterylizacja skóry
Maść do oczu Sztuczne łzyWebster Veterinary07-870-5261 Zapobiegaj wysuszaniu oczu 
Aplikatory z bawełnianą końcówkąFisher Scientific 
Izotiocyjanian rodaminy B– DekstranSigma-AldrichR9379Średnia mol wt 70kDa
Izotiocyjanian fluoresceiny– dekstranSigma-Aldrich46945Średnia mol wt 70kDa
Sterylizator narzędziNarzędzia do nauki o18000-50do sterylizacji narzędzia chirurgicznego
Zestaw stabilizatorów kręgosłupaWyprodukowany na zamówienie z Norton Neuroscience InstituteSkontaktuj się z Y. Ping Zhang, aby uzyskać szczegółowe informacje.
(yipingzhang50@gmail.com)
Produktydo pielęgnacji zwierząt Vetbond 3M1469SBTissue klej
Klej GelfoamHenry Schein9083300Zatrzymaj krwawienie
Noyes Nożyczki sprężynoweFST15013-12
Szczypce drobnoziarniste - Dumont #5FST11254-20
RongeurFine Science Tools16021-14laminektomia
Retraktor chirurgicznyFine Science Tools17005-04
SkalpelNarzędzia Fine Science10003-12 cięcie skóry
Ostrze skalpela #15Royal-TekBS2982
kątowe nożyczkiWorld Precision Instruments500260Może pochodzić od dowolnego dostawcy
3-0 szwów vicrylEthiconJ393HMoże pochodzić od dowolnego dostawcy
Jedwabny pleciony niewchłanialny szew, 3-0, C-7, Odwrotne cięcie, 18"LOOK786Może pochodzić od dowolnego dostawcy
Strzykawka 1 mlHenke Sass Wolf4010.200.V0Może pochodzić od dowolnego dostawcy
Igła o rozmiarze 21 BD305165Może pochodzić od dowolnego dostawcy
AgarSigma-AldrichA1296Może pochodzić od dowolnego dostawcy
Dwufotonowy laserowy mikroskop skaningowyMikroskopia
Urządzenie LISAWykonane na zamówienie w Norton Neuroscience InstituteSkontaktuj się z Y. Ping Zhang, aby uzyskać szczegółowe informacje.
(yipingzhang50@gmail.com)
ParaformaldehydSigma-Aldrich158127
HCImage LiveHamamatsu CorporationOprogramowanie do obrazowania
PrairieViewPrairie Technologies/BrukerOprogramowanie do obrazowania dwufotonowego
ImageJOprogramowanie do analizy obrazu
Statystyki Matlaba zestaw narzędziMathWorks, Inc.https://www.mathworks.com/products/statistics.html?s_tid=srchtitleOprogramowanie do analizy obrazu
1006015 naprawie mikro do cięcia skóry fluorescencyjna Bruker

Bibliografia

  1. National Spinal Cord Injury Statistical Center. Spinal Cord Injury Facts and Figures at a Glance. SCI Data Sheet 2016. , (2016).
  2. Dumont, R. J., et al. Acute spinal cord injury, part I: pathophysiologic mechanisms. Clin Neuropharmacol. 24 (5), 254-264 (2001).
  3. Beattie, M. S., Farooqui, A. A., Bresnahan, J. C. Review of current evidence for apoptosis after spinal cord injury. J Neurotrauma. 17 (10), 915-925 (2000).
  4. Liu, N. K., et al. A novel role of phospholipase A2 in mediating spinal cord secondary injury. Ann Neurol. 59 (4), 606-619 (2006).
  5. Wu, X., Xu, X. M. RhoA/Rho kinase in spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (1), 23-27 (2016).
  6. Li, X. G., et al. Combination of methylprednisolone and rosiglitazone promotes recovery of neurological function after spinal cord injury. Neural Regen Res. 11 (10), 1678-1684 (2016).
  7. Kulkarni, M. V., et al. Acute spinal cord injury: MR imaging at 1.5. T. Radiology. 164 (3), 837-843 (1987).
  8. Tator, C. H., Koyanagi, I. Vascular mechanisms in the pathophysiology of human spinal cord injury. J Neurosurg. 86 (3), 483-492 (1997).
  9. Kobrine, A. I., Doyle, T. F., Martins, A. N. Spinal cord blood flow in the rhesus monkey by the hydrogen clearance method. Surg Neurol. 2 (3), 197-200 (1974).
  10. Rivlin, A. S., Tator, C. H. Regional spinal cord blood flow in rats after severe cord trauma. J Neurosurg. 49 (6), 844-853 (1978).
  11. Koyanagi, I., Tator, C. H., Theriault, E. Silicone rubber microangiography of acute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 32 (2), 260-268 (1993).
  12. Noble, L. J., Wrathall, J. R. Correlative analyses of lesion development and functional status after graded spinal cord contusive injuries in the rat. Exp Neurol. 103 (1), 34-40 (1989).
  13. Maikos, J. T., Shreiber, D. I. Immediate damage to the blood-spinal cord barrier due to mechanical trauma. J Neurotrauma. 24 (3), 492-507 (2007).
  14. Tei, R., Kaido, T., Nakase, H., Sakaki, T. Secondary spinal cord hypoperfusion of circumscribed areas after injury in rats. Neurol Res. 27 (4), 403-408 (2005).
  15. Cohen, D. M., et al. Blood-spinal cord barrier permeability in experimental spinal cord injury: dynamic contrast-enhanced MRI. NMR Biomed. 22 (3), 332-341 (2009).
  16. Drew, P. J., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Fluctuating and sensory-induced vasodynamics in rodent cortex extend arteriole capacity. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (20), 8473-8478 (2011).
  17. Schaffer, C. B., et al. Two-photon imaging of cortical surface microvessels reveals a robust redistribution in blood flow after vascular occlusion. PLoS Biol. 4 (2), e22(2006).
  18. Kim, T. N., et al. Line-scanning particle image velocimetry: an optical approach for quantifying a wide range of blood flow speeds in live animals. PLoS One. 7 (6), e38590(2012).
  19. Tang, P., et al. In vivo two-photon imaging of axonal dieback, blood flow, and calcium influx with methylprednisolone therapy after spinal cord injury. Sci Rep. 5, 9691(2015).
  20. Thrivikraman, K. V., Huot, R. L., Plotsky, P. M. Jugular vein catheterization for repeated blood sampling in the unrestrained conscious rat. Brain Res Brain Res Protoc. 10 (2), 84-94 (2002).
  21. Walker, M. J., et al. A novel vertebral stabilization method for producing contusive spinal cord injury. J Vis Exp. (95), e50149(2015).
  22. Anderson, K. D., Sharp, K. G., Steward, O. Bilateral cervical contusion spinal cord injury in rats. Exp Neurol. 220 (1), 9-22 (2009).
  23. Krishna, V., et al. A contusion model of severe spinal cord injury in rats. J Vis Exp. (78), (2013).
  24. Lepore, A. C. Intraspinal cell transplantation for targeting cervical ventral horn in amyotrophic lateral sclerosis and traumatic spinal cord injury. J Vis Exp. (55), (2011).
  25. Zhang, Y. P., et al. Spinal cord contusion based on precise vertebral stabilization and tissue displacement measured by combined assessment to discriminate small functional differences. J Neurotrauma. 25 (10), 1227-1240 (2008).
  26. Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. J Vis Exp. (124), (2017).
  27. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  28. Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, 1932(2013).
  29. Farrar, M. J., et al. Chronic in vivo imaging in the mouse spinal cord using an implanted chamber. Nat Methods. 9 (3), 297-302 (2012).
  30. Evans, T. A., Barkauskas, D. S., Myers, J. T., Huang, A. Y. Intravital imaging of axonal interactions with microglia and macrophages in a mouse dorsal column crush injury. J Vis Exp. (93), e52228(2014).
  31. Davalos, D., Akassoglou, K. In vivo imaging of the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Vis Exp. (59), e2760(2012).
  32. Davalos, D., et al. Stable in vivo imaging of densely populated glia, axons and blood vessels in the mouse spinal cord using two-photon microscopy. J Neurosci Methods. 169 (1), 1-7 (2008).
  33. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O'Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat Methods. 9 (3), 273-276 (2012).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Obrazowanie dwufotonoweanaliza przep ywu krwipomiar rednicy naczydekstran rodamynowyizotiocyjanian fluoresceinymodel urazu st uczeniowegoobrazowanie in vivo
Badanie in vivo Dwukolorowa metoda obrazowania dynamiki naczyń krwionośnych po kontuzyjnym urazie rdzenia kręgowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.