Leki oparte na przeciwciałach zrewolucjonizowały leczenie chorób zapalnych. Oprócz bezpośredniego wpływu na określone cele, przeciwciała mogą aktywować makrofagi, aby stały się przeciwzapalne. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić aktywację makrofagów przeciwzapalnych in vitro, przy użyciu makrofagów szpiku kostnego myszy, oraz in vivo, przy użyciu makrofagów otrzewnowych.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Ocena wpływu leków opartych na przeciwciałach na mysi szpik kostny i aktywację makrofagów otrzewnowej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Makrofagi to fagocytarne wrodzone komórki odpornościowe, które inicjują reakcje immunologiczne na patogeny i przyczyniają się do gojenia i restytucji tkanek. Makrofagi są równie ważne w wyłączaniu reakcji zapalnych. Wykazaliśmy, że makrofagi stymulowane dożylną immunoglobuliną (IVIg) mogą wytwarzać duże ilości cytokiny przeciwzapalnej, interleukiny 10 (IL-10) i niskie poziomy cytokin prozapalnych w odpowiedzi na lipopolisacharydy bakteryjne (LPS). IVIg jest poliwalentnym przeciwciałem, głównie immunoglobuliną Gs (IgG), zebranym z osocza ponad 1000 dawców krwi. Stosuje się go w celu uzupełnienia przeciwciał u pacjentów z niedoborami odporności lub w celu tłumienia odpowiedzi immunologicznej u pacjentów ze stanami autoimmunologicznymi lub zapalnymi. Wykazano również, że infliksymab, terapeutyczne przeciwciało przeciwko czynnikowi martwicy nowotworów alfa (TNFα), aktywuje makrofagi do produkcji IL-10 w odpowiedzi na bodźce zapalne. IVIg i inne leki biologiczne oparte na przeciwciałach można testować w celu określenia ich wpływu na aktywację makrofagów. W artykule opisano metody wyprowadzania, stymulacji i oceny mysich makrofagów szpiku kostnego aktywowanych przez przeciwciała in vitro oraz mysich makrofagów otrzewnowej aktywowanych przeciwciałami in vivo. Na koniec pokazujemy zastosowanie western blotting w celu określenia udziału określonych szlaków sygnalizacji komórkowej w przeciwzapalnej aktywności makrofagów. Protokoły te mogą być stosowane u genetycznie modyfikowanych myszy w celu określenia wpływu określonego białka (białek) na przeciwzapalną aktywację makrofagów. Techniki te można również wykorzystać do oceny, czy określone leki biologiczne mogą działać poprzez zmianę makrofagów w stan aktywacji przeciwzapalnej wytwarzający IL-10, który zmniejsza reakcje zapalne in vivo. Może to dostarczyć informacji na temat roli aktywacji makrofagów w skuteczności leków biologicznych podczas modelowania chorób u myszy oraz dostarczyć informacji na temat potencjalnego nowego mechanizmu działania u ludzi. Z drugiej strony, może to ostrzegać przed stosowaniem specyficznych leków biologicznych na bazie przeciwciał w leczeniu chorób zakaźnych, zwłaszcza jeśli makrofagi odgrywają ważną rolę w obronie gospodarza przed tą infekcją.
Wprowadzenie
Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe, które odgrywają wiele ról w odpowiedzi immunologicznej na infekcję lub uraz. Makrofagi są odpowiedzialne za inicjowanie odpowiedzi immunologicznej na infekcję lub uszkodzenie tkanek, zatrzymywanie odpowiedzi zapalnej i promowanie reakcji gojenia1. Przykładami trzech najlepiej zbadanych stanów aktywacji makrofagów są: 1) makrofagi traktowane interferonem gamma (IFNγ) i bakteryjnym lipopolisacharydem (LPS), oznaczonym jako M (IFNγ + LPS), które przyczyniają się do odpowiedzi zapalnej; 2) makrofagi stymulowane interleukiną 4 (IL-4), M (IL-4), które są związane z odpowiedzią leczniczą; 3) makrofagi stymu....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.
1. Pozyskiwanie i aktywacja makrofagów szpiku kostnego za pomocą przeciwciał
- Przeprowadzić eutanazję za pomocą uduszenia CO2 .
- Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Poddaj mysz eutanazji 5% znieczuleniem izofluranem przez 60 - 90 s, aż do unieruchomienia, a oddech będzie głęboki i powolny.
- Wyłączyć znieczulenie izofluranem i podawać 6 - 8 l/min CO2 do momentu, aż mysz przestanie oddychać. Pozostaw mysz z włączonym CO2 na co najmniej k....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
Makrofagi pochodzące z szpiku kostnego myszy można hodować z prekursorów komórek krwiotwórczych zawartych w aspiratach szpiku kostnego. Aspiraty szpiku kostnego pobrane z kości udowych i piszczelowych jednej myszy C57BL/6 zazwyczaj dostarczają 107 makrofagów pochodzących z szpiku kostnego, co czyni je wygodnym źródłem makrofagów do eksperymentów. BMDM mogą być wykorzystywane do testowania odpowiedzi na leki oparte na przeciwciałach w warunkach in vitro po wystawieniu n.......
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Stany aktywacji makrofagów odgrywają ważną rolę zarówno w homeostazie tkanek, jak i w chorobie22. Makrofagi mogą mieć różne, a także nakładające się na siebie stany aktywacji, w zależności od sygnałów w ich mikrośrodowisku3. Odgrywają one odrębne role na wszystkich etapach odpowiedzi zapalnej: obronie przed patogenami, gojeniu się ran i restytucji tkanek, a także mają wyraźny stan aktywacji przeciwzapalnej, który jest ważny dla wyłączenia odpowiedzi zapalnej
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.
Podziękowania
L.K. jest laureatem 4-letniego stypendium (4YF) dla absolwentów Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. L.M.S. jest laureatem Kanadyjskiego Towarzystwa Gastroenterologii/ Crohn's and Colitis Canada/ CIHR New Investigator Salary Award i jest stypendystą biomedycznym Fundacji Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem. Praca ta była wspierana przez grant projektowy z Canadian Blood Services, we współpracy z Canadian Institutes of Health Research (grant # CIHR2016-LS).
....Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Iscove' powiedział: s zmodyfikowany Dulbecco" s medium (IMDM) | Technologie życiowe | 12440053 | |
| Surowica bydlęca płodu (FBS) | Technologie życia | 12483-020 | |
| Rekombinowany mysi czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów myszy (MCSF) | Technologie komórek macierzystych | 78059 | |
| Penicylina-streptomycyna | Technologie życiowe | 15140148 | |
| Monotioglicerol (MTG) | Sigma | 88640 | |
| 1X bufor do lizy czerwonych krwinek | eBioscience | ||
| Bufor dysocjacji komórek | Technologie życiowe | 13150016 | Bezenzymatyczne, oparte na Hanksa, |
| Lipopolisacharyd EDTA (LPS) | Sigma aldrich | L 4516 | Z E. coli 0127:B8 |
| IVIg (Gammunex) | Grifols | otrzymany ze Szpitala Dziecięcego BC, Medycyna transfuzjologiczna | |
| IVIg (płyn Gammagarda) | Baxter Healthcare Corporation | Otrzymane ze Szpitala Dziecięcego BC, Medycyna Transfuzji IVIg | |
| (Octagam) | Octapharma | Otrzymane ze Szpitala Dziecięcego BC, Medycyna | |
| Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (sterylna), pH 7,4 | Technologie życiowe | 10010023 | |
| myszy IL-10 ELISA | BD nauki biologiczne | 555252 | |
| mysz IL-12/23p40 ELISA | BD biologiczne | 555165 | |
| przeciwciało anty-Erk1/2 | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9101 | |
| przeciwciało anty-pp38 | Technologia sygnalizacji komórkowej | 9211 | |
| przeciwciało anty-GAPDH | Fitzgerald industries | 10R-G109A | |
| 26 g igła | BD biosciences | 305110 | |
| Strzykawka 1 ml | BD biosciences | 309659 | |
| Strzykawka 10 ml | BD biosciences | 309604 | |
| 15 ml probówka stożkowa | BD biosciences | 352096 | |
| 50 ml probówka stożkowa | BD biosciences | 352070 | |
| (1,7 ml) | Diamed | SPE155-N | |
| 75 cm2 kolba do hodowli tkankowych | BD biosciences | 353136 | |
| Skrobak do komórek | BD biosciences | 353085 | |
| Forcepts | VWR | 82027-386 | cienka końcówka, preparacja |
| Nożyczki | VWR | 82027-582 | Delikatne, 4 1/2" |
| Mikroskop jasnopolowy | Motic | AE31 | Kontrast odwróconej fazy |
| Skala | Mettler | PE 3000 |
Bibliografia
- Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
- Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(201....
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
