Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Ocena wpływu leków opartych na przeciwciałach na mysi szpik kostny i aktywację makrofagów otrzewnowej

7.8K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56689

⸱

26 grudnia 2017

 , 
1British Columbia Children's Hospital Research Institute, University of British Columbia

W tym artykule

Podsumowanie

Leki oparte na przeciwciałach zrewolucjonizowały leczenie chorób zapalnych. Oprócz bezpośredniego wpływu na określone cele, przeciwciała mogą aktywować makrofagi, aby stały się przeciwzapalne. Protokół ten opisuje, w jaki sposób można ocenić aktywację makrofagów przeciwzapalnych in vitro, przy użyciu makrofagów szpiku kostnego myszy, oraz in vivo, przy użyciu makrofagów otrzewnowych.

Streszczenie

Makrofagi to fagocytarne wrodzone komórki odpornościowe, które inicjują reakcje immunologiczne na patogeny i przyczyniają się do gojenia i restytucji tkanek. Makrofagi są równie ważne w wyłączaniu reakcji zapalnych. Wykazaliśmy, że makrofagi stymulowane dożylną immunoglobuliną (IVIg) mogą wytwarzać duże ilości cytokiny przeciwzapalnej, interleukiny 10 (IL-10) i niskie poziomy cytokin prozapalnych w odpowiedzi na lipopolisacharydy bakteryjne (LPS). IVIg jest poliwalentnym przeciwciałem, głównie immunoglobuliną Gs (IgG), zebranym z osocza ponad 1000 dawców krwi. Stosuje się go w celu uzupełnienia przeciwciał u pacjentów z niedoborami odporności lub w celu tłumienia odpowiedzi immunologicznej u pacjentów ze stanami autoimmunologicznymi lub zapalnymi. Wykazano również, że infliksymab, terapeutyczne przeciwciało przeciwko czynnikowi martwicy nowotworów alfa (TNFα), aktywuje makrofagi do produkcji IL-10 w odpowiedzi na bodźce zapalne. IVIg i inne leki biologiczne oparte na przeciwciałach można testować w celu określenia ich wpływu na aktywację makrofagów. W artykule opisano metody wyprowadzania, stymulacji i oceny mysich makrofagów szpiku kostnego aktywowanych przez przeciwciała in vitro oraz mysich makrofagów otrzewnowej aktywowanych przeciwciałami in vivo. Na koniec pokazujemy zastosowanie western blotting w celu określenia udziału określonych szlaków sygnalizacji komórkowej w przeciwzapalnej aktywności makrofagów. Protokoły te mogą być stosowane u genetycznie modyfikowanych myszy w celu określenia wpływu określonego białka (białek) na przeciwzapalną aktywację makrofagów. Techniki te można również wykorzystać do oceny, czy określone leki biologiczne mogą działać poprzez zmianę makrofagów w stan aktywacji przeciwzapalnej wytwarzający IL-10, który zmniejsza reakcje zapalne in vivo. Może to dostarczyć informacji na temat roli aktywacji makrofagów w skuteczności leków biologicznych podczas modelowania chorób u myszy oraz dostarczyć informacji na temat potencjalnego nowego mechanizmu działania u ludzi. Z drugiej strony, może to ostrzegać przed stosowaniem specyficznych leków biologicznych na bazie przeciwciał w leczeniu chorób zakaźnych, zwłaszcza jeśli makrofagi odgrywają ważną rolę w obronie gospodarza przed tą infekcją.

Wprowadzenie

Makrofagi to wrodzone komórki odpornościowe, które odgrywają wiele ról w odpowiedzi immunologicznej na infekcję lub uraz. Makrofagi są odpowiedzialne za inicjowanie odpowiedzi immunologicznej na infekcję lub uszkodzenie tkanek, zatrzymywanie odpowiedzi zapalnej i promowanie reakcji gojenia1. Przykładami trzech najlepiej zbadanych stanów aktywacji makrofagów są: 1) makrofagi traktowane interferonem gamma (IFNγ) i bakteryjnym lipopolisacharydem (LPS), oznaczonym jako M (IFNγ + LPS), które przyczyniają się do odpowiedzi zapalnej; 2) makrofagi stymulowane interleukiną 4 (IL-4), M (IL-4), które są związane z odpowiedzią leczniczą; 3) makrofagi stymulowane kompleksami immunologicznymi (IC) i LPS, M(IC + LPS), które mają zdolność wyłączania odpowiedzi zapalnej2,3. M(IC + LPS) różnią się od makrofagów gojących się ran M(IL-4) i nie wyrażają enzymu arginazy (Arg-1) lub FIZZ14. Najlepszym markerem tych przeciwzapalnych makrofagów jest ich produkcja cytokin5. Makrofagi odgrywają wiele ról w utrzymaniu zdrowia, ale także przyczyniają się do chorób zapalnych i raka3. Z tego powodu makrofagi są kluczowym celem terapeutycznym w leczeniu wielu różnych chorób. Ważne jest, aby zbadać wpływ przeciwciał na ich stan aktywacji, aby opracować terapie oparte na makrofagach.

Tematem tego artykułu jest wykorzystanie makrofagów pochodzących z mysiego szpiku kostnego (BMDM) i makrofagów otrzewnowych do testowania wpływu przeciwciał na reakcje zapalne in vitro i in vivo. Ostatnio przeprowadzono wiele badań pokazujących wpływ przeciwciał na aktywację makrofagów6,7,8. Makrofagi współaktywowane z kompleksami immunologicznymi, które są przeciwciałami skompleksowanymi z antygenem, oraz LPS, normalnie zapalnym bodźcem, wytwarzają bardzo wysoki poziom cytokiny przeciwzapalnej IL-10 i bardzo niski poziom cytokiny prozapalnej, interleukiny 12 (IL-12)9. Ponadto stwierdzono, że infliksymab, przeciwciało monoklonalne przeciwko TNFα, działa częściowo poprzez indukowanie przeciwzapalnych makrofagów przez region krystalizacji fragmentu (Fc)7. Informowaliśmy, że IVIg + LPS indukują przeciwzapalną aktywację makrofagów, która jest podobna do M (IC + LPS), w której współstymulowane makrofagi wytwarzają duże ilości IL-10 i niewielkie ilości podjednostki cytokin prozapalnych Interleukina 12 lub 23 p40 (IL-12 / 23p40), interleukina-6 (IL-6) i TNF8. IVIg to lek składający się z przeciwciał poliklonalnych, głównie IgG, które zostały zebrane z krwi ponad 1000 dawców10. Jest stosowany w leczeniu wielu różnych chorób immunologicznych, takich jak idiopatyczna plamica małopłytkowa i przewlekła polineuropatia demielinizacyjna, ale jej mechanizm działania nie jest w pełni zrozumiały11. Wpływ leków opartych na przeciwciałach na aktywację makrofagów można ocenić za pomocą metod opisanych w niniejszym dokumencie.

Wpływ określonych leków biologicznych na aktywację makrofagów można przetestować w BMDM i makrofagach otrzewnowych. Wykorzystanie tych źródeł makrofagów pozwala na ocenę komórek pierwotnych. Wstępne testowanie przeciwciał na hodowanych komórkach pierwotnych wymaga mniej czasu i inwestycji pieniężnych niż inne czasochłonne i kosztowne modele choroby. Wstrzykując lek zdrowej myszy in vivo, izolując komórki i analizując je ex vivo, można określić, czy uzasadnione są badania oceniające, czy leczenie lekami biologicznymi wpływa na aktywację makrofagów w modelach choroby.

Z nielicznymi badaniami testującymi wpływ terapii biologicznych na aktywację makrofagów bezpośrednio in vitro i in vivo, nasze techniki dają przewagę nad alternatywnymi technikami. Obecne techniki obejmują testowanie wpływu leków biologicznych na populacje mieszane komórek in vitro, takich jak wpływ infliksymabu w mieszanej reakcji limfocytów (MLR) lub IVIg na ludzkie makrofagi w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej, gdzie efektu nie można przypisać określonemu typowi komórki7,12. Stosowanie BMDM i makrofagów otrzewnowych jest korzystne w porównaniu z używaniem linii komórkowych, takich jak komórki RAW264.7, które nie wytwarzają cytokiny prozapalnej, IL-12, w odpowiedzi na LPS8,13. Testowanie wpływu leku opartego na przeciwciałach na odpowiedzi makrofagów ex vivo ma zalety, ponieważ odpowiedzi cytokin można przypisać bezpośrednio makrofagom, zamiast wnioskować o odpowiedziach makrofagów poprzez pomiar poziomu cytokin w surowicy14. BMDM i makrofagi otrzewnowe można uzyskać i wyizolować od genetycznie zmodyfikowanych myszy w celu określenia specyficznej roli białka w przeciwzapalnej aktywacji makrofagów. Na przykład, użyliśmy BMDM z niedoborem Il10 (-/-), aby wykazać, że indukowane IVIg zmniejszenie produkcji cytokin prozapalnych jest częściowo zależne od IL-108. Mechanizm działania leku można badać za pomocą western blotting, w którym można określić rolę określonych białek i zdarzeń sygnalizacyjnych. Ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) można przeprowadzić na BMDM lub makrofagach otrzewnowych, aby pokazać wzorce ekspresji genów, które wynikają z aktywacji przeciwciał. Modele chorób u myszy mogą dostarczyć informacji na temat potencjalnej skuteczności terapii biologicznych opartych na przeciwciałach w modelach chorób takich jak nieswoiste zapalenie jelit, reumatoidalne zapalenie stawów i rak15,16,17. Jednak opisane tutaj techniki dostarczą informacji na temat mechanizmu działania tych leków biologicznych poprzez określenie, czy indukują one przeciwzapalną aktywność makrofagów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej.

1. Pozyskiwanie i aktywacja makrofagów szpiku kostnego za pomocą przeciwciał

  1. Przeprowadzić eutanazję za pomocą uduszenia CO2 .
    1. Umieść mysz w komorze indukcyjnej. Poddaj mysz eutanazji 5% znieczuleniem izofluranem przez 60 - 90 s, aż do unieruchomienia, a oddech będzie głęboki i powolny.
    2. Wyłączyć znieczulenie izofluranem i podawać 6 - 8 l/min CO2 do momentu, aż mysz przestanie oddychać. Pozostaw mysz z włączonym CO2 na co najmniej kolejne 5 minut. Sprawdź, czy nie słychać już bicia serca ani oddechu. Wykonaj zwichnięcie szyjki macicy, aby zapewnić śmierć.
      UWAGA: Myszy w wieku 8 - 12 tygodni zapewniają najwyższą wydajność makrofagów.
  2. Spryskaj nogi myszy 70% etanolem i przypnij je rękami i nogami wyciągniętymi w pozycji leżącej nad piankową deską. Za pomocą nożyczek i kleszczy, aby przytrzymać skórę, wykonaj płytkie cięcie (0,2 cm), aby usunąć skórę i sierść z powierzchni każdej z tylnych nóg.
    UWAGA: Wykonaj tę procedurę i wszystkie manipulacje kulturą tkankową w sterylnym kapturze.
  3. Przytnij mięśnie, aby uwidocznić piszczele i kości udowe. Usuń piszczele i kości udowe, przecinając kość i mięśnie tuż poniżej stawu biodrowego i powyżej kostek. Odetnij jak najwięcej mięśni
    4. .
  4. Spryskaj kości 70% etanolem i odczekaj 1 minutę, aż odparuje, a następnie umieść je w 6-dołkowej płytce z podłożem do płukania kości (zmodyfikowana pożywka Dulbecco firmy Iscove (IMDM), 10% płodowa surowica bydlęca (FBS)).
  5. Przytnij końce kości, odcinając 0,1 cm kości od kostki i górnej części kości udowej, tak aby jama kostna była odsłonięta. Upewnij się, że szpik jest widoczny, a w jamie kostnej można umieścić igłę o rozmiarze 26.
  6. Przetnij kości i mięśnie, aby oddzielić piszczele i kości udowe od stawów kolanowych. Wprowadzić do jamy igłę o rozmiarze 26 dołączoną do strzykawki o pojemności 10 ml. Przepłukać szpik kostny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml z 5 ml pożywki do płukania kości. Przepłukać dwie piszczele i dwie kości udowe z jednej myszy do każdej probówki o pojemności 50 ml.
  7. Kilkakrotnie pipetuj w górę i w dół lub obracaj szpik z małą prędkością, aby delikatnie rozproszyć grudki. Sznurki szpiku powinny być rozdrobnione na małe (mniej niż 0,5 mm) drobinki szpiku. Napełnij stożkową probówkę do 50 ml środkiem do płukania kości. Zawartość stożkowej probówki odpipetować do kolby o długości 75cm2 poddanej działaniu kultur tkankowych i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 1 h.
    UWAGA: Dojrzałe makrofagi i komórki mezenchymalne przylgną do kolby i zostaną wyrzucone, podczas gdy pożądane krwiotwórcze komórki progenitorowe pozostaną w zawiesinie.
  8. Odpipetować pożywkę z krwionośnymi komórkami progenitorycznymi do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Odwirować probówkę o sile 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml pożywki hodowlanej czynnika stymulującego tworzenie kolonii makrofagów (MCSF) (IMDM, 10% FBS, 5 ng/ml MCSF, 100 U/ml penicyliny/streptomycyny i 150 μM monotioglicerolu (MTG)).
  9. Policz komórki za pomocą hemocytometru18. Dodaj pożywkę do ponownego zawieszenia komórek do stężenia 0,5 x 106 komórek/ml, 1,5 x 107 komórek/kolbę w 30 ml pożywki i delikatnie pipetuj w górę iw dół. Odpipetować 30 ml zawiesiny do nowej kolby o długości 75cm2 poddanej hodowli tkankowej.
  10. W 4. i 7. dniu po początkowej hodowli w kroku 1.9 sprawdź, czy komórki przylegają do siebie i są lekko rozgałęzione, używając mikroskopu jasnego pola z odwróconym kontrastem fazowym. Wyrzucić pożywkę zawierającą nieprzylegające komórki. Umyj komórki jednorazowo IMDM i dodaj 30 ml pożywki hodowlanej MCSF.
  11. Gdy komórki osiągną dojrzałość do 10 dnia (>95% dodatnie dla F4/80 i Mac-1), sprawdź ponownie, czy komórki przylegają i nieznacznie.
  12. Aby ułożyć komórki na płytkach do stymulacji, wyjmij pożywkę hodowlaną z kolby i dodaj 8 ml wolnego od enzymów buforu dysocjacji komórek na bazie EDTA (tabela materiałów). Inkubować komórki przez 5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .
  13. Zeskrobać komórki delikatnie, z niewielkim naciskiem, za pomocą sterylnego skrobaka do komórek. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki oderwały się od powierzchni kolby. Pipetą zdysocjowano komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Przepłukać kolbę 3 razy 5 ml IMDM i połączyć roztwór płuczący z zebranymi komórkami. Odwirować komórki przy 300 x g w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  14. Zawiesić osad komórkowy w 3 ml pożywki hodowlanej MCSF na 50 ml stożkowej probówki. Policz żywotne komórki za pomocą hemocytometru18. Zawiesić komórki w stężeniu 1 x 106 komórek/ml i podać 100 μl zawiesiny komórkowej (1 x 105 komórek/basenik) na studzienkę 96-dołkowej kultury tkankowej poddanej działaniu płaskiej płytki dennej.
    UWAGA: Kości z jednej myszy wygenerują wystarczającą ilość komórek na 100 dołków. W razie potrzeby 1 ml komórek można posiać na płytce 6-dołkowej (hodowla tkankowa poddana obróbce, płaskie dno). Większa liczba komórek (1 x 10,6 komórek) może być przydatna do analiz western blot.
  15. Po przyleganiu stymuluj zduplikowane lub trzykrotne studzienki, z których każda zawiera 10 ng / ml LPS w IMDM, 30 mg / ml IVIg lub IVIg + LPS. Dawki LPS lub IVIg można miareczkować w celu optymalizacji odpowiedzi. Pozostaw zduplikowane lub potrojone studzienki jako niestymulowane kontrole. Inkubować je przez 24 godziny (37 °C, 5% CO2 ).
    UWAGA: Ponownie posiane komórki powinny przylegać do dołków hodowli tkankowych w ciągu 1 godziny.
  16. Zebrać supernatanty komórkowe z każdej studzienki do oddzielnych probówek mikrowirówek o pojemności 1,7 ml i usunąć wszelkie cząstki stałe, wirując z prędkością 10 000 x g przez 5 minut.
  17. Usunąć supernatant komórek i unikać naruszania osadu. Umieścić sklarowany supernatant komórkowy w sterylnej probówce do mikrowirówki.
    UWAGA: Supernatanty komórkowe można natychmiast oznaczyć na obecność cytokin IL-10 i podjednostki cytokin IL-12/23p40 za pomocą testu immunoenzymatycznego (ELISA) lub przechowywać w temperaturze -80 °C przez długi czas. Postępuj zgodnie z protokołem ELISA z dostępnego na rynku zestawu (Tabela materiałów). Można oznaczyć inne cytokiny prozapalne, takie jak IL-6 i TNF, ponieważ są one również redukowane przez jednoczesne leczenie stymulacją IVIg + LPS w porównaniu ze stymulacją samym LPS. Po stymulacji komórki adherentne mogą być przygotowane do technik takich jak western blotting lub ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy (Q-PCR) 19,20.

2. Wyzwanie dla myszy in vivo za pomocą IVIg i zbieranie makrofagów otrzewnowej

  1. Zważ każdą mysz. Obliczyć objętość dożylnego ig (100 mg/ml stężenia podstawowego) potrzebną do podania końcowej dawki 2,5 g/kg masy ciała dla każdej myszy.
    UWAGA: Na przykład dla myszy o wadze 20 g wymagane jest 500 μl IVIg.
  2. Pobrać wymaganą ilość iniekcji dożylnej do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w sterylną igłę o rozmiarze 26. W przypadku myszy kontrolnych, które nie otrzymają IVIg, należy podać równoważną objętość dawki sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), pH 7,4 zamiast IVIg.
  3. Chrap mysz jedną ręką, chwytając jej skórę z tyłu szyi kciukiem i palcem wskazującym, a przytrzymując ogon i tylne nogi pozostałymi palcami. Przechyl jego ciało w kierunku ziemi.
  4. Umieść igłę pod kątem 30 - 40° w stosunku do brzucha myszy, w prawym dolnym kwadrancie, skos do góry i wbij 1.5 cm igły. Wstrzyknąć dootrzewnowo IVIg lub PBS. Poczekaj 1 godzina.
  5. Poddać myszy eutanazji 5% znieczuleniem izofluranem, a następnie uduszeniu 6-8 l/min CO2 (patrz kroki 1.1.1 - 1.1.2) lub zgodnie z wytycznymi etycznymi instytucji.
  6. Przypnij mysz do piankowej tablicy z rozłożonymi kończynami. Spryskaj części 70% etanolem.
    UWAGA: Zabieg należy wykonać w sterylnym kapturze.
  7. Wykonaj płytkie nacięcie w skórze (0,2 cm) nożyczkami wzdłuż linii środkowej myszy, aby uniknąć przecięcia jamy otrzewnej. Ściągnij skórę brzucha z brzucha myszy za pomocą kleszczy, tak aby widoczna była wyściółka nienaruszonej ściany otrzewnej.
  8. Napełnij strzykawkę o pojemności 5 ml 5 ml sterylnego PBS (pH 7,4). Włóż igłę o rozmiarze 25 lub 27 w górnej części wnęki z lewej lub prawej strony w kierunku środka myszy skosem igły do góry.
    UWAGA: Ostrożnie umieść igłę w myszy, aby nie wstrzykiwać PBS do narządów, ale raczej do przestrzeni otrzewnej.
  9. Wepchnij płyn do jamy otrzewnej. Wyciągnij igłę z jamy i masuj otrzewną przez 10 sekund, aby usunąć wszelkie komórki. Wbić igłę w górną część jamy i omijać narządy. Zebrać i umieścić odzyskany płyn popłuczyn w stożkowej probówce o pojemności 15 ml na lodzie.
    UWAGA: Na każde wstrzyknięte 5 ml płynu zostanie odzyskane około 3,75 ml.
  10. Powtórz wstrzyknięcie i odzyskaj (kroki 2,8 - 2,9) jeszcze 3 razy (całkowita objętość wstrzyknięcia 20 ml), aby odzyskać łącznie 15 ml płynu do płukania. Zebrać płukanie z każdej myszy do osobnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml.
    UWAGA: Po ostatnim wstrzyknięciu może być łatwiej pobrać płyn z lewej i prawej strony myszy, gdzie nagromadził się płyn. Narządy będą powodować mniejsze zakłócenia z igłą w tej pozycji.
  11. Wirować komórki w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 500 μl pożywki galwanicznej (IMDM, 10% FBS i 100 U/ml penicyliny/streptomycyny) na przepłukaną mysz. Policz żywotne makrofagi za pomocą hemocytometru18.
    UWAGA: Makrofagi będą nieco większe niż inne komórki otrzewnej. Typowa wydajność to 5 x 105 - 1 x 106 makrofagów/mysz przy użyciu myszy C57BL/6 typu dzikiego.
    Opcjonalnie: Jeśli w osadzie komórkowym znajduje się duża liczba czerwonych krwinek, wykonaj etap lizy, aby je usunąć, używając 1x buforu do lizy czerwonych krwinek zgodnie z instrukcjami producenta.
  12. Zawiesić komórki w pożywce galwacyjnej w ilości 1 x 106 makrofagów/ml i płytce 100 μl na studzienkę na 96-dołkowej płytce poddanej działaniu płaskiej hodowli tkankowej.
    UWAGA: Może być konieczne zebranie komórek od więcej niż jednej myszy do eksperymentu w przypadku korzystania z potrójnych studzienek lub miareczkowania stymulantów. Na przykład, jeśli jedna mysz miała 5 x 105 makrofagów, wymagane byłoby 500 μl pożywki galwanicznej. Byłoby wystarczająco dużo komórek na 5 studzienek lub 1 eksperyment w dwóch egzemplarzach, z jedną dawką LPS.
  13. Inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić makrofagom przyleganie. Komórkami przylegającymi są makrofagi otrzewnej. Usuń supernatanty komórkowe i komórki nieprzylegające. Przepłukać studzienki dwukrotnie 200 μl IMDM (wstępnie podgrzanym do 37 °C), odczekać 10 s i powoli przechylić płytkę. Wymień medium galwaniczne. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 30 minut przed stymulacją.
  14. Stymuluj makrofagi za pomocą 10 ng/ml LPS w IMDM lub pozostaw niestymulowane, jako kontrolę. Inkubować przez 24 godziny, zebrać i sklarować supernatanty komórkowe (patrz kroki 1.16 - 1.17) do analizy cytokin IL-10 metodą ELISA. Postępuj zgodnie z protokołem ELISA z dostępnego na rynku zestawu (tabela materiałów).
    UWAGA: Po stymulacji przylegające komórki można przygotować do technik takich jak western blot lub PCR.

3. Wyzwanie dla myszy in vivo z IVIg + LPS i zbieranie makrofagów otrzewnowej

  1. Zważ każdą mysz. Obliczyć objętość dożylnego ig (100 mg/ml stężenia podstawowego) potrzebną do podania końcowej dawki 2,5 g/kg masy ciała. Obliczyć ilość LPS (100 μg/ml stężenia podstawowego w IMDM) potrzebną do zapewnienia końcowej dawki 0,2 μg/g masy ciała.
    UWAGA: Na przykład dla myszy o wadze 20 g wymagane jest 500 μl roztworu podstawowego IVIg i 40 μl roztworu LPS o stężeniu 100 μg/ml.
  2. Pobrać wymaganą ilość IVIg i LPS do sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml wyposażonej w sterylną igłę o rozmiarze 26. W przypadku myszy kontrolnych, które nie otrzymają IVIg, równoważną objętość IVIg należy zastąpić sterylnym PBS pH 7,4.
  3. Chrap mysz jedną ręką, chwytając jej skórę z tyłu szyi kciukiem i palcem wskazującym, a przytrzymując ogon i tylne nogi pozostałymi palcami. Przechyl jego ciało w kierunku ziemi.
  4. Umieść igłę pod kątem 30 - 40° w stosunku do brzucha myszy, w prawym dolnym kwadrancie, skos do góry i włóż 1,5 cm. Wstrzyknij IVIg + LPS lub PBS + LPS dootrzewnowo, jak w kroku 2.4.
  5. Po 1 godzinie zbierz makrofagi otrzewnowe, wykonując kroki 2,5 - 2,10.
  6. Odwirować komórki w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Usunąć 1 ml odzyskanego płynu z płukania i użyć do analiz IL-10 i IL-12/23p40 metodą ELISA zgodnie z instrukcjami producenta lub zamrozić w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz.
    UWAGA: Aby zapewnić dokładne porównanie między zabiegami analizy cytokin płynu popłuczynowego, wykonaj 4 razy płukanie jamy otrzewnej 5 ml do końcowej objętości 15 ml. Nie wszystkie płyny zostaną odzyskane z każdego spłukiwania.
  7. Podobnie jak w kroku 2.11, ponownie zawiesić i policzyć żywotne makrofagi.
    UWAGA: Makrofagi będą nieco większe niż inne komórki otrzewnej. Typowa wydajność to 5 x 105 - 1 x 106 makrofagów/mysz przy użyciu myszy C57BL/6 typu dzikiego.
    Opcjonalnie: Jeśli w osadzie komórkowym znajduje się duża liczba czerwonych krwinek, należy przeprowadzić etap lizy zgodnie z instrukcjami producenta w celu ich usunięcia, jak w kroku 2.11.
  8. Podobnie jak w kroku 2.12, ponownie zawieś komórki w podłożu galwanicznym.
    UWAGA: Do eksperymentu może być konieczne zebranie komórek z więcej niż jednej myszy. Na przykład, jeśli jedna mysz miała 5 x 105 makrofagów, wymagane byłoby 500 μl pożywki galwanicznej.
  9. Podobnie jak w ppkt 2.13, inkubować komórki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C 5% CO2 , aby makrofagi mogły się przylegać.
  10. Zebrać i sklarować kondycjonowaną pożywkę, zgodnie z krokami 1.14 - 1.15, ze wszystkich komórek otrzewnej.
    UWAGA: Próbki mogą być użyte natychmiast lub zamrożone i przechowywane w temperaturze -80 °C do analizy cytokin metodą ELISA.
  11. Wykonaj krok 2.11, ale inkubuj komórki przez 24 godziny bez stymulacji. Zebrać i sklarować supernatanty komórkowe, zgodnie z krokami 1.16 - 1.17, do analizy cytokin metodą ELISA.
    UWAGA: Komórki można przygotować do technik takich jak western blot lub PCR, jak w krokach 1.16 - 1.17 i 2.14.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Makrofagi pochodzące z szpiku kostnego myszy można hodować z prekursorów komórek krwiotwórczych zawartych w aspiratach szpiku kostnego. Aspiraty szpiku kostnego pobrane z kości udowych i piszczelowych jednej myszy C57BL/6 zazwyczaj dostarczają 107 makrofagów pochodzących z szpiku kostnego, co czyni je wygodnym źródłem makrofagów do eksperymentów. BMDM mogą być wykorzystywane do testowania odpowiedzi na leki oparte na przeciwciałach w warunkach in vitro po wystawieniu n...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stany aktywacji makrofagów odgrywają ważną rolę zarówno w homeostazie tkanek, jak i w chorobie22. Makrofagi mogą mieć różne, a także nakładające się na siebie stany aktywacji, w zależności od sygnałów w ich mikrośrodowisku3. Odgrywają one odrębne role na wszystkich etapach odpowiedzi zapalnej: obronie przed patogenami, gojeniu się ran i restytucji tkanek, a także mają wyraźny stan aktywacji przeciwzapalnej, który jest ważny dla wyłączenia odpowiedzi zapalnej

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają do ujawnienia żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

L.K. jest laureatem 4-letniego stypendium (4YF) dla absolwentów Uniwersytetu Kolumbii Brytyjskiej. L.M.S. jest laureatem Kanadyjskiego Towarzystwa Gastroenterologii/ Crohn's and Colitis Canada/ CIHR New Investigator Salary Award i jest stypendystą biomedycznym Fundacji Michaela Smitha na rzecz Badań nad Zdrowiem. Praca ta była wspierana przez grant projektowy z Canadian Blood Services, we współpracy z Canadian Institutes of Health Research (grant # CIHR2016-LS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Iscove' powiedział: s zmodyfikowany Dulbecco" s medium (IMDM)Technologie życiowe12440053
Surowica bydlęca płodu (FBS)Technologie życia12483-020
Rekombinowany mysi czynnik stymulujący tworzenie kolonii makrofagów myszy (MCSF)Technologie komórek macierzystych78059
Penicylina-streptomycynaTechnologie życiowe15140148
Monotioglicerol (MTG)Sigma88640
1X bufor do lizy czerwonych krwinekeBioscience
Bufor dysocjacji komórekTechnologie życiowe13150016Bezenzymatyczne, oparte na Hanksa,
Lipopolisacharyd EDTA (LPS)Sigma aldrichL 4516Z E. coli 0127:B8
IVIg (Gammunex)Grifolsotrzymany ze Szpitala Dziecięcego BC, Medycyna transfuzjologiczna
IVIg (płyn Gammagarda)Baxter Healthcare CorporationOtrzymane ze Szpitala Dziecięcego BC, Medycyna Transfuzji IVIg
(Octagam)OctapharmaOtrzymane ze Szpitala Dziecięcego BC, Medycyna
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS) (sterylna), pH 7,4Technologie życiowe10010023
myszy IL-10 ELISABD nauki biologiczne555252
mysz IL-12/23p40 ELISABD biologiczne555165
przeciwciało anty-Erk1/2Technologia sygnalizacji komórkowej9101
przeciwciało anty-pp38Technologia sygnalizacji komórkowej9211
przeciwciało anty-GAPDHFitzgerald industries10R-G109A
26 g igłaBD biosciences305110
Strzykawka 1 mlBD biosciences309659
Strzykawka 10 mlBD biosciences309604
15 ml probówka stożkowaBD biosciences352096
50 ml probówka stożkowaBD biosciences352070
(1,7 ml)DiamedSPE155-N
75 cm2 kolba do hodowli tkankowychBD biosciences353136
Skrobak do komórekBD biosciences353085
ForceptsVWR82027-386cienka końcówka, preparacja 
NożyczkiVWR82027-582Delikatne, 4 1/2"
Mikroskop jasnopolowyMoticAE31Kontrast odwróconej fazy
Skala Mettler PE 3000
Transfuzjologii

Bibliografia

  1. Murray, P. J., Wynn, T. A. Protective and pathogenic functions of macrophage subsets. Nat Rev Immunol. 11 (11), 723-737 (2011).
  2. Martinez, F. O., Gordon, S. The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment. F1000Prime Rep. 6, 13(2014).
  3. Mosser, D. M., Edwards, J. P. Exploring the full spectrum of macrophage activation. Nat Rev Immunol. 8 (12), 958-969 (2008).
  4. Edwards, J. P., Zhang, X., Frauwirth, K. A., Mosser, D. M. Biochemical and functional characterization of three activated macrophage populations. J Leukoc Biol. 80 (6), 1298-1307 (2006).
  5. Mosser, D. M., Zhang, X. Activation of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.12 (2008).
  6. Gallo, P., Gonçalves, R., Mosser, D. M. The influence of IgG density and macrophage Fc (gamma) receptor cross-linking on phagocytosis and IL-10 production. Immunol Lett. 133 (2), 70-77 (2010).
  7. Vos, A. C., et al. Anti-tumor necrosis factor-α antibodies induce regulatory macrophages in an Fc region-dependent manner. Gastroenterology. 140 (1), 221-230 (2011).
  8. Kozicky, L. K., et al. Intravenous immunoglobulin skews macrophages to an anti-inflammatory, IL-10-producing activation state. J Leukoc Biol. 98 (6), 983-994 (2015).
  9. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Salgame, P., Mosser, D. M. Reversal of proinflammatory responses by ligating the macrophage Fcgamma receptor type I. J Exp Med. 188 (1), 217-222 (1998).
  10. Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. The antiinflammatory activity of IgG: the intravenous IgG paradox. J Exp Med. 204 (1), 11-15 (2007).
  11. Gelfand, E. W. Intravenous immune globulin in autoimmune and inflammatory diseases. N Engl J Med. 368 (8), 777(2013).
  12. Andersson, J., Skansén-Saphir, U., Sparrelid, E., Andersson, U. Intravenous immune globulin affects cytokine production in T lymphocytes and monocytes/macrophages. Clin Exp Immunol. 104, Suppl 1 10-20 (1996).
  13. Saito, S., Matsuura, M., Hirai, Y. Regulation of lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production by activation of repressor element GA-12 through hyperactivation of the ERK pathway. Clin Vaccine Immunol. 13 (8), 876-883 (2006).
  14. Cao, S., Zhang, X., Edwards, J. P., Mosser, D. M. NF-kappaB1 (p50) homodimers differentially regulate pro- and anti-inflammatory cytokines in macrophages. J Biol Chem. 281 (36), 26041-26050 (2006).
  15. Neurath, M. F. New targets for mucosal healing and therapy in inflammatory bowel diseases. Mucosal Immunol. 7 (1), 6-19 (2014).
  16. Bryant, A., Moore, J. Rituximab and its potential for the treatment of rheumatoid arthritis. Ther Clin Risk Manag. 2 (2), 207-212 (2006).
  17. Weiner, L. M., Surana, R., Wang, S. Monoclonal antibodies: versatile platforms for cancer immunotherapy. Nat Rev Immunol. 10 (5), 317-327 (2010).
  18. Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods Mol Biol. 740, 7-12 (2011).
  19. Liu, Z. Q., Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory and trouble shooting. N Am J Med Sci. 6 (3), 160(2014).
  20. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  21. Lucas, M., Zhang, X., Prasanna, V., Mosser, D. M. ERK activation following macrophage FcgammaR ligation leads to chromatin modifications at the IL-10 locus. J Immunol. 175 (1), 469-477 (2005).
  22. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  23. Anderson, C. F., Gerber, J. S., Mosser, D. M. Modulating macrophage function with IgG immune complexes. J Endotoxin Res. 8 (6), 477-481 (2002).
  24. Sutterwala, F. S., Noel, G. J., Clynes, R., Mosser, D. M. Selective suppression of interleukin-12 induction after macrophage receptor ligation. J Exp Med. 185 (11), 1977-1985 (1997).
  25. Riquelme, P., et al. IFN-γ-induced iNOS expression in mouse regulatory macrophages prolongs allograft survival in fully immunocompetent recipients. Mol Ther. 21 (2), 409-422 (2013).
  26. Vos, A. C., et al. Regulatory macrophages induced by infliximab are involved in healing in vivo and in vitro. Inflamm Bowel Dis. 18 (3), 401-408 (2012).
  27. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14 Unit 14.11 (2008).
  28. Gerber, J. S., Mosser, D. M. Reversing lipopolysaccharide toxicity by ligating the macrophage Fc gamma receptors. J Immunol. 166 (11), 6861-6868 (2001).
  29. Durandy, A., et al. Intravenous immunoglobulins--understanding properties and mechanisms. Clin Exp Immunol. 158, Suppl 1 2-13 (2009).
  30. Jolles, S., Sewell, W. A., Misbah, S. A. Clinical uses of intravenous immunoglobulin. Clin Exp Immunol. 142 (1), 1-11 (2005).
  31. Murakami, K., et al. Intravenous immunoglobulin preparation prevents the production of pro-inflammatory cytokines by modulating NFκB and MAPKs pathways in the human monocytic THP-1 cells stimulated with procalcitonin. Inflamm Res. 63 (9), 711-718 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Makrofagi szpiku kostnegomakrofagi otrzewneimmunoglobulina do ylnaprodukcja IL 10Western blottingstymulacja kom rekanaliza cytokinmodele mysie
Ocena wpływu leków opartych na przeciwciałach na mysi szpik kostny i aktywację makrofagów otrzewnowej
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.