Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Sekwencjonowanie całego genomu Candida glabrata w celu wykrycia markerów oporności na leki przeciwgrzybicze

12.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56714

⸱

28 grudnia 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology-Public Health, Westmead Hospital, 2Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, ICPMR, 3Marie Bashir Institute for Infectious Diseases and Biosecurity, The University of Sydney, 4Department of Microbiology and Infectious Diseases, Canberra Hospital and Health Services, Australian National University Medical School, 5Infection Management Services, Australian National University Medical School, 6Department of Microbiology and Infectious Diseases, St. Vincent's Hospital, 7Department of Infectious Diseases, Peter MacCallum Cancer Centre

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

To badanie wprowadziło sekwencjonowanie całego genomu do analizy mutacji w genach nadających oporność na leki przeciwgrzybicze u Candida glabrata. Izolaty C. glabrata oporne na echinokandyny, azole i 5-flucytozynę zostały zsekwencjonowane w celu zilustrowania metodologii. Profile wrażliwości izolatów korelowały z obecnością lub brakiem określonych wzorców mutacji w genach.

Streszczenie

Candida glabrata może szybko nabywać mutacje, które skutkują opornością na leki, szczególnie na azole i echinokandyny. Identyfikacja mutacji genetycznych ma zasadnicze znaczenie, ponieważ oporność wykryta in vitro może być często skorelowana z niepowodzeniem klinicznym. Zbadaliśmy możliwość wykorzystania sekwencjonowania całego genomu (WGS) do analizy całego genomu oporności na leki przeciwgrzybicze u C. glabrata. Celem było zidentyfikowanie czynników i barier we wdrażaniu WGS oraz zmierzenie jego skuteczności. W niniejszym artykule przedstawiono kluczowe punkty kontrolne kontroli jakości i podstawowe elementy metodologii WGS do badania markerów genetycznych związanych ze zmniejszoną podatnością na leki przeciwgrzybicze. Szacuje również dokładność analizy danych i czas realizacji testów.

Podatność fenotypowa 12 klinicznych i jednego szczepu ATCC C. glabrata została określona za pomocą testów wrażliwości przeciwgrzybiczej. Obejmowały one trzy pary izolatów od trzech pacjentów, u których rozwinął się wzrost minimalnych stężeń hamujących leku. W dwóch parach drugi izolat z każdej pary rozwinął oporność na echinokandyny. Drugi izolat z trzeciej pary rozwinął oporność na 5-flucytozynę. Pozostałe składały się z izolatów wrażliwych i odpornych na azole. Polimorfizmy pojedynczych nukleotydów (SNP) w genach związanych z opornością na echinokandynę, azol i 5-flucytozynę potwierdzono w opornych izolatach za pomocą WGS przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji.  Zidentyfikowano niesynonimiczne SNP w genach oporności przeciwgrzybiczej, takich jak FKS1, FKS2, CgPDR1, CgCDR1 i FCY2. Ogólnie rzecz biorąc, średnio 98% odczytów WGS izolatów C. glabrata zmapowano do genomu referencyjnego z około 75-krotnym pokryciem głębokości odczytu. Czas realizacji i koszt były porównywalne z sekwencjonowaniem Sangera.

Podsumowując, WGS C. glabrata był w stanie ujawnić klinicznie istotne mutacje genów związane z opornością na różne klasy leków przeciwgrzybiczych bez potrzeby wielokrotnego sekwencjonowania PCR/DNA. Stanowi to pozytywny krok w kierunku ustanowienia zdolności WGS w laboratorium klinicznym do jednoczesnego wykrywania substytucji oporności na leki przeciwgrzybicze.

Wprowadzenie

Candida glabrata jest coraz częściej spotykanym patogenem, który ma znaczenie jako gatunek wykazujący odporność na azole, a ostatnio także na echinokandyny1,2,3. W przeciwieństwie do diploidalnego C. albicans, haploidalny genom C. glabrata może pozwolić mu na łatwiejsze nabywanie mutacji i rozwijanie oporności wielolekowej. Stwierdzono również kooporność na obie klasy leków4. W związku z tym wczesna ocena wrażliwości na leki przeciwgrzybicze i wykrycie lekooporności u C. glabrata ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej, celowanej terapii, a także w kontekście zarządzania przeciwgrzybiczego w celu ograniczenia czynników powodujących oporność na środki przeciwdrobnoustrojowe1,5,6. Ustanowienie wydajnego przepływu pracy w celu szybkiego wykrywania obecności mutacji potwierdzających związanych z biomarkerami oporności w opornych izolatach również przyczyni się do poprawy decyzji dotyczących przepisywania leków i wyników klinicznych.

Podatność na leki przeciwgrzybicze jest zwykle oceniana poprzez pomiar minimalnego stężenia hamującego (MIC), które jest definiowane jako najniższe stężenie leku, które powoduje znaczne zmniejszenie wzrostu mikroorganizmu w porównaniu z kontrolą wzrostu bez leku. Instytut Standardów Klinicznych i Laboratoryjnych (CLSI) oraz Europejski Komitet ds. Badań Wrażliwości Drobnoustrojowej (EUCAST) ustandaryzowały metody badania wrażliwości, aby oznaczanie MIC było dokładniejsze i bardziej spójne7,8. Jednak użyteczność przeciwgrzybiczego MIC pozostaje ograniczona, zwłaszcza w przypadku echinokandyn, w szczególności w odniesieniu do porównań międzylaboratoryjnych, w których stosuje się różne metodologie i warunki9. Istnieje również niepewna korelacja MIC z odpowiedzią na leczenie echinokandyną i niemożnością odróżnienia izolatów WT (lub podatnych) od tych zawierających mutacje FKS (szczepy oporne na echinokandynę)10,11. Pomimo dostępności potwierdzających jednogenowych PCR i sekwencjonowania Sangera markerów oporności przeciwgrzybiczej, realizacja wyników jest często opóźniona z powodu braku jednoczesnego wykrywania wielu markerów oporności5,12. W związku z tym równoczesne wykrywanie mutacji powodujących oporność w różnych miejscach genomu, możliwe dzięki analizie opartej na sekwencjonowaniu całego genomu, oferuje znaczące korzyści w porównaniu z obecnymi podejściami.

Sekwencjonowanie całego genomu (WGS) zostało pomyślnie wdrożone do śledzenia przenoszenia chorób podczas epidemii, jak również podejście do oceny ryzyka w całym genomie i testowania oporności na leki u bakterii i wirusów13. Ostatnie postępy w technologii sekwencjonowania kwasów nukleinowych sprawiły, że sekwencjonowanie całego genomu (WGS) patogenów w klinicznie wykonalnym czasie jest zarówno wykonalne z technicznego, jak i ekonomicznego punktu widzenia. Sekwencjonowanie DNA ma istotne zalety w porównaniu z innymi metodami identyfikacji i charakterystyki patogenów stosowanymi w laboratoriach mikrobiologicznych14,15,16. Po pierwsze, zapewnia uniwersalne rozwiązanie o wysokiej przepustowości, szybkości i jakości. Sekwencjonowanie może być stosowane do każdego mikroorganizmu i pozwala na uzyskanie korzyści skali w lokalnych lub regionalnych laboratoriach. Po drugie, tworzy dane w formacie "dostosowanym do przyszłych wyzwań", które można porównywać na poziomie krajowym i międzynarodowym. Wreszcie, potencjalna użyteczność WGS w medycynie została zwiększona przez szybki wzrost publicznych baz danych zawierających genomy referencyjne, które można połączyć z równoważnymi bazami danych, które zawierają dodatkowe metadane kliniczne i epidemiologiczne17,18.

Ostatnie badania wykazały przydatność WGS do identyfikacji markerów oporności przeciwgrzybiczej z klinicznych izolatów Candida spp. 10,19,20. Wynika to głównie z dostępności wysokowydajnych sekwencerów stacjonarnych, uznanych potoków bioinformatycznych i malejących kosztów sekwencjonowania21,22. Przewagą grzybowego WGS nad sekwencjonowaniem Sangera jest to, że WGS umożliwia sekwencjonowanie wielu genomów w jednym przebiegu. Ponadto WGS genomów Candida może identyfikować nowe mutacje w celach leków, śledzić ewolucję genetyczną i pojawianie się klinicznie istotnych typów sekwencji20,22,23. Co najważniejsze, w przypadku wewnętrznej oporności wielolekowej, WGS może pomóc we wczesnym wykryciu mutacji nadających oporność przed wyborem leczenia22,24.

Tutaj zbadaliśmy wykonalność badań przesiewowych z wykorzystaniem WGS pod kątem mutacji związanych z opornością na leki na różne klasy środków przeciwgrzybiczych. Przedstawiamy metodykę wdrożenia WGS z perspektywy użytkownika końcowego i laboratorium diagnostycznego mikologii. Do tej analizy włączyliśmy trzy pary izolatów hodowane z trzech oddzielnych przypadków klinicznych, w których oporność in vitro na echinokandyny i 5-flucytozynę rozwinęła się z czasem po leczeniu przeciwgrzybiczym.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Nie wymagano zgody etycznej na to badanie.

1. Subkultura i przygotowanie inokulum dla Candida glabrata

  1. Należy wybrać panel izolatów C. glabrata do badania, który powinien również zawierać co najmniej jedną kolekcję kultur typu amerykańskiego C. glabrata (ATCC) o znanym wzorcu wrażliwości.
  2. Subkulturuj izolat, dotykając pojedynczej kolonii za pomocą sterylnej jednorazowej plastikowej pętli i rozpylając smugi na płytce z aganem dekstrozowym Sabouraud (SDA)8.
  3. Inkubować płytkę SDA przez 24-48 godzin w temperaturze 35 °C, aby uzyskać czystą kulturę izolatu o dobrym wzroście.

2. Oznaczanie wrażliwości przeciwgrzybiczej

  1. Użyj sterylnej jednorazowej plastikowej pętli, aby wybrać 4-5 kolonii o średnicy około 1 mm ze świeżo wyhodowanego izolatu C. glabrata na płytce SDA. Zawiesić ponownie w 3 ml sterylnej wody destylowanej. Dobrze wymieszać przez delikatne pipetowanie, aby uzyskać jednolitą zawiesinę.
  2. Dostosuj gęstość komórek do 0,5 McFarlanda, co odpowiada 1 x 106 do 5 x 106 komórek/ml za pomocą densytometru 8.
  3. Przeprowadzić badanie wrażliwości przy użyciu testu komercyjnego (patrz Tabela materiałów i odczynników) na wszystkich izolatach C. glabrata zgodnie z instrukcjami producenta. Zinterpretuj wrażliwość izolatów na podstawie wynikowych wartości MIC leków przeciwgrzybiczych zgodnie z wytycznymi CLSI i przygotuj raport (Tabela 1)8.

3. Ekstrakcja genomowego DNA do sekwencjonowania

  1. Zawiesić pętlę kolonii ze świeżo wyhodowanej płytki SDA w 300 μl 50 mM EDTA w probówce o pojemności 1,5 ml.
  2. Dodać 40 μl zymoliazy (10 mg/ml) do zawiesiny i delikatnie pipetować 5 razy, aż zawiesina stanie się jednolita.
  3. Inkubować próbkę w temperaturze 37 °C przez 1-2 godziny w celu wytrawienia ściany komórkowej. Schłodzić w temperaturze pokojowej przez 5 min.
  4. Odwirować zawiesinę o stężeniu 14 000 × g przez 2 minuty, a następnie ostrożnie usunąć supernatant.
  5. Ekstrahować genomowe DNA zgodnie z wytycznymi zestawu do ekstrakcji DNA (patrz tabela materiałów).
  6. Ponownie zawiesić wyekstrahowany osad DNA w 50 μl 10 mM buforu Tris (pH 7,5-8,5) zamiast buforu elucyjnego dostarczonego w zestawie.
  7. Sprawdź czystość DNA, mierząc gęstość optyczną (O.D) przy 260/280 nm25.

4. Kwantyfikacja genomowego DNA

  1. Przygotuj 1x bufor Tris EDTA (TE) dostarczony w zestawie testowym w oparciu o wytyczne producenta dotyczące testu fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów).
  2. Rozcieńczyć próbkę DNA, dodając 2 μl do 98 μl 1x buforu do oznaczania TE (końcowa objętość 100 μl, współczynnik rozcieńczenia 1:50) na jednorazowej płytce 96-dołkowej. Ten etap rozcieńczania można wykonać ręcznie za pomocą pipety wielokanałowej lub za pomocą zautomatyzowanej stacji roboczej do obsługi cieczy.
  3. Przygotować zakres wzorców, rozcieńczając DNA lambda (100 μg/ml) dostarczone w zestawie do oznaczania fluorescencji (tabela 2) i dołączyć do pomiaru wraz z próbkami.
  4. Dodać 100 μl barwnika fluorescencyjnego do 100 μl rozcieńczonych próbek DNA i wzorców do reakcji. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem.
  5. Zmierz fluorescencję wszystkich próbek w oparciu o wytyczne producenta.
  6. Wykreślić krzywą wzorcową, korzystając z odczytów fluorescencji i obliczyć pierwotne stężenie próbek DNA.
  7. Określić objętość DNA i 10 mM buforu Tris (pH 8), które należy dodać, aby dostosować stężenie DNA do 0,2 ng/μl.
  8. Wykonaj rozcieńczenia DNA za pomocą zautomatyzowanej stacji roboczej do obsługi cieczy. Ten etap można również osiągnąć poprzez pipetowanie ręczne.

5. Przygotowanie biblioteki DNA

Uwaga: Przygotowanie biblioteki i sekwencjonowanie zostało przeprowadzone zgodnie z protokołami producenta i wytycznymi dostarczonymi przez firmę (Rysunek 1A) (zobacz Tabelę materiałów).

  1. Znakowanie i amplifikacja PCR
    1. Oznacz nową 96-dołkową cienkościenną płytę cienkościenną z twardą skorupą.
    2. Dodać 5 μl ilościowo oznaczonego wejściowego DNA w stężeniu 0,2 ng/μl (łącznie 1 ng) do każdej studzienki na próbkę płytki.
    3. Dodać 10 μl buforu do znakowania i 5 μl buforu amplifikacyjnego do każdej studzienki zawierającej DNA i delikatnie pipetować do wymieszania. Uszczelnij płytę za pomocą samoprzylepnej uszczelki płytowej.
    4. Umieścić płytkę w termocyklerze i uruchomić następujący program PCR: 55 °C przez 5 minut i utrzymać w temperaturze 10 °C. Gdy próbka osiągnie temperaturę 10 °C, należy natychmiast przystąpić do neutralizacji.
    5. Dodać 5 μl buforu neutralizacyjnego do płytki, aby zneutralizować reakcję amplikonową, i delikatnie wymieszać pipetą. Zamknąć płytkę i inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.
    6. Do próbek dodać 15 μl indeksującego mastermixu PCR.
    7. Użyj pudełka z probówkami indeksowymi dostępnymi dla konfiguracji w formacie płytki 96-dołkowej, tak aby każda próbka otrzymała unikalną kombinację wskaźników na podstawie szablonu indeksu (Tabela 3).
    8. Ułóż probówki z indeksami w stojaku na płytki indeksowe (Rysunek 1B) zgodnie z kolejnością podaną w szablonie w tabeli 3 i zapisz położenie indeksów na szablonie.
    9. Umieścić płytkę do znakowania z dodatkiem PCR mastermix na stojaku na płytki indeksowe z probówkami indeksowymi w odpowiedniej kolejności.
    10. Umieść probówki startera indeksowego 1 w układzie pionowym, a probówki startera indeksującego 2 w układzie poziomym na stojaku indeksowym. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie dodać 5 μl starterów indeksujących do każdej próbki.
    11. Wymień stare nasadki probówek indeksowych na nowe, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego między indeksami.
    12. Uszczelnić płytkę za pomocą 96-dołkowych przezroczystych uszczelniaczy do płytek i przeprowadzić drugi PCR w następujący sposób: 95 °C przez 30 s, 12 cykli po 95 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s, 72 °C przez 30 s i 72 °C przez 5 min.
  2. Oczyszczanie PCR
    1. Przenieść produkt PCR do oczyszczenia PCR z płytki znakującej na płytkę z głęboką studzienką (patrz tabela materiałów).
    2. Odwiruj dostępny na rynku roztwór kulek magnetycznych (patrz Tabela materiałów) w oparciu o instrukcje producenta i dodaj 30 μl kulek do każdego produktu PCR na płytce z głęboką studzienką.
    3. Potrząsać płytką na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 1800 obr./min przez 2 minuty i inkubować w temperaturze pokojowej bez wstrząsania przez 5 minut.
    4. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty, aż supernatant się usunie.
    5. Ostrożnie wyrzucić supernatant z płytką nadal umieszczoną na stojaku magnetycznym.
    6. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu za pomocą płytki na stojaku magnetycznym.
    7. Inkubować płytkę na stojaku magnetycznym przez 30 sekund i ostrożnie wyjąć i wyrzucić supernatant, nie naruszając kulek.
    8. Powtórz ponownie etap prania i pozostaw kulki do wyschnięcia na powietrzu przez 15 minut. Usuń nadmiar etanolu, jeśli występuje.
    9. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 52,5 μl buforu do reprodukcji do kulek.
    10. Potrząsać płytką na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 1800 obr./min przez 2 minuty i inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 minuty bez wstrząsania.
    11. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym i poczekaj, aż supernatant się oczyści.
    12. Za pomocą pipety wielokanałowej ostrożnie przenieść 50 μl supernatantu z płytki czyszczącej na nową płytkę z twardą skorupą.
  3. Normalizacja biblioteki
    1. Odczynniki normalizujące bibliotekę rozmrażać zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów).
    2. Przenieść 20 μl supernatantu z płytki oczyszczającej na nową płytkę głębinową.
    3. Dodać 45 μl magnetycznej zawiesiny kulek i uszczelnić płytkę zgrzewarką do płytek.
    4. Potrząsać płytką na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 1800 obr./min przez 30 min. Ten czas inkubacji jest krytyczny i nie powinien być przekraczany.
    5. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty i upewnij się, że supernatant się oczyścił (Rysunek 1B).
    6. Usunąć i wyrzucić supernatant do odpowiedniego pojemnika na odpady niebezpieczne, tak aby tabliczka nadal znajdowała się na stojaku magnetycznym.
    7. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i umyj kulki buforem myjącym o pojemności 45 μl.
    8. Potrząsać płytką z buforem do przemywania na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 1800 obr./min przez 5 minut.
    9. Umieść płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty i wyrzuć supernatant, gdy stanie się przezroczysty.
    10. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i ponownie powtórz mycie buforem myjącym.
    11. Zdejmij płytkę ze stojaka magnetycznego i dodaj 30 μl 0,1 N NaOH.
    12. Potrząsać płytką z 0,1 N NaOH na wytrząsarce do mikropłytek z prędkością 1800 obr./min przez 5 minut i umieścić płytkę na stojaku magnetycznym na 2 minuty lub do momentu, gdy płyn będzie klarowny.
    13. Dodać 30 μl buforu elucyjnego do każdej studzienki nowej 96-dołkowej cienkościennej cienkościennej płytki bibliotecznej o twardej skorupie.
    14. Przenieść 30 μl supernatantu z płytki normalizacyjnej na końcową znormalizowaną płytkę biblioteczną, aby uzyskać końcową objętość 60 μl. Biblioteki są teraz gotowe do sekwencjonowania.
  4. Oznaczanie stężenia w bibliotece DNA metodą qPCR
    1. Rozmrozić mastermix, startery i wzorce dostarczone w zestawie qPCR zgodnie z wytycznymi producenta (patrz Tabela materiałów).
    2. Połączyć odczynnik PCR, mastermix i starter dostarczony w zestawie qPCR zgodnie z instrukcjami producenta, a podwielokrotności można przechowywać w temperaturze -20 °C.
    3. Aby określić stężenie biblioteki DNA, należy rozcieńczyć biblioteki DNA w stosunku 1:8000 przy użyciu 10 mM buforu Tris (pH 8), wykonując rozcieńczenie 1:100 (1,5 μl biblioteki DNA na 148,5 μl buforu Tris), a następnie rozcieńczenie 1:80 (2 μl od 1:100 do 158 μl buforu Tris).
    4. Potrząsać płytką rozcieńczającą przy 700 obr./min przez co najmniej 1 minutę, a następnie odwirować przy 14000 × g przez 1 min.
    5. Przygotować 20 μl końcowej reakcji PCR, mieszając 4 μl rozcieńczonej biblioteki DNA lub wzorców DNA i 16 μl mastermixu.
    6. Wykonaj PCR zgodnie z ustawieniami producenta w termocyklerze: 95 °C przez 5 minut, 35 cykli 95 °C przez 30 s i 60 °C przez 45 s i końcowe 65 °C do 95 °C dla analizy krzywej topnienia.
    7. Uzyskaj wartości Ct z bibliotek i wzorców DNA próbki z termocyklera qPCR.
    8. Wygeneruj krzywą standardową na podstawie wartości Ct wzorców (Rysunek 2). Zdefiniuj górny i dolny zakres kontroli jakości, ± 3 cykle od średniej. Na przykład, jeśli średnia wartość Ct wynosi 13 cykli, to zakres QC wynosi od 16 do 10 cykli.
    9. Określ indywidualne i średnie stężenia biblioteczne (ALC) na podstawie krzywej wzorcowej i wartości Ct.
    10. Określ objętość całkowitej puli bibliotek (PAL) do użycia na podstawie obliczeń podanych poniżej do końcowego sekwencjonowania, biorąc pod uwagę, że docelowe stężenie biblioteki wynosi od 1,4 do 1,8 pM.
      nuta: Średnie stężenie biblioteczne otrzymane z qPCR= ALC; Łączna liczba bibliotek w puli (PAL) = ALC / 2; Denaturowany PAL (DAL) = PAL * 0,666
      W zależności od objętości DAL, który jest zmieszany z buforem, jest to stężenie biblioteki, która ma być dodana do komory przepływowej. Na przykład, jeśli 65 μL biblioteki dodaje się do 835 μL buforu, to z tego rozcieńczenia (Dil 1) dodaje się 195 do całkowitej objętości 1300 μL: (65/900) * dnPAL = Dil1
      Dil1 * (195/1300) = Stężenie końcowe (powinno wynosić od 1,4 do 1,8 pM)

6. Łączenie bibliotek i inicjowanie sekwencjonowania w sekwencerze laboratoryjnym

  1. Wkład z odczynnikiem rozmrozić zgodnie z wytycznymi producenta. Wyjąć nową komorę przepływową z opakowania z miejsca przechowywania w temperaturze 4 °C i doprowadzić do temperatury pokojowej co najmniej 30 minut przed sekwencjonowaniem. Przed użyciem wyjąć wkład buforowy i bufor do sekwencjonowania wstępnego schładzania (patrz Tabela materiałów).
  2. Przygotować bibliotekę kontrolną, mieszając 5 μl biblioteki (1 nM) i 5 μl 0,2 N NaOH. Krótko wirować i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby denaturować bibliotekę kontrolną na pojedyncze nici.
  3. Dodaj 5 μl 200 mM Tris-HCl, pH 7 i wiruj. Dodać 235 μl wstępnie schłodzonego buforu do sekwencjonowania i delikatnie wymieszać. Całkowita objętość wynosi 250 μL z końcowym stężeniem biblioteki kontrolnej przy 20 pM.
  4. Połącz biblioteki DNA, przenosząc 5 μl każdej biblioteki próbek, które mają być sekwencjonowane, z końcowej znormalizowanej płytki bibliotecznej do pojedynczej probówki o niskim poziomie wiązania 1,5 ml.
  5. Dodaj 30 μl połączonej biblioteki i 30 μl 0,2 N NaOH do bibliotek denaturacyjnych w innej probówce o niskim poziomie wiązania.
  6. Wirować rurkę o niskim wiązaniu i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, aby denaturować biblioteki na pojedyncze nici.
  7. Dodaj 30 μl 200 mM Tris-HCl, pH 7 do probówki ze zdenaturowanymi bibliotekami, aby zneutralizować reakcję.
  8. Dodaj 65 μl zneutralizowanej zawiesiny zdenaturowanych bibliotek i 835 μl wstępnie schłodzonego buforu sekwencjonującego i wiru, aby dobrze wymieszać.
  9. W końcowej probówce o niskim poziomie wiązania połącz następujące elementy: 195 μl ze zobojętnionych zdenaturowanych bibliotek, 1,30 μl biblioteki kontrolnej i 1103,70 μl buforu sekwencjonującego. Dokładnie wymieszaj.
  10. Załaduj końcową mieszankę biblioteczną (1300 μl) do wyznaczonego miejsca na kartridżu z odczynnikiem.
  11. Skonfiguruj przebieg sekwencjonowania, wprowadzając szczegóły projektu i próbki na wyznaczonej stronie internetowej programu Sequencer, postępując zgodnie z wytycznymi.
  12. Rozpocznij sekwencjonowanie zgodnie z wytycznymi. Załaduj celę przepływową, kasetę z odczynnikiem z bibliotekami i kasetę buforową w sekwencerze laboratoryjnym.
  13. Zapisz numery partii wszystkich zestawów odczynników i wkładów użytych w sekwencjonowaniu.

7. Pobieranie danych ze strony internetowej sekwencjonowania

  1. Pobierz pliki FASTQ zgodnie z instrukcjami producenta podanymi na stronie internetowej.
  2. Aby uzyskać dobrą jakość przebiegu, sprawdź, czy procent Q30 wynosi ≥ 75%, a gęstość klastra wynosi od 170 do 280 K/mm2, a optymalna przy 200-210 K/mm2 (Tabela 4).

8. Sekwencjonowanie Analiza danych

  1. Importuj pliki FASTQ sekwencjonowanych próbek do zintegrowanego pakietu oprogramowania do analizy danych (patrz Tabela materiałów).
  2. Utwórz przepływ pracy sekwencjonowania w oprogramowaniu, dodając funkcje z listy, a mianowicie przycinanie, mapowanie do odniesienia (wybierz genom referencyjny), lokalne wyrównanie i analizę wariantów (Rysunek 3A) przy użyciu ustawień wymienionych w Tabeli 5.
  3. Uruchom przepływ pracy, wybierając pojedynczą próbkę lub partię przykładowych plików FASTQ i zapisz pliki wyjściowe w wyznaczonych folderach przykładów.
  4. Wygeneruj raport dla głębokości pokrycia sekwencji, zmapowanych regionów i listy wariantów strukturalnych w genomie (Rysunek 3B).
  5. Użyj listy wariantów strukturalnych, aby wyszukać niesynonimiczne polimorfizmy pojedynczego nukleotydu (SNP) w genach nadających oporność i zjadliwość.
  6. Przygotuj raport, podając lokalizację SNP, gen i liczbę izolatów opornych lub podatnych (tabela 6).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przebadano trzynaście szczepów C. glabrata, w tym C. glabrata ATCC 90030 oraz 12 izolatów z Clinical Mycology Reference laboratory (izolaty od CMRL1 do CMRL12), Westmead Hospital, Sydney (tabela 1). Obejmowały one trzy pary izolatów CMRL-1/CMRL-2, CMRL-3/CMRL-4 oraz CMRL-5/CMRL-6, pobranych przed i po terapii przeciwgrzybiczej, bez powiązań epidemiologicznych między nimi 24 (tabela 1).

W...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W badaniu tym określono wykonalność, przybliżone ramy czasowe i precyzję wykrywania lekooporności C . glabrata pod kontrolą WGS. Czas realizacji (TAT) na przygotowanie i sekwencjonowanie biblioteki wynosił cztery dni, a raportowanie analizowanych wyników jeden-dwa dni. Dla porównania, przy co najmniej podobnej ilości TAT do oznaczania wrażliwości z płytek hodowlanych i sekwencjonowania Sangera ze znacznie większą liczbą próbek. Około 30-90 genomów C. glabrata można sekwencjonować w oparciu o zdolność ko...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani konfliktu interesów, który mogliby ujawnić.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Centrum Chorób Zakaźnych i Mikrobiologii, Zdrowia Publicznego. Autorzy nie otrzymali żadnych innych funduszy na to badanie. Autorzy dziękują doktorom Alicii Arnott, Nathanowi Bachmannowi i Ranjeecie Menonowi za ich fachowe porady i pomoc w całym eksperymencie sekwencjonowania genomu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
DensiCHECK PlusBioMé rieux Inc K083536Densytometr używany do odczytów McFarland
Sensititre YeastOneTREK Diagnostic Systems, Thermo ScientificYO10Komercyjna płytka do oznaczania wrażliwości ze standardowymi lekami przeciwgrzybiczymi.
Jednorazowe pętle i igły do zaszczepiania FisherbrandFisher Scientific, Thermo Fisher Scientific22-363-605Jednorazowe plastikowe pętle mogą być używane bezpośrednio z opakowania. Nie wymaga palenia.
Probówki do mikrowirówek Eppendorf Safe-Lock SigmaAldrich, MerckT2795     Objętość 2,0 mL, naturalny
 
ZYMOLIAZA 20T firmy Arthrobacter luteusMP Biomedicals, LLC8320921Służy do lizy ściany komórkowej izolatu grzybów przed
ekstrakcją DNA
Wizard Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Promega A1120Wykonuje 100 ekstrakcji DNA
Quant-iT PicoGreen dsDNA Zestaw testowyThermo Fisher ScientificP7589  Odczynnik Picogreen określany w protokole jako barwnik fluorescencyjny.
Zawiera wzorzec DNA Lambda i odczynnik Picogreen do testu.
Zestaw do przygotowania próbek DNA Nextera XTIlluminaFC-131-1096Zawiera pudełko 1 i pudełko 2  odczynniki do 96 próbek
Zestaw indeksów Nextera XT v2IlluminaFC-131-2001,
FC-131-2002,
FC-131-2003,
FC-131-2004		Zestaw indeksów A
Zestaw indeksów B
Zestaw indeksów C
Zestaw indeksów D
NextSeq 500/550 High Output Kit v2 IlluminaFC-404-2004300 cykli, Ponad 250 próbek w zestawie
NextSeq 500 Mid Output v2 KitIlluminaFC-404-2003300 cykli, Ponad 130 próbek w zestawie
Zestaw kontrolny PhiXIlluminaFC-110-3001Aby uporządkować indeksy z zestawu indeksów w kolejności
Zestaw opraw płytowych TruSeq IndexFC-130-1005 2 Osprzęt
Zestaw do kwantyfikacji biblioteki KAPA
do sekwencjonowania nowej generacji		KAPA BiosystemsKK4824Zawiera gotowe wzorce, podkłady i
MasterMix Janus NGS Express System obsługi cieczy PerkinElmerYJS4NGSSłuży do rozcieńczania DNA podczas sekwencjonowania
  0,8 ml Płyta do przechowywaniaThermo Scientific AB0765BPłytka MIDI do czyszczenia biblioteki DNA i
normalizacji
Agencourt AMPure XPBeckman CoulterA63881  Koraliki magnetyczne w roztworze do oczyszczania biblioteki
Stojak magnetyczny-96Thermo Fisher ScientificAM10027Służy do oczyszczania DNA na bazie kulek magnetycznych
OrbiShaker MP Benchmark ScientificBT150296-dołkowa wytrząsarka do płytek z 4 platformami
Twarda skorupa PCR PłytkaBioRadHSP9601Cienkościenna, 96-dołkowy
LightCycler 480 Instrument II Roche 5015278001Mieści 96-dołkową płytkę
Microseal 'B' PCR Plate Sealing Folia, klej, optyczna BioRad  MSB1001Przezroczyste 96-dołkowe uszczelniacze do płytek
CLC Genomics WorkbenchQiagenCLCBioOprogramowanie do analizy danych, wersja 8
NextSeq500 instrumentIllumina Iluminacja Sekwencer laboratoryjny używany do sekwencjonowania nowej generacji
 

Bibliografia

  1. Beyda, N. D., et al. FKS mutant Candida glabrata: risk factors and outcomes in patients with candidemia. Clin Infect Dis. 59 (6), 819-825 (2014).
  2. Chapeland-Leclerc, F., et al. Acquisition of flucytosine, azole, and caspofungin resistance in Candida glabrata. bloodstream isolates serially obtained from a hematopoietic stem cell transplant recipient. Antimicrob Agents Chemother. 54 (3), 1360-1362 (2010).
  3. Glockner, A., Cornely, O. A. Candida glabrata-unique features and challenges in the clinical management of invasive infections. Mycoses. 58 (8), 445-450 (2015).
  4. Pfaller, M. A., et al. Frequency of decreased susceptibility and resistance to echinocandins among fluconazole-resistant bloodstream isolates of Candida glabrata. J Clin Microbiol. 50 (4), 1199-1203 (2012).
  5. Lewis, J. S., Wiederhold, N. P., Wickes, B. L., Patterson, T. F., Jorgensen, J. H. Rapid emergence of echinocandin resistance in Candida glabrata resulting in clinical and microbiologic failure. Antimicrob Agents Chemother. 57 (9), 4559-4561 (2013).
  6. Klevay, M. J., et al. Therapy and outcome of Candida glabrata versus Candida albicans bloodstream infection. Diagn Microbiol Infect Dis. 60 (3), 273-277 (2008).
  7. Arendrup, M. C., Cuenca-Estrella, M., Lass-Florl, C., Hope, W., Eucast, A. EUCAST technical note on the EUCAST definitive document EDef 7.2: method for the determination of broth dilution minimum inhibitory concentrations of antifungal agents for yeasts EDef 7.2 (EUCAST-AFST). Clin Microbiol Infect. 18 (7), 246-247 (2012).
  8. Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts. Clinical and Laboratory Standards Institute. , USA. Fourth Informational Supplement (M27-S4) (2012).
  9. Arendrup, M. C., Pfaller, M. A. Danish Fungaemia Study, G. Caspofungin Etest susceptibility testing of Candida species: risk of misclassification of susceptible isolates of C. glabrata and C. krusei when adopting the revised CLSI caspofungin breakpoints. Antimicrob Agents Chemother. 56 (7), 3965-3968 (2012).
  10. Singh-Babak, S. D., et al. Global analysis of the evolution and mechanism of echinocandin resistance in Candida glabrata. PLoS Pathog. 8 (5), 1002718(2012).
  11. Shields, R. K., Nguyen, M. H., Clancy, C. J. Clinical perspectives on echinocandin resistance among Candida species. Curr Opin Infect Dis. 28 (6), 514-522 (2015).
  12. Dudiuk, C., et al. Set of classical PCRs for detection of mutations in Candida glabrata FKS. genes linked with echinocandin resistance. J Clin Microbiol. 52 (7), 2609-2614 (2014).
  13. Koboldt, D. C., Steinberg, K. M., Larson, D. E., Wilson, R. K., Mardis, E. R. The next-generation sequencing revolution and its impact on genomics. Cell. 155 (1), 27-38 (2013).
  14. Barzon, L., et al. Next-generation sequencing technologies in diagnostic virology. J Clin Virol. 58 (2), 346-350 (2013).
  15. Didelot, X., Bowden, R., Wilson, D. J., Peto, T. E. A., Crook, D. W. Transforming clinical microbiology with bacterial genome sequencing. Nat Rev Gen. 13 (9), 601-612 (2012).
  16. Koser, C. U., et al. Routine use of microbial whole genome sequencing in diagnostic and public health microbiology. PLoS Pathog. 8 (8), 1002824(2012).
  17. Lipkin, W. I. The changing face of pathogen discovery and surveillance. Nat Rev Microbiol. 11 (2), 133-141 (2013).
  18. Sintchenko, V., Holmes, E. C. The role of pathogen genomics in assessing disease transmission. BMJ. 350, 1314(2015).
  19. Garnaud, C., et al. Next-generation sequencing offers new insights into the resistance of Candida spp. to echinocandins and azoles. J Antimicrob Chemother. 70 (9), 2556-2565 (2015).
  20. Sanmiguel, P. Next-generation sequencing and potential applications in fungal genomics. Methods Mol Biol. 722, 51-60 (2011).
  21. Mardis, E. R. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem. 6, 287-303 (2013).
  22. Zoll, J., Snelders, E., Verweij, P. E., Melchers, W. J. Next-Generation Sequencing in the mycology lab. Curr Fungal Infect Rep. 10, 37-42 (2016).
  23. Chrystoja, C. C., Diamandis, E. P. Whole genome sequencing as a diagnostic test: challenges and opportunities. Clin Chem. 60 (5), 724-733 (2014).
  24. Biswas, C., et al. Identification of genetic markers of resistance to echinocandins, azoles and 5-fluorocytosine in Candida glabrata by next-generation sequencing: a feasibility study. Clin Microbiol Infect. , (2017).
  25. Glasel, J. A. Validity of nucleic acid purities monitored by 260nm/280nm absorbance ratios. BioTechniques. 18 (1), 62-63 (1995).
  26. Cannon, R. D., et al. Efflux-mediated antifungal drug resistance. Clin Microbiol Rev. 22 (2), 291-321 (2009).
  27. Ferrari, S., et al. Gain of function mutations in CgPDR1. of Candida glabrata not only mediate antifungal resistance but also enhance virulence. PLoS Pathog. 5 (1), 1000268(2009).
  28. Rodrigues, C. F., Silva, S., Henriques, M. Candida glabrata: a review of its features and resistance. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (5), 673-688 (2014).
  29. Garcia-Effron, G., Lee, S., Park, S., Cleary, J. D., Perlin, D. S. Effect of Candida glabrata FKS1 and FKS2 mutations on echinocandin sensitivity and kinetics of 1,3-beta-D-glucan synthase: implication for the existing susceptibility breakpoint. Antimicrob Agents Chemother. 53 (9), 3690-3699 (2009).
  30. Arendrup, M. C., Perlin, D. S. Echinocandin resistance: an emerging clinical problem. Curr Opin Infect Dis. 27 (6), 484-492 (2014).
  31. Costa, C., et al. New Mechanisms of Flucytosine Resistance in C. glabrata Unveiled by a Chemogenomics Analysis in S. cerevisiae. PLoS One. 10 (8), 0135110(2015).
  32. de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., Chauhan, N. Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryot Cell. 12 (4), 470-481 (2013).
  33. de Groot, P. W., et al. The cell wall of the human pathogen Candida glabrata: differential incorporation of novel adhesin-like wall proteins. Eukaryot Cell. 7 (11), 1951-1964 (2008).
  34. Vale-Silva, L. A., et al. Upregulation of the adhesin gene EPA1 mediated by PDR1 in Candida glabrata leads to enhanced host colonization. mSphere. 1 (2), (2016).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

oporno przeciwgrzybiczadetekcja SNPsekwencjonowanie nast pnej generacjiprzygotowanie biblioteki DNAminimalne st enie hamuj cegen FKS1gen FKS2gen CgPDR1
Sekwencjonowanie całego genomu Candida glabrata w celu wykrycia markerów oporności na leki przeciwgrzybicze
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.