Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

Michelle M. Giarmarco; Whitney M. Cleghorn; James B. Hurley; Susan E. Brockerhoff

doi:10.3791/56977

Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przygotowanie świeżych plastrów siatkówki od dorosłego danio pręgowanego do eksperymentów obrazowania ex vivo

9.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/56977

⸱

9 maja 2018

Michelle M. Giarmarco¹ , Whitney M. Cleghorn¹ , James B. Hurley¹^,² , Susan E. Brockerhoff¹^,²

¹Department of Biochemistry, University of Washington, ²Department of Ophthalmology, University of Washington

W tym artykule

Podsumowanie

Obrazowanie tkanki siatkówki może dostarczyć informacji o pojedynczej komórce, której nie można uzyskać tradycyjnymi metodami biochemicznymi. Protokół ten opisuje przygotowanie wycinków siatkówki od danio pręgowanego do obrazowania konfokalnego. Fluorescencyjne czujniki kodowane genetycznie lub barwniki wskaźnikowe umożliwiają wizualizację wielu procesów biologicznych w różnych typach komórek siatkówki.

Streszczenie

Siatkówka to złożona tkanka, która inicjuje i integruje pierwsze etapy widzenia. Dysfunkcja komórek siatkówki jest cechą charakterystyczną wielu chorób powodujących ślepotę, a przyszłe terapie opierają się na fundamentalnym zrozumieniu tego, jak różne komórki siatkówki funkcjonują normalnie. Uzyskanie takich informacji za pomocą metod biochemicznych okazało się trudne, ponieważ udział poszczególnych typów komórek w środowisku komórek siatkówki jest zmniejszony. Obrazowanie siatkówki na żywo może zapewnić wgląd w wiele procesów biologicznych na poziomie subkomórkowym, dzięki rosnącej liczbie genetycznie kodowanych biosensorów fluorescencyjnych. Jednak do tej pory technika ta ograniczała się do kijanek i larw danio pręgowanego, najbardziej zewnętrznych warstw siatkówki izolowanych siatkówk lub obrazowania siatkówk w niższej rozdzielczości u żywych zwierząt. W tym miejscu przedstawiamy metodę generowania żywych wycinków siatkówki ex vivo od dorosłego danio pręgowanego do obrazowania na żywo za pomocą mikroskopii konfokalnej. Preparat ten daje poprzeczne wycinki ze wszystkimi warstwami siatkówki i większością typów komórek widocznych do wykonywania eksperymentów obrazowania konfokalnego z wykorzystaniem perfuzji. Transgeniczne danio pręgowane wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych lub bioczujników w określonych typach komórek siatkówki lub organellach są wykorzystywane do ekstrakcji informacji o pojedynczej komórce z nienaruszonej siatkówki. Dodatkowo plastry siatkówki można obciążyć fluorescencyjnymi barwnikami wskaźnikowymi, co zwiększa wszechstronność tej metody. Protokół ten został opracowany do obrazowania Ca^{2 +} w fotoreceptorach czopków danio pręgowanego, ale przy odpowiednich markerach można go dostosować do pomiaru Ca^{2 +} lub metabolitów w komórkach Müllera, komórkach dwubiegunowych i poziomych, mikrogleju, komórkach amakrynowych lub komórkach zwojowych siatkówki. Nabłonek barwnikowy siatkówki jest usuwany z plastrów, więc ta metoda nie jest odpowiednia do badania tego typu komórek. Wraz z praktyką możliwe jest generowanie seryjnych plasterków z jednego zwierzęcia do wielu eksperymentów. Ta elastyczna technika zapewnia potężne narzędzie do odpowiedzi na wiele pytań dotyczących biologii komórek siatkówki, Ca²⁺ i homeostazy energetycznej.

Wprowadzenie

Danio rerio (danio rerio) stał się powszechnie stosowany w medycynie i podstawowych badaniach naukowych¹, ze względu na swoje małe rozmiary, szybki rozwój i układy narządów kręgowców. Naturalna przezroczystość larw danio pręgowanego w połączeniu z ustalonymi metodami transgenezy umożliwiła szczegółową wizualizację procesów komórkowych u żywego zwierzęcia. Szereg genetycznie kodowanych biosensorów fluorescencyjnych zostało ukierunkowanych na określone komórki danio pręgowanego w celu wykrycia Ca²⁺², nadtlenek wodoru³, aktywacja apoptotyczna⁴ i ATP