Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej wnętrza.
Artykuł metodologiczny
Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania się oraz różnicowania we wszystkie typy komórek organizmu wskazuje, że niosą one ogromny potencjał zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym opracowaniu przedstawiamy zwięzły, krok po kroku opisany protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalne wyodrębnienie masy komórkowej wnętrza.
Protokół
Zamrożone ludzkie embriony wykorzystane do pozyskania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hES) zostały przekazane do badań po uzyskaniu odpowiedniej świadomej zgody, zgodnie z protokołami badawczymi, które zostały przejrzane i zatwierdzone zarówno przez komitet ds. wykorzystania ludzi jako obiektów badań, jak i przez komitet nadzorczy ds. badań nad embrionalnymi komórkami macierzystymi na Uniwersytecie Harvarda.
Poniższy protokół pisemny oparto na opublikowanych parametrach opisanych przez Cowana i wsp. 2004, z niewielkimi modyfikacjami.
Hodowla zarodków
Wymrozić ludzkie embriony przy użyciu zestawu Quinn's Advantage Thaw Kit i hodować w kropelkach medium Global uzupełnionego o 15% Plasmanate, aż do osiągnięcia stadium rozwiniętej blastocysty.
Izolacja wewnętrznej masy komórkowej metodą immunosurgery
Przygotowanie:
- Przygotować płytki do usuwania błony przejrzystej (zona pellucida) oraz immunochirurgii (patrz poniżej), przygotowując krople każdego z roztworów w płytkach 10 cm. Przykryć olej mineralny, aby zapobiec odparowywaniu. Przygotować jeden rząd kropel na każdy zarodek przeznaczony do derywacji.
- Acidic Tyrodes EmbryoMax, stosować bez zmian.
- Pożywka do derywacji komórek hES: 75% KO-DMEM, 10% KO-Serum Replacement, 10% Plasmanate, 2,5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) testowanej na komórkach ES, 2 mM Glutamax-I, 1% nieessentialnych aminokwasów, 50 jednostek/ml penicyliny, 50 µg/ml streptomycyny, 0,055 mM b-merkaptoetanolu, 5 ng/ml bFGF.
- Królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko ludzkim erytrocytom, zrekonstytuowane zgodnie z sugestią producenta, rozcieńczone 1:10 w pożywce do derywacji komórek hES.
- Surowica komplementu świnki morskiej, zrekonstytuowana zgodnie z sugestią producenta, rozcieńczona 1:10 w pożywce do derywacji komórek hES.
- Przed użyciem wyrównać temperaturę wszystkich płytek do 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek.
- Przygotować pipety kapilarne 50 µl-100 µl (VWR) do przenoszenia zarodków. Odciąć końce za pomocą rylca diamentowego i używać z wężykiem pipety ustnej wyposażonym w filtr 0,2 µm.
Procedura immunochirurgiczna:
Uwagi:
- W tej procedurze komórki trofektodermy są niszczone poprzez krótką ekspozycję na przeciwciała skierowane przeciwko komórkom ludzkim przy jednoczesnej aktywności dopełniacza. Z tego względu protokół działa najlepiej w przypadku wysokiej jakości embrionów z nienaruszoną trofektodermą, ponieważ jedynie integralność strukturalna blastocysty zapobiega podatności ICM na reakcję immunologiczną.
- Wszystkie procedury wykonano przy użyciu mikroskopu do mikrodissekcji wyposażonego w podgrzewany stolik.
Kroki:
- Opłucz pipetę do przenoszenia embrionów za pomocą FBS, aby zapobiec przywieraniu embrionów.
- Przenieś blastocystę z naczynia hodowlanego do kropli hES na płytce AT.
- Rozpocznij procedurę, przenosząc blastocystę z kropli hES przez serię kropli AT. W trzeciej kropli obserwuj rozpuszczanie błony przejrzystej (zazwyczaj trwa to 5-30 sekund). Należy uważać, aby nie przedobrzyć z zabiegiem, ponieważ może to naruszyć integralność embrionu.
- Przenieś blastocystę przez serię kropli pożywki do wyprowadzenia komórek hES, aby wypłukać AT. Zaleca się wcześniejsze napełnienie pipety pożywką, aby natychmiast zneutralizować reakcję AT. Blastocysty można tu przechowywać, dopóki wszystkie nie zostaną poddane obróbce AT.
- Przenieś blastocystę przez serię kropli przeciwciał pierwszorzędowych, pozostawiając ją w trzeciej kropli na 30 minut inkubacji w 37°C w inkubatorze do hodowli tkanek.
- Przenieś blastocystę przez serię kropli pożywki do wyprowadzenia komórek hES, aby wypłukać przeciwciała pierwszorzędowe.
- Przenieś blastocystę przez serię kropli dopełniacza, pozostawiając ją w trzeciej kropli w celu obserwacji lizy komórek trofektodermy. Przez pierwsze 30 sekund na stole mikroskopu obserwuj blastocystę pod kątem „pęcherzykowania” komórek trofektodermy podczas ich lizy. Jeśli liza zostanie zaobserwowana w tym czasie, pozostaw naczynie na stole mikroskopu, aby monitorować reakcję do jej zakończenia. Jeśli w ciągu pierwszych 30 sekund nie zaobserwowano pęcherzykowania, przenieś naczynie do inkubatora, sprawdzając je co 5 minut, aż większość trofektodermy ulegnie lizie. Może to potrwać od 5 do 15 minut. Ściśle monitoruj reakcję, aby zminimalizować czas trwania procesu i potencjalne uszkodzenie masy komórkowej wnętrza.
- Przenieś blastocystę przez serię kropli pożywki do wyprowadzenia komórek hES, aby wypłukać aktywność dopełniacza.
- Używając szklanej pipety o średnicy nieco mniejszej niż blastocysta (wyciągniętej z kapilar VWR 10µl), wciągnij i wypuść blastocystę, aby usunąć większość zlizowanej trofektodermy.
- Wyizolowane ICM wysiej na komórki zasilające z mitotycznie inaktywowanych fibroblastów embrionalnych myszy (MEF). MEF powinny zostać przygotowane dzień przed wyprowadzaniem i przeniesione na pożywkę do wyprowadzenia komórek hES w dniu zabiegu. Płytki NUNC z 4 dołkami dobrze sprawdzają się w początkowych etapach wyprowadzania.
- Nie niepokoj płytki przez pierwsze 1-2 dni. Następnie codziennie sprawdzaj, czy pojawił się rozrost kolonii embrionalnych komórek macierzystych (zazwyczaj widoczny w ciągu 1-2 tygodni). Pożywkę należy wymieniać w połowie objętości co drugi dzień, zaczynając od 3. dnia.
Wzrost i pasażowanie komórek ES
Gdy przyrost komórek hES osiągnie wielkość około 0,5mm lub więcej, jest on gotowy do ekspansji poprzez mechaniczne pobieranie.
- Mechanicznie rozdziel połowę przerostu i przenieś do nowych płytek zawierających świeże komórki karmne. Agregaty embrionalnych komórek macierzystych powinny liczyć około 30-50 komórek każdy. Pozostałą połowę przerostu zachowaj jako zapas dla pierwszego pasażu (p1). Przerost (p0) można pobierać kilkakrotnie w miarę jego dalszej ekspansji.
- Kolonie wtórne można w podobny sposób rozdzielać i powiększać w większych naczyniach hodowlanych aż do pasaży 3-5, po których nowe linie komórkowe mogą zostać zaadaptowane do pasażowania enzymatycznego z użyciem trypsyny. Zawartość surowicy w pożywkach hodowlanych powinna być również stopniowo redukowana do 1% i 0% podczas tych początkowych pasaży, aby zminimalizować różnicowanie komórek ES.
- Wszystkie ustanowione linie embrionalnych komórek macierzystych powinny zostać zbankowane poprzez zamrożenie części wczesnych pasaży do późniejszej ekspansji.
- Dodatkowo każda linia komórkowa powinna zostać scharakteryzowana poprzez analizę kariotypu i zwalidowana za pomocą badań pluripotencji i różnicowania in vitro oraz in vivo.
Dyskusja
Przedstawiony tutaj protokół dostarcza badaczom zwięzłego i łatwego do śledzenia schematu pozyskiwania linii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez immunosurgicalną izolację wewnętrznej masy komórkowej.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
A.E.C. jest stypendystą Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research oraz Merck Research Laboratories. Dziękujemy D. Egli i C. Cowan za porady eksperymentalne oraz dyskusje.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Quinn’Zestaw do rozmrażania Advantage Thaw Kit | Szałwia | ART-8016 | |
| Pożywka uniwersalna | Życie Globalne | GMGB-050 | |
| Plasmanate | Talecris | 61325 | |
| EmbryoMax Acidic Tyrodes | Chemicon International | MR-004-D | |
| KO-DMEM | Invitrogen | 10829-018 | |
| Zamiennik surowicy KO-Serum | Invitrogen | 10828-028 | |
| definiowana płodowa surowica bydlęca przebadana pod kątem komórek ES | Hyclone | SH30070.03 | |
| Glutamax-I | Invitrogen | 35050-079 | |
| Aminokwasy nieistotne | Invitrogen | 11140-076 | |
| Penicylina/Streptomycyna | Invitrogen | 15070-063 | |
| Rekombinowany ludzki podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów | Invitrogen | 13256-029 | |
| Beta-merkapto–etanol | Invitrogen | 21985-023 | |
| królicze przeciwciało pierwotne przeciwko ludzkim erytrocytom | Rockland Immunochemicals | 109-4139 | |
| Surowica z dopełniaczem świnki morskiej | Sigma-Aldrich | S-1639 | |
| Pipety kapilarne w rozmiarach 10 µL, 50 µL, 100 µL | VWR international | ||
| Pipety ustne z drenami | VWR international | zaopatrzone w pipety kapilarne marki VWR | |
| filtr strzykawkowy Acrodisc 0,2 μm | Pall Corporation | PN4192 | |
| 0,5% trypsyna-EDTA | Invitrogen | 25300-120 | |
| Naczynia do hodowli tkankowej | VWR international | ||
| Naczynia do hodowli tkankowych | Nalge Nunc international | ||
| stereomikroskop operacyjny Nikon SMZ1500 wyposażony w podgrzewany stół Nikon Tokai Hit ThermoPlate | |||
| embrionalne fibroblasty mysie (E12.5) |
Bibliografia
- Cowan, C. A., Klimanskaya, I., McMahon, J., Atienza, J., Whitmyer, J., Zucker, J. P., Wang, S. P., Morton, C. C., McMahon, A. P., Powers, D., Melton, D. A. Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N ENGL J MED. 350 (13), 1353-1356 (2004).
Przedruki i uprawnienia
