Artykuł metodologiczny

Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR

14.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57457

⸱

14 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dermatology, Program in Epithelial Biology, Stanford University School of Medicine, 2Program in Cancer Biology, Stanford University School of Medicine, 3Canary Center for Cancer Early Detection, Department of Radiology, Stanford University School of Medicine, 4Department of Biology, Bridgewater State University, 5System Biosciences, 6Veterans Affairs Healthcare System

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Pętla chromatyny odgrywa znaczącą rolę w regulacji genów; jednak nie ma postępu technologicznego, który pozwalałby na selektywną i odwracalną modyfikację pętli chromatyny. W tym miejscu opisujemy potężny system reorganizacji pętli chromatyny za pomocą CRISPR-dCas9 (CLOuD9), który wykazano, że selektywnie i odwracalnie moduluje ekspresję genów w docelowych loci.

Streszczenie

Ostatnie badania wyraźnie wykazały, że długodystansowe, trójwymiarowe interakcje pętli chromatyny odgrywają znaczącą rolę w regulacji ekspresji genów, ale czy pętla jest odpowiedzialna, czy jest wynikiem zmian w ekspresji genów, jest nadal niewiadoma. Do niedawna sposób, w jaki pętla chromatyny wpływa na regulację aktywności genów i funkcji komórkowych, był stosunkowo niejednoznaczny, a ograniczenia w istniejących metodach manipulowania tymi strukturami uniemożliwiały dogłębne zbadanie tych interakcji. Aby rozwiać tę niepewność, opracowaliśmy metodę selektywnej i odwracalnej reorganizacji pętli chromatyny przy użyciu CRISPR-dCas9 (CLOuD9). Dynamika systemu CLOuD9 została wykazana przez udaną lokalizację konstruktów CLOuD9 w celu ukierunkowania loci genomowych w celu modulowania lokalnej konformacji chromatyny. Co ważne, potwierdzono również zdolność do odwrócenia indukowanego kontaktu i przywrócenia endogennej konformacji chromatyny. Modulacja ekspresji genów za pomocą tej metody ustanawia zdolność do regulacji ekspresji genów komórkowych i podkreśla ogromny potencjał zastosowań tej technologii w tworzeniu stabilnych pętli chromatyny de novo, które znacząco wpływają na ekspresję genów w kontekście raka i rozwoju.

Wprowadzenie

Związek między fałdowaniem chromatyny w jądrze a specyficzną organizacją genomu wzbudził duże zainteresowanie w ostatnich latach, ponieważ wykazano, że jest ściśle związany z ekspresją genów1,2. Chociaż dokładny związek między aktywnością genów a modulacją struktury chromatyny pozostaje niejasny, postawiono hipotezę, że interakcje między kontaktami chromosomalnymi w wyniku dynamicznej trójwymiarowej organizacji chromatyny pełnią funkcję regulacji genów3. Rzeczywiście, taki efekt został dobrze zademonstrowany w locus ludzkiego genu globiny, gdzie region kontroli locus (LCR) reguluje aktywność genów globiny w sposób specyficzny rozwojowo, tworząc pętlę chromatyny między dwoma regionami4. Jednak zarówno w tym, jak i w innych regionach nie jest jasne, czy pętla chromatyny jest przyczyną, czy konsekwencją zmian w ekspresji genów.

Do tej pory wyzwania związane z badaniem tego zjawiska pozostawały nierozwiązane. Na przykład inne próby indukowania pętli chromatyny obejmowały modyfikację liniowej sekwencji DNA lub skomplikowane procedury wymagające dużej ilości wiedzy na temat konkretnych elementów, które ułatwiają pętlę5,6,7,8. Dodatkowo, podczas gdy poprzednie prace sugerowały, że pętle chromatyny napędzają ekspresję genów w określonym i ograniczonym kontekście7,8, poziom, na którym pętla chromatyny wpływa na transkrypcję globalnie, jest niepewny. Chociaż zainteresowanie wpływem pętli dalekiego zasięgu na ekspresję genów stale rosło w ostatnich latach, pytania bez odpowiedzi dotyczące nawiązywania i utrzymywania kontaktów chromatyny w celu zmiany aktywności genów utrzymują się.

Technologia, którą opracowaliśmy, wykorzystuje niedobór nukleazy zgrupowane regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR)-CRISPR-associated protein 9 (dCas9), aby umożliwić szerokie zastosowanie w dowolnym genomowym loci9. Technologia ta eliminuje złożone problemy związane z modyfikacjami liniowej sekwencji DNA i jest dostępna bez znaczącej wcześniejszej wiedzy na temat poszczególnych składników pętli. Przede wszystkim narzędzie jest uniwersalne i ma szerokie zastosowanie w pętlach chromatyny rozpoznawanych w fazie rozwoju, a także w różnych chorobach, takich jak rak. Moc CLOuD9 jest demonstrowana poprzez odwracalną zmianę struktury pętli w celu skutecznego modulowania ekspresji genów.

Protokół

1. Projekt gRNA

  1. Wybierz standardowe narzędzie do projektowania gRNA, aby zaprojektować przewodnik RNAs10. Dla każdego eksperymentu należy użyć komplementarnych par wcześniej opracowanych konstruktów CLOuD99 (tj. co najmniej 1 konstrukt S. aureus (CSA) i 1 S. pyogenes (CSP)).
    1. W wybranym narzędziu do projektowania online należy użyć sekwencji "NGG" Protospacer Adjacent Motif (PAM) o długości prowadnicy 20 bp dla CSP oraz sekwencji PAM "NNGRRT" o długości prowadnicy 21 dla CSA.
    2. Wybierz przewodniki na podstawie oceny szczegółowości i zaprojektuj przewodniki na obu pasmach, aby zmaksymalizować szanse na uzyskanie działającego przewodnika.
    3. Zamów 2 oligonukleotydy na przewodnik od producenta oligo: dla oligo do przodu dodaj "caccg" do końca 5' sekwencji prowadzącej, a dla odwróconego oligo, dodaj "aaac" do końca 5' i "c" do końca 3' przed złożeniem zamówienia.
  2. Początkowo zaprojektuj 3-5 gRNA dla każdego regionu zainteresowania, rozłożone na obszarze 250-1000 pz. Oceń skuteczność celowania gRNA w następujący sposób:
    1. Klon zidentyfikował gRNA do aktywnego plazmidu Cas9 (patrz krok 3) i przejściowo transfekował do komórek 293T (patrz krok 4)11.
    2. Hoduj komórki przez 2-3 dni w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Medium (DMEM) z 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną-streptomycyną (paciorkowcowość), a następnie zbierz i wyekstrahuj genomowe DNA12.
    3. Amplifikacja docelowych regionów za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR). Uruchom produkty na 1,5% żelu agarozowym i oczyść odpowiednie pasma.
    4. Wykonaj test endonukleazy T7 zgodnie z opisem w protokole Guschin i wsp.13,14.
      UWAGA: Skuteczne prowadnice to te, które są zdeterminowane do cięcia DNA w miejscu docelowym.

2. Hodowla komórkowa

  1. Utrzymuj komórki w zdrowym i aktywnie dzielącym się stanie.
    1. W przypadku K562 hodowla w pożywkach Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 z 10% FBS i 1% paciorkowca.
      1. Hoduj K562s w kolbie z szyjką o średnicy 25 cmi 2 w celu konserwacji i dostosuj gęstość komórek do 400 000 komórek na ml każdego dnia.
      2. Po transdukcji K562 za pomocą konstruktów CLOuD9 dodać 2 μg/ml puromycyny i 100 μg/ml higromycyny do pożywki konserwującej.
    2. Dla 293Ts hodowla w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle Medium (DMEM) z 10% FBS i 1% paciorkowcem.
      1. Wyhoduj 293Ts na 10 cm2 talerzach i podziel, gdy się zlewają.

3. Przygotowanie plazmidu i insercja gRNA15

Uwaga: Mapy plazmidów są dostępne w dodatku, a startery użyte w przykładowych eksperymentach są dostępne w Tabeli Uzupełniającej 1.

  1. Wymieszaj 5 μg lentiwirusowego plazmidu CRISPR z 3 μl BsmBI, 3 μl fosfatazy alkalicznej, 6 μl 10x buforu i 0,6 μl świeżo przygotowanego 100 mM DTT. Doprowadzić całkowitą objętość do 60 μl za pomocąddH2O i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut w celu trawienia i defosforylacji plazmidu.
  2. Żel oczyszcza strawiony plazmid i eluuje w ddH2O.
  3. Wymieszaj 1 μl każdego z sparowanych prowadników w 100 μM z 1 μl 10x buforu ligacyjnego T4, 6,5 μl ddH2O i 0,5 μl T4 PNK, aby uzyskać 10 μl całkowitej objętości. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, następnie w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie zmniejszać do 25 °C w temperaturze 5 °C/min.
    Uwaga: Spowoduje to wyżarzanie pary prowadnic.
  4. Rozcieńczyć wyżarzane prowadnice (od kroku 3.3) w stosunku 1:200 w ddH2O.
  5. Zmieszać 1 μl strawionego plazmidu z kroku 3.2 z 0,5 μl rozcieńczonych ligowanych prowadnic z kroku 3.4, 2,5 μl 2x buforu, 1 μl ddH2O i 0,5 μl ligazy, aby uzyskać całkowitą reakcję 5,5 μl. Inkubuj to w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby podwiązać przewodniki do plazmidu trawionego przez BsmBI.
  6. Przekształć nowo ligowany plazmid z kroku 3.5 w bakterie Stbl3 i amplifikować przy użyciu dowolnej metody przygotowania plazmidu.

4. Produkcja lentiwirusów

  1. Policz 750 000 komórek 293T na studzienkę na płytkę sześciodołkową za pomocą hemocytometru i zasiaj je w DMEM z 10% FBS i 1% paciorkowcem. Użyj jednej studni dla każdej konstrukcji.
  2. 24 godziny po wysiewie zmień pożywkę na świeży DMEM bez antybiotyków z 10% FBS.
  3. W jednej probówce rozcieńczyć 11 μl odczynnika do transfekcji na bazie lipidów ze 150 μl pożywki OptiMEM, na reaction11.
  4. W osobnej probówce rozcieńczyć 2 μg plazmidu wektora lentiwirusowego CLOuD9 z kroku 3.6, 0,35 μg pMDLg/pRRE, 1 μg pRSV-Rev i 0,65 μg pMD2.G ze 150 μl pożywki OptiMEM, na reaction11.
  5. Dla każdej reakcji dodać rozcieńczone mieszaniny plazmidów lentiwirusowych do rozcieńczonego odczynnika do transfekcji na bazie lipidów w stosunku 1:1 i inkubować przez 5 min11.
  6. Dodać całą objętość każdego zmieszanego kompleksu z kroku 4.5 do odpowiednich studzienek komórek 293T wolnych od antybiotyków z kroku 4.2.
  7. 48 godzin później zebrać pożywkę do produkcji wirusa, pipetując do świeżej probówki i wirować do 300 x g przez 5 minut. Po odwirowaniu przenieś supernatant do nowej probówki, aby usunąć resztki komórek.
  8. Natychmiast należy użyć pożywki do produkcji wirusa w celu transdukcji komórek docelowych lub zamrozić w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.

5. Transdukcja komórek w lentiwirusie

  1. Dodaj 250 μl każdego interesującego konstruktu wirusa (składającego się z komplementarnych plazmidów CLOuD9) do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej 80 000 komórek do aplikacji CLOuD9.
  2. Doprowadzić całkowitą objętość pożywki w każdym stożku do 1 ml za pomocą pożywki wolnej od antybiotyków i dodać polibren do końcowego stężenia między 1-8 μg/ml (maksymalne stężenie polibrenu tolerowane przez zastosowany typ komórki będzie musiało zostać określone doświadczalnie).
  3. Wirować komórki w temperaturze 800 x g przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie ponownie zawiesić przez pipetowanie bez usuwania supernatantu wirusa. Przenieść całą zawiesinę komórkową na płytkę do hodowli komórkowej.
  4. 24 godziny po transdukcji, wirować komórki w dół przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
  5. Odessać wirusowy supernatant i ponownie zawiesić komórki w zwykłej pożywce do hodowli komórkowych.
  6. Następnego dnia dodaj puromycynę (1 μg/ml dla komórek 293T) i higromycynę (25 μg/ml dla komórek 293T) do pożywki do hodowli komórkowej, aby wybrać komórki podwójnie transdukowane. Eksperymentalnie określić odpowiednie stężenia puromycyny i higromycyny dla danego typu komórki przed rozpoczęciem eksperymentów.
  7. Komórki należy przechowywać w pożywce selekcyjnej przez co najmniej 3 dni przed jakimikolwiek dalszymi eksperymentami i utrzymywać w pożywce selekcyjnej przez cały czas trwania wszystkich eksperymentów.

6. Dimeryzacja i wypłukiwanie komórek

  1. Dodać 1 mM kwasu abscysynowego (ABA) lub równoważną objętość dimetylosulfotlenku (DMSO) do kontroli do hodowli komórkowej w celu dimeryzacji wybranych i transdukowanych komórek CLOuD9. Zużyć ABA w ciągu 6 miesięcy od daty otrzymania, przechowywać w chłodnym miejscu i chronić przed światłem przez cały okres użytkowania. W razie potrzeby można użyć 2 mM ABA.
    1. Zmieniaj pożywkę codziennie, aby zapewnić świeże ABA (lub DMSO dla kontroli) na czas trwania eksperymentów.
      UWAGA: Nie zaobserwowano jeszcze ograniczenia długości dimeryzacji.
  2. Odwrotna dimeryzacja poprzez usunięcie pożywki zawierającej ABA i dwukrotne przemycie komórek roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS), aby pokryć powierzchnię płytki. Następnie hoduj komórki w pożywkach wolnych od ABA, aby utrzymać stan niedimeryzowany.

7. Immunoprecypitacja i ko-immunoprecypitacje

UWAGA: Spraw, aby wszystkie były świeże i bezpośrednio przed użyciem.

  1. Po zakończeniu eksperymentów dimeryzacji zbierz i odwiruj komórki, a następnie odessaj supernatant.
  2. Sieciowanie i zamrażanie komórek
    1. Przygotuj świeży zapas 1% formaldehydu w PBS w temperaturze pokojowej, używając świeżych materiałów. Na każde 2 miliony komórek delikatnie ponownie zamieszaj z 1 ml 1% formaldehydu w temperaturze pokojowej dokładnie przez 10 minut, obracając.
      UWAGA: Użyj minimalnej objętości 10 ml do sieciowania mniej niż 10 milionów komórek.
    2. Usieciowanie hartować z dodatkiem glicyny do końcowego stężenia 0,125 M, a następnie inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, obracając się.
    3. Zakręć komórki i umyj 1-2x lodowatym PBS. Granulki komórkowe można następnie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C lub natychmiast zużyć.
      UWAGA: Ciepło odwróci wiązania krzyżowe formaldehydu. W pośpiechu komórki mogą być przechowywane bezpośrednio w temperaturze -80 °C bez szybkiego zamrażania.
  3. Przygotować koniugat przeciwciało/kulka
    Uwaga: Optymalizacja warunków dla wybranego przeciwciała (tj. testowanie różnych do lizy komórek i przeprowadzanie IP) może być warta zachodu. Dwa popularne, bufor do lizy Farnham i zmodyfikowany bufor RIPA, mogą mieć znaczący wpływ na wydajność IP i wydajność sonikacji. Wszystkie kompozycje buforowe znajdują się w Tabeli Materiałów. Dodatkowo należy pamiętać, że sonikacja chromatyny może potrwać kilka godzin.
    1. Ponownie zawiesić kulki, krótko wirując, jeśli jest to odpowiednie dla wybranego przeciwciała.
    2. Przenieś odpowiednią ilość koralików do eksperymentu do probówki o pojemności 1,5 ml. Jako punkt wyjścia użyj 20 μl kulek na każdy 1 μg przeciwciała. Nie dodawaj jeszcze przeciwciała.
      UWAGA: Jako punkt wyjścia należy użyć 10 μg przeciwciała z 200 μl kulek na 1 mg całkowitego lizatu, chyba że wiadomo, że przeciwciało jest mniej lub bardziej skuteczne, niż by to sugerowało. W przypadku białek o niskiej liczebności może być konieczna korekta tego stosunku.
    3. W przypadku stosowania buforu do lizy Farnhama, przemyć 3x w buforze rozcieńczającym IP. W przypadku stosowania buforu do lizy RIPA należy przemyć 3x w buforze do lizy RIPA.
    4. Ponownie zawieś koraliki w końcowym woluminie tego samego bufora z kroku 7.3.3 (rozcieńczenie IP lub bufor RIPA), który jest >1x i <5x większy niż objętość początkowa. tj. W przypadku początkowej objętości kulki 100 μl należy użyć od 100 do 500 μl końcowej objętości zawiesiny.
    5. Dodaj przeciwciało do umytych kulek teraz w odpowiednim stężeniu. Aby uzyskać dobre przeciwciało HA lub Flag przeciwko konstruktom IP CLOuD9, należy użyć przeciwciał w stosunku 1:50 (μg białka: μg lizatu białkowego) i inkubować między 8+ h i przez noc w temperaturze 4 °C, obracając się. Alternatywnie inkubować przez 2-4 godziny w temperaturze pokojowej.
    6. Usunąć supernatant z kulek i wyrzucić.
    7. Płukanie koralików 3x za pomocą bufora do mycia.
    8. Zawiesić w minimalnej objętości bufor używany do nocnej inkubacji z przeciwciałem (rozcieńczenie IP lub bufor RIPA). Przechowywać w chłodzie, aż połączy się z lizatem białkowym.
  4. Sonizacja chromatyny
    1. Najpierw poddaj komórki lizie z dodatkiem buforu pęczniejącego do granulek komórek na lodzie przez 10 minut, przesuwając komórki co kilka minut, aby zapobiec osiadaniu.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, 500 μl buforu pęczniejącego dodaje się do 25 milionów komórek i stamtąd skaluje, ale nie należy używać mniej niż 500 μl buforu na <25 milionów komórek.
    2. Odbijaj ręcznie zarówno zgodnie z ruchem wskazówek zegara, jak i przeciwnie do ruchu wskazówek zegara, po 13 razy.
    3. Następnie wirować jądra w dół w temperaturze 4 °C przez 5 minut w temperaturze 1 500 x g. Całkowicie odessać supernatant i powtórzyć w celu usunięcia pozostałego supernatantu, a następnie zważyć osad komórkowy w mg.
    4. Dodaj inhibitor proteazy do buforu do lizy jąder (bufor Farnhama lub bufor RIPA, powyżej, wybierz jeden).
    5. Dodać 10 razy więcej buforu do lizy jąder do granulowanych jąder w celu ponownego zawieszenia (na przykład dodać 1 ml buforu do lizy jąder do 0,100 g osadu). Krótko wirować i lizować przez 10 minut na lodzie.
      UWAGA: Należy pamiętać o rozmiarze rurki do sonikacji. Idealna objętość to często <1 ml, więc próbki mogą wymagać podzielenia się, jeśli granulki są bardzo duże.
      1. W przypadku Co-IP, należy krótko poddać sonikację jąder, aby rozpuścić materiał i schłodzić SDS do poziomu umożliwiającego immunoprecypitację za pomocą 2-3 objętości buforu rozcieńczającego, a następnie przejść do kroku 7.4.6. W przypadku bardzo wrażliwych przeciwciał należy dodać więcej buforu rozcieńczającego, aby jeszcze bardziej zmniejszyć stężenie SDS.
        UWAGA: Przerwij sonikację, gdy lizat się usunie; Zmieni się z nieprzezroczystej/półprzezroczystej bieli na całkowicie przezroczyste. Utrzymuj próbki tak zimne, jak to możliwe i nie przesadzaj z dźwiękiem.
      2. W przypadku ChIP należy dokładnie poddać sonikę DNA, aby uzyskać fragmenty DNA o długości 150-1000 pz, a następnie przejść do kroku 7.4.6.
    6. Wirować nierozpuszczalny materiał z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    7. Przenieś rozpuszczalny materiał do świeżej probówki.
    8. W przypadku Co-IP zmierz stężenie białka i przejdź do obniżania w kroku 7.5.
    9. W przypadku ChIP usunąć 10 μl podwielokrotności oczyszczonego lizatu i dodać 40 μl buforu elucyjnego IP i 6 μl 5 M NaCl do tego, co daje w sumie 56ul. Gotować przez 15 minut w temperaturze 95 °C, dodać 5-10 μl 3 M NaOAc pH 5 i oczyścić na kolumnie oczyszczającej PCR. Zmierz stężenie DNA, mierząc absorbancję przy 260 nm i standaryzuj próbki. Następnie przejdź do rozwijania w kroku 7.5.
      UWAGA: Dodatkowy lizat można zamrozić w temperaturze -80 °C i użyć w późniejszym czasie, ale najlepsze wyniki uzyskuje się ze świeżego lizatu. W przypadku zamrażania nie zamrażaj/nie rozmrażaj lizy więcej niż raz.
  5. Rozwijanego
    1. Przenieś odpowiednią ilość lizatu białkowego do świeżej probówki. W przypadku stosowania buforu do lizy Farnhama, rozcieńczyć w 2,1 objętości buforu rozcieńczającego IP (powyżej).
    2. Odłożyć 100 μl supernatantu do kontroli wejściowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do następnego dnia.
    3. Dodaj teraz koniugat kulka/przeciwciało z kroku 7.3.8 do próbek.
    4. Obracaj próbki w temperaturze 4 °C przez noc i upewnij się, że objętość jest wystarczająca do ruchu cieczy w probówkach o pojemności 1,5 ml.
  6. Umyj i elute
    1. Po nocnej rotacji zachowaj supernatant jako frakcję niewiążącą. Następnie umyj kulki 3-5x w buforze rozcieńczającym IP.
    2. Przygotować bufor elucyjny IP w temperaturze pokojowej, bez inhibitorów.
    3. Kompleksy elutyczne z 50 μl buforu elucyjnego wstrząsać wirem w temperaturze 67 °C przez 15 minut. Przenieść elucję do nowej probówki i powtórzyć z kolejnymi 50 μl. Połączyć je oba, aby uzyskać łącznie 100 μl elucji.
      UWAGA: Jeśli jest zbyt dużo tła z tej procedury elucji, ciepło może zostać zmniejszone lub wyeliminowane podczas wytrząsania/inkubacji. Na ogół zmniejsza to wydajność białka docelowego, ale znacznie zmniejsza tło.
  7. Odwrotne usieciowanie przez ogrzewanie w temperaturze 67 °C przez >4 h.
    UWAGA: Nie jest to absolutnie konieczne w przypadku Co-IP, ale może być pomocne. >
    1. W przypadku Co-IP, aby zapewnić pełną dimeryzację między interesującymi celami, uruchom eluaty na żelu SDS Page i sonduj przeciwciała przeciwko znacznikowi HA lub znacznikowi Flag, jak wskazano, wszystko w stosunku 1: 1,000. Następnie przejdź do kroku 8.
    2. W przypadku ChIP-qPCR, aby zapewnić prawidłową lokalizację i ukierunkowanie każdego składnika CRISPR-dCas9, należy oczyścić produkt elucji na kolumnie i wymyć w 10 μl. Przeprowadzić ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) oczyszczonego DNA w czasie rzeczywistym. Startery wykorzystane w prezentowanych danych dostępne są w tabeli uzupełniającej 1. Następnie przejdź do kroku 8.

8. Ekstrakcja RNA i ilościowy PCR

  1. Aby zbadać wywołane przez CLOuD9 zmiany w ekspresji genów, najpierw wyizoluj i oczyść całkowite RNA zarówno z osadów komórek kontrolnych, jak i dimeryzowanych osadów komórkowych.
  2. Wykonaj komplementarne DNA (cDNA) z oczyszczonego RNA metodą odwrotnej transkrypcji17 i wykonaj analizy qPCR. Podkłady są dostępne w Tabeli Uzupełniającej 1.

9. Test wychwytywania konformacji chromosomów

  1. Aby zaobserwować zmiany w częstości kontaktów loci genomowych indukowanych przez CLOuD9, należy przeprowadzić testy wychwytywania konformacji chromosomów (3C)8.
  2. Określ ilościowo produkty ligacji 3C w dwóch zestawach duplikatów dla każdej z trzech kontrprób biologicznych za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Normalizować próbki do sygnałów 3C z locus tubuliny. Podkłady są dostępne w Tabeli Uzupełniającej 1.

Wyniki

CLOuD9 indukuje odwracalną pętlę między promotorem β-globiny a LCR. Odpowiednie zastosowanie systemu CLOuD9 indukuje odwracalny kontakt między komplementarnymi konstruktami CLOuD9 CSA i CSP poprzez dodanie lub usunięcie ABA z pożywki hodowli komórkowej (Rycina 1a). Konstrukty CSA i CSP (Rycina 1b) są lokalizowane w odpowiednich regionach genomowych przy użyciu standardowych gRNA CRISPR. Biorąc pod uwagę obszerną dokumentację ludzkiego locus globin oraz częste fałdowanie i reorganizację chromosomową zachodzącą w tym miejscu podczas rozwoju, region ten został wybrany w celu zademonstrowania użyteczności systemu CLOuD9. Dodatkowo wybrano linię komórkową K562, ponieważ wykazano, że konsekwentnie wykazuje ona wysoką ekspresję płodowego genu γ-globiny, w przeciwieństwie do genu β-globiny, który jest zazwyczaj eksprimowany w zdrowych komórkach linii erytroidalnej osób dorosłych. Dzięki zastosowaniu komórek K562 można zbadać zdolność CLOuD9 do modyfikowania ekspresji genów poprzez próbę przywrócenia ekspresji genu β-globiny w tej linii komórkowej.

Przed indukcją dimeryzacji wykorzystano immunoprecypitację chromatyny z ilościową reakcją PCR (ChIP-qPCR), aby zapewnić dokładną lokalizację i celowanie każdego komponentu CLOuD9 (Rycina uzupełniająca 1). Ponadto koimmunoprecypitacja (Co-IP) w obecności i w nieobecności ABA potwierdziła dimeryzację CSA i CSP w obecności ligandu, a także odwracalność procesu w jego nieobecności (Rycina 1c oraz Rycina uzupełniająca 2). 24 h po dodaniu ABA, w komórkach zawierających obie części dimeryzujące, lecz nie w kontrolach zawierających tylko dwa konstrukty CSA lub CSP, odnotowano zwiększenie kontaktu między β-globiną a LCR, co zmierzono za pomocą metody uchwycenia konformacji chromosomów (3C), potwierdzając tym samym specyficzność zmian w chromatynie dla celowanych miejsc (Rycina 1c oraz Ryciny uzupełniające 3,4). Utworzenie interakcji LCR-β-globina nie wyeliminowało całkowicie endogennego kontaktu LCR-globina, lecz raczej dopełniło pierwotny kontakt, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami8. Wzrost liczby kontaktów β-globina/LCR obserwowano do 72 h dimeryzacji, niezależnie od dokładnego regionu w obrębie celowanego LCR i regionu promotora β-globiny (Ryciny uzupełniające 5,6). Na koniec, odwracalność systemu potwierdzono za pomocą metody 3C po usunięciu ABA, co wykazało całkowity powrót do endogennej konformacji (Rycina 1d oraz Ryciny uzupełniające 3-6).

Przyjęliśmy, że sukces odniesiony w komórkach K562 może wynikać z lokalizacji locus globiny w regionie euchromatyny (Rysunek 1d), dlatego w celu zbadania tej hipotezy wykorzystano drugą linię komórkową. System CLOuD9 zastosowano w komórkach HEK 293T w regionach heterochromatycznych, które nie wykazują ekspresji genów globiny (Rysunek 1e). Wynik był podobny do tego, który zaobserwowano w komórkach K562; metodą 3C po 24 h inkubacji z ABA zmierzono więcej oddziaływań LCR β-globiny (Rysunek 1e oraz Rysunek uzupełniający 3), co stanowi dowód na wysoką zdolność systemu CLOuD9 do funkcjonowania w różnych środowiskach komórkowych, niezależnie od pierwotnego stanu lub konformacji chromatyny.

Aby potwierdzić szeroką stosowalność metody CLOuD9, przetestowano dodatkowe loci, w tym promotor Oct4 oraz dystalny enhancer 5' w komórkach 293T. Wcześniej w tej linii komórkowej nie wykryto ekspresji Oct4, a ponadto nie opisano żadnych endogennych kontaktów. Dowody na ekspresję Oct4 w embrionalnych komórkach macierzystych wynikającą z kontaktu z dystalnym enhancerem 5' stały się motywacją do przeprowadzenia tego eksperymentu; analogiczny wynik zaobserwowano w locus β-globiny18. Kontakt między dystalnym enhancerem a promotorem Oct4 zidentyfikowano w komórkach z zastosowaniem CLOuD9, ale nie w komórkach kontrolnych (Rycina 1f). Dodatkowo zaobserwowano, że interakcja promotora Oct4 z dystalnym enhancerem 5' doprowadziła również do kontaktu enhancera 3' z promotorem Oct4. Zdarzenie to jest zgodne z dowodami wskazującymi, że enhancer 3' oddziałuje z kompleksem promotor Oct4/dystalny enhancer 5' podczas endogennej aktywacji genu10.

CLOuD9 indukuje specyficzne dla kontekstu zmiany w loci genów. Po potwierdzeniu, że system CLOuD9 rzeczywiście indukuje kontakty chromosomowe w loci genów, postanowiliśmy zbadać wpływ pętli na ekspresję genów. Udokumentowano, że transkrypcja genów globiny oraz Oct4 jest zależna odpowiednio od kontaktów między LCR a loci genów globin oraz między dystalnym enhancerem 5' a promotorem Oct41,11. W związku z tym postawiliśmy hipotezę, że wykorzystanie systemu CLOuD9 do wymuszenia tworzenia pętli chromatyny w każdej z tych regionów doprowadzi do indukcji ekspresji genów.

W obu loci analiza RT-qPCR wykazała, że pętle chromatyny indukowane przez ABA doprowadziły do wzrostu ekspresji Oct4 w komórkach 293T oraz ekspresji β-globiny w komórkach K562, choć nie zaobserwowano tego w komórkach 293T (Rycina 2a). Mimo że dodanie ABA do hodowli komórkowej na okres zaledwie 24 h znacząco zwiększyło ekspresję β-globiny, ekspresja ta nadal rosła stale do 72 godzin i była odwracalna po wypłukaniu ABA (Rycina 2a). Wszystkie komórki K562, z wyjątkiem kontrolnych, wykazywały ten trend, niezależnie od miejsca rozmieszczenia komponentów dimeryzacji w obszarach LCR i promotora β-globiny (Rycina 2a oraz Ryciny uzupełniające 7,8). Potwierdzeniem tych wyników była analiza ChIP-qPCR dla H3K4me3 oraz RNA Pol-II w locus β-globiny w komórkach K562 i 293T, która korelowała z obserwowanymi zmianami w transkrypcji (Rycina 2c-f).

CLOuD9 tworzy stabilne pętle chromatyny. Choć krótkotrwała indukcja pętli za pomocą CLOuD9 przebiegała zgodnie z oczekiwaniami, należało sprawdzić, czy długotrwała indukcja zapętlenia wywołuje odmienne efekty. Aby to zbadać, komórki hodowano w obecności ABA przez 10 dni. Chociaż zarówno w komórkach K562, jak i 293T odnotowano zwiększoną częstotliwość kontaktów między locus β-globiny a LCR w porównaniu z grupami kontrolnymi (Rycina 3a, b oraz Ryciny uzupełniające 9, 10), zmiany w ekspresji β-globiny zaobserwowano nadal wyłącznie w komórkach K562 (Rycina 3c). Co ciekawe, zauważono jednak, że w komórkach K562, w których nastąpiła silna upregulacja transkrypcji, długotrwała dimeryzacja przestała być odwracalna (Rycina 3a oraz Ryciny uzupełniające 9-11). Natomiast w komórkach 293T, w których po długotrwałej dimeryzacji nie zaobserwowano zmian w transkrypcji, indukowane zmiany w kontaktach chromatyny pozostały odwracalne (Rycina 3b oraz Rycina uzupełniająca 9).

Ogólnie zaobserwowano jedynie niewielki spadek ekspresji genów po 10 dniach od usunięcia ABA, która pozostała na poziomie znacząco wyższym niż poziomy ekspresji genów przed dimeryzacją (Rycina 3c). Zgodnie z tym, komórki K562, ale nie komórki 293T, wykazały w badaniu ChIP-qPCR trwałe zmiany w H3K4me3 oraz RNA Pol-II w locus β-globiny w porównaniu z kontrolą, nawet po 10 dniach od usunięcia ABA (Rycina 3d-f). Zatem nasze wyniki wskazują, że stabilność pętli chromatynowej wiąże się z bardziej trwałą ekspresją genów.

Schemat metody eksperymentalnej CRISPR dCas9, oś czasu edycji genów, wykresy sieciowania, K562, 293T.
Rycina 1: CLOuD9 indukuje odwracalne zapętlenie promotora β-globiny i LCR. (a) Dodanie kwasu abscysynowego (ABA, zielony) zbliża do siebie dwa komplementarne konstrukty CLOuD9 (CLOuD9 S. pyogenes (CSP), CLOuD9 S. aureus (CSA), odpowiednio czerwony i niebieski), przebudowując strukturę chromatyny. Usunięcie ABA przywraca endogenną konformację chromatyny. (b) Konstrukty CLOuD9 łączą technologię CRISPR-dCas9 z S. aureus i S. pyogenes z odwracalnie dimeryzującymi domenami PYL1 i ABI1. (c) Oś czasu eksperymentów dimeryzacji CLOuD9. (d) Analiza 3C mierząca częstotliwości sieciowania w obrębie locus β-globiny w komórkach K562 po 24 h traktowania ABA (czerwony) i następującym po nim wypłukaniu (niebieski), wykazująca odwracalność indukowanych kontaktów β-globiny/LCR (wyróżnione na szaro). Pomarańczowe groty strzałek wskazują specyficzne regiony docelowe konstruktu CLOuD9. Fragment EcoRI zawierający miejsca nadwrażliwości 1-4 LCR (czarny pasek) służył jako region kotwiczący. Oceniono częstotliwość jego sieciowania z innymi wskazanymi fragmentami EcoRI (nazwy na górze wykresu). Ludzkie geny β-globiny i miejsca nadwrażliwości LCR przedstawiono na dole wykresu wraz z koordynatami pozycji chromosomalnej. Dane z ChIP-seq dla H3K4me3 i H3K9me3 wykazują, że region ten jest euchromatyczny w komórkach K562. (e) Podobne odwracalne zmiany w strukturze chromatyny obserwuje się w komórkach HEK 293T, mimo dowodów z danych ChIP-seq dla H3K4me3 i H3K9me3, że region globiny jest heterochromatyczny w tym typie komórek. (f) Analiza 3C mierząca częstotliwości sieciowania w obrębie locus Oct4 w komórkach 293T po 72 h traktowania ABA (czerwony), wykazująca indukowane kontakty Oct4/dystalny enhancer (wyróżnione na szaro). Pomarańczowe groty strzałek wskazują specyficzne regiony docelowe konstruktu CLOuD9. Fragment MboI zawierający promotor Oct4 (czarny pasek) służył jako region kotwiczący. Oceniono częstotliwość jego sieciowania z innymi wskazanymi fragmentami MboI (nazwy na górze wykresu). Ludzkie regiony Oct4 przedstawiono na dole wykresu wraz z koordynatami pozycji chromosomalnej. Wszystkie wyniki 3C uzyskano z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Wartości 3C znormalizowano do tubuliny. Dla β-globiny częstotliwości oddziaływań między fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Dla Oct4 częstotliwości oddziaływań między fragmentem kotwiczącym a fragmentem kontrolnym ujemnym poza regionem oddziaływania Oct4 ustawiono na zero. Słupki błędu oznaczają s.d. n=3. Rycina ta została zmodyfikowana z Ryciny 1 w Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ekspresji genów; wyniki qPCR; wykresy i schematy; β-globin, Oct4, H3K4me3, Pol-II.
Rycina 2CLOuD9 indukuje specyficzne dla kontekstu zmiany w ekspresji genów i stanie chromatyny. (a) Indukowane przez CLOuD9 zapętlenie chromatyny w locus β-globiny skutkuje odwracalną indukcją ekspresji β-globiny w komórkach K562, ale nie w 293T. Istotność podano w stosunku do komórek kontrolnych. Dwustronny test t Studenta t-testy *P<0.05, t = 3,418, df = 5; ***P<0.0001, t = 10,42 df = 5; n.s. nieistotne statystycznie. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (s.d.). n = 3. (b) Zaobserwowano indukcję ekspresji Oct4 w komórkach 293T po pętleniu w tym samym locus wywołanym przez CLOuD9. Istotność podano w stosunku do komórek kontrolnych. Dwustronny test t Studenta t-testy *P<0.05, t = 4,562, df = 2. Słupki błędu oznaczają s.d. (c) Schemat rozmieszczenia starterów do ChIP-qPCR w obrębie regionu kodującego genu β-globiny. (d,e) ChIP-qPCR wykazuje odwracalne zmiany w poziomie H3K4me3 w locus β-globiny w komórkach K562, ale nie w 293T, po indukcji pętlowania przez CLOuD9. Dwustronny test t studenta t-testy *P<0,05, **P<0,001, ***P<0,0001. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (s.d.). (f) Zmiany w transkrypcji β-globiny w komórkach K562 pośredniczone przez CLOuD9 odpowiadają zwiększeniu zajętości przez polimerazę RNA Pol-II w obrębie całego ciała genu β-globiny. Dwustronny test t Studenta t-testy *P<0,05, **P<0,001, ***P<0,0001. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe (s.d.). Rycina została zmodyfikowana na podstawie Rycina 2 w Morgan, Stefanie L., i wsp..9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza ChIP-qPCR wykazująca ekspresję genów i sieciowanie w komórkach K562 i 293T po wypłukaniu ABA.
Rycina 3CLOuD9 tworzy stabilne pętle chromatynowe, które podtrzymują silną ekspresję genów po długotrwałej dimeryzacji. (a,b) Analiza 3C wykazuje, że w komórkach K562, ale nie w komórkach 293T, indukowane przez CLOuD9 zapętlenie chromatyny staje się nieodwracalne po 10 dniach traktowania ABA, nawet jeśli ABA zostaje usunięte na kolejne 10 dni. Wszystkie wyniki 3C uzyskano z co najmniej trzech niezależnych eksperymentów. Wartości 3C znormalizowano względem tubuliny, a częstotliwości interakcji między fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Słupki błędów oznaczają s.d. n = 3. (c) Stabilizacja pętli w komórkach K562 skutkuje trwałą ekspresją β-globiny, nawet po 10 dniach wypłukiwania ABA. W komórkach 293T nie zaobserwowano zmian w ekspresji β-globiny. Istotność określono w stosunku do komórek kontrolnych. Dwustronny test t Studenta t-testy ***P<0,0001, t = 5,963, df = 5; n.s. nieistotne statystycznie (d) Wyniki ChIP-qPCR wykazujące wzrosty znakowania H3K4me3 w obrębie locus β-globiny w odpowiedzi na indukowane przez CLOuD9 zapętlenie utrzymują się po 10 dniach wypłukiwania liganda w komórkach K562. Dwustronny test t studenta t-testy *P<0,05, **P<0,001, ***P<0.0001. (e) W komórkach 293T nie zaobserwowano istotnych zmian w sygnałach H3K4me3 po długotrwałej dimeryzacji w analizie ChIP-qPCR. (f) Zwiększone zajęcie locus $\beta$-globiny przez polimerazę RNA II po długotrwałej indukcji pętli zostało utrzymane w komórkach K562 po 10 dniach wymywania ligandu. Dwustronny test t Studenta t-testy *P<0,05, **P<0,001, ***P<0,0001. Wszystkie słupki błędów wskazują odchylenie standardowe (s.d.). Rysunek zmodyfikowano na podstawie Rysunek 3 w Morgan, Stefanie L., i wsp..9. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Rycina uzupełniająca 1: Konstrukty CLOuD9 lokalizują się w zamierzonych regionach docelowych. Immunoprecypitacja chromatyny oraz ilościowe PCR konstruktów CLOuD9 wykazują prawidłową lokalizację w zamierzonych loci genomowych. Rycina ta została zmodyfikowana na podstawie Supplementary Figure 1 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek dodatkowy 2: Konstrukty CLOuD9 wiążą się odwracalnie w odpowiedzi na traktowanie ABA. Koimmunoprecypitacje wykazujące asocjację białek dCas9 po 72 h traktowania ABA zostaje odwrócone po kolejnych 72 h wypłukiwania liganda. Rysunek ten został zmodyfikowany z Rysunku dodatkowego 2 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 3: Leczenie kontrolne nie wywołuje zmian w kontaktach chromatyny. Leczenie DMSO, środkiem kontrolnym, przez 24 godziny nie wywołuje zmian w endogennej konformacji chromatyny w badaniu 3C ani w komórkach K562, ani w HEK 293Ts. Wartości 3C znormalizowano do tubuliny, a częstotliwości interakcji między fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Słupki błędów oznaczają SD. n = 3. Rysunek ten został zmodyfikowany z Rysunku uzupełniającego 3 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina dodatkowa 4: Komórki kontrolne transdukowane CLOuD9 nie wykazują zmian w zapętleniu chromatyny. Skierowanie dwóch konstruktów CLOuD9 odpowiednio do LCR lub promotora β-globiny nie indukuje istotnych zmian w strukturze chromatyny w badaniu 3C po zastosowaniu ABA w porównaniu z traktowaniem kontrolnym. Wartości 3C znormalizowano względem tubuliny, a częstotliwości oddziaływań między fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Słupki błędów oznaczają SD. n = 3. Rycina ta została zmodyfikowana z Supplementary Figure 4 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 5: Pętlenie chromatyny CLOuD9 pozostaje odwracalne po 72 godzinach dimeryzacji. Analiza 3C w komórkach K562 wykazuje odwracalność kontaktów β-globiny/LCR indukowanych przez CLOuD9 po 72 godzinach traktowania ABA. Wartości 3C znormalizowano względem tubuliny, a częstotliwości oddziaływań pomiędzy fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Słupki błędu oznaczają SD. n = 3. Rycina ta została zmodyfikowana z Supplementary Figure 5 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 6: Pętlenie β-globiny/LCR indukowane przez CLOuD9 nie jest zależne od miejsca docelowego globiny. Kierowanie konstruktami CSA i CSP do różnych regionów LCR lub promotora β-globiny skutkuje podobnymi odwracalnymi zmianami w indukcji pętli w badaniu 3C po 72 godzinach traktowania ABA. Wartości 3C znormalizowano względem tubuliny, a częstotliwości oddziaływań między fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Słupki błędów oznaczają SD. n = 3. Rycina ta została zmodyfikowana z Supplementary Figure 6 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rycina uzupełniająca 7: Zmiany w ekspresji genów indukowane przez CLOuD9 są utrzymywane niezależnie od miejsca docelowego globiny. Kierowanie konstruktami CSA i CSP do naprzemiennych regionów promotora β-globiny i LCR nie ma wpływu na indukcję ekspresji genów po 72 h dimeryzacji. Jednakże, mimo zaobserwowanego pewnego wpływu na siłę ekspresji genów po długotrwałej (10-dniowej) dimeryzacji, wysokie poziomy β-globiny w stosunku do komórek kontrolnych były utrzymywane po kolejnym wypłukaniu ligandu przez dodatkowe 10 dni. Istotność podano w stosunku do komórek kontrolnych. **p < 0,001, t = 10,25, df = 5; ***p < 0,0001, od lewej do prawej t = 8,697, df = 6, t = 40,31, df = 7; n.s. brak istotności. Wszystkie słupki błędów oznaczają SD. Rycina ta została zmodyfikowana z Ryciny uzupełniającej 7 w publikacji Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Rysunek uzupełniający 8: Kontrolne komórki transdukowane CLOuD9 nie wykazują zmian w ekspresji β-globiny. Kierowanie dwóch konstruktów CLOuD9 odpowiednio do LCR lub promotora β-globiny nie indukuje istotnych zmian w ekspresji β-globiny po traktowaniu ABA w porównaniu z traktowaniem kontrolnym. Istotność podano w odniesieniu do komórek traktowanych kontrolnie. n.s. brak istotności. Rysunek ten został zmodyfikowany z Rysunku uzupełniającego 8 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek uzupełniający 9: Długotrwałe traktowanie kontrolne nie indukuje zmian w kontaktach chromatyny. Traktowanie DMSO, środkiem kontrolnym, przez 10 dni nie indukuje zmian w endogennej konformacji chromatyny w badaniu 3C zarówno w komórkach K562, jak i HEK 293Ts. Wartości 3C zostały znormalizowane względem tubuliny, a częstotliwości interakcji między fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Słupki błędów oznaczają SD. n = 3. Rysunek ten został zmodyfikowany z Supplementary Figure 9 w Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rysunek dodatkowy 10: Długotrwałe pętlenie β-globiny/LCR indukowane przez CLOuD9 nie zależy od miejsca docelowego globiny. Kierowanie konstruktami CSA i CSP do naprzemiennych regionów LCR lub promotora β-globiny skutkuje podobnie trwałym indukowaniem pętli, co wykazano za pomocą metody 3C po 10 dniach traktowania ABA i 10 dniach następującego po tym wypłukiwania liganda. Wartości 3C znormalizowano względem tubuliny, a częstotliwości oddziaływań między fragmentem kotwiczącym a fragmentem obejmującym fragment β/HS ustawiono na zero. Słupki błędów oznaczają SD. n = 3. Rysunek ten został zmodyfikowany z Rysunku dodatkowego 10 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać ten rysunek.

Rycina uzupełniająca 11: Konstrukcje CLOuD9 wiążą się nieodwracalnie w odpowiedzi na długotrwałą ekspozycję na ABA. Koimmunoprecypitacje wykazujące nieodwracalne wiązanie białek dCas9 CSA i CSP po 10 dniach traktowania ABA i kolejnych 10 dniach wypłukiwania liganda. Rycina ta została zmodyfikowana z Supplementary Figure 11 w publikacji Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę rycinę.

Tabela uzupełniająca 1: Lista sekwencji starterów dla gRNA, qRT-PCR, 3C oraz ChIP qPCR. Tabela ta została zmodyfikowana na podstawie Tabeli uzupełniającej 1 w pracy Morgan, Stefanie L., et al.9. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę

Dyskusja

Najbardziej krytycznymi etapami pętli chromatyny CLOuD9 są: 1) projektowanie lub stosowanie odpowiednich gRNA, 2) codzienna zmiana pożywki na komórkach transdukowanych CLOuD9, w tym ABA lub DMSO, 3) utrzymanie świeżości ABA oraz 4) przeprowadzanie dokładnych i starannych ocen konformacji chromatyny.

Ograniczenia CLOuD9 polegają przede wszystkim na możliwości projektowania przewodników do wybranego regionu docelowego. Przewodniki RNA wykonują ważne zadanie lokalizacji składników dCas9 w docelowych regionach DNA, które mają być dimeryzowane, a skuteczność przewodników opiera się na ich konkretnym miejscu docelowym. Bez odpowiednich składników gRNA układ CLOuD9 nie będzie w stanie tworzyć odwracalnie indukowanych pętli. W związku z tym, projektując wiele prowadnic dla każdego regionu zainteresowania i rozkładając je w regionie 250-1000 pz, zapewniony zostanie co najmniej jeden udany przewodnik. Lokalizacja przewodnika jest również integralną częścią dokładnych wyników. Ważne jest, aby unikać przewodników znajdujących się w miejscach wiązania czynnika transkrypcyjnego lub innych krytycznych regionach, aby zapobiec efektom tła, takim jak regulacja transkrypcji w górę lub w dół. Ponadto dokładna lokalizacja konstruktu CLOuD9 może nieznacznie wpływać na transkrypcję docelowego genu. Podkreśla to znaczenie testowania wielu par prowadnic dla każdego regionu docelowego w celu zidentyfikowania najbardziej wytrzymałej pary do celów eksperymentalnych. Ponadto, w każdej parze regionów docelowych, konstrukt CSA powinien być ukierunkowany na gRNA dla S. aureus, a konstrukt CSP powinien być ukierunkowany na gRNA dla S. pyogenes w celu ukierunkowanej swoistości.

Aby zapewnić dokładne wyniki i prawidłową dimeryzację, ważne jest również utrzymanie świeżości środowisk komórkowych po transdukcji konstruktów CLOuD9. Codzienna zmiana pożywki i dodanie świeżego dimeryzatora (lub kontroli) zapewnia, że komplementarne konstrukty pozostaną w pobliżu i zachowają zmienioną konformację chromatyny. Co więcej, zagwarantowanie, że ABA jest świeże i odpowiednio przechowywane zgodnie z protokołem producenta (otwarte w ciągu 6 miesięcy, przechowywane w niskiej temperaturze, chronione przed światłem) jest niezbędne do uzyskania autentycznych wyników.

Warto zauważyć, że dimeryzator ABA dla CLOuD9 był używany z białkami dimeryzacyjnymi ABI i PYL, a nie z częściej stosowanym systemem FRB i FKBP. Konieczność opracowania rapalogu dla systemu FRB/FKBP ograniczyłaby możliwość zastosowania CLOuD9 ze względu na toksyczność dla komórek nowotworowych. Alternatywny system ABI/PYL obszedł to ograniczenie, skutecznie umożliwiając szersze zastosowanie CLOuD9.

Wspólnie opracowaliśmy CLOuD9, unikalną i solidną technologię, która może w sposób wymuszony, ale odwracalny, tworzyć kontakty między docelowymi loci genomowymi dalekiego zasięgu. Poprzez indukcję pętli chromatyny wykazujemy również, że CLOuD9 może być wykorzystany do modyfikacji ekspresji genów w odpowiednim kontekście komórkowym. Zdolność adaptacyjna technologii pozwala na nieograniczone badanie interakcji między dowolnymi dwoma loci genomowymi, bez konieczności posiadania wcześniejszej wiedzy na temat regionów pętli lub mechanizmów pętli. Ponadto unikalna, wykazana odwracalność CLOuD9 umożliwia dalsze badania mechanizmów pętli w chorobie i rozwoju. Chociaż efekty pętli chromatyny na cel zostały wyraźnie wykazane, nie ma jeszcze danych dających wgląd w skutki pętli poza celem i późniejszy wpływ na pętle docelowe.

Nasze dane ilustrują tylko kilka zastosowań tego narzędzia, ale sugerują główną ideę, że układ chromatyny wskazuje na ekspresję genów. Nasza technologia może być wykorzystana do badania i ujawniania niuansów struktury chromatyny w regulacji genów, poprawiając w ten sposób ogólne zrozumienie roli fałdowania chromatyny w transkrypcji genów. Lepsze zrozumienie subtelności dynamiki transkrypcji może prowadzić do badań i leczenia raka, chorób dziedzicznych i zaburzeń wrodzonych, w których wyraźne składanie chromatyny niewątpliwie zmienia ekspresję genów 20,21,22,23. Kolejne prace z wykorzystaniem technologii CLOuD9 dostarczą dalszych informacji na temat układu i dynamiki domen chromatyny oraz sposobu, w jaki napędzają one fałdowanie w celu utrzymania stabilnej ekspresji genów zarówno w rozwoju, jak i chorobie.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Dziękujemy H. Chang, T. Oro, S. Tavazoie, R. Flynn, P. Batista, E. Calo i całemu laboratorium Wang za wsparcie techniczne i krytyczne przeczytanie manuskryptu. S.L.M. otrzymało wsparcie w tej pracy poprzez NSFGRF (DGE-114747), NDSEGF (FA9550-11-C-0028) oraz National Cancer Institute (1F99CA222541-01). K.C.W. jest wspierany przez Nagrodę Kariery dla Naukowców Medycznych od Burroughs Wellcome Fund, Jest stypendystką Fundacji Donalda E. i Delii B. Baxterów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
RPMI 1640  mediaLife Technologies11875-119Do hodowli komórkowych K562
Podłoża DMEMLife Technologies11995-0651X, do hodowli komórek 293T
lentiCRISPR v2Addgene plazmid# 52961Do rozwoju plazmidu CLOuD9
pRSV-RevAddgene plazmid# 12253Do produkcji lentiwirusa
pMD2.GPlazmid Addgene# 12259Do produkcji lentiwirusa
pMDLg / pRREPlazmid Addgene# 12251Do produkcji lentiwirusa
Lipofectamine 2000Thermo Fisher Scientific11668-019Do produkcji lentiwirusa
anty-HASygnalizacja komórkowa3724immunoprecypitacji
SigmaF1804Dla immunoprecypitacja
DNeasy Zestaw do krwi i tkanekQiagen69504Do ekstrakcji DNA
TRIzolLife Technologies15596-018Do ekstrakcji RNA
RNeasy KitQiagen74106Do ekstrakcji RNA
Indeks górny VILOLife Technologies11754-050Do cDNA 
SYBR Green I MasterMixRoche4707516001Do analizy qPCR
Light Cycler 480IIRocheDo analizy qPCR
przeciwciało anty-H3K4me3AbCamab8580Do przeciwciała anty-RNA ChIP-qPCR
Aktywnymotyw61083Do ChIP-qPCR
Inhibitor proteazy wolny od EDTARoche11873580001Do białka ekstrakcja
4-12% Tris Glycine gelBioradDowolny rozmiar, Do przeciwciała Western blot
anty-Rabbit HRPSanta Cruzsc-2030Do przeciwciała Western blot
anty-mysie HRPSygnalizacja komórkowa7076SDla Western blot
K562 i H3K293 Dane ChIP-SeqKodujENCSR000AKUDo analizy ChIP-seq
Dane K562 i H3K293 ChIP-SeqKodowanieENCSR000APEDo analizy ChIP-seq
K562 i H3K293 Dane ChIP-SeqKodowanieENCSR000FCJDo analizy ChIP-seq
Dane K562 i H3K293 ChIP-SeqGEOGSM1479215Do analizy ChIP-seq
Dynabeads Białko A do immunoprecypitacjiThermo Fisher Scientific10001DDo immunoprecypitacji
Dynabeads Białko G dla ImmunoprecypitacjaThermo Fisher Scientific10004DDo immunoprecypitacji
RNA Clean & Concentrator-5Zymo ResearchR1015Do oczyszczania RNA
Pierce 16% Formaldehyd Bez metanoluThermo Fisher Scientific28908Do sieciowania
plazmidu PX458 Addgene48138Sugerowany aktywny plazmid Cas9 do klonowania gRNA, ale każdy aktywny plazmid Cas9 zrobi to
Zestaw do oczyszczania QIAquick PCRQiagen28104Do oczyszczania
FastDigest BsmBIThermo Fisher ScientificFD0454Do klonowania przewodnika RNA
FastAPThermo Fisher ScientificEF0651Do klonowania przewodnika RNA
10X FastDigest BufferThermo Fisher ScientificB64Do klonowania przewodnika RNA
QIAquick Gel Extraction KitQiagen28704Do klonowania przewodnika RNA
10X T4 Ligation BufferNEBB0202SDo klonowania przewodnikowych RNA
T4 PNKNEBM0201SDo klonowania przewodnika RNA
2X Szybki bufor ligazyNEBB2200SDo klonowania przewodnika RNA
Szybka ligazaNEBM2200SDo klonowania przewodnika RNA
Buffers
Farnham lysis buffer1% Tris-Cl pH 8,0, 1% SDS, 1% roztwór wodny inhibitora proteazy (nie-EDTA) i 1 mM EDTA w wodzie
Modyfikowany bufor1% NP40/Igepal, 0,5% deoksycholan sodu, 0,1% SDS, 1 mM EDTA i 1% roztwór wodny inhibitora proteazy (nie-EDTA) w PBS pH 7,8 lub 7,4
IP bufor0,01% SDS, 1,1% Triton-X 100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris-HCl pH 8,0, 167 mM NaCl, 0,1x inhibitor proteazy
Bufor100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40 i 1% deoksycholan sodu
Bufor0,1 M Tris pH 7,5, 10 mM octan potasu, 15 mM octan magnezu, 1% NP-40
Bufor0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 1,2 mM EDTA, 16,7 mM Tris pH 8 i 167 mM
bufor elucyjny NaCl IP1% SDS, 10% NaHCO3  
przeciwciało Do przeciwciała anty-Flag przeciwko PCR RIPA rozcieńczający płuczący pęczniejący rozcieńczający

Bibliografia

  1. Krivega, I., Dean, A. Chromatin looping as a target for altering erythroid gene expression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1368, 31-39 (2016).
  2. Matharu, N., Ahituv, N. Minor loops in major folds: Enhancer-promoter looping, chromatin restructuring, and their association with transcriptional regulation and disease. PLoS Genet. 11, e1005640(2015).
  3. Dekker, J., Martí-Renom, M. A., Mirny, L. A. Exploring the three-dimensional organization of genomes: interpreting chromatin interaction data. Nat. Rev Genet. 14, 390-403 (2013).
  4. Kim, A., Dean, A. Chromatin loop formation in the b-globin locus and its role in globin gene transcription. Mol Cells. 34, 1-5 (2012).
  5. Petrascheck, M., et al. DNA looping induced by a transcriptional enhancer in vivo. Nucleic Acids Res. 33, 3743-3750 (2005).
  6. Ameres, S. L., et al. Inducible DNA-loop formation blocks transcriptional activation by an SV40 enhancer. EMBO J. 24, 358-367 (2005).
  7. Deng, W., et al. Controlling Long-Range Genomic Interactions at a Native Locus by Targeted Tethering of a Looping Factor. Cell. 149, 1233-1244 (2012).
  8. Deng, W., et al. Reactivation of developmentally silenced globin genes by forced chromatin looping. Cell. 158, 849-860 (2014).
  9. Morgan, S. L., et al. Manipulation of Nuclear Architecture through CRISPR-Mediated Chromosomal Looping. Nature Communications. 8, 13 July (2017).
  10. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biol. 17 (1), 148(2016).
  11. Lipofectamine 2000 Reagent. , Invitrogen by Life Technologies. (2013).
  12. DNeasy Blood & Tissue Kit Handbook. , QIAGEN. (2006).
  13. Determining Genome Targeting Efficiency using T7 Endonuclase I (M0302). , New England BioLabs. (2016).
  14. Guschin, D. Y., et al. A rapid and general assay for monitoring endogenous gene modification. Methods Mol Biol. 649, 247-256 (2010).
  15. Shalem, O., Sanjana, N. E., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells. Science. , 83-87 (2014).
  16. RNeasy Mini Handbook. , QIAGEN. (2012).
  17. SuperScript VILO cDNA Synthesis Product Information Sheet. , Thermo Fisher Scientific Inc. (2015).
  18. Theunissen, T. W., et al. Systematic identification of culture conditions for induction and maintenance of naive human pluripotency. Cell Stem Cell. 15, 471-487 (2014).
  19. Mokry, M., et al. Integrated genome-wide analysis of transcription factor occupancy, RNA polymerase II binding and steady state RNA levels identify differentially regulated functional gene classes. Nucleic Acids Res. 40, 148-158 (2012).
  20. Drier, Y., et al. An oncogenic MYB feedback loop drives alternate cell fates in adenoid cystic carcinoma. Nat Genet. 48, 265-272 (2016).
  21. Ryan, R. J. H., et al. Detection of enhancer-associated rearrangements reveals mechanisms of oncogene dysregulation in B-cell lymphoma. Cancer Discov. 5, 1058-1071 (2015).
  22. Montavon, T., et al. A regulatory archipelago controls Hox genes transcription in digits. Cell. 147, 1132-1145 (2011).
  23. Lupianez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

CRISPR dCas9p tlowanie chromatynyregulacja ekspresji gen wsystem CLOuD9dimeryzacja ABAimmunoprecypitacja chromatynyanaliza konformacji chromosom wtransdukcja lentiwirusowaprojektowanie gRNAselekcja kom rkowa
Reorganizacja struktury pętli chromatyny za pośrednictwem CRISPR
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.