Artykuł metodologiczny

Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem

13.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/57551

⸱

4 maja 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biocatalysis, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 2Department of Bioenergetics, Institute of Chemistry, Technische Universität Berlin, 3Molecular Genetics Group, Groningen Biomolecular Sciences and Biotechnology Institute, Department of Molecular Genetics, University of Groningen

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Protokół przedstawia selektywne wprowadzanie aminokwasów (ncAA) do laktokokowego peptydu przeciwbakteryjnego nizyny na bazie Escherichia coli. Jego właściwości mogą być zmieniane podczas ekspresji rekombinowanej poprzez podstawienie pożądanymi ncAA w zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Wynikające z tego zmiany bioaktywności są mapowane za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej.

Streszczenie

Natura ma wiele możliwości tworzenia nowych funkcji białkowych poprzez modyfikację sekwencji poszczególnych elementów budulcowych aminokwasów. Jednak wszystkie warianty opierają się na 20 aminokwasach kanonicznych (cAA). Jako sposób na wprowadzenie dodatkowych właściwości fizykochemicznych do polipeptydów, włączenie aminokwasów niekanonicznych (ncAA) jest coraz częściej stosowane w inżynierii białek. Ze względu na ich stosunkowo krótką długość, modyfikacja peptydów syntetyzowanych rybosomalnie i modyfikowanych potranslacyjnie przez ncAA jest szczególnie atrakcyjna. Nowe funkcjonalności i uchwyty chemiczne mogą być generowane przez specyficzne modyfikacje poszczególnych pozostałości. Metoda selektywnej inkorporacji ciśnieniowej (SPI) wykorzystuje auksotroficzne szczepy gospodarza, które są pozbawione niezbędnego aminokwasu w chemicznie zdefiniowanych pożywkach wzrostowych. Kilka strukturalnie i chemicznie podobnych analogów aminokwasów może być następnie aktywowanych przez odpowiednią syntetazę aminoacylo-tRNA i zapewnić substytucje cAA(s) → ncAA(s) specyficzne dla reszty w docelowej sekwencji peptydu lub białka. Chociaż w kontekście metody SPI ncAA są również włączane do proteomu gospodarza w fazie ekspresji genów rekombinowanych, większość zasobów komórki jest przypisana do ekspresji genu docelowego. Umożliwia to skuteczne wprowadzanie ncAA specyficznych dla pozostałości, często w połączeniu z dużymi ilościami zmodyfikowanego celu. Prezentowana praca opisuje inkorporację in vivo sześciu analogów proliny do przeciwdrobnoustrojowego peptydu nizyny, lantybiotyku naturalnie wytwarzanego przez Lactococcus lactis. Właściwości przeciwdrobnoustrojowe nizyny mogą być zmieniane i dalej rozszerzane podczas jej fermentacji i ekspresji w auksotroficznymi szczepach Escherichia coli w określonych pożywkach wzrostowych. W związku z tym skutki swoistej dla pozostałości zamiany cAA na ncAA mogą powodować zmiany w aktywności i swoistości przeciwdrobnoustrojowej. Testy aktywności przeciwdrobnoustrojowej i mikroskopia fluorescencyjna są wykorzystywane do testowania nowych wariantów nizyny pod kątem hamowania wzrostu Gram-dodatniego szczepu wskaźnikowego Lactococcus lactis. Spektroskopia mas służy do potwierdzenia włączenia ncAA do bioaktywnych wariantów nizyny.

Wprowadzenie

Odkrycie antybiotyków w XX wieku i równoległy rozwój nowych związków przeciwbakteryjnych przeciwko mikroorganizmom chorobotwórczym umożliwiło celowane leczenie infekcji bakteryjnych. Jednak ze względu na pojawienie się wielolekoopornych patogenów, takich jak oporny na metycylinę Staphylococcusaureus (MRSA), enterokoki oporne na wankomycynę (VRE), MDR (wielolekooporne) fagi Salmonella typhimurium typu 10 (DT10) i Klebsiella pneumoniae, pilnie konieczne jest opracowanie nowych środków przeciwdrobnoustrojowych1. Peptydy przeciwdrobnoustrojowe (AMP) to wszechstronne, często wysoce specyficzne związki, które są obiecującymi kandydatami do opracowania nowych leków dzięki swoim właściwościom fizykochemicznym, elastyczności, rozmiarowi, hydrofobowości i sposobowi działania2. AMP to małe peptydy składające się zwykle z 7 - 100 aminokwasów. Często mają strukturę kationową bogatą w dodatnio naładowane reszty argininy i lizyny, które oddziałują z docelową błoną komórkową drobnoustrojów, która jest przeciwnie naładowana3. Szczególną podgrupą AMP są peptydy syntetyzowane rybosomalnie i modyfikowane potranslacyjnie (RiPPs)4. Są one wytwarzane przez wiele organizmów z królestwa grzybów i domeny bakterii. Jednym z najbardziej znanych i szeroko stosowanych RiPP jest nizyna, naturalnie wytwarzana przez bakterię kwasu mlekowego Lactococcus lactis (L. lactis). Aktywna przeciwko panelowi bakterii Gram-dodatnich, nisyna jest stosowana jako biokonserwant w przemyśle spożywczym od ponad 50 lat ze względu na swoje właściwości przeciwdrobnoustrojowe i brak rozwiniętej oporności w docelowych szczepach drobnoustrojów5. Badania wykazały, że nizyna destabilizuje i generuje pory w błonach komórkowych bakterii, prowadząc do aktywności przeciwdrobnoustrojowej zarówno przeciwko patogenom Gram-dodatnim, jak i Gram-ujemnym6. Wiążąc się z lipidem II, synteza ściany komórkowej bakterii jest hamowana7. Nizyna jest kodowana przez nisA jako liniowy peptyd prekursorowy, który składa się z lidera i regionu peptydu rdzeniowego (Rysunek 1). Po syntezie rybosomalnej prenisyna jest najpierw modyfikowana przez dehydratazę NisB. Tutaj reszty seryny i treoniny w regionie rdzenia prepeptydu są odwadniane do dehydroalaniny (Dha) i dehydrobutyryny (Dhb)8. Następnie odwodnione reszty są łączone z cysteiną, tworząc pierścienie lantioninowe (stąd nazwa "lantibiotic" dla antybiotyków zawierających pierścienie lantioninowe) przez katalizowaną enzymatycznie addycję Michaela. Ta modyfikacja potranslacyjna (PTM) jest katalizowana przez cyklazę NisC. U L. lactis zmodyfikowana prenizyna jest następnie transportowana z komórki przez transporter NisT, a peptyd lidera jest rozszczepiany przez proteinazę NisP w celu uwolnienia dojrzałej i aktywnej formy nizyny9. Odpowiedzialny za to lider peptydaza NisP ma wysoką specyficzność substratową, ponieważ efektywnie przetwarza tylko zmodyfikowaną nisynę10.

Ogólnie, aktywne RiPP wynikają z działania enzymów PTM (na przykład NisBC), które drastycznie zwiększają przestrzeń chemiczną krótkich peptydów, np. poprzez acetylację, glikozylację, metylację lub fosforylację. Ten poziom złożoności można dodatkowo zwiększyć poprzez bezpośrednie włączenie NCA. Chociaż często jest to wykonalne, synteza chemiczna AMP jest wyzwaniem dla produkcji na dużą skalę ze względu na ich złożoność strukturalną. Na przykład całkowita synteza chemiczna laktozyny S w 71 etapach reakcji została osiągnięta przy końcowej wydajności 10%, a nizyny przy surowej wydajności zaledwie 0,003%11,12. Dlatego produkcja biologiczna stanowi realną alternatywę, ze względu na wytwarzanie prawidłowych stereocentrów i wysokie stężenie produktu.

Do dnia dzisiejszego ponad 150 ncAA, np. posiadających grupy funkcyjne zawierające fluor lub azydki, zostało włączonych do rekombinowanych białek, a także zgłoszono kilka przykładów AMP zmodyfikowanych przez ncAA13,14,15,16. Dzięki wprowadzeniu ncAA można uzyskać nowe właściwości fizykochemiczne w porównaniu z konwencjonalną mutagenezą. Różnorodność istniejących peptydów może zostać zwiększona, co może prowadzić do powstania nowych antybiotyków.

Jedną z metod włączania ncAA do rekombinowanych peptydów jest selektywna inkorporacja ciśnieniowa (SPI) oparta na użyciu auksotroficznych szczepów bakteryjnych17. Szczepy te nie są zdolne do syntezy odpowiadającego im analogu cAA ncAA. Metodologia wykorzystuje często obserwowaną zrelaksowaną specyficzność substratową, cechę wielu naturalnych syntetaz aminoacylo-tRNA (aaRSs)18. Oprócz naturalnych substratów cAA, enzymy te są często zdolne do rozpoznawania i aktywowania pożądanego ncAA oraz ładowania go do pokrewnych tRNA. Prowadzi to do rybosomalnej inkorporacji ncAA do docelowego produktu genu w sposób specyficzny dla reszty (tj. substytucja cAA → ncAA). Jest to oczywiście możliwe tylko wtedy, gdy pożądany ncAA jest strukturalnie i chemicznie podobny do aminokwasu kanonicznego i tolerowany przez fizjologię komórki, maszynerię translacyjną i docelową sekwencję peptydu lub białka. W określonej konfiguracji doświadczalnej auksotroficzne komórki gospodarza są hodowane w określonym pożywce zaopatrzonej w ograniczające stężenie natywnego aminokwasu, który ma zostać podstawiony. Wzrost lub wymiana komórek przez pożywkę wolną od cAA prowadzi do wewnątrzkomórkowego wyczerpania cAA. W kolejnym kroku dodaje się ncAA i indukuje się ekspresję genu docelowego. Nieuniknione jest, że ncAA są teraz również włączane do wielu innych białek w komórce gospodarza podczas tej fazy ekspresji docelowego genu. Niemniej jednak toksyczność konfiguracji SPI jest utrzymywana na niskim poziomie, ponieważ szczep Escherichia coli (E. coli) jest przekształcany za pomocą plazmidu przenoszącego gen docelowy pod kontrolą silnego promotora (zwykle wysoce konkurencyjnego promotora T7 / systemu polimerazy RNA)19. Bezpośrednio po indukcji (zwykle po wyczerpaniu cAA) komórki gospodarza przestają rosnąć, a ich cytoplazmatyczne maszynerie enzymatyczne są wykorzystywane głównie do ekspresji genu docelowego opartego na plazmidzie. Mutageneza ukierunkowana na miejsce może być wykorzystana do zdefiniowania miejsca (miejsc) instalacji ncAA specyficznej dla reszty w genie docelowym20.

Jako modelowy peptyd do inkorporacji ncAA, wybrano pentacykliczną AMP nisynę A. Ma długość 34 aminokwasów i ma tylko jedną resztę proliny w sekwencji peptydów rdzeniowych (Rysunek 1). Podobnie jak w subtylizynie, erycynie A i S oraz naskórku, a także w nizynie Z i nizynie Q, konserwatywna prolina wydaje się być niezbędna dla aktywności9,21. Prolina cAA odgrywa szczególnie ważną rolę w rotacji amidu peptydylo-prolilu i stabilizacji struktury drugorzędowej. Jego boczne konformacje pierścienia łańcucha (exo / endo) są odpowiedzialne za termodynamiczną stabilizację wiązania amidowego. Ukierunkowane modyfikacje chemiczne (takie jak hydroksylacja, fluorowanie, metylacja) marszczenia prolilu często mają krytyczny wpływ na stabilność składania, sztywność rusztowania i funkcje wielu struktur biologicznych22. W związku z tym można się spodziewać, że podstawienie analogu proliny Pro→ nada pierścieniowi B, drugiemu pierścieniowi nizyny, nowe i niezwykłe właściwości.

Tutaj do produkcji rekombinowanej nizyny użyto prolinowo-auksotroficznego szczepu E. coli. Wymaga to ekspresji genu prepeptydu nisA, a także genów enzymu modyfikującego nisBC. Genetycznie kodowany produkt peptydowy zawiera N-końcowy lider oznaczony Hisem do oczyszczenia za pomocą chromatografii powinowactwa. Do oznaczania aktywności, L. lactis eksprymujący i wydzielający NisPT jest używany do aktywacji rekombinowanych wariantów nizyny z lizatów komórek E. coli lub oczyszczonych próbek peptydów (Rysunek 1). Dojrzały AMP zostaje wydany po rozszczepieniu lidera przez NisP. W tej metodzie dyfuzji agarowej próbka AMP dyfunduje do stałego podłoża wzrostowego i może hamować wzrost mikroorganizmu Gram-dodatniego. Po inkubacji można to zaobserwować wizualnie za pomocą aureoli hamujących wzrost. Oprócz L. lactis jako wskaźnika, zmodyfikowane warianty nizyny wykazywały aktywność przeciwdrobnoustrojową przeciwko Enterococcus faecalis, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus i Lactobacillus johnsonii21,23.

Alternatywną i eksperymentalnie odmienną metodą włączania ncAA do RiPPs jest tłumienie kodonów stop (SCS)24. W tym celu wymagana jest ortogonalna para syntetazy tRNA / aminoacylo-tRNA (aaRS) dla odpowiedniego ncAA. Idealnie, wszystkie te trzy składniki są bioortogonalne, tj. nie wchodzą w interakcje z endogennymi tRNA i aaRS. Specyficzny dla ncAA aaRS może być generowany przez modyfikację miejsca aktywnego enzymu i badanie przesiewowe bibliotek genetycznych zmutowanych syntetaz25. Co więcej, wprowadzenie ncAA wymaga kodonu, który jest ponownie przypisywany i który nie koduje dla cAA. Zwykle używany jest bursztynowy kodon stop24,26.

Niedawno, SPI zostało założone w celu włączenia zawierających α-chloroacetamidy i kompatybilnych z chemią kliknięć ncAA do klasy NisA27. Na przykład Nε-allok-lizyna została włączona do kaptystruiny peptydu lasso za pomocą metod inkorporacji specyficznych dla miejsca (SCS) i specyficznych dla reszty (SPI), a następnie zmodyfikowana in vitro przez metatezę katalizowaną rutenem28. W porównaniu do SPI, metoda SCS jest bardziej skomplikowana, ponieważ ortogonalna para tRNA / aaRS musi być równolegle wyrażona. Do tej pory o-pary do inkorporacji proliny zostały opracowane29, ale zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, nie zgłoszono żadnego przykładu inkorporacji analogowej proliny.

Należy zauważyć, że nie wszystkie ncAA mogą być włączone przy użyciu metodologii SPI. Po pierwsze, wychwyt ncAA do cytoplazmy jest regulowany przez wiele białek transportowych, które są osadzone w błonie cytoplazmatycznej, która jest błoną wewnętrzną dla bakterii Gram-ujemnych, takich jak E. coli. Zwykle E. coli jest zdolna do transportu szerokiej gamy analogów aminokwasów do komórki z łańcuchami bocznymi strukturalnie i chemicznie podobnymi do aminokwasów kanonicznych. Po drugie, wiele chemicznie reaktywnych lub niestabilnych ncAA może działać jako inhibitor wzrostu komórkowego, ponieważ są toksyczne dla metabolizmu i fizjologii komórki gospodarza30. W związku z tym należy wcześniej zbadać wychwyt i toksyczność ncAA dla gospodarza produkcyjnego. Aby uniknąć inaktywacji maszynerii PTM jako efektu ubocznego, ściśle kontrolowany układ ekspresji odpowiedzialnych genów może być wykorzystany do włączenia naturalnego aminokwasu do enzymów modyfikujących (np. nisBC) i ncAA do genu docelowego (np. nisA). Można to osiągnąć za pomocą dwóch różnych promotorów i indukcji ekspresji genów docelowych, jak pokazano w specjalnie zaprojektowanych protokołach SPI31. Jak opisano powyżej, metoda SPI opiera się na zrelaksowanej specyficzności substratowej aaRS, która pozwala na aktywację ncAA i ładowanie pokrewnego tRNA. Następnie tRNA jest dostarczane do rybosomu, po czym następuje tworzenie wiązań amidowych i fałdowanie docelowego (poli)peptydu. W tych procesach mogą stać się istotne mechanizmy korekty i edycji32. Z tych powodów bardzo ważne jest, aby mieć docelowy ncAA, który jest strukturalnie i chemicznie podobny do cAA. Innymi kluczowymi punktami są wystarczająca stabilność (zarówno w pożywce wzrostowej, jak i w metabolizmie komórkowym) oraz rozpuszczalność ncAA. Dodatkowo powinien być albo dostępny w handlu, albo łatwy do syntezy chemicznej.

Tutaj opisujemy protokół dla SPI, pozwalający na specyficzne dla reszt włączenie ncAA do rekombinowanych RiPPs. W szczególności różne analogi proliny są włączane do przeciwdrobnoustrojowego peptydu nizyny A przy użyciu E. coli jako organizmu gospodarza. Spektrometria mas służy do weryfikacji, czy zamienniki aminokwasów i produkty peptydowe są analizowane pod kątem bioaktywności za pomocą testów hamowania wzrostu i mikroskopii fluorescencyjnej przy użyciu drobnoustrojów wskaźnikowych.

Podstawowym wymogiem dla udanej ekspresji rekombinowanej nizyny z określonymi ncAA jest odpowiedni auksotropiczny szczep E. coli prolinii. W przypadku tej auksotrofii proA musi być dysfunkcyjny, na przykład osiągnięty przez nokaut genomowy. Komórki całkowicie pozbawione wewnątrzkomórkowej biosyntezy Pro (tj. delecji proABC) bez możliwości rewersji są stabilnymi auksotrofami. Powszechnie stosowanymi metodami nokautu genów są transdukcja fagów lub nokaut jednogenowy według Datsenko & Wanner33. Co więcej, szczepy nokautujące proA można uzyskać z publicznych repozytoriów, takich jak Addgene, CGSC lub kolekcja Keio. Ponieważ pokazana tutaj rekombinowana ekspresja nisABC opiera się na użyciu promotorów T7, ekspresyjny szczep gospodarza musi przenosić indukowalny gen dla polimerazy RNA T7. Można to osiągnąć poprzez wprowadzenie profaga λDE3 do genomu gospodarza, na przykład za pomocą komercyjnego zestawu. Alternatywnie, szczepy takie jak BL21(DE3) mogą być auksotroficzne, jak opisano powyżej.

Protokół

1. Klonowanie wektorów ekspresyjnych i transformacja aukstroficznego szczepu produkcyjnego

W niniejszej pracy geny biosyntezy nizyny, a mianowicie nisABC, zostały pobrane z L. lactis i przeniesione do plazmidowych wektorów ekspresyjnych opartych na promotorze T7. Pełne sekwencje DNA nisABC znajdują się w wpisie GenBank X6830734. Gen kodujący peptyd prekursorowy (nisA) został wprowadzony do wektora pET-3a nadającego oporność na ampicylinę. Geny kodujące dehydratazę (nisB) oraz cyklazę (nisC) zostały umieszczone w wektorze pRSFDuet-1, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami35, który nadaje oporność na kanamycynę.

UWAGA: W przypadku nisA kodony czterech ostatnich aminokwasów (ASPR) sekwencji liderowej zmutowano, aby kodowały VSLR36, co miało na celu uczynienie reszty proliny w rdzeniowym peptydzie unikalną oraz zapewnienie prawidłowego przetwarzania prepeptydu przez NisP. Na N-końcu, w celu oczyszczania, dodano znacznik heksa-histydynowy flankowany resztami łącznika (patrz Rysunek 1).

Schemat biosyntezy nizyny; modyfikacja peptydu za pomocą NisB i NisC; układ testu aktywności.
Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie biosyntezy i PTM NisA w E. coli oraz odszczepienia sekwencji liderowej przez szczep wskaźnikowy L. lactis  w późniejszym teście aktywności. W pierwszym kroku syntetyzowany rybosomalnie jest nieaktywny liniowy prenisin (składający się z sekwencji liderowej i regionu rdzenia peptydowego zawierającego unikalną prolinę (kolor różowy) w pozycji 9), kodowany przez gen nisA. Następnie prenisin ulega modyfikacji potranslacyjnej poprzez dehydratację reszt seryny i treoniny do dehydroalaniny (Dha) i dehydrobutyryny (Dhb), co jest katalizowane przez NisB. Cyklaza NisC tworzy mostki tioeterowe via addycję Michaela grup sulfhydrylowych cysteiny do Dha lub Dhb. Nieaktywny zmodyfikowany prenisin jest oczyszczany z E. coli i testowany pod kątem aktywności przeciwdrobnoustrojowej. W tym kroku jest on transportowany do wnętrza komórki Gram-dodatniego szczepu wskaźnikowego L. lactis . Sekwencja liderowa jest odszczepiana przez proteazę NisP (oznaczoną grotem strzałki), co uwalnia w pełni aktywną nizynę. Może ona zostać usunięta również in vitro  poprzez traktowanie trypsyną (*). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

  1. Zastosować standardowy protokół szoku termicznego37 lub elektroporacji38, aby przeprowadzić transformację szczepu E. coli aukstroficznego względem proliny (patrz wyżej) plazmidami pET-3a nisA(VSLR) oraz pRSFDuet-1 nisBC.
  2. Nanieść pipetą 25-100 µL zawiesiny transformowanych komórek na płytki agarowe zawierające ampicylinę, kanamycynę i 1% (w/v) glukozy. Rozprowadzić roztwór równomiernie po powierzchni płytek za pomocą rozpylacza lub kulek szklanych.
  3. Inkubować płytki przez noc w temperaturze 37 °C.
  4. Następnego dnia po południu wyizolować pojedynczą kolonię i zaszczepić nią 10 mL podłoża LB zawierającego ampicylinę, kanamycynę i 1% (w/v) glukozy w kolbie o pojemności 50 mL.
  5. Kulturować z wytrząsaniem przez noc (12-16 h) w temperaturze 37 °C i przy 200 rpm.
  6. Pobrać 250 µL sterylnego 80% glicerolu i 550 µL kultury, dokładnie wymieszać w probówce 2 mL i przechowywać jako mrożony stok komórek w temperaturze 80 °C.

2. Przygotowanie nowej pożywki minimalnej (NMM)

UWAGA: W niniejszym protokole jako chemicznie zdefiniowana płynna pożywka do wzrostu bakterii zastosowano NMM20. Zaleca się również ścisłe przestrzeganie kolejności przygotowania składników, aby uniknąć wytrącania osadu. W przypadku stosowania form aminokwasów innych niż wymienione w tabeli Materiały (np. przeciwchlorków), należy sprawdzić ich rozpuszczalność. NMM19 zawiera 19 aminokwasów z wyjątkiem cAA, który ma zostać zastąpiony (w tym przypadku proliną) analogiem ncAA. Końcowe stężenia składników podano w Tabeli 1. W zależności od szczepu bakterii wykorzystanego do produkcji, dodatek biotyny i tiaminy może być opcjonalny.

  1. Przygotowanie mieszaniny aminokwasów
    1. Rozpuścić 0,5 g Phe, Trp i Tyr w 100 mL ddH2O, dodając kilka kropli stężonego HCl aż do całkowitego rozpuszczenia.
    2. Odważyć po 0,5 g z pozostałych 16 aminokwasów. Wymieszać z 22 mL 1 M KH2PO4 i 48 mL 1 M K2HPO4. Dopełnić ddH2O do objętości ok. 800 mL. Mieszać do uzyskania klarownego roztworu.
    3. Dodać rozpuszczone Phe, Trp i Tyr, a następnie doprowadzić objętość roztworu do 1 L za pomocą ddH2O.
    4. Przesterylizować mieszaninę aminokwasów poprzez filtrację próżniową przy użyciu jednostki filtrującej nakręcanej na butelkę.
  2. Roztwory stokowe dla NMM19
    1. Najpierw przygotować 1 M roztwory stokowe następujących składników: (NH4)2SO4, KH2PO4, K2HPO4, MgSO4 oraz 5 M roztwór stokowy NaCl. Sterylizować w autoklawie.
    2. Przygotować 50 mL roztworów stokowych D-glukozy (1 M), CaCl2 (1 g/L), FeCl2 (1 g/L), tiaminy (10 g/L), biotyny (10 g/L) oraz mikroelementów (CuSO4, ZnCl2, MnCl2, (NH4)2MoO4; 1 mg/L). Każdy z roztworów sterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra strzykawkowego.
  3. Przygotowanie NMM19
    1. Wymieszać wszystkie roztwory stokowe tak, aby uzyskać końcowe stężenia: 7,5 mM (NH4)2SO4, 1,7 mM NaCl, 22 mM KH2PO4, 50 mM K2HPO4, 1 mM MgSO4 oraz 20 mM D-glukozy, 50 mg/L mieszaniny aminokwasów, 1 µg/L CaCl2, 1 µg/L FeCl2, 10 µg/L tiaminy, 10 mg/L biotyny i 0,01 µg/mL mikroelementów.

3. Ekspresja rekombinantowej nizyny z włączeniem analogów proliny za pomocą SPI

W tej sekcji przeprowadzana jest rekombinacyjna ekspresja prepeptydu (tutaj: nisA) oraz genów PTM (tutaj: nisBC). Najpierw komórki są hodowane w obecności wszystkich cAA, ponieważ zastosowano złożone medium LB. Dodaje się glukozę, aby stłumić ekspresję genów docelowych na poziomie tła, co w przeciwnym razie mogłoby doprowadzić do produkcji peptydu typu dzikiego (tutaj: nizyny) z powodu nieszczelności promotorów. Dopiero po wyczerpaniu docelowego cAA (tutaj: proliny) dodaje się ncAA i indukuje ekspresję genu docelowego w medium chemicznie zdefiniowanym. Inkubację kultur ciekłych należy przeprowadzać w odpowiednich kolbach z napowietrzaniem (np. 500 mL w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 L przy 200 rpm).

  1. Za pomocą sterylnego końcówki do pipety rozpocząć świeżą hodowlę nocną z zamrożonego banku komórek lub świeżej kolonii (patrz krok 1). Użyć 25 mL pożywki LB zawierającej ampicylinę, kanamycynę oraz 1% (w/v) glukozy i inkubować przez noc (12-16 h) w temperaturze 37 °C przy 200 rpm.
  2. Zaszczepić 1 L sterylnej świeżej pożywki 10 mL hodowli nocnej (1% v/v) i inkubować w temperaturze 37 °C przy 200 rpm do momentu osiągnięcia OD600 = 0.5.
  3. Wirować w temperaturze 4 °C przez 15 min przy 4,500 x g.
  4. Odlać nadsącz i resuspender osad w 20 mL NMM19 (przygotowanego w kroku 2.3) zawierającego antybiotyki i 1% (w/v) glukozy. Wirować w temperaturze 4 °C przez 10 min przy 4,500 x g.
  5. Resuspender osad komórkowy w 500 mL tej samej pożywki i inkubować w temperaturze 30 °C przy 200 rpm przez 1 h.
    UWAGA: Na tym etapie następuje deplekcja cAA (w tym przypadku proliny).
  6. Podzielić hodowlę na równe części (jedną dla każdego ncAA). Indukować każdą hodowlę 1 mM izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranosydem (IPTG) i dodać 1 mM analogów proliny (4S/R-fluoroproliny, 4S/R-hydroksyproliny lub 4S/R-metanoproliny).
    UWAGA: W ramach kontroli do jednej z hodowli można dodać 1 mM proliny, co spowoduje produkcję peptydu typu dzikiego.
  7. Inkubować przez noc (12-16 h) w temperaturze 28 °C przy 200 rpm.
  8. Wirować hodowle komórkowe w probówkach 50 mL w temperaturze 4 °C przez 20 min przy 5,000 x g. Odlać nadsącz i przechowywać osady w temperaturze -80 °C do czasu oczyszczania.

4. Izolacja i oczyszczanie analogów nizyny z oznakowaniem His

Peptydy są oczyszczane w warunkach denaturujących z użyciem chlorku guanidyny (GuHCl)39, silnego denaturanta.

Uwaga: GuHCl jest szkodliwy w przypadku połknięcia lub wdychania oraz powoduje podrażnienie skóry i poważne podrażnienie oczu. Należy stosować ochronę oczu i rękawice.

  1. Przygotować 250 mL buforu wiążącego (5 M GuHCl, 300 mM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4), buforu płuczącego (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 25 mM imidazolu, pH 7,4) oraz buforu elucyjnego (300 mM NaCl, 25 mM Tris, 250 mM imidazolu, pH 7,4). W tym celu przenieść substancje stałe do butelki o pojemności 250 mL i dopełnić do 200 mL za pomocą ddH2O. Wymieszać dokładnie i dostosować pH do 7,4 za pomocą 1 M NaOH lub HCl. Następnie dopełnić do 250 mL za pomocą ddH2O. Wszystkie roztwory buforowe przefiltrować za pomocą jednostki filtrującej nakrętkowej.
  2. Lizy komórek
    ​W tym przypadku zastosowano sonikator (z maksymalną mocą wyjściową wysokiej częstotliwości (HF) 200 W); należy pamiętać, że ustawienia mocy niezbędne do rozbicia komórek mogą się różnić w zależności od urządzenia. Wszystkie etapy przeprowadza się w lodzie. Alternatywnie można zastosować chemiczną lizę komórek, homogenizator ciekły lub prasę francuską (French press).
    1. Do każdej probówki wirówkowej (z kroku 3.8) dodać 12 mL buforu wiążącego i resuspendować za pomocą wortexu.
    2. Zanurzyć końcówkę sondy sonikatora w zawiesinie komórkowej. Ustawić sonikator na 40% amplitudy z impulsem 1 s włączony / 5 s wyłączony przez 15 min.
      UWAGA: Czyścić końcówkę sonikatora pomiędzy próbkami, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Przetrzeć sondę sonikatora 70% etanolem.
    3. Wirować zlizowaną zawiesinę komórkową w temperaturze 4 °C przez 40 min przy 15 000 x g, aby odwirować resztki komórkowe. Przenieść nadsącz do nowej probówki reakcyjnej.
  3. Chromatografia powinowactwa
    W przypadku chromatografii powinowactwa do zimmobilizowanych jonów metali (IMAC)40 można zastosować pompę perystaltyczną lub system FPLC z kartridżem 1 mL (tutaj wypełnionym żywicą Ni-NTA). W celu przygotowania buforów należy przejść do kroku 4.1.
    UWAGA: Oczyszczanie metodą IMAC jest możliwe, ponieważ produkowany peptyd rekombinowany posiada N-końcowy znacznik His, który jest usuwany w kroku 6 przez peptydazę sygnałową NisP, uwalniając dojrzałą nizynę. Oczyszczanie przeprowadzać w temperaturze pokojowej lub 4 °C. Jeśli jest to możliwe dla danego kartridża IMAC, zastosować szybkość przepływu 1 mL na minutę.
    1. Najpierw przemyć kartridż 5 objętościami kolumny (cv) ddH2O w celu usunięcia buforu do przechowywania.
    2. Równoważyć 10 cv buforu wiążącego.
    3. Przetworzyć lizat komórkowy (krok 4.2), używając filtra strzykawkowego w celu usunięcia cząstek, a następnie nałożyć go na kartridż.
    4. Przemyć 15 cv buforu płuczącego, aby usunąć materiał niespecyficzny i nieprzypisany.
    5. Eluować 10 cv buforu elucyjnego i zbierać frakcje o objętości 1 mL do probówek 1,5 mL. Przechowywać frakcje w temperaturze 4 °C krótkoterminowo (do 3 dni) lub w temperaturze -20 °C długoterminowo.
    6. Przed przechowywaniem przemyć kartridż 10 cv ddH2O, a następnie 5 cv 20% etanolu.

5. Analiza spektrometryczna analogów nizyny metodą LC-ESI-TOF

UWAGA: Przykładową aparaturę do chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas z jonizacją elektrorsikową i analizatorem czasu przelotu (LC-ESI-TOF-MS) przedstawiono w tabeli Materiały.

  1. Przeprowadź rozdział HPLC 15-20 µL roztworu peptydów (przygotowanego w kroku 4.3) na kolumnie C5, stosując fazę ruchomą składającą się z wody (A) i acetonitrylu (B), oba z dodatkiem 0,1% kwasu mrowego, z gradientem od 5-80% B w ciągu 20 min. Do spektrometrii mas (MS) wykorzystaj elucję po 5 min.
    UWAGA: W zależności od zawartości peptydów i ich powinowactwa do kolumny HPLC, objętości próbek oraz warunki rozdziału mogą wymagać optymalizacji.
  2. Użyj odpowiedniego oprogramowania w celu dekonwolucji zmierzonych widm mas i obliczenia różnych stanów ładunku peptydów41. Porównaj masę obserwowanych gatunków peptydów z obliczoną masą typu dzikiego po substytucji cAA → ncAA. Należy uwzględnić, że liniowy prepeptyd ulega potranslacyjnej modyfikacji w postaci ośmiu dehydratacji (-8 H2O) i pięciu cyklizacji (patrz Rysunek 1).
    UWAGA: Przy zastosowaniu buforów zawierających sód, analiza MS w trybie pozytywnym może wykazać addukty sodowe. Pojawiają się one jako dodatkowe piki o wyższej masie po dekonwolucji (dla każdego adktu sodowego obserwowana masa po dekonwolucji jest wyższa o 22,99 Da). Aby usunąć te addukty, można przeprowadzić oczyszczanie za pomocą HPLC42 lub rozległą dializę43.

6. Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej

  1. Przygotowanie płytek z agarem GM17 w warunkach sterylnych
    1. Przygotować nocną kulturę szczepu wskaźnikowego L. lactis NZ9000 niosącego plazmid pNG nisPT44 w temperaturze 30 °C w bulionie M1745 z 1% (w/v) glukozą (=GM17) i 5 µg/mL chloramfenikolem.
    2. Zmierzyć OD600, zaszczepić świeże medium do OD600 = 0,1 i inkubować do osiągnięcia OD600 = 0,4-0,6. Następnie umieścić kolbę w lodzie.
      Uwaga: Każdy pomiar OD600 zużywa objętość kultury. Należy pamiętać, że dla każdej płytki agarowej do testu potrzebny będzie 1 mL kultury bakteryjnej. W razie potrzeby odpowiednio zwiększyć objętość kultury płynnej.
    3. W przypadku agaru 1,5%, odważyć 4,5 g agaru do szklanej butelki na pożywki. Dodać 300 mL ddH2O, wymieszać i autoklawować.
    4. Przygotować 2x bulion M17 (dwukrotnie stężony) w 300 mL ddH2O i autoklawować.
    5. Wymieszać 25 mL 2x bulionu M17 zawierającego 10 µg/mL chloramfenikolu i 2% glukozy z 1 mL prekultury L. lactis (4% v/v).
    6. Dodać 25 mL roztopionego agaru 1,5% (świeżo autoklawowanego lub podgrzanego w mikrofalówce).
      UWAGA: Przed tym krokiem pozwolić butelce ostygnąć do temperatury bezpiecznej w dotyku (około 50 °C). Jest to konieczne, ponieważ L. lactis jest organizmem mezofilnym wrażliwym na wysokie temperatury.
    7. Wylać roztwór do dużej szalki Petriego. Osuszać płytki przez 10-15 min.
    8. Zsterylizować końcówki szklanej pipety Pasteura nad płomieniem. Odczekać do ich ostygnięcia, a następnie użyć szerokiego końca do wykonania otworów w zestalonym agarze GM17.
  2. Przygotowanie próbek
    1. Pobrać 1 mL kultur ekspresyjnych E. coli (przygotowanych w kroku 3.7) do opisanej probówki 1,5 mL i wirować przez 3 min przy 7 000 x g. Odessać pozostałe medium i resuspendować osad komórkowy w 500 µL Na-P (bufor fosforanowy sodu 50 mM, pH 7,4, przygotowany z 0,5 M wodorofosforanu sodu i 0,5 M wodorofosforanu sodu dwuwodnego).
    2. Sonicować próbki w lodzie (por. krok 4.2.2). Zanurzyć końcówkę sondy sonikatora w zawiesinie komórkowej. Ustawić sonikator na 30% amplitudy z impulsem 1 s włączenia i 5 s wyłączenia przez 3 min.
    3. Wirować lizat komórkowy przez 10 min przy 13 000 x g w celu osadzenia szczątków komórkowych. Przenieść nadsącz do nowej probówki reakcyjnej w lodzie.
    4. Rozcieńczyć i znormalizować nadsącze ekstraktu komórkowego do OD600 = 0,6 na 1 mL, w odniesieniu do gęstości zebranych komórek, za pomocą Na-P.
  3. Test aktywności
    1. Dodać 40 µL każdej znormalizowanej próbki do otworu w agarowej płytce wskaźnikowej (Rysunek 3). Jako związek kontrolny przeciwbakteryjny zastosować chloramfenikol w stężeniu 400 µg/mL. Jako kontrolę negatywną zastosować bufor elucyjny. Odczekać, aż wszystkie próbki rozprzestrzenią się w agarze. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 °C.
    2. Wykonać zdjęcia płytek agarowych za pomocą skanera płaskiego lub aparatu cyfrowego. Rozmiary halo inhibicji wzrostu można zmierzyć ręcznie lub za pomocą programu ImageJ46.

7. Mikroskopia fluorescencyjna

W celu obserwacji wpływu AMP na komórki bakteryjne można zastosować mikroskopię świetlną oraz fluorescencyjną. Należy zauważyć, że mechanizm działania nizyny opiera się na destabilizacji i tworzeniu porów w błonach bakteryjnych6. W niniejszym przypadku do barwienia błony komórkowej bakterii wykorzystano czerwień Nilową, która ulega rozproszeniu i agregacji w wyniku lizy komórek.

UWAGA: Przykładową aparaturę przedstawiono w tabeli Materiały. Ilość dodanego roztworu AMP można dostosować w zależności od stężenia i bioaktywności peptydu.

  1. Przygotowanie komórek
    1. Przygotować 10 mM roztwór zapasowy czerwieni nilowej (Nile red) w dimetylosulfotlenku (DMSO).
    2. Wyhodować szczep wskaźnikowy L. lactis do OD600 = 1,0 zgodnie z krokami 6.1.1-6.1.2.
    3. Odwirować 1 mL hodowli przez 3 min w temperaturze 4 °C przy 5,000 x g.
    4. Usunąć nadsącz, resuspender w 1 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS)47.
    5. Ponownie odwirować i resuspender.
    6. Dodać 1 µL roztworu zapasowego czerwieni nilowej, delikatnie wymieszać.
  2. Akwizycja obrazów mikroskopowych
    1. Nanieść 30 µL przygotowanej zawiesiny komórkowej na szkiełko podstawowe, wzbudzając przy 520 nm.
    2. Ustawić czas akwizycji na 0,2 s, częstotliwość serii kinetycznej na 0,1 Hz oraz długość serii na 200 obrazów.
    3. Dodać 0,3 - 1,5 µL lizatu komórkowego lub próbki IMAC (odpowiednio z kroku 6.2.4 lub 4.3.5). W przypadku próbek IMAC jako kontrolę negatywną można zastosować bufor elucyjny.
    4. Monitorować i rejestrować emisję fluorescencji przy λ ≥ 560 nm.
  3. Analiza danych
    1. Sekwencje obrazów z mikroskopii są zapisywane jako pliki wideo (.avi). Pojedyncze obrazy analizuje się za pomocą programu ImageJ46.

Wyniki

Niniejszy protokół został opracowany w celu umożliwienia produkcji wariantów nizyny modyfikowanych ncAA z resyduowo-specyficzną inkorporacją analogów proliny metodą SPI. Wcześniej zgłoszono wykonalność oraz wydajności na poziomie 24 mg/L dla rekombinacyjnej produkcji w pełni zmodyfikowanej nizyny typu dzikiego39. Przy zastosowaniu metody SPI wydajności docelowych peptydów/białek są często dobre i mogą osiągać ilości zbliżone do produkcji typu dzikiego48. W ramach pierwszych eksperymentów należy przetestować rekombinacyjną produkcję RiPP typu dzikiego w wybranym gospodarzu aukstroficznym. W tym przypadku jako szczep gospodarza wykorzystano proline-aukstroficzną E. coli MG1655 ΔproBA::frt ΔproC::frt (DE3). W celu inkorporacji ncAAs można zoptymalizować czas hodowli i indukcji, a także skład pożywki i temperaturę, aby uzyskać maksymalną wydajność peptydów.

Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej
Produkcję i oczyszczanie rekombinowanej nizyny typu dzikiego przeprowadzono zgodnie z powyższym protokołem. W tym przypadku w kroku 3.6 zamiast pochodnych ncAA zastosowano prolinę. W celu weryfikacji produkcji RiPP oraz porównania aktywności przeciwdrobnoustrojowej przed i po oczyszczaniu wykorzystano test aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Do testu aktywności użyto bezpośrednio frakcji elucji oraz przełomu z kolumny IMAC, badając je przeciwko gram-dodatniemu szczepowi wskaźnikowemu L. lactis (Rycina 2). Ponieważ szczep ten wykazuje ekspresję NisP, warianty nizyny zawarte odpowiednio w lizatach komórek E. coli lub w próbkach oczyszczonego peptydu ulegają aktywacji poprzez proteolityczne odcięcie peptydu sygnałowego. Wyraźnie stwierdzono, że przełom wykazuje aktywność hamującą wzrost. Można to wyjaśnić brakiem wiązania materiału bioaktywnego z kolumną IMAC. Wszystkie przetestowane frakcje elucji wykazały zwiększoną aktywność w porównaniu z próbką nieoczyszczoną, co wskazuje na zagęszczenie peptydu z tagiem His za pomocą IMAC. Należy zauważyć, że bufor elucyjny (jako kontrola negatywna) nie wpływał na wzrost L. lactis w tym teście.

Schemat testu podatności na antybiotyki z eluatami, buforem i przepływem; lek Cm (400 µg/mL).
Rysunek 2. Test aktywności przeciwdrobnoustrojowej po oczyszczaniu metodą IMAC rekombinacyjnie otrzymanej nizyny typu dzikiego.Frakcje elucji od 5 do 15 oraz ciecz przepływową po oczyszczaniu IMAC przetestowano w porównaniu z nieoczyszczonym lizatem komórkowym (rozcieńczonym w celu normalizacji OD600) przeciwko szczepowi wskaźnikowemu L. lactis. Wielkość halo zahamowania wzrostu wskazuje na aktywność przeciwdrobnoustrojową. Chloramfenikol w stężeniu 400 µg/mL zastosowano jako kontrolę pozytywną, a bufor elucyjny IMAC jako kontrolę negatywną. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby udowodnić aktywność przeciwdrobnoustrojową rekombinacyjnie otrzymanych wariantów nizyny zawierających sześć różnych analogów proliny, przeprowadzono test aktywności w celu zbadania inhibicji szczepu wskaźnikowego L. lactis. Rysunek 3 przedstawia inhibicję wzrostu dla pięciu z sześciu próbek otrzymanych przy użyciu analogów proliny. Najlepsze wyniki (oceniane na podstawie wielkości halo) zaobserwowano w eksperymentach z inkorporacją analogów (4R)-fluoroproliny, (4R)-hydroksyproliny oraz (4S)-metanoproliny. Porównując wielkość halo inhibicji wzrostu z nizyną typu dzikiego, otrzymaną i przebadaną równolegle, wszystkie trzy warianty nizyny wykazały podobną siłę inhibicji. Jednak sama wielkość halo nie może służyć do oceny aktywności swoistej, ponieważ nie określono stężenia AMP. Zatem testy te służą jedynie do jakościowego sprawdzenia, czy aktywność przeciwdrobnoustrojowa otrzymanych wariantów nizyny została zachowana czy utracona. Aby wyznaczyć aktywność swoistą, należy określić stężenie wariantów nizyny (patrz Dyskusja).

Procesy reakcji chemicznych ze strukturami cząsteczkowymi; schematy przedstawiają przemiany związków.
Rysunek 3. Analiza aktywności przeciwdrobnoustrojowej lizatów komórkowych zawierających warianty nizyny wytworzone via SPI z analogami proliny. Porównanie wariantów nizyny z próbkami rekombinowanego typu dzikiego. Wszystkie próbki zostały znormalizowane pod kątem OD600 po lizie komórek w stosunku do gęstości zebranej kultury komórkowej. Halo wskazują na bioaktywność w postaci zahamowania wzrostu szczepu wskaźnikowego. Pierwszy rząd od lewej do prawej: (4R)-fluoroprolina, (4R)-hydroksyprolina, (4R)-metanoprolina oraz chloramphenicol (400 µg/mL; pozytywna kontrola przeciwdrobnoustrojowa). Drugi rząd: (4S)-fluoroprolina, (4S)-hydroksyprolina, (4S)-metanoprolina oraz prolina (kontrola typu dzikiego). Należy zwrócić uwagę na nomenklaturę chemiczną; np. (4R)-fluoroprolina jest określana również jako trans-4-fluoroprolina. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Spektrometria mas LC-ESI-TOF
Po oczyszczaniu metodą IMAC włączenie ncAAs do nizyny przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas LC-ESI-TOF. Rysunek 4 przedstawia zdekonewolucjonowane widma mas wariantu nizyny zawierającego (4R)-fluoroprolinę. Wariant ten został oczyszczony metodą IMAC zgodnie z powyższym opisem, a następnie przeanalizowany za pomocą spektrometrii mas LC-ESI-TOF, zatem wciąż posiadał on peptyd sygnałowy. Główny pik na Rysunku 4A odpowiada zmodyfikowanej nizynie zawierającej (4R)-fluoroprolinę z zdekonewolucjonowaną masą 6883,18 Da (masa obliczona 6882,05 Da, masa obliczona dla odpowiadającego mu peptydu typu dzikiego z proliną w pozycji 9 wynosi 6864,06 Da). Dwa piki o niższej intensywności i wyższej masie odpowiadają adduktom sodu, zgodnie z oznaczeniem. Rysunek 4B przedstawia gatunki głównego związku o różnych ładunkach, wyznaczone przez algorytm dekonwolucji. Na przykład pik przy 1148,11 m/z odpowiada gatunkowi sześciokrotnie naładowanemu ([M+6H]6+).

Wyniki spektrometrii mas; A) znormalizowana obfitość względem masy [Da], B) intensywność względna względem m/z.
Rycina 4. Spektrometria mas LC-ESI-TOF rekombinowanych wariantów nizyny zawierających (4R)-fluoroprolinę, oczyszczonych metodą IMAC. (A) Zdekonwolucjonowany chromatogram spektrometrii mas (widok ogólny na wstawce) dla wariantu nizyny (nadal z sekwencją liderową) z (4R)-fluoroproliną (oczekiwane masy (Da): [M+H]+ = 6882,05, [M+Na]+ = 6904,03, [M+2Na]2+ = 6926,02). (B) Widma złożone dla jonów [M+H]+. Oczekiwane masy (Da): [M+5H]5+ = 1377,41, [M+6H]6+ = 1148,01, [M+7H]7+ = 984,15, [M+8H]8+ = 861,26, [M+9H]9+ = 765,67, [M+10H]10+ = 689,21, [M+11H]11+ = 626,64, [M+12H]12+ = 574,50. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Mikroskopia fluorescencyjna
Aktywność przeciwdrobnoustrojową rekombinowanej nizyny oraz jej wariantów zawierających ncAA można również wykazać poprzez bezpośrednią obserwację L. lactis szczep wskaźnikowy poprzez mikroskopia fluorescencyjna. Do barwienia błony komórkowej bakterii użyto Nile red, silnie hydrofobowego barwnika fluorescencyjnego. Rycina 5 pokazuje jakościową zmianę stanu agregacji hodowli komórkowej oraz morfologię pojedynczych komórek. Komórki zabarwiono czerwienią Nilową (Nile red) i naniesiono na szkiełko podstawowe do mikroskopii. Górny rząd przedstawia komórki bezpośrednio na początku, gdy bufor, rekombinowana nizyna typu dzikiego lub nizyna zawierająca (4R)-fluoroprolina, lub (4R)-hydroksyprolinę. Dolny panel przedstawia odpowiadające im obrazy po 20 minutach inkubacji.

Mikroskopia fluorescencyjna, analiza obrazu dyspersji nanocząstek, porównywanie stopni agregacji
Rycina 5Mikroskopia fluorescencyjna wpływu rekombinowanej nizyny na komórki Gram-dodatnie. Obrazy mikroskopowe 30 µL L. lactis szczep wskaźnikowy (OD600 = 1) znakowanych czerwienią nilową pobrano przed (panel górny) i po (panel dolny) 20-minutowej inkubacji z 1 µL bufor (A), 0.3 µL rekombinowana nizyna typu dzikiego (B) i 0.6 µL warianty nizyny zawierające (4R)-fluoroprolina (C) i (4R)-hydroksyprolina (D). Niebieskie kółka zaznaczają obszary z zagregowanymi lub zdeformowanymi komórkami, a niebieskie strzałki wskazują obszary, w których można zaobserwować dyfuzję fluorescencyjnych fragmentów błon. Aby wyświetlić tę figurę w większym rozmiarze, kliknij tutaj.

Rysunek 5A pokazuje, że ogólny wygląd komórek nie uległ zmianie w ciągu 20 minut obserwacji. Wzrastała jedynie liczba osadzonych w tym czasie komórek, w związku z czym w obserwowanym obszarze o wymiarach 80 µm x 80 µm widoczna jest większa ich liczba. Rysunek 5B pokazuje, że komórki Gram-dodatnie po 20 minutach ekspozycji na nisin typu dzikiego pojawiły się w formie agregatów i były rozmyte (zaznaczone niebieskimi okręgami), nawet po dodaniu niskich ilości (tutaj 0,3 µL eluatu IMAC). Dodatkowo z komórek do buforu dyfundował jasny materiał, co wskazuje na mobilizację fragmentów błon znakowanych Nile red w tym przedziale czasowym (zaznaczone niebieskimi strzałkami). Wyniki te wskazują na lizę komórek, co zostało wykazane podczas traktowania nisinem6,49. Podobne efekty zaobserwowano po inkubacji z wariantem nisinu zawierającym (4R)-fluoroprolinę (Rysunek 5C) oraz nisinem zawierającym (4R)-hydroksyprolinę (Rysunek 5D); w obu przypadkach po 20 minutach widoczne były liczne zdeformowane i zagregowane komórki, co stanowi wyraźny kontrast w stosunku do próbki kontrolnej (Rysunek 5A).

KomponentStężenie
(NH4)2SO4 7,5 mM
NaCl 8,5 mM
KH2PO422 mM
K2HPO450 mM
MgSO₄41 mM
D-glukoza20 mM
Wszystkie kanoniczne aminokwasy
(z wyjątkiem tego do zastąpienia)		50 mg/L
Wapń2+1 µg/mL
Fe2+1 µg/mL
Pierwiastki śladowe
(Cu2+, Zn2+, Mn2+, MoOH2+)		0.01 µg/mL
Tiamina10 µg/mL
Biotyna10 µg/mL

Tabela 1. Skład chemicznie zdefiniowanej pożywki bakteryjnej NMM19 po przygotowaniu zgodnie z krokiem 2.

Dyskusja

Dzięki zastosowaniu SPI do wprowadzania analogów proliny, docelowe struktury nizyny mogą być znacznie modyfikowane, tworząc nowe warianty peptydów o unikalnych kombinacjach sekwencji i właściwościach chemicznych. W ten sposób można obejść podstawowy limit klasycznej technologii genowej, który jest ograniczony do chemii łańcucha bocznego 20 cAA. Dywersyfikacja chemiczna nizyny in vivo , jak pokazano powyżej, demonstruje ogólne podejście do uzupełniania naturalnych PTM i radykalnego zwiększania przestrzeni chemicznej RiPP. Wierzymy, że poszerzenie repertuaru naturalnych aminokwasów jest bardzo obiecujące, szczególnie w przypadku AMP. W białkach ogromny zakres funkcji może być realizowany poprzez zdefiniowany układ 20 cAA w trójwymiarowych strukturach. Przy długości zaledwie 7-100 aa3, sposoby osiągnięcia takich cech strukturalnych tylko za pomocą cAA byłyby ograniczone w przypadku AMP. Nie jest więc zaskakujące, że naturalne AMP w postaci RiPP są powszechnie intensywnie modyfikowane potranslacyjnie4. W ten sam sposób ncAA jako alternatywne elementy budulcowe są bardzo obiecujące, jeśli chodzi o poprawę ich parametrów farmakodynamicznych i farmakokinetycznych (patrz Baumann i in. 201735 i odniesienia tam).

Metodologia SPI zastosowana w tej pracy korzysta ze stosunkowo łatwej konfiguracji eksperymentalnej, prostego wykonania i wysokiej odtwarzalności. Ze względu na globalną substytucję, możliwe jest również włączenie wielomiejscowego ncAA do peptydów docelowych. Z drugiej strony, metoda ta może nie być odpowiednia do zastąpienia aminokwasów często występujących w produkcie docelowego genu. Zasadniczo niepożądane pozycje mogą zostać zmienione przez mutagenezę ukierunkowaną, ale te dodatkowe zmiany mogą również wpływać na kilka właściwości AMP, w tym strukturę i bioaktywność. Gdy szczep auksotroficzny do produkcji jest dostępny, można przetestować kilka ncAA bez konieczności wprowadzania rozległych zmian na poziomie genetycznym. Co więcej, metoda nie ogranicza się do auksotroficznych szczepów E. coli , ale może być również wykonywana przy użyciu naturalnego żywiciela produkcyjnego. Na przykład Zhou i in. wykazali, że SPI do produkcji nowych RiPP działa również w naturalnie Trp-auksotropie L. lactis: Używając zdefiniowanych pożywek, trzy analogi tryptofanu zostały włączone w czterech pozycjach do nizyny50.

Ponieważ metoda SPI prowadzi do globalnego zastąpienia wybranego cAA przez ncAA, ma ona ogólne zastosowanie do szerokiego zakresu docelowych peptydów i białek. Dostępny jest szereg auksotroficznych szczepów E. coli (patrz krok 1), co pozwala na przetestowanie kilku cAA pod kątem zastąpienia przez ncAA. Najczęściej stosuje się analogi met włączone przy użyciu szczepów z niedoborem metA (np. B834(DE3)). Przykładami izostrukturalnych analogów Met są azydohomoalanina (Aha) i homopropargyloglicyna (Hpg), dostępne na rynku ncAA, które można skutecznie włączyć. Oba wprowadzają bioortogonalne uchwyty, które umożliwiają przyłączanie cząsteczek przenoszących kompatybilną funkcjonalność alkinową lub azydkową. Na przykład barwniki fluorescencyjne lub ugrupowania glikolu polietylenowego (PEG) mogą być przyłączane przez katalizowaną miedzią(I) cykloaddycję azydku alkiny (CuAAC)51.

Chociaż obie metody inkorporacji rekombinowanych ncAA (SPI i SCS) zwykle osiągają wystarczające ilości docelowe, plony są często zmniejszone w stosunku do produkcji odpowiednich peptydów i białek typu dzikiego. Ponieważ czystość często koreluje z wydajnością produkcji, mogą być wymagane dodatkowe etapy oczyszczania, szczególnie w przypadku gatunków o niskiej liczebności. W tym konkretnym przypadku produkcji rekombinowanej nizyny, sekwencja lidera oznaczona przez Hisa znacznie upraszcza oczyszczanie RiPP poprzez selektywne wzbogacanie z lizatów komórkowych. Oczyszczanie pokazane w tym protokole poprawia czystość i stężenie nizyny, ale często nie daje czystości AMP wystarczającej do określenia wydajności i określonej aktywności. Oprócz IMAC, powszechnie stosowane metody oczyszczania AMP obejmują HPLC, chromatografię jonowymienną (IEC) i wytrącanie (np. przy użyciu acetonu lub kwasu trichlorooctowego (TCA)) lub ich kombinacje - co daje wieloetapowy schemat oczyszczania52. Należy zauważyć, że ich powszechnie polikationowy charakter może ułatwiać oczyszczanie IEC. Liofilizacja jest często stosowana do przechowywania oczyszczonych AMP.

Idealnie byłoby, gdyby ncAA do włączenia do AMP były dostępne na rynku po przystępnych cenach lub łatwe do wytworzenia za pomocą prostych i powtarzalnych protokołów syntezy chemicznej. Równie ważnym warunkiem wstępnym dla metody SPI jest rozpoznanie, aktywacja i naładowanie ncAA do pokrewnego tRNA przez endogenne lub współeksprymowane aaRS. Można to przetestować in vitro za pomocą aktywacji aminokwasów lub testu aminoacylacji tRNA53. Jako łatwą alternatywę można przeprowadzić ekspresję testów SPI białek modelowych, takich jak białko zielonej fluorescencji (GFP), przeprowadzanych zarówno w obecności, jak i przy braku suplementacji ncAA. Ponadto ważnymi czynnikami są rozpuszczalność w pożywce wzrostowej i przepuszczalność komórek, a także stabilność chemiczna.

W tym przykładzie aktywność przeciwdrobnoustrojowa została zbadana przy użyciu szczepu wskaźnikowego Gram-dodatniego. Ponieważ wyraża wiodącą peptydazę NisP, ostatni etap dojrzewania nizyny jest katalizowany. Usunięcie sekwencji wiodącej (oznaczonej przez Hisa w celu oczyszczenia) można również przeprowadzić in vitro poprzez traktowanie oczyszczonym NisP50 lub trypsyną54. Poza zakresem tych prac, organizmy chorobotwórcze i szczepy wielolekooporne mogą być następnie testowane pod kątem bakteriostatycznego lub bakteriobójczego hamowania przez AMP przy użyciu podobnej metodologii. Klinicznie istotne gatunki docelowe obejmują MRSA, MDR Mycobacterium tuberculosis, VRE, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa i Klebsiella pneumoniae. Oprócz przedstawionego tutaj testu dyfuzji na płytce agarowej, hamowanie wzrostu można również przeprowadzić przy użyciu odpowiednich płynnych pożywek zaszczepionych gatunkami bakterii i uzupełnionych AMP. Stosując metody rozcieńczania bulionu, minimalne stężenie hamujące (MIC) można określić za pomocą czystych peptydów55. Przedstawiony tutaj test aktywności może być również wykorzystany do oszacowania bioaktywności i siły działania roztworów zawierających AMP w stosunku do związków odniesienia, na przykład dostępnej na rynku nizyny.

Rekombinowana produkcja RiPP jest często możliwa39, co zwykle obejmuje koekspresję genów PTM. Z chwilą, gdy szczep produkcyjny zostanie przeniesiony do chemicznie zdefiniowanego lub syntetycznego podłoża minimalnego zawierającego odpowiedni ncAA, następuje zastąpienie odpowiadającego mu cAA specyficznego dla pozostałości. W związku z tym inne RiPP mogą być wytwarzane przy użyciu tej samej metodologii, pod warunkiem, że ich produkcja rekombinowana jest wykonalna i można znaleźć warunki, w których włączenie ncAA i PTM daje wystarczające ilości produktu docelowego. Należy zauważyć, że oprócz proteomu komórki gospodarza, maszyneria peptydowa PTM może również zostać zmodyfikowana przez ncAA podczas SPI. W związku z tym czas indukcji ekspresji docelowej i długość następnego okresu inkubacji mogą wymagać optymalizacji. Ponieważ włączenie ncAA do enzymów PTM może wpływać na ich stabilność i aktywność, w zasadzie może to mieć wpływ na produkcję przetworzonego RiPP. Wystarczająca skuteczność enzymu PTM jest wskazywana przez tworzenie przetworzonego prepeptydu, wykrywanego przez stwardnienie rozsiane i testy bioaktywności. Jak przedstawiono powyżej, różne indukowalne promotory mogą być stosowane w celu wytworzenia genów PTM najpierw (w przypadku braku ncAA), a następnie indukcji genu peptydu prekursorowego w obecności ncAA. Ogólnie rzecz biorąc, produkcja peptydu docelowego zawierającego cAA musi zostać stłumiona przed dodaniem ncAA, dlatego wymagana jest ścisła represja genu prekursorowego. W ramach tego protokołu osiąga się to poprzez tłumienie kataboliczne poprzez dodanie glukozy do pożywki wzrostowej. Zwłaszcza, że enzymy PTM wymagane do przetwarzania prepeptydów pochodzą zwykle od genetycznie odległego gospodarza, temperatura ekspresji i wykorzystanie kodonów odpowiednich genów mogą wymagać optymalizacji, jeśli produkcja rekombinowana nie została jeszcze ustalona. Zasadniczo obecność ncAA w prepeptydzie może zakłócać rozpoznawanie i przetwarzanie enzymów PTM, w przypadku nizyny NisBC i NisP. W celu włączenia ncAA do AMP zaleca się zatem przeprowadzenie najpierw eksperymentów ekspresji na małą skalę w celu określenia odpowiednich warunków ekspresji i wiarygodności testu aktywności AMP.

Oświadczenia

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

J.H.N., T.B. i M.B. potwierdzają finansowanie przez program UE FW7 (SYNPEPTIDE). F.-J.S. i T.F. potwierdzają finansowanie przez Federalne Ministerstwo Edukacji i Nauki (program BMBF "HSP 2020", projekt TU-WIMIplus SynTUBio) oraz Niemiecką Fundację Badawczą (Klaster Doskonałości "Ujednolicenie koncepcji w katalizie").

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
chlorek soduCarl Roth, NiemcyP029
chlorowodorek guanidynyCarl Roth, Niemcy0035.2
wodorofosforan dipotasuCarl Roth, NiemcyP749.3
diwodorofosforan potasuCarl Roth, Niemcy3904.3
diwodorofosforan sodu jednowodnyCarl Roth, NiemcyK300.2
wodorofosforan disodowyCarl Roth, NiemcyP030.2
L-alaninaCarl Roth, Niemcy3076.2
L-argininaCarl Roth, Niemcy3144.3
Monohydrat L-asparaginyCarl Roth, NiemcyHN23.1
Kwas L-asparaginowyCarl Roth, NiemcyT202.1
L-cysteinaCarl Roth, Niemcy3467.3
L-glutaminaCarl Roth, Niemcy3772.1
Kwas L-glutaminowyCarl Roth, Niemcy3774.1
L-glicynaCarl Roth, Niemcy3187.3
L-histydynaCarl Roth, Niemcy3852.3
L-izoleucynaCarl Roth, Niemcy3922.3
L-leucynaCarl Roth, Niemcy3984.3
L-lizyna monohydratCarl Roth, Niemcy4207.2
L-metioninaCarl Roth, Niemcy9359.4
L-fenyloalaninaCarl Roth, Niemcy4491.2
L-prolinaCarl Roth, NiemcyT205.3
L-serynaCarl Roth, Niemcy4682.4
L-treoninaCarl Roth, NiemcyT206.2
L-tryptofanCarl Roth, Niemcy4858.2
L-tyrozynaCarl Roth, NiemcyT207.2
L-walinaCarl Roth, Niemcy4879.4
siarczan amonuCarl Roth, Niemcy3746.3
magnez siarczanCarl Roth, Niemcy0261.2
D-glukozaCarl Roth, Niemcy6780przygotować 20% (w/v) roztwór do dodania do stopionego agaru
chlorek wapniaCarl Roth, NiemcyPN93.2
chlorek żelaza(II)Sigma-Aldrich, Niemcy372870
chlorowodorek tiaminySigma-Aldrich, NiemcyT1270
biotynaCarl Roth, Niemcy3822.2
siarczan miedzi(II)Merck, Niemcy102792
chlorek manganu(II)Carl Roth, NiemcyKK36.2
chlorekMerck, Niemcy108816
ortomolibdenian immonuSigma-Aldrich, Niemcy277908
glicerolCarl Roth, Niemcy7533.3
izopropyl β-D-1-tiogalaktopiranozydSigma-Aldrich, NiemcyI6758
sól sodowa ampicylinyCarl Roth, NiemcyK029,5stężenie robocze 100 &mikro; g / ml dla E. coli, przygotować zapas 100 mg / ml w ddH2O
siarczan kanamycynyCarl Roth, NiemcyT832.2stężenie robocze 50 &mikro; g/ml dla E. coli, przygotować 50 mg/ml zapasu w ddH2O
chloramfenikoluCarl Roth, Niemcy3886.1stężenie robocze 5 &mikro; g/ml dla L. lactis, przygotować 37 mg/ml zapasu etanolu
(4S)-fluoroprolinyBachem, SzwajcariaF-3970
(4S)-hydroksyprolinaBachem, SzwajcariaF-1395
(4R)-hydroksyprolinaBachem, SzwajcariaF-2980
(4S)-metanoprolinachemicznie syntetyzowany
(4R)-metanoprolinachemicznie syntetyzowany
kwas solny (HCl)Carl Roth, NiemcyP074.4
etanolVWR, Niemcy20825.324
M17-bulionSigmal-Aldrich, Niemcy56156produkt komercyjny, patrz Terzaghi BE & Sandine WE, Appl Microbiol., 1975, 29(6):807-13 dla zawartości i przygotowania
agar-agarCarl Roth, Niemcy5210.5
Nisyna z Lactococcus lactis Sigma-Aldrich, NiemcyProdukt komercyjny N5764, może być stosowany jako odniesienie do bioaktywności
dimetylosulfotlenku (DMSO)Carl Roth, NiemcyA994.1
imidazolCarl Roth, Niemcy3899.3
Fiolka z autosamplerem 1,5 ml do LC-MSSigma-Aldrich, NiemcySupelco 854165
acetonitrylVWR, NiemcyHiPerSolv CHROMANORM ULTRA dla LC-MS,wymagany gatunek 83642 LC-MS
kwas mrówkowyVWR, NiemcyHiPerSolv CHROMANORM dla LC-MS, wymagany gatunek 84865LC-MS
1 ml kolumna Ni-NTA IMAC, np. HisTrap FF CrudeGE Healthcare, UK29-0486-31różni producenci i żywice dostępne dla IMAC
0,45 i mikro; m Filtr butelkowyVWR, Niemcy10040-470sterylna filtracja roztworów za pomocą pompy próżniowej
0,45 i mikro; m filtr strzykawkowy membrana PVDFCarl Roth, NiemcyCCY1.1sterylna filtracja roztworów za pomocą strzykawki i do usuwania cząstek z lizatów komórkowych
strzykawka luer-lock, PP, 50 mlCarl Roth, NiemcyT552.2sterylna filtracja roztworów   
1,5 ml probówki EppendorfEppendorf, Niemcy30120086
szalki Petriego (polistyren, sterylne)Carl Roth, NiemcyTA19
Czerwień nilowaSigma-Aldrich, Niemcy72485
E. coli i Delta; proA szczepCGSC, kolekcja KeioJW0233-2prolinowo-auksotroficzny szczep E. coli K-12
E. coli B834(DE3)Novagen (Merck), Niemcy69041metionino-auksotroficzny szczep E. coli B
i lambda; Zestaw do lizogenizacji DE3Novagen (Merck), Niemcy69734-3
bakterii Lactococcus lactis NZ9000 pNG nisPT, patrz Khusainov R & Wirówka stołowa Kuipers OP, PLoS One, 8 (9), e74890
do probówek Eppendorf 1,5 mlEppendorf, Niemcy Pompa5427 R
GE Healthcare, Wielka BrytaniaP1
FPLCGE Healthcare, Wielka Brytaniai Auml; kta Purifier 10 lub podobny
mikroskop odwróconyNikonTI Eclipse szerokokątny mikroskop fluorescencyjny  z obiektywem 100x (N.A. 1.4) i lampą rtęciowąprzykładowa konfiguracja do mikroskopii fluorescencyjnej
Kamera CCD zwielokrotniająca elektrony (EMCCD)Andor Technologies, Wielka BrytaniaAndor Luca Przykładowa konfiguracja do mikroskopii fluorescencyjnej
Filtr wzbudzenia fluorescencjiThorlabs, USAKostka dichroiczna (TLV-U-MF2-TRITC)przykładowy zestaw do mikroskopii fluorescencyjnej
filtr emisji fluorescencjiAHF Analysentechnik, NiemcyT 560 LPXRprzykładowy zestaw do mikroskopii fluorescencyjnej
szkiełko nakrywkowe 24 x 60 mmCarl Roth, NiemcyLH26.1przykładowy zestaw do mikroskopii fluorescencyjnej
Olejek immersyjnyCarl Zeiss, NiemcyImmersol 518 Fdo mikroskopii fluorescencyjnej
Bandelin, NiemcySonopuls HD3200 z sonotrodą MS-72Maksymalna moc wyjściowa HF 200 W
Kolumna HPLC C5 (2,1x100 mm, 3 i mikro; m wielkość cząstek)Sigma-Aldrich, Niemcy567227-Uprzykładowa konfiguracja do spektrometrii mas
ESI-TOF sprzężona z systemem HPLCAgilent, USAAgilent 6530 Dokładny QTOF masy z przykładową konfiguracją HPLC 1260do spektrometrii mas
(4R)-fluoroprolina Bachem, Szwajcaria F-3975Szczep wskaźnikowy perystaltyczna System przykładowy zestaw do sonikurki sonicure

Bibliografia

  1. Ferri, M., Ranucci, E., Romagnoli, P., Giaccone, V. Antimicrobial resistance: A global emerging threat to public health systems. Crit Rev Food Sci Nutr. 57 (13), 2857-2876 (2017).
  2. Bahar, A. A., Ren, D. Antimicrobial peptides. Pharmaceuticals. 6 (12), 1543-1575 (2013).
  3. Ageitos, J. M., Sánchez-Pérez, A., Calo-Mata, P., Villa, T. G. Antimicrobial peptides (AMPs): Ancient compounds that represent novel weapons in the fight against bacteria. Biochem Pharmacol. 133, 117-138 (2017).
  4. Arnison, P. G., et al. Ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide natural products: overview and recommendations for a universal nomenclature. Nat Prod Rep. 30 (1), 108-160 (2013).
  5. Lubelski, J., Rink, R., Khusainov, R., Moll, G. N., Kuipers, O. P. Biosynthesis, immunity, regulation, mode of action and engineering of the model lantibiotic nisin. Cell Mol Life Sci. 65 (3), 455-476 (2008).
  6. Shin, J. M., Gwak, J. W., Kamarajan, P., Fenno, J. C., Rickard, A. H., Kapila, Y. L. Biomedical applications of nisin. J Appl Microbiol. 120 (6), 1449-1465 (2016).
  7. Scherer, K. M., Spille, J. -H., Sahl, H. -G., Grein, F., Kubitscheck, U. The lantibiotic nisin induces lipid II aggregation, causing membrane instability and vesicle budding. Biophys J. 108 (5), 1114-1124 (2015).
  8. Jung, G. Lantibiotica - ribosomal synthetisierte Polypeptidwirkstoffe mit Sulfidbrücken und α,β-Didehydroaminosäuren. Angew Chemie. 103 (9), 1067-1084 (1991).
  9. Rink, R., et al. Lantibiotic structures as guidelines for the design of peptides that can be modified by lantibiotic enzymes. Biochemistry. 44 (24), 8873-8882 (2005).
  10. Lagedroste, M., Smits, S. H. J., Schmitt, L. Substrate Specificity of the Secreted Nisin Leader Peptidase NisP. Biochemistry. 56 (30), 4005-4014 (2017).
  11. Ross, A. C., Liu, H., Pattabiraman, V. R., Vederas, J. C. Synthesis of the lantibiotic lactocin S using peptide cyclizations on solid phase. J Am Chem Soc. 132 (2), 462-463 (2010).
  12. Fukase, K., et al. Synthetic Study on Peptide Antibiotic Nisin. V. Total Synthesis of Nisin. Bull Chem Soc Jpn. 65 (8), 2227-2240 (1992).
  13. Dumas, A., Lercher, L., Spicer, C. D., Davis, B. G. Designing logical codon reassignment - Expanding the chemistry in biology. Chem Sci. 6 (1), 50-69 (2015).
  14. Kuthning, A., Durkin, P., Oehm, S., Hoesl, M. G., Budisa, N., Süssmuth, R. D. Towards Biocontained Cell Factories: An Evolutionarily Adapted Escherichia coli Strain Produces a New-to-nature Bioactive Lantibiotic Containing Thienopyrrole-Alanine. Sci Rep. 6, 33447(2016).
  15. Piscotta, F. J., Tharp, J. M., Liu, W. R., Link, A. J. Expanding the chemical diversity of lasso peptide MccJ25 with genetically encoded noncanonical amino acids. Chem Commun (Camb). 51 (2), 409-412 (2015).
  16. Hartman, M. C. T., Josephson, K., Lin, C. -W., Szostak, J. W. An expanded set of amino acid analogs for the ribosomal translation of unnatural peptides. PLoS One. 2 (10), 972(2007).
  17. Johnson, J. A., Lu, Y. Y., Van Deventer, J. A., Tirrell, D. A. Residue-specific incorporation of non-canonical amino acids into proteins: recent developments and applications. Curr Opin Chem Biol. 14 (6), 774-780 (2010).
  18. Ibba, M., Söll, D. Aminoacyl-tRNAs: setting the limits of the genetic code. Genes Dev. 18 (7), 731-738 (2004).
  19. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. J Mol Biol. 189 (1), 113-130 (1986).
  20. Budisa, N., Steipe, B., Demange, P., Eckerskorn, C., Kellermann, J., Huber, R. High-level biosynthetic substitution of methionine in proteins by its analogs 2-aminohexanoic acid, selenomethionine, telluromethionine and ethionine in Escherichia coli. Eur J Biochem. 230 (2), 788-796 (1995).
  21. Rink, R., et al. Dissection and modulation of the four distinct activities of nisin by mutagenesis of rings A and B and by C-terminal truncation. Appl Environ Microbiol. 73 (18), 5809-5816 (2007).
  22. Kubyshkin, V., Durkin, P., Budisa, N. Energetic contribution to both acidity and conformational stability in peptide models. New J Chem. 40 (6), 5209-5220 (2016).
  23. Molloy, E. M., Field, D., O'Connor, P. M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Saturation mutagenesis of lysine 12 leads to the identification of derivatives of nisin A with enhanced antimicrobial activity. PLoS One. 8 (3), 58530(2013).
  24. Wang, L., Brock, A., Herberich, B., Schultz, P. G. Expanding the genetic code of Escherichia coli. Science. 292 (5516), 498-500 (2001).
  25. Liu, C. C., Schultz, P. G. Adding new chemistries to the genetic code. Annu Rev Biochem. 79, 413-444 (2010).
  26. Anderson, J. C., Wu, N., Santoro, S. W., Lakshman, V., King, D. S., Schultz, P. G. An expanded genetic code with a functional quadruplet codon. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (20), 7566-7571 (2004).
  27. Zambaldo, C., Luo, X., Mehta, A. P., Schultz, P. G. Recombinant macrocyclic lanthipeptides incorporating non-canonical amino acids. J Am Chem Soc. 139 (34), 11646-11649 (2017).
  28. Al Toma, R. S., et al. Site-directed and global incorporation of orthogonal and isostructural noncanonical amino acids into the ribosomal lasso peptide capistruin. Chembiochem. 16 (3), 503-509 (2015).
  29. Chatterjee, A., Xiao, H., Schultz, P. G. Evolution of multiple, mutually orthogonal prolyl-tRNA synthetase/tRNA pairs for unnatural amino acid mutagenesis in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (37), 14841-14846 (2012).
  30. Budisa, N., Pal, P. P. Designing novel spectral classes of proteins with a tryptophan-expanded genetic code. Biol Chem. 385 (10), 893-904 (2004).
  31. Voller, J. -s, Thi To, T. M., Biava, H., Koksch, B., Budisa, N. Global substitution of hemeproteins with noncanonical amino acids in Escherichia coli with intact cofactor maturation machinery. Enzyme Microb Technol. 106, 55-59 (2017).
  32. Moghal, A., Hwang, L., Faull, K., Ibba, M. Multiple Quality Control Pathways Limit Non-protein Amino Acid Use by Yeast Cytoplasmic Phenylalanyl-tRNA Synthetase. J Biol Chem. 291 (30), 15796-15805 (2016).
  33. Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6640-6645 (2000).
  34. Engelke, G., Gutowski-Eckel, Z., Hammelmann, M., Entian, K. D. Biosynthesis of the lantibiotic nisin: genomic organization and membrane localization of the NisB protein. Appl Environ Microbiol. 58 (11), 3730-3743 (1992).
  35. Baumann, T., Nickling, J. H., Bartholomae, M., Buivydas, A., Kuipers, O. P., Budisa, N. Prospects of In vivo Incorporation of Non-canonical Amino Acids for the Chemical Diversification of Antimicrobial Peptides. Front Microbiol. 8, 124(2017).
  36. Plat, A., Kluskens, L. D., Kuipers, A., Rink, R., Moll, G. N. Requirements of the engineered leader peptide of nisin for inducing modification, export, and cleavage. Appl Environ Microbiol. 77 (2), 604-611 (2011).
  37. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. J Vis Exp. , (2017).
  38. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. J Vis Exp. , (2017).
  39. Shi, Y., Yang, X., Garg, N., van der Donk, W. A. Production of lantipeptides in Escherichia coli. J Am Chem Soc. 133 (8), 2338-2341 (2011).
  40. Hochuli, E., Bannwarth, W., Döbeli, H., Gentz, R., Stüber, D. Genetic Approach to Facilitate Purification of Recombinant Proteins with a Novel Metal Chelate Adsorbent. Nat Biotechnol. 6 (11), 1321-1325 (1988).
  41. Zhang, Z., Marshall, A. G. A universal algorithm for fast and automated charge state deconvolution of electrospray mass-to-charge ratio spectra. J Am Soc Mass Spectrom. 9 (3), 225-233 (1998).
  42. JoVE Science Education Database. High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). J Vis Exp. , (2017).
  43. JoVE Science Education Database. Dialysis: Diffusion Based Separation. J Vis Exp. , (2017).
  44. Khusainov, R., Kuipers, O. P. The presence of modifiable residues in the core peptide part of precursor nisin is not crucial for precursor nisin interactions with NisB- and NisC. PLoS One. 8 (9), 74890(2013).
  45. Terzaghi, B. E., Sandine, W. E. Improved medium for lactic streptococci and their bacteriophages. Appl Microbiol. 29 (6), 807-813 (1975).
  46. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  47. Phosphate-buffered saline (PBS). Cold Spring Harb Protoc. 2006 (1), (2006).
  48. van Hest, J. C. M., Tirrell, D. A. Efficient introduction of alkene functionality into proteins in vivo. Febs Lett. 428 (1-2), 68-70 (1998).
  49. Prince, A., et al. Lipid-II Independent Antimicrobial Mechanism of Nisin Depends On Its Crowding And Degree Of Oligomerization. Sci Rep. 6 (1), 37908(2016).
  50. Zhou, L., et al. Incorporation of tryptophan analogues into the lantibiotic nisin. Amino Acids. 48 (5), 1309-1318 (2016).
  51. Presolski, S. I., Hong, V. P., Finn, M. G. Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Click Chemistry for Bioconjugation. Curr Protoc Chem Biol. 3 (4), 153-162 (2011).
  52. Abts, A., et al. Easy and rapid purification of highly active nisin. Int J Pept. 2011, 175145(2011).
  53. Francklyn, C. S., First, E. A., Perona, J. J., Hou, Y. -M. Methods for kinetic and thermodynamic analysis of aminoacyl-tRNA synthetases. Methods. 44 (2), 100-118 (2008).
  54. van Heel, A. J., et al. Production and Modification of Five Novel Lantibiotics Using the Promiscuous Nisin Modification Machinery. ACS Synth Biol. 5 (10), 1146-1154 (2016).
  55. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nat Protoc. 3 (2), 163-175 (2008).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Warianty nizynytest dyfuzyjny w agarzemikroskopia fluorescencyjnaspektrometria masanalogi prolinyEscherichia coliLactococcus lactis
Peptydy przeciwdrobnoustrojowe wytwarzane przez selektywne wprowadzanie aminokwasów niekanonicznych pod ciśnieniem
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.