Głęboka iniekcja skórna jako model zakażenia skóry Candida albicans do analiz histologicznych

Podsumowanie

Tutaj opisujemy protokół, który umożliwia analizę histologiczną i molekularną próbek skóry po śródskórnym wstrzyknięciu Candida albicans. Protokół ten utrzymuje integralność strukturalną skóry i pozwala na lokalizację komórek odpornościowych rezydujących w tkance lub nowo zrekrutowanych, a także dystrybucję patogenów.

Streszczenie

Skóra jest niezwykle rozbudowanym organem ciała i, ze względu na tę dużą powierzchnię, jest stale narażona na działanie mikroorganizmów. Uszkodzenie skóry może łatwo prowadzić do infekcji skóry właściwej, które z kolei mogą powodować rozprzestrzenianie się patogenów do krwiobiegu. Zrozumienie, w jaki sposób układ odpornościowy zwalcza infekcje na bardzo wczesnym etapie i w jaki sposób gospodarz może wyeliminować patogeny, jest ważnym krokiem w kierunku stworzenia podstaw dla przyszłych interwencji terapeutycznych. W tym miejscu opisujemy model infekcji Candida albicans, który może uwidocznić procesy zachodzące we wczesnym okresie infekcji, w tym gdy patogen przekroczył barierę nabłonkową, a także odpowiedź immunologiczną wywołaną inwazją C. albicans. Wykorzystaliśmy ten model infekcji do przeprowadzenia analiz histologicznych, które pokazują komórki odpornościowe, które infiltrują skórę, a także obecność i lokalizację patogenu. Próbki pobrane po zakażeniu mogą być przetworzone do ekstrakcji RNA.

Wprowadzenie

Ciało ludzkie pokryte jest niezwykle dużą ilością mikroorganizmów. Powierzchnia skóry jest siedliskiem prawie miliona bakterii na centymetr kwadratowy¹. Liczba ta nie odzwierciedla jednak pełnej różnorodności mikroorganizmów, które kolonizują skórę. Oprócz bakterii, organizm ludzki jest skolonizowany przez wiele gatunków grzybów, w tym C. albicans, który jest w stanie przetrwać zarówno na poziomie błony śluzowej, jak i skóry².

W ostatnich latach odsetek osób, u których zdiagnozowano infekcje grzybicze, ogromnie wzrósł. Wynika to głównie z większej liczby osób z obniżoną odpornością, tj. pacjentów zakażonych wirusem HIV oraz pacjentów, którzy przeszli chemioterapię lub leki immunosupresyjne po przeszczepie³. W badaniu przeprowadzonym w Stanach Zjednoczonych, Wisplinghoff i wsp. wykazali, że 9,5% szpitalnych zakażeń krwi było spowodowanych przez gatunki Candida⁴. Ze względu na zwiększone występowanie infekcji grzybiczych, a zwłaszcza ze względu na podwyższony odsetek gatunków Candida występujących podczas infekcji krwi, zrozumienie, w jaki sposób patogen ten wymyka się kontroli układu odpornościowego, jest niezwykle ważne.

C. albicans to grzyb dymorficzny, który rośnie w różnych formach morfologicznych, takich jak drożdże, blastospory, pseudostrzępki i strzępki, w zależności od warunków środowiskowych⁵. W formie strzępki C. albicans wykazuje najwyższą zdolność inwazyjności i ma zdolność przenikania przez nabłonek⁶.

Zakażenia C. albicans były badane przy użyciu kilku eksperymentalnych metod. Najczęstszym modelem zakażenia jest dożylne wstrzyknięcie drożdży C. albicans⁷. Jednak model ten nie uwzględnia wszystkich procesów, które zachodzą, zanim grzyb zdoła rozprzestrzenić się do krwiobiegu. Inny model wykorzystuje zdolność C. albicans do inwazji nabłonka. Ta metoda, znana również jako model papieru ściernego⁸, została opracowana przez Gaspari et al. w 1998 roku⁹ i polega na użyciu papieru ściernego do ścierania skóry, eliminując w ten sposób warstwę rogową naskórka przed nałożeniem C. albicans. Zabieg ten pozwala grzybowi wniknąć w nabłonek, umożliwiając w ten sposób analizę zdolności inwazyjnych tego patogenu. Wreszcie, w różnych badaniach wykorzystano inne modele zakażeń dla przewodu pokarmowego¹⁰ i dróg oddechowych¹¹.

Powstawanie rany (jak w modelu z papieru piaskowego) powoduje aktywację kilku szlaków, w tym rekrutacji i aktywacji komórek odpornościowych, w celu przyspieszenia procesu gojenia¹². Może to zmienić lub zamaskować odpowiedź immunologiczną specyficznie wywołaną przeciwko patogenowi, prowadząc w ten sposób do mylących wyników.

Tutaj opisujemy metodę infekcji skóry, która pozwala uniknąć początkowego powstania rany i indukcji podstawowego środowiska zapalnego. Aby zachować nienaruszoną strukturę nabłonka, bezpośrednio wstrzykujemy C. albicans w postaci strzępki do głębokiej skóry właściwej. Mimo że pojedyncze wstrzyknięcie może wywołać łagodny stan zapalny, ilość stanu zapalnego jest ograniczona i ograniczona w porównaniu z tworzeniem się otwartej rany, jak w modelu z papieru ściernego. Podejście, które tutaj opisujemy, pozwala na badanie odpowiedzi immunologicznej na infekcję grzybiczą i rozprzestrzenianie się przy jednoczesnym unikaniu nadmiernego i istniejącego wcześniej środowiska zapalnego spowodowanego uszkodzeniami mechanicznymi.

Protokół

Wszystkie procedury zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) i działały pod nadzorem Departamentu Zasobów Zwierzęcych w Szpitalu Dziecięcym (ARCH) w Szpitalu Dziecięcym w Bostonie lub zostały zatwierdzone przez włoskie Ministerstwo Zdrowia i przeprowadzone przez Instytucjonalny Komitet Opieki nad Zwierzętami na Uniwersytecie Milano-Bicocca.

1. Przygotowanie C. albicans

1. Kultura C. albicans, szczep CAF3-1¹³, w probówkach zawierających bogate podłoże (ekstrakt drożdżowy, dekstroza peptonowa (YEPD), 1% (w/v) ekstrakt drożdżowy, 2% (w/v) peptonu Bacto, 2% (w/v) glukozy) uzupełnione urydyną (50 mg/L) w temperaturze 25 °C. W tych warunkach C. albicans rośnie jako drożdże.
   UWAGA: Można stosować inne szczepy C. albicans, takie jak izolat kliniczny szczepu C. albicans SC5314¹³. Ponieważ niedawno wykazaliśmy, że proces wrzodziejący jest indukowany przez aktywację wrodzonego układu odpornościowego¹⁴, teoretycznie można zastosować każdy szczep C. albicans, który zachowuje zarówno składniki ściany komórkowej i strukturę, jak i zdolność do tworzenia projekcji strzępek.
2. Monitoruj kulturę, zliczając stężenie komórkowe za pomocą analizatora licznika komórek.
3. Zbierz kulturę, gdy osiągnie stężenie około 8 x 10⁶ komórek/ml. Alternatywnie użyj spektrofotometru do pomiaru OD₆₀₀.
   UWAGA: Zwykle wartość OD₆₀₀ = 1 odpowiada stężeniu drożdży 3 x 10⁷ komórek/ml, ale zalecane jest miareczkowanie.
4. Zawiesić hodowlę w pożywce YEPD-urydyna, używając HEPES (50 mM, pH 7,5) jako czynnika buforowego i inkubować kulturę w temperaturze 37 °C w celu wywołania tworzenia strzępek. Sprawdź tworzenie strzępek pod mikroskopem przy 100-krotnym powiększeniu. Tworzenie strzępek jest widoczne 5 godzin po wyhodowaniu w temperaturze 37 °C; jednak należy użyć komórek 16 godzin po inkubacji w temperaturze 37 °C, gdy procent strzępek osiągnie prawie 95% całkowitej hodowli.
5. W celu dalszego wzbogacenia preparatu w stężenie strzępek, odwirować porcje kultury przy 3 300 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w sterylnym PBS o stężeniu 1 x^10,8 strzępek/ml.

2. Głębokie wstrzyknięcie skórne

1. Na 24 godziny przed zabiegiem zakażenia znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (80 - 100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg), a następnie ogolić bok myszy za pomocą elektrycznej maszynki do strzyżenia.
   UWAGA: Po każdym zabiegu obejmującym znieczulenie umieść myszy pod lampą grzewczą, aż skutecznie wyzdrowieją.
2. Odpocznij myszy przez 24 godziny, aby uniknąć stanu zapalnego spowodowanego procesem golenia.
3. 24 godziny po zabiegu golenia znieczulić myszy wstrzyknięciem dootrzewnowym ketaminy (80 - 100 mg/kg) i ksylazyny (10 mg/kg).
4. Sprawdź odruch łapy, aby upewnić się, że myszy są głęboko znieczulone. Oceń odruch łapy, mocno ściskając łapę. Jeśli znieczulenie zostanie osiągnięte, zwierzę nie odczuwa bólu i nie porusza się.
5. Wstrzyknąć strzępki C. albicans do głębokiej skóry właściwej za pomocą strzykawki insulinowej o pojemności 0,3 ml z igłą 30 G x 8 mm w końcowej objętości 50 μl/wstrzyknięcie, co odpowiada 5 x 10⁶ strzępek na wstrzyknięcie.
   1. Pociągnij skórę ogolonego boku dwoma palcami, aby wstrzyknąć objętość bezpośrednio do głębokiej skóry właściwej. Wprowadzić igłę pod kątem 10 - 15° skosem igły skierowanym do góry.
   2. Pod tym kątem patogen zostanie wstrzyknięty na głębokość około 300 - 500 μm. Aby upewnić się, że wstrzyknięcie jest prawidłowo wykonane, należy sprawdzić, czy wstrzyknięta objętość tworzy guzek, który wchłania się kilka minut po wstrzyknięciu.
      UWAGA: Guz powstały po wstrzyknięciu będzie miał około 1^cm2. Jest to obszar, który zostanie usunięty w wyznaczonym punkcie czasowym w celu analizy molekularnej lub histologicznej.
   3. W przypadku punktów czasowych krótszych niż 24 godziny (zalecane) należy oznaczyć obszar infekcji markerem, ponieważ guzek powstały w wyniku wstrzyknięcia utrzymuje się przez kilka minut, po czym ulega wchłonięciu. W przypadku punktów czasowych trwających 24 godziny lub dłużej ten krok nie jest wymagany, ponieważ owrzodzenie lub torbiel będą wyraźnie widoczne.

3. Pobieranie próbek i przygotowanie do barwienia histologicznego

1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z procedurami instytucjonalnymi.
2. Za pomocą kleszczy chirurgicznych pociągnij skórę na granicy miejsca wstrzyknięcia, uprzednio oznaczonego markerem. Za pomocą nożyczek chirurgicznych wyciąć zainfekowane miejsce, przecinając skórę zgodnie z zaznaczoną linią.
   UWAGA: Uważaj, aby oddzielić skórę od otrzewnej za pomocą nożyczek z okrągłą końcówką.
3. Zanurz skórę w jednorazowej formie bazowej wypełnionej związkiem o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), wewnętrzną stroną skóry skierowaną do góry. Próbkę należy zamrozić w ciekłym azocie, aż związek stanie się biały. Nie pozwól, aby ciekły azot pokrył próbkę przed jej całkowitym zamrożeniem, ponieważ mogłoby to spowodować uszkodzenie próbki.
   UWAGA: Uwaga! W kroku 3.3 załóż osłonę twarzy w celu ochrony przed ciekłym azotem.
4. Jeżeli próbki nie są natychmiast wykorzystywane do przygotowania szkiełek, należy je szybko przechowywać w temperaturze -80 °C.
   UWAGA: Próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C przez czas nieokreślony.

4. Przygotowanie slajdów

1. Przeciąć próbkę na pół, aby przygotować plastry do badania histologicznego, zaczynając od środka próbki.
2. Pokrój plastry o grubości 5 μm za pomocą kriostatu.
   UWAGA: W przypadku próbek skóry temperatura kriostatu nie powinna być wyższa niż -25 °C. Wyższa temperatura spowodowałaby częściowe stopienie H-OCT, a zatem próbki nie byłyby utrzymywane we właściwej pozycji podczas procedury cięcia.
3. Użyj dodatnio naładowanych szkiełek mikroskopowych, aby zebrać plasterki.
4. Jeśli zebrane plastry nie zostaną wykorzystane wkrótce po przygotowaniu, należy je przechowywać w temperaturze -20 °C. W tym momencie plastry można przechowywać w temperaturze -20 °C przez czas nieokreślony.

5. Barwienie hematoksyliny i eozyny

1. Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w hematoksylinie Gilla na 4 minuty. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut.
2. Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w roztworze Eozyny Y na 1 minutę. Umyj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 minut. Przed kontynuowaniem protokołu opłucz szkiełka wodą destylowaną.
3. Odwodnić przez zanurzenie w seryjnie rosnących stężeniach roztworów etanolu (50%, 70%, 80%, 95%, 100%). Zanurz szkiełka na 15 s w każdym roztworze etanolu.
4. Czyścić szkiełka przez co najmniej 2 minuty przez zanurzenie w histologicznym środku czyszczącym.
5. Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego i szkiełek nakrywkowych.
6. Uzyskuj obrazy preparatów za pomocą skanera mikroskopowego przy 40-krotnym powiększeniu.

6. Barwienie kwasem okresowym Schiffa (PAS)

1. Przymocuj szkiełka ≥99,5% acetonem w temperaturze pokojowej przez 1 minutę. Myj szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 1 minutę.
2. Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w roztworze kwasu okresowego (1 g/dl) na 5 minut. Umyj szkiełka w 3 podmianach wody destylowanej.
3. Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w odczynniku Schiffa na 15 min. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 5 min.
4. Zabarwić szkiełka przez zanurzenie w hematoksylinie Gilla na 5 minut. Myć szkiełka pod bieżącą wodą z kranu przez 30 sekund.
5. Odwodnić szkiełka przez zanurzenie w 3 zmianach 100% etanolu. Za każdym razem zanurzaj zjeżdżalnie na 15 sekund.
6. Czyścić szkiełka przez co najmniej 2 minuty przez zanurzenie w histologicznym środku czyszczącym.
7. Zamontuj prowadnice za pomocą medium montażowego i szkiełek nakrywkowych.
8. Uzyskaj obrazy szkiełek za pomocą skanera do slajdów mikroskopowych.

7. Pobieranie próbek i przygotowanie do ekstrakcji RNA

1. Poddaj myszy eutanazji zgodnie z procedurami instytucjonalnymi. Usunąć próbki skóry jak w kroku 3.2.
2. Zanurzyć próbki w probówce typu snap-cap o pojemności 2 ml z 1 ml odczynnika do ekstrakcji kwasem tiocyjanianu guanidyny, fenolu i chloroformu.
   UWAGA: W tym miejscu można wstrzymać działanie protokołu, a próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C.
3. Pociąć próbkę na kawałki o wielkości około 0,2^cm2 za pomocą kleszczy chirurgicznych.
   UWAGA: Uwaga! Większość odczynników do izolacji RNA jest toksyczna i mutagenna. Kroki 7.3 i 7.4 należy wykonać pod wyciągiem.
4. Rozbij próbkę za pomocą młyna perełkowego z prędkością 20 oscylacji/s przez 20 minut. Alternatywnie można użyć mechanicznego garncarza.
5. Sprawdź skuteczną homogenizację próbek, szukając obecności nienaruszonych kawałków skóry. Powtórzyć ten krok, jeśli próbki nie są całkowicie zhomogenizowane.
6. Odwirować próbki o masie 16 000 x g przez 1 minutę. Zachować supernatanty do ekstrakcji RNA i wyrzucić osad. Ten krok jest wykonywany w celu wyeliminowania włosów i zanieczyszczeń, które mogłyby zablokować kolumny ekstrakcyjne.
7. Kontynuuj ekstrakcję RNA za pomocą kolumn oczyszczających RNA¹⁴.
8. Użyj spektrofotometru, aby ocenić oczyszczanie i stężenie RNA. Jeżeli ekstrakty RNA nie są natychmiast używane do przygotowania cDNA, należy przechowywać próbki w temperaturze -80 °C.

Wyniki

Dzięki wstrzyknięciu patogenu bezpośrednio do głębokiej skóry właściwej, morfologia strukturalna tkanki pozostaje nienaruszona (Rysunek 1A).

Zachowanie integralności strukturalnej skóry umożliwia wykrycie komórek odpornościowych oraz ich lokalizację w miejscu infekcji. Większe powiększenie przedstawione na Rysunku 1B ujawnia, że ropień składa się głównie z leukocytów po...

Dyskusja

Tutaj opisaliśmy metodę infekcji C. albicans w celu zbadania procesu zapalnego, który jest inicjowany po wejściu grzyba do głębokiej skóry właściwej.

Mimo że tworzenie się ropni skóry jest stosunkowo rzadkim zdarzeniem po zakażeniu C. albicans ¹⁵, wstrzyknięcie grzyba bezpośrednio do głębokiej skóry właściwej pozwala nie tylko na badanie powstawania ropni wywołanego przez grzyby, ale także na analizę specyficznych komórek odpornościowych, które uczestn...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Reagents
PBS	Euroclone	ECB4053L	ciepły w temperaturze 37 stopni Celsjusza; Kąpiel C przed użyciem
Laboratoria histoliniowe	związku H-OCT	R0030
Laboratoria linii histoliniowej	hematoksyny Gilla	09-178-2
Roztwór eozyny Y, alkoholowe	laboratoria histoliniowe	09-209-05
Absolut	etanolu scharlau	ET00232500
Citro-HISTOCLEAR	laboratoria	histo-lineR0050
Eukitt, podłoże montażowe	bio-optica
Aceton	sigma-aldrich	179124
PAS system barwienia	sigma-aldrich	395B-1KT
Bacto Peptone	BD	211677
Ekstrakt z drożdży baktonowych	BD	212750
D(+)-Glukoza bezwodna do biologii molekularnej	Applichem PanReac	50-99-7
Uridine	Merck Millipore	8451
HEPES	Applichem PanReac	A1070,0500
Probówki Safe-Lock 2 ml	eppendorf	30121597
TRIzol Reagent	Life Technologies	15596018	Toksyczny, i mutagenny. Stosuj wszystkie potrzebne środki ostrożności
Rneasy Mini Kit	QIAGEN	74104
ciekły azot			Nosić ochronę oczu
Instrument
Coulter Counter-Particle Count	Beckman Coulter
Wirówka do redlic 5415 R	eppendorf
MC 3000 Kriostat mikrotomowy	Laboratoria
TissueLiser	QIAGEN
strong>Materiały
0,3 ml Strzykawka insulinowa z igłą 30G x 8mm	BD	324826
Kleszcze
Nożyczki
Forma bazowa jednorazowe	laboratoria histo-line	2781
Dodatnio naładowane preparaty biomikroskopowe	bio-optica	09-2000
Szkiełka nakrywkowe 24 x 50 mm	termonaukowe	11911998

histo-line<chirurgicznechirurgiczne