Izometryczny pomiar kurczliwości tętnicy krezkowej myszy za pomocą miografii drutowej

Summary

Technika wirekowego miografu jest używana do badania funkcji mięśni gładkich naczyń krwionośnych i badania przesiewowego nowych leków. Przedstawiamy szczegółowy protokół pomiaru izometrycznej kurczliwości tętnicy krezkowej myszy oraz badań przesiewowych nowych środków zwiotczających mięśnie gładkie naczyń krwionośnych.

Abstract

Technika miografu drutowego jest używana do oceny kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych w odpowiedzi na depolaryzację, agonistów/inhibitory GPCR i leki. Jest szeroko stosowany w wielu badaniach nad fizjologicznymi funkcjami mięśni gładkich naczyń krwionośnych, patogenezą chorób naczyniowych, takich jak nadciśnienie, oraz opracowywaniem leków zwiotczających mięśnie gładkie. Mysz jest szeroko stosowanym zwierzęciem modelowym z dużą pulą modeli chorób i genetycznie modyfikowanych szczepów. Wprowadziliśmy tę metodę, aby szczegółowo zmierzyć izometryczny skurcz tętnicy krezkowej myszy. 1,4-milimetrowy odcinek tętnicy oporowej krezki myszy wyizolowano i zamontowano na komorze miografu, przepuszczając dwa stalowe druty przez jej światło. Po etapach równoważenia i normalizacji segment naczynia został wzmocniony roztworem o wysokiej zawartości K⁺ dwukrotnie przed testem skurczowym. Jako przykład zastosowania tej metody w opracowywaniu leków, zmierzyliśmy działanie rozkurczające nowej substancji naturalnej, neoliensyny, wyizolowanej z chińskiego zioła, zarodków nasion lotosu (Nelumbo nucifera Gaertn.) na tętnice krezkowe myszy. Segmenty naczyń zamontowane w komorze miografu stymulowano roztworem o wysokiej zawartości K⁺. Gdy napięcie siły osiągnęło stabilną, podtrzymaną fazę, do komory dodawano skumulowane dawki neolienzyny. Odkryliśmy, że neolienzynina ma zależne od dawki działanie rozkurczające skurcze mięśni gładkich, co sugeruje, że ma ona potencjalne działanie przeciwko nadciśnieniu. Ponadto, ponieważ segment naczynia może przetrwać co najmniej 4 godziny po zamontowaniu i wielokrotnie utrzymywać kurczliwość wywołaną przez roztwór o wysokiej zawartości K⁺, sugerujemy, że system miografu drutowego może być używany do czasochłonnego procesu badań przesiewowych leków.

Introduction

System miograficzny małych naczyń używany tutaj służył do pomiaru izometrycznego skurczu małych naczyń oporowych o wewnętrznych średnicach od 100 do 400 μm. Izolowane małe naczynia (o długości około 2 mm) były wprowadzane za pomocą dwóch drutów o średnicy 40 μm, a następnie były kolejno montowane na szczękach po stronie mikrometra i przetwornika. Ta technika miograficzna została po raz pierwszy zaproponowana w 1972 roku¹, a następnie rozwinięta głównie przez Mulvany'ego i jego kolegów^2,3,4,5,6. Jest to teraz dojrzała technika ze stabilnym sprzętem, łatwym wykonaniem i standardową procedurą normalizacji^7,8,9. Zastosowaliśmy tę metodę z pewnymi modyfikacjami do pomiarów w tętnicy krezkowej myszy.

Mięśnie gładkie naczyń krwionośnych pokrywają ściany prawie wszystkich naczyń krwionośnych. Ich podstawową funkcją jest generowanie sił poprzez skurcz w odpowiedzi na różne bodźce. Prawidłowa kurczliwość mięśni gładkich naczyń krwionośnych jest niezbędna do regulacji ciśnienia krwi i suplementu diety¹⁰. Nieprawidłowa regulacja ciśnienia krwi skutkuje różnymi chorobami, w tym nadciśnieniem, niewydolnością serca i niedokrwieniem. Kilka badań sugeruje, że nieprawidłowe ciśnienie krwi jest zawsze związane z dysfunkcją kurczliwości mięśni gładkich naczyń krwionośnych^7,11,12,13. Metoda miografowa pozwala na badanie izometrycznej kurczliwości naczyń myszy indukowanej różnymi bodźcami, w tym środkami zwężającymi naczynia krwionośne, inhibitorami i lekami. Skuteczne pomiary skurczu pomogą nam zrozumieć mechanizmy utrzymania ciśnienia krwi i patogenezę chorób związanych z mięśniami gładkimi naczyń krwionośnych oraz zbadać nowe podejścia terapeutyczne.

Wiele chińskich ziół było powszechnie stosowanych w klinicznym leczeniu chorób naczyniowych; jednak ich skuteczne składniki zazwyczaj pozostają nieznane. W związku z tym izolacja i identyfikacja skutecznych składników jest bardzo ważna dla rozwoju nowych leków. Technologia miografu wielodrutowego oferuje proste podejście do badań przesiewowych składników aktywnych w ziołach. Opisaliśmy kilka badań z wykorzystaniem systemu miografu małych naczyń do zbadania skurczu tętnicy krezkowej myszy i zidentyfikowaliśmy naturalne związki o działaniu przeciwnadciśnieniowym^12,13,14. W tym miejscu opisujemy szczegółowy protokół metody miografu i oceniamy działanie rozkurczające neoliensyniny wyizolowanej z zarodków nasion lotosu (Nelumbo nucifera Gaertn).¹⁴.

Protocol

Manipulacje na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania (IACUC) Centrum Badań nad Modelowymi Zwierzętami Uniwersytetu w Nankinie.

1. Przygotowanie roztworu

1. Przygotuj roztwór HEPES-Tyrode (H-T) używając 137,0 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.
2. Przygotuj roztwór HEPES-Tyrode bez wapnia (Ca²⁺ wolny od HT) przy użyciu 140,6 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.
3. Przygotuj roztwór HEPES-Tyrode używając 124 mM KCl (High K⁺), używając 15,7 mM NaCl, 124,0 mM KCl, 1,8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂∙6H₂O, 5,6 mM D-glukozy i 10 mM HEPES, pH 7,3-7,4.

2. Przygotowanie do eksperymentu

1. Podgrzej roztwory H-T i High-K⁺ w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
2. Włącz system miograph, sprzęt do akwizycji danych i komputer.
3. Ostrożnie napełnij wszystkie komory miografu po 5 ml roztworu HT każda.
4. Napełnij dwie szalki Petriego odpowiednio 20 ml roztworów H-T o temperaturze 4 °C i Ca²⁺ wolnych od H-T i przechowuj na lodzie.
5. Napełnij pokrytą 10 cm szalką Petriego 20 ml roztworu HT i utrzymuj ją w temperaturze pokojowej.

3. Rozwarstwienie tętnicy krezkowej myszy

1. Poddaj eutanazji 8-12-tygodniową samicę lub samca myszy C57BL/6J przez zwichnięcie szyjki macicy. Przypnij mysz brzuchem skierowanym do góry.
2. Zwilż brzuch 70% etanolem. Następnie przeciąć skórę nożyczkami wzdłuż brzusznej linii środkowej od pachwiny i wykonać nacięcia od początku pierwszego nacięcia w dół do nóg po obu stronach. Odciągnij skórę z powrotem po obu stronach; Wykonaj podobne nacięcia, aby otworzyć otrzewną.
3. Za pomocą nożyczek przetnij przełyk, okrężnicę i inne tkanki łączne, aby całkowicie odizolować przewód pokarmowy z naczyniem pokarmowym od organizmu.
4. Za pomocą kleszczy przenieś wyizolowany segment do naczynia zawierającego zimną HT przygotowaną w kroku 2.4 i delikatnie przepłucz tkankę w roztworze HT kilka razy, aby zmyć krew.
5. Przenieść wyizolowany segment na powlekaną szalkę Petriego przygotowaną w kroku 2.5 i przeprowadzić rozwarstwienie tętnicy krezkowej w temperaturze pokojowej.
6. Wygładź żołądek, jelito czcze, jelito kręte i kątnicę w kierunku zgodnym z ruchem wskazówek zegara, a żołądek i kątnicę przypnij odpowiednio po lewej i prawej stronie.
7. Rozciągnij łożysko naczyniowe krezki i przymocuj jelito szpilkami, aby odsłonić wypreparowane tętnice krezkowe.
   Uwaga: W tych warunkach tętnice znajdują się na szczycie żył.
8. Włącz transmisyjne źródło światła mikroskopu stereoskopowego i wypreparuj tętnice pod mikroskopem. Upewnij się, że cała tkanka jest zanurzona w roztworze.
9. Zacisnąć tkankę tłuszczową wokół tętnic za pomocą kleszczy i odizolować tętnice, odcinając wszystkie tkanki łączne nożyczkami preparacyjnymi. Unikaj uszkodzenia tętnic.

4. Montaż tętniczy

1. Przenieść i zanurzyć drzewo tętnicze krezkowe w zimnym roztworze HT wolnym od Ca²⁺ (przygotowanym w kroku 2.4), zaciskając nadmiar tętnic kleszczami.
2. Odetnij 1,4-milimetrową część tętnicy proksymalnie do ściany jelita arkady krezki i użyj dwóch kleszczy, aby ostrożnie otworzyć obie strony tego odcinka tętnicy.
3. Przygotuj dwa segmenty drutu ze stali nierdzewnej o długości 2,5 cm i umieść je w tym samym naczyniu.
4. Delikatnie zaciśnij jeden koniec tętnicy za pomocą kleszczy i ostrożnie włóż dwa druty do światła tętnicy jeden po drugim za pomocą innych kleszczyków. Upewnij się, że druty są trzymane prosto i nie dotykają śródbłonka.
5. Używając dwóch kleszczyków, zacisnąć jednocześnie dwa stalowe druty na zewnątrz gwintowanego naczynia i ostrożnie przenieść naczynie z płytki Petriego do komory miografu uprzednio wypełnionej roztworem HT (krok 2.3).
6. Rozkręć szczęki, aby zrobić miejsce na montaż. Zaciśnij obie strony jednego z dwóch włożonych drutów za pomocą dwóch kleszczyków i umieść naczynie w szczelinie szczęki (Rysunek 1A).
7. Owiń obie strony zaciśniętego drutu wokół szczęki podłączonej do mikrometru (Rysunek 1B).
8. Zamocuj lewą, przekręcając ją zgodnie z ruchem wskazówek zegara. Wyprostuj drut za pomocą kleszczy po prawej stronie, a następnie przykręć prawą, przekręcając zgodnie z ruchem wskazówek zegara ( Rysunek 1C). Upewnij się, że naczynie zawsze znajduje się w szczelinie szczęki, ale nie dotykaj szczęki, aby uniknąć uszkodzenia.
9. Zamknij obie szczęki za pomocą mikrometru ( Rysunek 1D). Upewnij się, że dwie szczęki są wystarczająco blisko, ale nie stykają się ze sobą i że niezamocowany drut znajduje się na górze zamocowanego drutu.
10. Używając kleszczyków po prawej stronie, ostrożnie złóż odkręcony drut w rogu szczęki połączonej z przetwornikiem siły i owiń go zgodnie z ruchem wskazówek zegara wokół po prawej stronie (Rysunek 1E). Następnie dokręć. Powtórz ten krok po lewej stronie przewodu i przykręć po lewej stronie (Rysunek 1F).
11. Lekko rozsuń szczęki, ostrożnie obracając mikrometr (Rysunek 1G). Unikaj rozciągania naczynia. Za pomocą kleszczy przesuń drut po stronie mikrometra do płaszczyzny poziomej drutu po stronie przetwornika. Ostrożnie obróć mikrometr tak, aby szczelina między dwiema szczękami mogła po prostu pomieścić dwa druty.
12. Powtórz kroki 4.2 – 4.11, aby zamontować tętnice na pozostałych komorach. Podłącz wszystkie komory do urządzenia, przykryj komory, podłącz 100% dopływ tlenu i sondę temperatury, a następnie rozpocznij podgrzewanie do 37 °C. Otwórz oprogramowanie do tworzenia wykresów i naciśnij przycisk Start w oknie Widok wykresu, aby rozpocząć nagrywanie.
13. Równowaga przez około 20 minut.

5. Normalizacja

Uwaga: W celu standaryzacji warunków eksperymentalnych i uzyskania niezawodnej reakcji fizjologicznej naczyń krwionośnych, konieczna jest procedura normalizacji¹⁵. Zgodnie z relacją między siłą czynną a wewnętrznym obwodem statku, system miografu drutowego ma standardowy program normalizacyjny do oceny obwodu wewnętrznego (IC) zamontowanego statku^5,8,9. Krótko, aby obliczyć IC (μm), odczytaj mikrometr i wprowadź wartość jako wartość X, a siłę wyjściową przetwornika, tj. naprężenie spoczynkowe ścianki (mN / mm), jako wartość Y. Program zwróci dopasowaną krzywą (X, Y) i obliczy IC odpowiadającą ciśnieniu przezściennemu 100 mmHg (IC₁₀₀). Naczynie jest ustawione na znormalizowany obwód wewnętrzny (IC₁), gdy aktywna reaktywność jest maksymalna.

1. Ustaw siły na zero dla wszystkich kanałów w urządzeniu i równoważ przez kolejne 1-2 minuty.
2. Wybierz Ustawienia normalizacji z menu "DMT" i ustaw parametry w następujący sposób:
   Kalibracja okularu (mm/dz.): 0,36; Ciśnienie docelowe (kPa): 13,3; IC₁/IC₁₀₀: 0,9; Czas uśredniania online (sekundy): 2; Czas opóźnienia (sekundy): 60. Kliknij przycisk OK, aby zamknąć okno Ustawienia normalizacji DMT.
3. Wybierz interesujący Cię kanał z menu DMT, aby otworzyć okno normalizacji DMT dla odpowiedniego kanału. Wprowadź wartości stałe do okna w następujący sposób: Punkty końcowe tkanek a1: 0,1; Punkty końcowe tkanek a2: 4; Średnica drutu (μm): 40. W oknie wyświetlana jest obliczona długość naczynia jako 1,40 mm.
4. Odczytać mikrometr odpowiedniej komory tkankowej. Wprowadź wartość w polu Odczyt mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt. Ta wartość jest początkową wartością X (X0). Po upływie 60 sekund w oknie wyświetlana jest siła i ciśnienie efektywne (ERTP) odpowiadające tej wartości mikrometru. W tym samym czasie uaktywnia się pole odczytu mikrometru.
5. Rozciągnąć normalizowane naczynie, obracając mikrometr w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara. Wprowadź wartość mikrometru w polu Odczyt mikrometru i kliknij przycisk Dodaj punkt. Ponownie poczekaj na czas opóźnienia wynoszący 60 s.
6. Powtórz krok 5.5, kontynuuj rozciąganie naczynia i dodawaj wartości mikrometrów, aż w oknie pojawi się wartość "Mikrometr X₁", która jest obliczonym ustawieniem mikrometru wymaganym do rozciągnięcia naczynia do IC₁.
7. Ustaw mikrometr na wartość X₁.
   Uwaga: Znormalizowane napięcie wynosi zwykle 1-2 mN.

6. Rejestracja skurczu tętnic

Uwaga: Wszystkie roztwory, w tym rozwiązania H-T i High-K⁺ użyte w tej sekcji, zostały przygotowane w kroku 2.1.

1. Po normalizacji równoważyć naczynie w komorze przez 15-20 min.
   Uwaga: W tym kroku nie ma potrzeby zmiany rozwiązania.
2. Dwukrotnie rzuć wyzwanie naczyniu roztworem High-K⁺.
   1. Aby rzucić wyzwanie naczyniu, zastąp roztwór H-T 5 ml roztworu High-K⁺, aby wywołać skurcz przez 10 minut, a następnie przemyj 5 ml roztworu H-T 3-4 razy.
      Uwaga: Typowy skurcz ma maksymalną siłę powyżej 3 mN i stałą siłę podtrzymywaną około 2,5 mN¹². Jeśli pierwsze prowokacja generuje maksymalną siłę poniżej 2,5 mN lub utrzymująca się siła zmniejsza się z czasem, lub drugie prowokacja generuje znacznie mniejszą siłę niż pierwsza dawka, naczynie jest odrzucane i nie będzie używane do dalszych badań.
3. Rzuć wyzwanie naczyniu 5 ml roztworu High-K⁺, aby wywołać skurcz. Po 5 minutach dodać 0,5 μl roztworu podstawowego neolenzyny (10 mM w DMSO)¹⁴ do komory, aby rozluźnić naczynie przy końcowym stężeniu 1 μM neolienzyny.
4. Gdy siła jest stabilna (zwykle trwa to kilka minut), dodaj kolejne 0,5 μl roztworu podstawowego neolenzyny do komory, aby zwiększyć stężenie do 2 μM. Za każdym razem dodawać 1 μl roztworu podstawowego, aby zwiększyć stężenie do 4, 6, 8 i 10 μM, aby uzyskać krzywą dawka-odpowiedź.
   Uwaga: Stężenia podstawowe i robocze różnią się w zależności od leku.

Results

Zmierzyliśmy izometryczną kurczliwość tętnicy krezkowej myszy za pomocą wieloprzewodowego systemu miograficznego i oceniliśmy działanie rozkurczające neoliensyniny oczyszczonej z zarodków nasion lotosu (Nelumbo nucifera Gaertn.)¹⁴. Tętnica krezkowa myszy została wyizolowana, oczyszczona z tkanki łącznej i pocięta na segmenty o średnicy 1,4 mm. Odcinek tętnicy został wprowadzony za pomocą dwóch stalowych drutów w roztworze H-T wolnym od Ca²⁺ na s...

Discussion

Nadciśnienie tętnicze jest powszechnym wyzwaniem dla zdrowia publicznego ze względu na poważne powikłania, w tym choroby układu krążenia i nerek¹⁶. Zrozumienie patogenezy nadciśnienia tętniczego i zbadanie większej liczby leków przeciwnadciśnieniowych stało się pilnym zadaniem w tej dziedzinie. Ciśnienie krwi jest generowane i utrzymywane przez obwodowy opór krążenia. Zgodnie z prawem Poiseuille'a, stosunkowo małe tętnice generują dużą część oporu krążenia i służą jako dominujący producent ciśnien...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wieloprzewodowy system miograficzny	DMT	610-M
Drut ze stali nierdzewnej	DMT	400447
Nożyczki do preparacji Geuder	DMT	400431
Kleszcze Dumont	DMT	300413
PowerLab/8SP	ADInstruments	ML785
Oprogramowanie	ADInstruments	LabChart 5
NaCl	SigmaAldrich	S5886
KCl	SigmaAldrich	P5405
CaCl2	SigmaAldrich	C4901
MgCl2· 6H2O	SigmaAldrich	M2393
D-Glukoza	SigmaAldrich	G6152
HEPES	Sangon Biotech	A100511-0250
NaOH	SigmaAldrich	S8045
DMSO	SigmaAldrich	D2650