Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Elektrofizjologia całych komórek pierwotnych hodowanych mysich komórek enterochromafinowych

10.2K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58112

⸱

26 września 2018

 ,  ,  ,  ,  , 
1Enteric Neuroscience Program, Division of Gastroenterology & Hepatology,Department of Physiology & Biomedical Engineering, Mayo Clinic, 2Division of Gastroenterology, Department of Medicine, University of Massachusetts Medical School

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Komórki enterochromafiniczne (EC) stanowią mały podzbiór komórek nabłonka przewodu pokarmowego. Komórki EC są elektrycznie pobudliwe i uwalniają serotoninę, jednak trudności w hodowli i identyfikacji komórek EC mają ograniczone badania fizjologiczne. Przedstawiona tutaj metoda ustanawia model hodowli pierwotnej, który można badać pojedyncze komórki EC za pomocą elektrofizjologii.

Streszczenie

Komórki enterochromafiniczne (EC) w nabłonku przewodu pokarmowego (GI) stanowią największą subpopulację komórek enteroendokrynnych. Jako wyspecjalizowane komórki czuciowe, komórki EC wyczuwają bodźce świetlne i przekształcają je w zdarzenia uwalniania serotoniny (5-hyroksytryptaminy, 5-HT). Jednak elektrofizjologia tych komórek jest słabo poznana, ponieważ są one trudne do hodowli i identyfikacji. Metoda przedstawiona w niniejszej pracy przedstawia pierwotne hodowle komórek EC zoptymalizowane pod kątem elektrofizjologii pojedynczych komórek. Protokół ten wykorzystuje reporter transgenicznego cyjanowego białka fluorescencyjnego (CFP) do identyfikacji mysich komórek EC w mieszanych kulturach pierwotnych, rozwijając podejście do uzyskiwania wysokiej jakości zapisów elektrofizjologii całych komórek w trybach cęgów napięcia i prądu.

Wprowadzenie

Nabłonek przewodu pokarmowego (GI) to zróżnicowana społeczność składająca się z kilku typów komórek. Komórki enteroendokrynne stanowią około 1% wszystkich komórek nabłonka, a komórki enterochromafiniczne (EC) są największą populacją komórek enteroendokrynnych1. Ostatnie badania pokazują, że komórki enteroendokrynne2 i EC3,4 są elektrycznie pobudliwe. Jesteśmy zainteresowani zrozumieniem pierwotnej elektrofizjologii komórek EC. W związku z tym celem tego badania było ustalenie pierwotnych kultur komórkowych EC zoptymalizowanych pod kątem elektrofizjologii całych komórek.

Istniejące linie komórkowe EC, które produkują i wydzielają 5-HT (np. QGP-15, BON6, KRJ-17) i były używane do badania elektrofizjologii5,8 są zazwyczaj generowane z unieśmiertelnionych tkanek nowotworowych. Chociaż informacje uzyskane z tych linii komórkowych są cenne5,8, badania pierwotnej elektrofizjologii komórek są niezbędne do prawidłowego zrozumienia fizjologii komórek EC. Elektrofizjologia pierwotnych komórek EC wymaga izolacji i hodowli pojedynczych komórek nabłonkowych, co jest ograniczone przez niską żywotność kultur nabłonkowych.

Metoda hodowli przedstawiona w tym badaniu opiera się na transgenicznych myszach z fluorescencyjnie znakowanymi komórkami EC, takimi jak Tph1-CFP9, użyte w tym badaniu. Metoda optymalizuje mieszane pierwotne kultury nabłonkowe opracowane wcześniej2,10 dla elektrofizjologii pojedynczej komórki3. Poprzednie metody wykorzystywały kombinacje trypsyny/EDTA plus kolagenazy A lub EDTA i DTT do trawienia enzymatycznego i wykorzystywały gradienty gęstości do specyficznej izolacji i hodowli świnki morskiej11 i komórek EC szczura12. Niedawno organoidy jelitowe zostały wygenerowane i mechanicznie zakłócone do zapisów elektrofizjologicznych4. Hodowle wykorzystujące te metody dobrze nadają się do eksperymentów z uwalnianiem serotoniny, analizy RT-qPCR i, chociaż mogą być wykorzystane do elektrofizjologii, zależą od powodzenia czasochłonnego generowania organoidów, gradientów gęstości w celu identyfikacji komórek EC oraz zakłócających działanie trypsyny i EDTA na komórki. W przeciwieństwie do tego, opisany tutaj protokół ulepsza zabiegi enzymatyczne i mechaniczne, optymalizuje warunki hodowli i usprawnia procedury w celu wytworzenia pojedynczych i zdrowych komórek EC odpowiednich do wysokich standardów komórkowych potrzebnych do elektrofizjologii.

Ta metoda będzie przydatna dla naukowców, którzy chcą pracować nad pierwotnymi komórkami EC w mieszanych kulturach, a nie w kulturach unieśmiertelnionych, i chcą badać elektrofizjologię pojedynczych komórek. Jednak może okazać się mniej odpowiedni do badania populacji komórek, które wymagają sortowania lub długoterminowych hodowli, które wymagają przeżycia powyżej 72 godzin.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Kliniki Mayo. Podstawowa część tego protokołu dotycząca hodowli komórkowych jest oparta na wcześniej opublikowanych metodach, do których można się odwołać w celu uzyskania dalszych informacji10. Wszystkie procedury doświadczalne muszą zostać zatwierdzone przez IACUC, a wszystkie eksperymenty muszą być przeprowadzane zgodnie z odpowiednimi wytycznymi i przepisami.

1. Przygotowanie kultury

  1. media.
    1. Przygotować kompletną pożywkę do hodowli komórek EC z wysokim poziomem glukozy [4500 mg/l] Zmodyfikowanym podłożem Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionym 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1% L-glutaminą i 1% penicyliną-streptomycyną (Tabela 1).
      UWAGA: Nośniki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
    2. Przefiltrować kompletną pożywkę do hodowli komórek EC i umieścić 25 ml pożywki w probówce o pojemności 50 ml w temperaturze 37 °C.
    3. Przygotować pożywkę wytrawiającą z DMEM o wysokim poziomie glukozy [4,500 mg/l] uzupełnioną 0,1% albuminą surowicy bydlęcej (BSA) (Tabela 1).
    4. Przefiltrować pożywkę wytrawiającą i umieścić cztery porcje pożywki o pojemności 10 ml w oddzielnych probówkach o pojemności 50 ml i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
      UWAGA: Nośniki można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do jednego miesiąca.
  2. enzym.
    1. Odważyć 4 mg (do jelita czczego) lub 24 mg (do jelita grubego) kolagenazy XI [≥800 jednostek/mg] w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.
      UWAGA: Kolagenaza jest stabilna w temperaturze -20 °C przez okres do jednego roku.
    2. Ponownie zawiesić podwielokrotność kolagenazy w 1 ml lodowatego PBS z Ca2+ i Mg2+. Zwiruj roztwór, aby dokładnie połączyć i umieść na lodzie.
  3. Powlekanie płytek kulturowych.
    1. Rozmrozić 150 μl macierzy zewnątrzkomórkowej przez noc w temperaturze 4 °C na lodzie.
    2. Przygotować 5% roztwór macierzy zewnątrzkomórkowej w/v, mieszając 100 μl rozmrożonej macierzy zewnątrzkomórkowej z 2 ml lodowato zimnego, bezsurowicowego DMEM.
      UWAGA: Macierz zewnątrzkomórkowa krzepnie w temperaturze pokojowej i należy z nią obchodzić się za pomocą wstępnie schłodzonych pipet, probówek i pożywki, aż będzie gotowa do pokrycia potraw.
    3. Natychmiast pokryj szklany wewnętrzny krąg szalek o średnicy 35 mm ze szklanym dnem 250 μl 5% roztworu macierzy zewnątrzkomórkowej. Ten przepis pokryje do 8 potraw.
    4. Umieścić naczynia ze szklanym dnem w inkubatorze o temperaturze 37 °C podczas pozostałych etapów izolacji kultur komórkowych. Wiązanie macierzy zewnątrzkomórkowej zajmuje co najmniej 1 godzinę, ale można ją inkubować do 2,5 godziny, wykonując inne etapy izolacji.
      UWAGA: Inkubacje dłuższe niż 3 godziny mogą powodować nagromadzenie macierzy zewnątrzkomórkowej, co może utrudniać tworzenie się uszczelnień podczas elektrofizjologii całej komórki.

2. Izolacja tkanek

  1. Zgodnie z wytycznymi etycznymi, należy złożyć w ofierze 3 do 6 tygodniowego samca lub samicę transgenicznej myszy Tph1-CFP (The Jackson Laboratory Stock: 028366)9 lub inny szczep reporterski.
    UWAGA: Używamy śmiertelnej dawki rosnącego poziomu dwutlenku węgla i zwichnięcia szyjki macicy jako drugorzędnego środka zapewniającego śmierć. Komitet ds. Eutanazji AVAM uważa również zwichnięcie szyjki macicy za dopuszczalną pierwotną metodę eutanazji przez osoby przeszkolone w jej stosowaniu, jeśli zwierzęta są najpierw uspokojone.
  2. Przypnij uśpioną mysz do etapu rozwarstwiania pianki polistyrenowej za pomocą igieł 21 G. Odkaż brzuch myszy za pomocą 70% etanolu.
  3. Pociągnij napiętą skórę myszy za pomocą kleszczy do mikropreparacji (#4), a następnie użyj ostrych nożyczek chirurgicznych, aby wykonać poprzeczne nacięcie w dolnej części brzucha myszy, aby odsłonić jamę wewnątrzotrzewnową. Wykonaj kolejne nacięcie pionowo w górę brzucha, aż klatka piersiowa zostanie odsłonięta.
  4. Użyj kleszczy do mikropreparacji, aby przesunąć jelito ślepe na lewo od myszy, aby uzyskać wyraźny widok okrężnicy.
  5. Użyj nożyczek do mikropreparacji, aby przeciąć najbardziej dystalną część okrężnicy (ale nadal proksymalnie do odbytnicy) i wykonaj drugie cięcie dystalnie do żołądka. Umieść wyekstrahowane jelita na szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm2 wypełnionej 20 ml lodowatego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).
  6. Użyj małej linijki, aby zmierzyć i wyciąć 10 cm środkowej okrężnicy lub jelita czczego. Wyciągnij okrężnicę, odmierzając 10 cm odcinek jelita znajdujący się proksymalnie do pierwszego cięcia wykonanego nad odbytnicą. Zidentyfikuj jelito czcze, składając całe jelito cienkie na pół i wykonując pierwsze nacięcie w połowie drogi i drugie nacięcie 10 cm proksymalnie do pierwszego cięcia.
    UWAGA: Kontynuuj wykonywanie wszystkich kolejnych kroków izolacji na lodzie.
  7. Napełnij strzykawkę o pojemności 6 ml lodowatym PBS i umieść igłę strzykawki w świetle wyekstrahowanego odcinka jelita. Użyj kleszczy do mikropreparacji, aby zacisnąć i uszczelnić jelita wokół igły strzykawki i delikatnie przepłukać 10 ml PBS przez światło, aby spłukać kał
    8. .
  8. Odwróć tkankę jelitową, delikatnie przeplatając kleszcze mikropreparacyjne przez światło, ściskając ścianę jelita i cofając tkankę proksymalnie do czubka kleszczy. Powtarzaj ten proces, aż segment znajdzie się na lewej stronie, ze światłem skierowanym na zewnątrz.
  9. Użyj nożyczek do mikropreparacji, aby pociąć segment tkanki na 1 cm kawałki.
  10. Użyj kleszczyków do mikropreparacji, aby przenieść segmenty tkanki w zlewce o pojemności 50 ml wypełnionej sterylnym PBS o pojemności 5 ml. Użyj nożyczek do mikropreparacji, aby zmielić kawałki tkanki do uzyskania płynnej konsystencji.
  11. Umieść zmieloną tkankę i 15 ml lodowatego PBS w czystej probówce o pojemności 50 ml za pomocą pipety transferowej. Rozetrzeć 2 razy pipetą transferową, poczekać, aż tkanka się uspokoi, usunąć 15 ml supernatantu PBS i zastąpić świeżym PBS. Powtórz ten proces trzy razy, aż PBS będzie czysty.
  12. Umieść probówkę o pojemności 50 ml z umytymi kawałkami tkanek na lodzie i umieść wiaderko z lodem w kapturze do hodowli tkankowych.

3. Trawienie enzymatyczne i mechaniczne

  1. Pierwsze trawienie
    1. Z łaźni wodnej wyjąć jedną z probówek o pojemności 50 ml zawierających 10 ml wstępnie podgrzanego podłoża do wytrawiania. Do probówki o pojemności 50 ml dodać 250 μl roztworu kolagenazy PBS i rozdrobnione kawałki tkanki jelitowej.
      UWAGA: Uważaj, aby nie dołączać żadnych PBS z poprzednich etapów prania.
    2. Umieścić probówkę o pojemności 50 ml w łaźni wodnej na 5 minut (okrężnica lub jelito czcze) w temperaturze 37 °C. Wstrząsnąć probówką 2x na minutę.
      UWAGA: Optymalny czas i intensywność trawienia mechanicznego może się różnić i będzie musiała zostać określona przez użytkownika. Aby określić optymalne warunki trawienia, po każdym trawieniu można obejrzeć 10 μl podwielokrotności komórek. Podczas trawienia 1 supernatant powinien składać się z grudek komórek.
    3. Powoli rozcierać tkankę jeden raz za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Na krótko pozwól kawałkom tkanki osiąść, a następnie użyj pipety transferowej, aby usunąć całe 10 ml supernatantu.
  2. Drugie trawienie: Powtórz kroki od 3.1.1 do 3.1.3. Wydłuż czas inkubacji do 10 minut w przypadku trawienia okrężnicy i utrzymuj czas inkubacji na poziomie 5 minut dla jelita czczego.
    UWAGA: Po obserwacji supernatant powinien nadal składać się z dużych skupisk komórek.
  3. Trzecie trawienie
    1. Powtórz krok 3.1.1
    2. Umieść probówkę o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 10 minut (okrężnica lub małe jelito czcze). Wstrząsaj probówką 2-3 razy na minutę z większą intensywnością niż Trawienie 1 i 2.
    3. Powoli pipetuj tkankę w górę i w dół za pomocą pipety serologicznej o pojemności 10 ml. Pozwól kawałkom tkanki osiąść przez krótki czas.
      UWAGA: Supernatant powinien składać się z kombinacji pojedynczych komórek i małych grudek.
    4. Za pomocą pipety transferowej umieścić 10 ml supernatantu w nowej probówce o pojemności 15 ml, dodać 2 ml podgrzanej pożywki do kompletnych hodowli komórek EC i raz odwrócić, aby wymieszać.
    5. Wirować w temperaturze 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie użyć pipety transferowej, aby usunąć supernatant. Użyj pipety transferowej, aby ponownie zawiesić pozostały osad w 2,5 ml podgrzanej, kompletnej pożywki do hodowli komórek EC.
  4. Czwarte trawienie: Powtórzyć kroki od 3.3.1 do 3.3.5. Wydłuż czas inkubacji do 15 minut w przypadku jelita grubego i pozostaw na poziomie 10 minut w przypadku jelita czczego.
    UWAGA: Supernatant powinien teraz składać się z pojedynczych komórek.

4. Hodowla komórkowa

  1. Za pomocą pipety transferowej połączyć zawiesiny komórek zebrane z procesów trawienia 3 i 4 w nowej probówce o pojemności 15 ml (całkowita objętość 5 ml).
  2. Pobrać 10 μl podwielokrotności komórek do policzenia za pomocą hemocytometru i obracać pozostałą zawiesinę komórek przy 100 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
    UWAGA: Końcowa zawiesina komórek będzie składać się z małych grudek i pojedynczych komórek.
  3. Usunąć supernatant za pomocą pipety transferowej i ponownie zawiesić osad w kompletnej pożywce do hodowli komórek EC o gęstości 1 000 000 komórek na ml.
    UWAGA: Ostateczna objętość zawiesiny komórek będzie zależeć od końcowej liczby komórek. Typowa liczba komórek waha się od 2 000 000 do 4 000 000.
  4. Wyjąć z inkubatora powlekane naczynia hodowlane ze szklanym dnem. Użyj pipety P1000, aby zastąpić macierz zewnątrzkomórkową z każdej szalki hodowlanej 250 μl końcowej zawiesiny komórek.
    UWAGA: Powłoka macierzy zewnątrzkomórkowej ma tendencję do przyklejania się do krawędzi naczynia ze szklanym dnem. Należy zachować szczególną ostrożność, aby usunąć powłokę wzdłuż krawędzi, aby zapobiec gromadzeniu się żelu.
  5. Przygotować roztwór podstawowy inhibitora ROCK Y-27632 w temperaturze 1 mM. Dodać 2,5 μl roztworu podstawowego do każdego naczynia ze szklanym dnem, aby uzyskać stężenie robocze 10 μM inhibitora ROCK w każdym naczyniu.
    UWAGA: Ten krok ma kluczowe znaczenie dla przetrwania kultur jelita czczego, ale jest opcjonalny dla jelita grubego.
  6. Umieść każdą naczynie hodowlane w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 24 do 72 godzin (Rysunek 1).

5. Przygotowanie komórek EC do elektrofizjologii całych komórek

  1. Wyłóż wewnętrzną średnicę stolika mikroskopu dwoma paskami folii woskowej o wymiarach 5 x 0,5 cm, aby utworzyć O-ring. Zamontuj 35-milimetrową naczynie do hodowli komórkowej w pierścieniu uszczelniającym o przekroju okrągłym (Rysunek 2A-B).
  2. Wypłucz zarówno pływające zanieczyszczenia, takie jak nieprzyłączona macierz zewnątrzkomórkowa lub martwe komórki, jak i surowicę pożywki hodowlanej całkowicie z komórek EC, aby zapobiec utrudnianiu tworzenia się uszczelnień między ogniwem EC a elektrodą. Zastosowanie trzech następujących opcji w celu uzyskania dokładnego mycia komórek wystarczającego do elektrofizjologii:
    1. Opcja 1: Wymiana roztworu jest bardziej efektywna w długiej komorze niż w komorze okrągłej. Ponieważ komórki EC zostały wyhodowane w okrągłych szalkach o średnicy 35 mm, utwórz plastikową eliptyczną wkładkę do naczynia.
      1. Stwórz wkładkę za pomocą druku 3D lub tradycyjnych metod frezowania. Zastosowana przez nas wkładka została wyfrezowana z tworzywa akrylowego o następujących wymiarach (w mm): średnica zewnętrzna 34,5; elipta wewnętrzna, 20x9; wysokość zewnętrzna, 10; wysokość wewnętrzna, 1,5; przęsło mostu, 3x3; prześwit mostu, 1,5; wlot i wylot, 4 x 4 każdy.
      2. Opuść wkładkę do naczynia hodowlanego (Rysunek 2A-B) i przymocuj ją do górnej części stolika mikroskopu za pomocą dwóch kawałków plasteliny o masie od 0,15 do 0,2 g wciśniętych w prostokąty o wymiarach 1,2 x 0,3 x 0,1 cm (Rysunek 2A-C).
      3. Za pomocą plastikowej pipety do przenoszenia powoli dodawaj roztwór zewnątrzkomórkowy po jednej stronie naczynia (wlot), jednocześnie zasysając z drugiej strony (wylot).
    2. Opcja 2: Bez wkładki z tworzywa sztucznego dodać roztwór zewnątrzkomórkowy za pomocą pipety transferowej z jednej strony naczynia (wlotu), jednocześnie zasysając z drugiej strony (wylotu). Powoli obracaj położenie pipety transferowej (np. od N do E do S), jednocześnie odzwierciedlając położenie igły aspiracyjnej po przeciwnej stronie (np. od S do W do N).
    3. Opcja 3: Pokryć macierz zewnątrzkomórkową prostokątne szkiełka nakrywkowe w kroku 1.3.3 i wyhodować zawiesinę komórkową na tych szkiełkach nakrywkowych w kroku 4.4. Przenieść szkiełko nakrywkowe do prostokątnej komory wypełnionej roztworem zewnątrzkomórkowym, pomijając krok 5.1 i pomijając krok 5.3. Przepłukać komorę roztworem zewnątrzkomórkowym z plastikowej pipety do przenoszenia, jak opisano w opcji 1 (5.2.1.3).
  3. Ponownie przymocuj stolik z hodowlą komórkową nad odwróconym mikroskopem (Rysunek 2D). Inkubować kulturę komórkową EC w roztworze zewnątrzkomórkowym bez surowicy w temperaturze pokojowej.
  4. Po 4 godzinach ponownie spłucz kulturę roztworem zewnątrzkomórkowym, jak opisano powyżej. Kontynuuj elektrofizjologię całych komórek.

6. Elektrofizjologia całych komórek EC z hodowli pierwotnej

  1. Uzyskanie giga-uszczelnienia całej komórki
    1. Pociągnij tuzin elektrod do rezystancji 1–5 MΩ,
      UWAGI: Najlepiej sprawdzają się pipety o rezystancji 1–2 MΩ, które dają uszczelki 10–100 GΩ. Polerowanie ogniowe końcówek elektrod nie jest konieczne do uzyskania uszczelnień GΩ.
    2. Pokryj równomiernie stożek nosowy wszystkich pipet polimerem. Trzymaj pipetę poziomo do podłoża i prostopadle do przodu opalarki. Powoli obracaj pipetę, aż polimer stwardnieje.
    3. Wlej porcję roztworu wewnątrzkomórkowego do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Przenieść 1,2 ml tego roztworu do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Pobrać kolejne 0,7 ml roztworu wewnątrzkomórkowego do strzykawki. Usunąć powietrze z końca strzykawki. Przymocować elastyczną igłę o masie 34 g i średnicy 67 mm do strzykawki i wypłukać resztki powietrza z tej igły.
    4. Zidentyfikuj ogniwo Tph1-CFP+, które nie ma kontaktu z żadną inną komórką ani zanieczyszczeniami.
    5. Napełnij końcówkę elektrody roztworem wewnątrzkomórkowym. Napełnić pipetę za pomocą strzykawki. Ostrożnie przetrząśnij pipetę paznokciem, aby rozproszyć powierzchnię styku pęcherzyków powietrza.
    6. Z tłokiem wciągniętym w 0,3 ml powietrza, podłączyć strzykawkę o pojemności 6 ml do wylotu rurki uchwytu. Zamontuj elektrodę w uchwycie.
      UWAGA: Podłącz strzykawkę do rurki przed wejściem elektrody do roztworu kąpieli, aby utrzymać neutralne lub dodatnie ciśnienie w roztworze wewnątrzkomórkowym przed uszczelnieniem.
    7. Załaduj dwuetapowy protokół cęgowy napięcia, który rejestruje prądy aktywujące w stanie ustalonym za pomocą drabinki napięciowej w pierwszym kroku i rejestruje dostępne prądy za pomocą pojedynczego napięcia w drugim kroku. Otwórz test szczelności (5 mV przy 50 kHz).
    8. Opuść elektrodę do roztworu kąpieli. Za pomocą mikromanipulatorów manewruj końcówką elektrody w płaszczyźnie i bezpośrednio poziomo od ogniwa. Usunąć 0,3 ml powietrza ze strzykawki.
    9. Delikatnie przesuń elektrodę poziomo wzdłuż osi x, aby dotknąć ogniwa. Zwróć uwagę, czy na ogniwie EC pojawi się wgłębienie i/lub wzrost rezystancji membrany w teście uszczelnienia. W razie potrzeby ponownie wyreguluj elektrodę w dół wzdłuż osi z i/lub poziomo wzdłuż osi x, nie przesuwając się poza linię środkową ogniwa.
    10. Nałożyć 0,1–0,2 ml ssania na strzykawkę o pojemności 6 ml. Trzymać tłok nieruchomo aż do osiągnięcia 100 MΩ, a następnie zwolnić uchwyt z tłoka. Poczekaj, aż komórka zostanie giga-uszczelniona. Delikatnie odłączyć strzykawkę, odkręcając ją.
      UWAGA: Jeśli komórka EC początkowo nie zostanie uszczelniona, możliwe będzie jej ponowne uszczelnienie przy kolejnej próbie. W tym celu należy delikatnie odciągnąć elektrodę od ogniwa EC o rezystancji uszczelnienia <20 MΩ. Sterując zużytą elektrodą za pomocą mikromanipulatorów, okrąż docelowe ogniwo EC, aby ręcznie usunąć matrycę lub zanieczyszczenia. Następnie spróbuj uszczelnić ogniwo EC nową elektrodą.
  2. Rejestruj prąd Na+ bramkowany napięciem całego ogniwa.
    1. Podłączyć strzykawkę o pojemności 3 ml z 0,5–1,0 ml powietrza. Szybko odsysaj (0,1–0,5 ml) na strzykawkę o pojemności 3 ml. Powtarzać tę czynność aż do uzyskania dostępu do całej komórki, a następnie delikatnie odłączyć strzykawkę.
      UWAGA: Ponieważ działanie strzykawki może początkowo się zmieniać i zmieniać stopniowo wraz z upływem czasu i użytkowaniem, należy wcześniej przećwiczyć ze strzykawką o pojemności 3 ml (uszczelniając koniec palcem wskazującym), aby upewnić się, że tłok odchyli się w zakresie 0,1–0,2 ml od pozycji wyjściowej. Jeśli nie, należy wymienić strzykawkę na nową.
    2. Włącz kompensację pojemności całego ogniwa. Dostosuj pojemność i rezystancję szeregową. Włącz kompensację rezystancji szeregowej. Przy opóźnieniu ustawionym na 60 ms dostosuj przewidywaną, a następnie skorygowaną kompensację rezystancji szeregowej. Zamknij test uszczelnienia.
    3. Zapisz średnio 5 przebiegów prądu Na+ bramkowanego napięciem całego ogniwa ( Rysunek 3A).
    4. Szybko zwróć uwagę na dwa parametry prądu Na+ bramkowanego napięciem: napięcie przy prądzie okna (Rysunek 3B, czerwone symbole, przecięcie krzywych aktywacji i dezaktywacji w stanie ustalonym) oraz szczytowa gęstość prądu Na+.
      UWAGA: Ogniwa EC ze szczytowymi prądami Na+ większymi niż -50 pA w trybie cęgów napięciowych zwykle uruchamiają potencjały wywołane w trybie cęgów prądowych. Dodatkowo, prądy większe niż -200 pA w zacisku napięciowym (Rysunek 3A) zwykle spontanicznie uruchamiają potencjały czynnościowe w zaciskach prądowych z potencjałów membranowych (czerwona linia, Rysunek 3D) w pobliżu napięcia prądu okna (czerwone symbole, Rysunek 3B).
  3. Rejestruj wywołane potencjały czynnościowe.
    1. Wyłącz kompensację rezystancji szeregowej. Wyłącz polecenie zewnętrzne. Przełącz tryb z V-clamp na I-clamp. Dostosuj wzmocnienie. Załaduj protokół cęgów prądu epizodycznego. Dostosuj ilość prądu podtrzymania na 0 pA. Włącz polecenie zewnętrzne.
      UWAGA: Nie przełączaj się z V-clamp na I-clamp (lub odwrotnie) bez uprzedniego wyłączenia zewnętrznego polecenia.
    2. Zwróć uwagę na spoczynkowy potencjał błony. Wyreguluj wejściowy prąd podtrzymania tak, aby potencjał membrany odczytywał prąd poniżej prądu okna (np. -80 do -100 mV). Dostosuj protokół cęgów prądu epizodycznego tak, aby interwał krokowy wejścia prądu był mniejszy niż wartość prądu podtrzymania (Rysunek 3C, kroki +2 pA dla prądu podtrzymania -3 pA).
    3. Rejestruj wywołane potencjały czynnościowe. Zwróć uwagę na najmniejszą ilość prądu wstrzykiwanego do wyzwolenia potencjału czynnościowego (Rysunek 3C, przemiatanie 3 z 5, krok +4 pA od -3 pA utrzymanie = +1 pA).
  4. Rejestruj spontaniczne potencjały czynnościowe.
    1. Wyłącz polecenie zewnętrzne. Załaduj protokół cęgów prądowych bez przerw (nieepizodycznych).
      UWAGA: Nie włączaj ponownie polecenia zewnętrznego, dopóki ilość prądu podtrzymującego w protokole cęgów prądowych bez przerw nie zostanie zweryfikowana jako odpowiednia dla ogniwa.
    2. Zmień prąd podtrzymujący tak, aby był ilością prądu wstrzykniętego w ostatnim przebiegu w wywołanym protokole, który nie wyzwolił potencjału czynnościowego (Rysunek 3D, prąd wejściowy podczas drugiego przebiegu, krok +2 pA od -3 pA utrzymanie = -1 pA).
    3. Włącz polecenie zewnętrzne. Dokładnie sprawdź, czy przewidywany prąd podtrzymania obniża potencjał błony poniżej progu, aby wyzwolić potencjał czynnościowy. W razie potrzeby wyreguluj prąd podtrzymania. Rejestruj spontaniczną aktywność.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Hodowle:
Pierwotne mysie komórki nabłonkowe otrzymane z transgenicznego modelu Tph1-CFP przytwierdzają się do naczyń po 4 godzinach i są gotowe do eksperymentów fizjologicznych w przedziale od 24 do 72 h. Gdy warunki hodowli nie były zoptymalizowane, hodowla komórek nabłonkowych składała się z dużych skupisk, pływających szczątków komórkowych, uszkodzonych błon oraz słabego sygnału CFP w komórkach EC (Rysunek 1A). Hodowle...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Pełne zrozumienie funkcji komórek EC wymaga wysokiej jakości metody hodowli pierwotnej w celu wygenerowania komórek do elektrofizjologii całych komórek. Pierwotne hodowle nabłonka przewodu pokarmowego były tradycyjnie trudne ze względu na niską przeżywalność. Łagodząc ten czynnik zakłócający, obecna metoda pozwala uzyskać hodowle pojedynczych komórek EC z jelita cienkiego lub grubego, które są w stanie przetrwać kilka dni.

Stwierdziliśmy, że następujące czynniki miały kluczowe znaczenie dla po...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Autorzy dziękują Pani Lyndsay Busby za pomoc administracyjną oraz Panu Robertowi Highetowi z Mayo Clinic Division of Engineering za zaprojektowanie i druk 3D wkładu do naczynia hodowlanego. Praca ta była wspierana przez NIH K08 do AB (DK106456), grant pilotażowy i wykonalność dla AB z Mayo Clinic Center for Cell Signaling in Gastroenterology (NIH P30DK084567) oraz nagrodę American Gastroenterological Association Research Scholar Award 2015 (AGA RSA) dla AB i NIH R01 dla GF (DK52766).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Naczynie hodowlane 100 mm x 15 mmCorning (Falcon)351029
Pipeta transferowaFisherbrand13-711-7M
10 mL pipeta serologicznaCorning (Falcon) 
50 ml stożkowycorning (Falcon) 
15 ml StożkowyCorning (Sokół) 
1,000 ml Barierowe końcówki do pipetThermo Scientific (Art)2079EZachowaj sterylność
Naczynia ze szklanym dnem MatTekMatTek CorporationP35G-1.5-14-CUtrzymuj sterylne
kleszcze do mikropreparacji - bardzo cienkie, bardzo długie końcówkiNarzędzia do naukiSB12630M
Nożyczki chirurgiczne - ostreNasco14002-14
Nożyczki do mikropreparacjiNascoSB46568M
Monoject Hypo Needle, 21 G x 1" A, 100/BXCovidien8881250172
  Tg (Tph1-CFP) 1Able / J MyszyJacksonStock # 028366Używaj myszy płci męskiej lub żeńskiej w wieku od 4 do 7 tygodni
Niemetalowe igły strzykawkowe Microfil (rozmiar 34, 67 mm)World Precision InstrumentsMF34G-5
Parafilm "M" Folia laboratoryjnaPechiney Opakowanie
R6101Dow Corning
6 ml ze zwykłą końcówką typu luerMonoject
Strzykawka 3 ml ze zwykłą końcówką typu luerMonoject
Sprzęt do elektrofizjologii
AmplifierUrządzenia molekularneAxopatch 200B
System akwizycji danych (daq)Urządzenia molekularneDigidata 1440A
KondycjonersygnałuUrządzenia molekularneOprogramowanie CyberAmp 320
Urządzenia molekularnepClamp 10.6
357551352098352097z tworzywa sztucznego Strzykawka

Bibliografia

  1. Rindi, G., Leiter, A. B., Kopin, A. S., Bordi, C., Solcia, E. The "normal" endocrine cell of the gut: changing concepts and new evidences. Annals of the New York Academy of Sciences. 1014, 1-12 (2004).
  2. Rogers, G. J., et al. Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells. The Journal of Physiology. 589, Pt 5 1081-1093 (2011).
  3. Strege, P. R., et al. Sodium channel NaV1.3 is important for enterochromaffin cell excitability and serotonin release. Scientific Reports. 7 (15650), (2017).
  4. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198 (2017).
  5. Alcaino, C., Knutson, K., Gottlieb, P. A., Farrugia, G., Beyder, A. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is inhibited by D-GsMTx4. Channels. 11 (3), 245-253 (2017).
  6. Kim, M., Javed, N. H., Yu, J. G., Christofi, F., Cooke, H. J. Mechanical stimulation activates Galphaq signaling pathways and 5-hydroxytryptamine release from human carcinoid BON cells. Journal of Clinical Investigation. 108 (7), 1051-1059 (2001).
  7. Modlin, I. M., Kidd, M., Pfragner, R., Eick, G. N., Champaneria, M. C. The functional characterization of normal and neoplastic human enterochromaffin cells. The Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 91 (6), 2340-2348 (2006).
  8. Wang, F., et al. Mechanosensitive ion channel Piezo2 is important for enterochromaffin cell response to mechanical forces. The Journal of Physiology. 595 (1), 79-91 (2017).
  9. Li, H. J., et al. Distinct cellular origins for serotonin-expressing and enterochromaffin-like cells in the gastric corpus. Gastroenterology. 146 (3), 754-764 (2014).
  10. Psichas, A., Tolhurst, G., Brighton, C. A., Gribble, F. M., Reimann, F. Mixed primary cultures of murine small intestine intended for the study of gut hormone secretion and live cell imaging of enteroendocrine cells. Journal of Visualized Experiments. (122), 55687(2017).
  11. Raghupathi, R., et al. Identification of unique release kinetics of serotonin from guinea-pig and human enterochromaffin cells. The Journal of Physiology. 591, Pt 23 5959-5975 (2013).
  12. Nozawa, K., et al. TRPA1 regulates gastrointestinal motility through serotonin release from enterochromaffin cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (9), 3408-3413 (2009).
  13. Reimann, F., et al. Characterization and functional role of voltage gated cation conductances in the glucagon-like peptide-1 secreting GLUTag cell line. The Journal of Physiology. 563, Pt 1 161-175 (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Pierwotna hodowla komórekmyszy reporterowe CFPclamp napięciowyclamp prądowytrawienie tkanekizolacja komórekrejestracja prądów sodowychdetekcja potencjału czynnościowego
Elektrofizjologia całych komórek pierwotnych hodowanych mysich komórek enterochromafinowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.