Test przesiewowy oparty na SA-β-galaktozydazie do identyfikacji leków senoterapeutycznych

Podsumowanie

Starzenie się komórek jest kluczowym czynnikiem w rozwoju przewlekłych patologii związanych z wiekiem. Identyfikacja środków terapeutycznych ukierunkowanych na komórki starcze daje nadzieję na wydłużenie procesu starzenia się w dobrym zdrowiu. W tym miejscu przedstawiamy nowatorski test do badań przesiewowych w celu identyfikacji senoterapeutyków na podstawie pomiaru aktywności związanej ze starzeniem β-galaktozydazy w pojedynczych komórkach.

Streszczenie

Starzenie się komórek jest jedną z cech charakterystycznych starzenia się, o której wiadomo, że negatywnie wpływa na długość życia w zdrowiu. Leki zdolne do zabijania komórek starczych w hodowli komórkowej, zwane senolitykami, mogą zmniejszyć obciążenie komórek starczych in vivo i wydłużyć okres zdrowia. Do tej pory zidentyfikowano wiele klas senolityków, w tym inhibitory HSP90, inhibitory z rodziny Bcl-2, pipelonguminę, peptyd hamujący FOXO4 oraz skojarzenie dazatynibu z kwercetyną. Wykrywanie SA-β-Gal przy podwyższonym pH lizosomalnym jest jednym z najlepiej scharakteryzowanych markerów wykrywania komórek starczych. Pomiary aktywności β-galaktozydazy (SA-β-Gal) związanej ze starzeniem się w żywych komórkach przy użyciu fluorescencyjnego substratu C₁₂FDG w połączeniu z określeniem całkowitej liczby komórek przy użyciu barwnika Hoechsta interkalującego DNA otwierają możliwość badań przesiewowych w kierunku leków senoterapeutycznych, które albo zmniejszają ogólną aktywność SA-β-Gal poprzez zabijanie komórek starczych (senolityków), albo przez tłumienie SA-β-Gal i innych fenotypów komórek starczych (senomorfiki). Wykorzystanie platformy do akwizycji i analizy obrazów fluorescencyjnych o wysokiej zawartości pozwala na szybkie i wysokoprzepustowe badania przesiewowe bibliotek leków pod kątem wpływu na SA-β-Gal, morfologię komórek i liczbę komórek.

Wprowadzenie

Starzenie się komórek zostało po raz pierwszy opisane przez Leonarda Hayflicka i Paula Moorheada, którzy wykazali, że normalne komórki mają ograniczoną zdolność do namnażania się w hodowli¹. Starzejące się komórki nie namnażają się pomimo obecności składników odżywczych, czynników wzrostu i braku hamowania kontaktu, ale pozostają aktywne metabolicznie². Zjawisko to znane jest jako starzenie replikacyjne i przypisuje się je głównie skracaniu telomerów, przynajmniej w komórkach ludzkich³. Dalsze badania wykazały, że komórki mogą być również indukowane do starzenia się w odpowiedzi na inne bodźce, takie jak stres onkogenny (starzenie się wywołane onkogenem, OIS), uszkodzenie DNA, leki cytotoksyczne lub napromienianie (starzenie się wywołane stresem, SIS)^4,5,6. W odpowiedzi na uszkodzenie DNA, w tym erozję telomerów, komórki albo starzeją się, rozpoczynają niekontrolowany wzrost komórek, albo ulegają apoptozie, jeśli uszkodzenia nie można naprawić. W tym przypadku starzenie się komórek wydaje się być korzystne, ponieważ działa w sposób hamujący nowotwór². Natomiast starzenie się nasila się wraz z wiekiem z powodu nagromadzenia uszkodzeń komórek, w tym uszkodzenia DNA. Ponieważ komórki starcze mogą wydzielać cytokiny, metaloproteinazy i czynniki wzrostu, zwane fenotypem wydzielniczym związanym ze starzeniem się (SASP), ten zależny od wieku wzrost starzenia się komórek i SASP przyczynia się do zmniejszenia homeostazy tkanek, a następnie starzenia się. Wiadomo również, że ten zależny od wieku wzrost obciążenia związanego ze starzeniem się wywołuje choroby metaboliczne, wrażliwość na stres, zespoły progerii i zaburzenia gojenia^7,8 i jest częściowo odpowiedzialny za liczne choroby związane z wiekiem, takie jak miażdżyca, choroba zwyrodnieniowa stawów, zwyrodnienie mięśni, powstawanie wrzodów i choroba Alzheimera9^,10,11,12,13. Eliminacja komórek starczych może pomóc w zapobieganiu lub opóźnianiu dysfunkcji tkanek i przedłużeniu okresu zdrowia¹⁴. Zostało to wykazane w transgenicznych modelach myszy^14,15,16, a także przy użyciu leków senolitycznych i kombinacji leków, które zostały odkryte zarówno dzięki badaniom przesiewowym leków, jak i analizie bioinformatycznej szlaków indukowanych specyficznie w komórkach starczych^{17,18,19,20,21,22}. Zidentyfikowanie bardziej optymalnych leków senoterapeutycznych, zdolnych do skuteczniejszego zmniejszania obciążenia komórek starczych, jest ważnym kolejnym krokiem w rozwoju podejść terapeutycznych dla zdrowego starzenia się.

Starzejące się komórki wykazują charakterystyczne cechy fenotypowe i molekularne, zarówno w hodowli, jak i in vivo. Te markery starzenia mogą być przyczyną lub wynikiem indukcji starzenia się lub produktem ubocznym zmian molekularnych w tych komórkach. Jednak żaden pojedynczy marker nie znajduje się specyficznie w komórkach starczych. Obecnie wykrywanie β-galaktozydazy związanej ze starzeniem (SA-β-Gal) jest jedną z najlepiej scharakteryzowanych i uznanych metod pomiaru starzenia się in vitro i in vivo opartych na pojedynczych komórkach. SA-β-Gal jest hydrolazą lizosomalną o optymalnej aktywności enzymatycznej przy pH 4. Pomiar jego aktywności przy pH 6 jest możliwy, ponieważ komórki starcze wykazują zwiększoną aktywność lizosomalną^23,24. W przypadku żywych komórek podwyższone pH lizosomalne uzyskuje się przez alkalizację lizosomalną wakuolarnym inhibitorem H⁺-ATPazy Bafilomycyną A1 lub inhibitorem kwasowości endosomalnej chlorochiną^25,26. 5-dodekanylaminofluoresceina Di-β-D-galaktopyranozyd (C₁₂FDG) jest stosowany jako substrat w żywych komórkach, ponieważ zatrzymuje rozszczepiony produkt w komórkach dzięki swojemu 12-węglowemu ugrupowaniu lipofilowe²⁵. Co ważne, sama aktywność SA-β-Gal nie jest bezpośrednio związana z żadnym szlakiem zidentyfikowanym w komórkach starczych i nie jest niezbędna do wywołania starzenia. Dzięki temu testowi komórki starcze można zidentyfikować nawet w heterogenicznych populacjach komórek i starzejących się tkankach, takich jak biopsje skóry od osób starszych. Został również wykorzystany do pokazania korelacji między starzeniem się komórek a starzeniem się²³, ponieważ jest to wiarygodny marker do wykrywania komórek starczych w kilku organizmach i warunkach^27,28,29,30. W tym miejscu opisano wysokoprzepustowy test przesiewowy SA-β-Gal oparty na subsecie fluorescencyjnym C₁₂FDG przy użyciu pierwotnych mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) z silnym starzeniem się komórek wywołanym stresem oksydacyjnym oraz omówiono jego zalety i wady. Chociaż test ten można przeprowadzić na różnych typach komórek, zastosowanie MEF z niedoborem Ercc1 i upośledzoną naprawą DNA pozwala na szybszą indukcję starzenia się w warunkach stresu oksydacyjnego. U myszy zmniejszona ekspresja endonukleazy naprawy DNA ERCC1-XPF powoduje upośledzoną naprawę DNA, przyspieszoną akumulację endogennych uszkodzeń DNA, podwyższony ROS, dysfunkcję mitochondriów, zwiększone obciążenie komórkami starczymi, utratę funkcji komórek macierzystych i przedwczesne starzenie się, podobnie jak w naturalnym starzeniu się^31,32. Podobnie, MEF-y z niedoborem Ercc1 starzeją się szybciej w culture¹⁷. Ważną cechą testu MEF w procesie starzenia się jest to, że każda studzienka zawiera mieszaninę komórek starczych i niestarzejących się, co pozwala na wyraźne wykazanie efektów specyficznych dla komórek starczych. Jednak chociaż uważamy, że zastosowanie stresu oksydacyjnego w komórkach pierwotnych w celu wywołania starzenia się jest bardziej fizjologiczne, test ten może być również stosowany w przypadku linii komórkowych, w których starzenie się jest indukowane przez czynniki uszkadzające DNA, takie jak etopozyd lub napromienianie.

Protokół

Wykorzystanie zwierząt zostało zatwierdzone przez Scripps Florida Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Generacja starzejącego się mysiego fibroblastu embrionalnego (MEF) – 12-15 dni

1. Wyizoluj MEF-y typu dzikiego i Ercc1^-/- od ciężarnych samic myszy w 13. dniu embrionalnym (E13), jak opisano wcześniej³³.
   UWAGA: Wszystkie poniższe kroki przeprowadza się w kapturze do hodowli tkankowych w warunkach aseptycznych i przy użyciu sterylnych narzędzi.
2. Wytnij głowę zarodka nad oczami.
3. Usuń czerwoną tkankę (serce i wątrobę) i użyj jej do genotypowania, jeśli to konieczne.
4. Przygotuj 500 ml mieszaniny 1:1 zmodyfikowanego podłoża orła (DMEM) firmy Dulbecco i F10 szynki z 10% płodową surowicą bydlęcą, 1x aminokwasami endogennymi, penicyliną i streptomycyną jako pożywką wzrostową i podgrzej ją do 37 °C przez około 15 minut przed każdym użyciem. Przechowywać podłoże wzrostowe w temperaturze 4 °C.
5. Resztę zarodka inkubować z 0,25% trypsyną/EDTA przez 10 minut.
6. Zmiel zarodek na kawałki o średnicy 1 mm i kilkakrotnie pipetuj tkankę w górę iw dół.
7. Dodać 10 ml pożywki wzrostowej i tkanek płytki jednego zarodka na płytkę do hodowli komórkowej o średnicy 10 cm (pasaż 0).
8. Hodować komórki w temperaturze 37 °C, 3%_O2, 5% CO₂,
   UWAGA: W tych warunkach tylko komórki MEF przyczepiają się do niepowlekanych płytek do hodowli tkankowych.
9. Zmieniaj pożywkę codziennie w przejściu 0, aby usunąć nieprzyłączone tkanki i fragmenty komórek.
   UWAGA: W zależności od wielkości zarodka i jakości izolacji, komórka zwykle osiąga zbieżność po 2 do 3 dniach.
10. Trypsynizacja
    1. Ostrożnie usuń pożywkę wzrostową i umyj komórki 10 ml 1x PBS dwa razy.
    2. Dodać 2 ml 0,025% roztworu trypsyny/EDTA do komórek na płytkach o średnicy 10 cm i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2-3 minuty.
    3. Upewnij się, że komórki są oderwane od powierzchni, sprawdzając komórki pod mikroskopem.
    4. Zakończ trawienie trypsyny, dodając taką samą ilość pożywki wzrostowej.
    5. Przenieść komórki do stożkowej probówki i odwirować komórki o masie 200 x g przez 3 minuty i odrzucić supernatant.
    6. Ostrożnie zawieś komórki w świeżej pożywce wzrostowej, policz komórki i umieść je na nowych płytkach przy przewidywanej gęstości komórek.
11. W przypadku podhodowli niestarzejącej się należy podzielić zlewające się komórki w stosunku 1:4 i rozciągnąć na kolejne pasaże w temperaturze 3%_O2, 37 °C, aby uzyskać więcej komórek (pasaż 1).
    UWAGA: W tym momencie komórki mogą być utrzymywane w hodowli lub przechowywane do późniejszego wykorzystania w ciekłym azocie, w kriowialach zawierających około 1 miliona komórek każda. Ten etap oferuje również możliwość wygenerowania mieszanej partii komórek od różnych zwierząt w celu zmniejszenia zmienności wynikającej z analizy na pojedynczych zwierzętach.
12. Aby wywołać starzenie się komórek, należy rozszczepić nasienie zlewających się komórek z pasażu 1 w stosunku 1:4 i inkubować je w temperaturze 20%_O2, 37 °C, 5% CO₂ przez 3 dni; te warunki hodowli są atmosferyczne dla tlenu.
    UWAGA: Hodowla komórek i blastocyst w stężeniach tlenu w otoczeniu może podnieść markery starzenia się komórek, szczególnie gdy naprawa uszkodzeń DNA jest zaburzona^34,35,36.
13. Powtórz tę procedurę dla 2 kolejnych fragmentów.
14. Aby monitorować starzenie się komórek, zmierz stopniowy wzrost średnicy i objętości komórek podczas każdego etapu trypsynizacji za pomocą zaawansowanego systemu liczenia komórek Coultera.
15. Oceń zmniejszenie proliferacji komórek, określając podwojenie populacji (PD) za pomocą równania
    PDT = (t_{2-t 1})/3,32 x (log n₂ – log n₁)
    UWAGA: Czas podwojenia populacji był używany tylko dla komórek niestarzejących się.
16. Użyj komórek wczesnego pasażu typu dzikiego lub Ercc1^-/- MEF, które były utrzymywane w temperaturze 3%_O2, 37 °C, 5% CO₂ jako niestarzejące się komórki kontrolne.

2. Test przesiewowy β-Gal związany ze starzeniem się – 2-3 dni

1. Przygotować 10 mM roztworów podstawowych wszystkich leków do badania w DMSO i przechowywać podwielokrotności w temperaturze -80 °C. Nie zamrażać i nie rozmrażać roztworów podstawowych, ponieważ może to zmniejszyć aktywność leków.
   UWAGA: W tym przypadku inhibitor HSP90 17DMAG został użyty jako lek senolityczny zdolny do specyficznego zabijania komórek starczych¹⁷.
2. W dniu eksperymentu rozmrozić podwielokrotność, rozcieńczyć leki w świeżej pożywce hodowlanej i dodać do komórek zawierających kondycjonowaną pożywkę w stosunku 1:1, aby uzyskać ostateczne stężenie w pożywce wzrostowej.
3. Stosować 96-dołkowe płytki do wstępnego rozcieńczania do seryjnych rozcieńczeń i kombinacji leków.
   UWAGA: W przypadku komórek MEF ustalono empirycznie, że stężenia DMSO nie powinny przekraczać 2%, a komórki kontrolne traktowane najwyższymi zastosowanymi stężeniami DMSO powinny być uwzględniane w każdym przebiegu.
4. Wysiewać 5 x 10³ komórki starcze lub 3 x 10³ komórki niestarzejące się w basenie na 96 płytkach dołkowych co najmniej 6 godzin przed poddaniem działaniu substancji w 100 μl pożywki wzrostowej i inkubować w temperaturze 20%_O2, 37 °C, 5% CO₂,
   UWAGA: Komórki powinny być w około 80% zlewane przed zabiegiem.
5. Użyj czarnej ściany/przezroczystej hodowli tkankowej dna, poddanych działaniu 96-dołkowych płytek, aby zminimalizować przesłuch sygnału fluorescencyjnego i tło.
   UWAGA: Jednak przezroczyste płyty również zostały pomyślnie przetestowane.
6. Dodać rozcieńczenia leku do komórek MEF i inkubować przez 24 godziny do 48 godzin w warunkach 20%_O2, 37 °C, 5% CO_{2 .}
7. Utrzymuj niestarzejące się komórki w warunkach 3%_O2, 37 °C, 5% CO_{2 .}
8. Do alkalizacji lizosomalnej przygotować 10 mM roztwór bafilomycyny A1 w porcji i przechowywać w stanie zamrożonym w temperaturze -20 °C.
9. Do analizy fluorescencyjnej aktywności SA-β-Gal należy przygotować roztwór podstawowy 2 mM C₁₂FDG, przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem.
10. Do roztworu roboczego należy przygotować 100 μM C₁₂FDG w pożywce wzrostowej w dniu doświadczenia.
    UWAGA: Wszystkie etapy (inkubacji) z udziałem C₁₂FDG należy wykonywać w ciemności.
11. Usuń roztwór leku i przemyj komórki 1 raz 100 μL 1x PBS.
12. Indukować alkalizację lizosomalną przez wstępne traktowanie komórek 90 μl roztworu bafilomycyny A1 o stężeniu 100 nM przygotowanego w pożywce do hodowli świeżych komórek przez 1 godzinę w temperaturze 20%_O2, 37 °C, 5% CO_{2 .}
13. Dodać 10 μL 100 μM C₁₂FDG roztworu roboczego do pożywki hodowlanej (stężenie końcowe 10 μM).
14. Inkubuj komórki przez 2 godziny.
15. Dodać 2 μl 100 μg/ml barwnika Hoechst 33342 (końcowe stężenie 2 μg/ml) do kultury i inkubować przez 20 minut.
16. Usuń pożywkę i dodaj 100 μl świeżej pożywki.

3. Ilościowa analiza obrazu fluorescencyjnego o wysokiej zawartości

1. Użyj platformy akwizycji i analizy obrazów fluorescencyjnych o wysokiej zawartości, aby uzyskać obrazy fluorescencyjne komórek w dwóch kanałach odpowiednich do przechwytywania fluorescencji Hoechst i C12FDG (np. odpowiednio ustawienia wstępne kanałów DAPI i FITC).
   UWAGA: Protokoły akwizycji wymagają zdefiniowania kilku zmiennych, które są specyficzne dla testu. Celem protokołu akwizycji jest uchwycenie odpowiedniej liczby ostrych obrazów fluorescencyjnych wystarczającej liczby komórek do dalszej analizy ilościowej.
2. Opracuj odpowiedni protokół analizy, wybierając każdy kanał i określając, dostosowując jedno lub więcej selektywnych kryteriów, co kwalifikuje się jako cecha zainteresowania w każdym kanale.
   1. W przypadku jądra należy użyć takich wstępnych ustawień segmentacji (np. segmentacja jądra, segmentacja pęcherzyków, segmentacja cytoplazmy), które pozwolą na identyfikację organelli komórkowych na podstawie wielu kryteriów, w tym morfologii, wielkości i intensywności sygnału. Dostosuj te kryteria, aby uwzględnić jądra, wykluczając fragmenty jądrowe i szczątki, które mogą mieć sygnał, ale które są na przykład zbyt duże lub zbyt małe, aby być jądrami.
   2. Sprawdź sygnał w kanale FITC, który jest fluorescencją z rozszczepionego C₁₂FDG i reprezentuje ilość związanej ze starzeniem się aktywności β-galaktozydazy w komórkach.
      UWAGA: Komórki starcze mają wyższą aktywność β-galaktozydazy związaną ze starzeniem się niż komórki niestarzejące się; jednak fluorescencja C₁₂FDG będzie niedyskretna i ciągła, co wymaga ustalenia progu między tym, co uważa się za komórkę C₁₂FDG-dodatnią i C₁₂FDG-ujemną.
   3. Korzystając z dostępnego na rynku oprogramowania analitycznego, wygeneruj liczbę przypadków, w których zdefiniowany region otaczający jądro (przypuszczalna komórka) co najmniej raz nałożył się na ponadprogowy C₁₂FDG.
      UWAGA: Oprogramowanie analityczne automatycznie generuje zliczanie za pomocą łączenia celów. Jest to praktyczna definicja starzejącej się komórki C₁₂FDG-dodatniej w teście.
3. Przeanalizować wszystkie próbki w trzech egzemplarzach z 3-5 polami na studzienkę, a wartości średnie i odchylenia standardowe są odpowiednio obliczane.
4. Oblicz procent komórek starczych, korzystając z następującego wzoru:
   Starzejące się komórki (%) = x 100

4. Parametry walidacji testu

1. Dla wszystkich próbek współczynnik zmienności wewnątrz- i międzytestowej (%CVs) obliczono przy użyciu następującego wzoru:
   CV w teście wewnętrznym (n = 10 powtórzeń zmierzonych w jednym eksperymencie) = x 100 (%)
   CV między testami (n = 5 niezależnych eksperymentów) = x 100 (%)
2. Do celów badań przesiewowych należy określić wartość Z', parametr statystyczny służący do oceny jakości testu, z komórek traktowanych 200 nM rapamycyną przez 24 godziny w temperaturze 20%_O2, 37 °C, 5% CO₂ (kontrola pozytywna dla leków senoterapeutycznych) i nieleczonych komórek starczych (kontrola ujemna).
   UWAGA: Wartość Z' została obliczona zgodnie z Zhang et al.³⁷. Wartości Z' od 0,5 do 1 wskazują, że test może być stosowany do badań przesiewowych leków.

Wyniki

Aktywność SA-β-Gal można wykryć w komórkach, które są indukowane do starzenia się na różne sposoby, od wyczerpania replikacyjnego, genotoksyczności i stresu oksydacyjnego, po aktywację onkogenu^23,25,38. W obecnym modelu wykorzystującym mysie embrionalne komórki fibroblastów z niedoborem Ercc1, normoksyczne warunki wzrostu (20%_O2) były wystarczające do wywołania starzenia się k...

Dyskusja

SA-β-Gal jest dobrze zdefiniowanym biomarkerem starzenia się komórek, pierwotnie odkrytym przez Dimri i in. (1995), wykazującym, że starzejące się ludzkie fibroblasty mają zwiększoną aktywność SA-β-Gal podczas oznaczania przy pH 6,²³ w porównaniu z komórkami proliferującymi. Tymczasem testy in vitro i in vivo na obecność SA-β-Gal ustalono dla różnych typów komórek i tkanek 25,39,40. Oparta na flu...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
DMEM	Corning	10-013-CV	medium
Ham's F10	Gibco	12390-035	średnia
płodowa surowica bydlęca	Tissue Culture Biologics	101	surowica
1x aminokwasy endogenne	Corning	25-025-Cl	aminokwasy
bafilomycyna A1	Sigma	B1793	inhibitor lizosomalny
C12FDG	Setareh Biotech	7188	substrat b-Gal
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399	Środek interkalacyjny DNA
17DMAG	Selleck Chemical LLC	50843	Inhibitor HSP90
System obrazowania komórek InCell6000	obrazowania o wysokiej zawartości	Healthcare