Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

Podsumowanie

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Streszczenie

Ze względu na swoją wysoką rozdzielczość, mikroskopia elektronowa (EM) jest niezbędnym narzędziem dla wirusologów. Jednak jedną z głównych trudności podczas analizy komórek zakażonych wirusem lub transfekowanych za pośrednictwem EM jest niska skuteczność infekcji lub transfekcji, co utrudnia badanie tych komórek. Aby przezwyciężyć tę trudność, można najpierw wykonać mikroskopię świetlną (LM) w celu przypisania subpopulacji zakażonych lub transfekowanych komórek. Tak więc, wykorzystując zastosowanie białek fluorescencyjnych (FP) połączonych z białkami wirusowymi, LM jest tutaj używany do rejestrowania pozycji komórek "transfekowanych pozytywnie", wyrażających FP i rosnących na podporze o alfanumerycznym wzorze. Następnie komórki są dalej przetwarzane na EM poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF), substytucję przez wymrażanie (FS) i zatapianie żywicy. Ultraszybki etap zamrażania zapewnia doskonałe zachowanie błony wybranych komórek, które można następnie analizować na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). W tym miejscu przedstawiono krok po kroku proces korelacyjnej mikroskopii świetlnej elektronów (CLEM), szczegółowo opisujący przygotowanie próbki, obrazowanie i korelację. Projekt eksperymentalny może być również zastosowany do odpowiedzi na wiele pytań z zakresu biologii komórki.

Wprowadzenie

Pomysł połączenia dwóch modalności mikroskopowych w celu uzyskania lepszego obrazu konkretnego procesu biologicznego jest raczej stary. Tak więc pierwsze badanie na temat wirusów przy użyciu "mikroskopii korelacyjnej" zostało opublikowane w 1960 roku jako dwie oddzielne publikacje^1,2. W pracy tej autorzy przeanalizowali zmiany w morfologii jądra indukowane przez adenowirusy za pomocą dwóch technik mikroskopowych. W pierwszej publikacji opisano obserwacje z mikroskopii elektronowej (EM) opisujące szczegóły morfologiczne związane z infekcją adenowirusem¹. W drugiej publikacji różne struktury zaobserwowane przez EM zostały skorelowane z obrazami histochemicznych wzorców barwienia z mikroskopii świetlnej (LM), aby określić charakter struktur wcześniej obserwowanych przez EM².

Jednak w tych wczesnych badaniach, ich obserwacje były wykonywane przy użyciu różnych zainfekowanych komórek przygotowanych jako niezależne eksperymenty. "Korelacja" miała być w istocie rozumiana jako połączenie informacji pochodzących z dwóch modalności obrazowania w celu zrozumienia określonego zjawiska, porównanie wszystkich uzyskanych wyników z różnymi testami w celu zrozumienia danego procesu biologicznego.

Obecnie termin mikroskopia korelacyjna, znany również jako korelacyjne światło i mikroskopia elektronowa (CLEM), jest stosowany do coraz większej liczby metod (recenzowanych w bibliografii^3,4,5), z tą wspólną cechą, że obie techniki obrazowania (LM i EM) są przeprowadzane na tej samej próbce. Połączenie obu metod prowadzi w ten sposób do wielomodalnej, wieloskalowej i wielowymiarowej analizy tej próbki³. Zaletą jest to, że LM może zapewnić szeroki przegląd wielu różnych komórek, umożliwiając identyfikację subpopulacji komórek wyrażających białko lub białka będące przedmiotem zainteresowania w heterogenicznej populacji komórek. EM pokonuje limit rozdzielczości LM, zapewniając obraz o wyższej rozdzielczości konkretnego zdarzenia wewnątrzkomórkowego. Co więcej, EM umożliwia wizualizację niefluorescencyjnego kontekstu subkomórkowego, w tym wszystkich organelli związanych z błoną, dużych kompleksów makromolekularnych (np. rybosomów, centrioli itp.) i elementów cytoszkieletu, dostarczając w ten sposób dodatkowych informacji przestrzennych, tzw. "przestrzeni referencyjnej"⁶, i nadając kontekst plamce fluorescencyjnej wykrytej przez LM.

W ciągu ostatnich kilku lat, CLEM stał się potężnym narzędziem nie tylko dla biologów komórkowych⁵, ale także dla wirusologów (recenzowanych w reference⁷) chcących zrozumieć złożone interakcje wirus-komórka, które prowadzą do udanej propagacji wirusa. Dlatego zrozumienie, w jaki sposób wirusy modyfikują błony komórkowe i organelle na swoją korzyść, jest niezbędne do opracowania leków przeciwwirusowych w celu wyeliminowania wirusów chorobotwórczych.

Tutaj opisana jest metoda CLEM, która pozwala na wykrywanie przez LM komórek wyrażających białka wirusowe połączone z białkiem fluorescencyjnym (FP). Komórki te są następnie kriounieruchamiane i dalej przygotowywane do analizy ultrastrukturalnej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) w celu uzyskania nowych informacji na temat tego, jak ekspresja tych białek zmienia układ błon wewnątrzkomórkowych (Rysunek 1). CLEM został przeprowadzony z chemicznie utrwalonymi komórkami w większości opublikowanych do tej pory badań wirusologicznych^{8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19}. Wynika to głównie z konieczności inaktywacji materiału zakaźnego ze względów bezpieczeństwa biologicznego w laboratoriach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 i -3 (BSL-2 i BSL-3), gdzie krioimmobilizacja komórek zwykle nie jest możliwa. W przypadku pytań wymagających optymalnej ochrony błon komórkowych wysoce zalecana jest witryfikacja poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF)²⁰. W takich przypadkach można zastosować opisany tutaj protokół CLEM. Co ciekawe, szczególnie podczas pracy z próbkami zakaźnymi, HPF można wykonać na próbkach, które zostały wcześniej chemicznie inaktywowane, na przykład w laboratoriach BSL-2 i BSL-3. Połączenie chemicznego utrwalania, po którym następuje HPF, jest możliwością przynajmniej częściowego skorzystania z zalet metod kriokonserwacji^21,22.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie przepływu pracy dla analizy komórek za pomocą CLEM. Komórki rosnące na wzorzystych dyskach szafirowych są najpierw analizowane przez LM w celu zlokalizowania komórek wyrażających FP przed ich przetworzeniem na EM. Po zlokalizowaniu komórki są natychmiast utrwalane przez HPF i FS, a następnie zatopione w żywicy. Po polimeryzacji żywicy podpora, w której rosły komórki (=krążki szafirowe) musi zostać usunięta z bloku żywicy. Blok zawierający osadzone komórki jest przycinany do małego trapezu, z którego pozostałe komórki, wyrażające FPs, są cięte diamentowym nożem. Ultracienkie skrawki są zbierane na siatkach szczelinowych i dalej badane przez TEM w celu uzyskania informacji ultrastrukturalnych tych komórek. Ten rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany za zgodą reference²⁹. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Protokół

1. Przygotowanie wzorzystych krążków szafirowych do hodowli komórkowej

1. Przenieść wzorzyste krążki szafirowe (patrz tabela materiałów), z wzorem alfanumerycznym wytrawionym na jednej z ich powierzchni, do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.
   UWAGA: Alternatywnie można użyć konwencjonalnych tarcz szafirowych o grubości 0,05 mm bez wzoru alfanumerycznego, w których wzór odniesienia jest tworzony przez pokrycie ich węglem z siatką szukacza na górze. W tym celu należy je oczyścić etanolem przed nałożeniem wzoru węglowego.
2. Umyj je dokładnie etanolem. Rozłóż je na szalce Petriego z bibułą filtracyjną i pozostaw do wyschnięcia. Umieść je na szklanym szkiełku oddzielnie od siebie za pomocą cienkiej długiej pęsety.
3. Sprawdź za pomocą odwróconego mikroskopu (powiększenie 4x), czy wzór współrzędnych jest czytelny na każdym szafirowym krążku.
   UWAGA: Jeśli tak nie jest, odwróć szafirowe krążki za pomocą pęsety.
4. Przechowuj krążki szafirowe na szalce Petriego.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Hodowla komórkowa z wzorzystymi dyskami szafirowymi

1. Sterylizuj wzorzyste krążki szafiru za pomocą środka sieciującego w ultrafiolecie (UV) przez 5 minut.
2. Zanieś szafirowe krążki do szafki bezpieczeństwa biologicznego hodowli komórkowych. Wysterylizuj długą pęsetę etanolem w komorze bezpieczeństwa biologicznego.
3. Dodać połowę pożywki do hodowli komórkowych (patrz tabela materiałów) do naczynia do hodowli komórkowych. Ostrożnie przenieś krążki szafirowe za pomocą długiej pęsety do naczynia do hodowli komórkowej.
4. Nasiona 1 x 10⁵ komórek Huh7-Lunet, stabilnie eksprymujących polimerazę T7 zawieszoną w drugiej połowie pożywki do hodowli komórkowych, na szalkę hodowlaną.
   UWAGA: Oblicz liczbę komórek do zasiania w taki sposób, aby w punkcie końcowym eksperymentu zbieg komórek nie przekraczał 20–30%. Wysoka gęstość komórek utrudni relokację komórek na późniejszych etapach przez EM. Co więcej, nadmierna konfluencja może spowodować oderwanie się komórek od szafirowych krążków.
5. Sprawdź, czy szafirowe krążki pozostają na dnie naczynia hodowlanego i czy współrzędne alfanumeryczne są nadal czytelne za pomocą odwróconego mikroskopu.
   UWAGA: Jeśli krążki unoszą się w pożywce do hodowli komórkowych, użyj długiej pęsety, aby popchnąć krążki na dno i ostatecznie obrócić je z powrotem do właściwej orientacji.
6. Następnego dnia należy przetransfekować komórki, jak wcześniej podano w references^21,23, postępując zgodnie z instrukcjami producenta środka do transfekcji.

3. Obrazowanie LM komórek rosnących na wzorzystych dyskach szafirowych

1. Przenieś krążki szafiru w punkcie końcowym eksperymentu na metalową płytkę obrazową zawierającą 30–50 μl/ pozycję pożywki bez wskaźnika pH, aby zmniejszyć niespecyficzną fluorescencję tła.
   UWAGA: Opisana tutaj metalowa płytka (Rysunek 2) została zaprojektowana na warsztatach Europejskiego Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL). W przypadku braku tej lub podobnej płytki, zamiast LM można również użyć szalek do hodowli komórkowych ze szklanym dnem. Ważne jest, aby zmienić normalną pożywkę do hodowli komórkowych na pożywkę bez wskaźnika pH. Należy również pamiętać, że należy unikać długich czasów ekspozycji, ponieważ mogą one powodować fotowybielanie, prowadzące do akumulacji reaktywnych form tlenu (ROS) i fizjologicznego uszkodzenia komórek^24,25.
2. Zobrazuj komórki pod odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym o szerokim polu.
   UWAGA: W przypadku stosowania białka znakowanego białkiem zielonej fluorescencji (GFP), jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, należy stosować odpowiednio filtry wzbudzenia i emisji 450–490 nm i 500–550 nm.
3. Najpierw uzyskaj obraz komórek w małym powiększeniu (10–20X), aby przydzielić komórki wyrażające FPs. Zapisz współrzędne wzorzystych dysków szafirowych, w których znajdują się interesujące komórki, za pomocą mikroskopii kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC).
   UWAGA: Zszycie kilku obszarów może pomóc w uzyskaniu lepszego przeglądu lokalizacji interesującej komórki lub komórek. Należy również pamiętać, że opcjonalnie można tu zastosować mikroskopię z kontrastem fazowym.
4. Uzyskaj obrazy o dużym powiększeniu (fluorescencja i DIC) (63–100X, obiektywy zanurzeniowe w oleju) tej samej komórki/komórek, aby lepiej dostrzec subkomórkową lokalizację białka będącego przedmiotem zainteresowania w przestrzeni wewnątrzkomórkowej.
   UWAGA: Obrazy DIC dostarczają informacji kontekstowych. Informacje te są często kluczowe dla późniejszego skorelowania obrazów LM z mikrofotografiami EM, ponieważ ostateczna korelacja jest bardziej precyzyjna z "anatomicznymi" punktami orientacyjnymi komórki. Ponieważ niektóre krążki szafirowe mogą pęknąć podczas kriounieruchomienia, zdecydowanie zaleca się przygotowanie trzech krążków na każdy warunek. Co więcej, niektóre komórki odłączają się od dysków podczas HPF i kolejnych etapów tego protokołu, podczas gdy ultrastruktura innych komórek może zawierać artefakty w wyniku uszkodzenia przez zamarzanie. W związku z tym co najmniej dwa obszary dysków powinny być obrazowane za pomocą LM, aby upewnić się, że w końcu będzie wystarczająca liczba komórek do analizy. Co ważne, te dwa obszary powinny znajdować się po przeciwnych stronach dysku. W ten sposób blok żywicy, w którym osadzone są komórki, można przeciąć na dwie połowy i uzyskać odcinki tych obszarów.

Rysunek 2: Schemat obrazowania LM komórek rosnących na wzorzystych dyskach szafirowych. (A) Krążki szafirowe są przenoszone za pomocą cienkiej pęsety na płytkę obrazową. (B-C) Płytka ta została specjalnie zaprojektowana w warsztacie EMBL w Heidelbergu, aby pasowała do mikroskopu świetlnego, w którym krążki szafiru mogą być obrazowane za pomocą pożywki do hodowli komórkowych bez wskaźnika pH. Składa się z metalowego suwaka o wymiarach 75 mm x 25 mm x 1 mm z czterema-pięcioma otworami wyfrezowanymi w nim wiertłem 3 mm, aby pasował do rozmiaru szafirowych krążków. Dodatkowo po każdej stronie otworów wyfrezowano małe rowki pod kątem 90°. Otwory te ułatwiają dostęp do dysków za pomocą kleszczy podczas manipulowania nimi. Aby zapewnić optymalne warunki obrazowania, szkiełka nakrywkowe nr 0 (o grubości od 0,085 do 0,13 mm) przyklejono poniżej otworów klejem UV i umieszczono w świetle UV w celu stwardnienia. (D) Obraz wzorzystego dysku szafirowego w dużym powiększeniu, przedstawiający współrzędne alfanumeryczne, które są wytrawione na jego powierzchni. Wzorzyste tarcze szafirowe są dostępne w handlu (patrz tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Krio-immobilizacja komórek rosnących na wzorzystych dyskach szafirowych za pomocą HPF

1. Umieścić aluminiowe nośniki "A" i "B" do HPF (patrz Tabela Materiałów) na szalce Petriego z bibułą filtracyjną nasączoną 1-heksadecenem. Zanurz wzorzyste krążki szafirowe zawierające komórki na szalce Petriego z 1-heksadecenem.
   UWAGA: Przesuń nieco krążki, aby zmyć pożywkę do hodowli komórkowych.
2. Zamontuj szafirowe krążki między aluminiowym nośnikiem "A" i "B" w uchwycie HPF w następujący sposób (Rysunek 3B). Na dole umieść nosidełko "B" płaską stroną skierowaną do góry. Umieść szafirowe krążki po tej płaskiej stronie komórkami skierowanymi do góry. Dodaj nośnik "A" o głębokości 0,1 mm skierowany w stronę komórek.
   UWAGA: Ponieważ wzorzyste krążki szafirowe są grubsze niż konwencjonalne krążki szafirowe, dostępny na rynku nośnik "A" (przeznaczony do użytku z niewzorzystymi krążkami szafirowymi 0,05 mm) musiał zostać przycięty do 0,05 mm po tej stronie głębokości 0,2 mm w warsztacie EMBL, aby zmieścić się w uchwycie HPF (Rysunek 3A). W tym celu nośnik "A" wkłada się w koniec metalowej rurki tak, aby jej bok 0,2 mm był odsłonięty i pozostawał nieruchomy podczas jej ścinania. Przycięta strona jest następnie szlifowana tak, aby była płaska. Alternatywnie, na wzorzystym krążku szafirowym (dostępnym w handlu, patrz Tabela materiałów) można użyć specjalnego aluminiowego nośnika, który w tym przypadku jest "kanapką" HPF składającą się tylko z szafirowego krążka i tego nośnika.
3. Zamknij uchwyt maszyny HPF i zamroź komórki.
   UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla konkretnej maszyny HPF. Alternatywnie można użyć innych maszyn HPF^6,26. W każdym przypadku należy pamiętać o istnieniu maszyn nowej generacji od dostawców.
   UWAGA: Używaj okularów ochronnych i zestawu słuchawkowego do ochrony słuchu.
4. Umieść zamrożoną "kanapkę" w styropianowym pudełku z ciekłym azotem do tymczasowego przechowywania.
   UWAGA: Używaj okularów ochronnych i skontaktuj się z lokalnymi funkcjonariuszami ds. bezpieczeństwa, aby uzyskać informacje o potencjalnych zagrożeniach związanych z obchodzeniem się z ciekłym azotem.
   1. Aby uniknąć nieporozumień, umieść każdą "kanapkę" w osobnej probówce mikrowirówkowej o pojemności 0,5 ml (wewnątrz pudełka z polistyrenu) oznaczonej numerem.
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Jeśli substytucja przez zamrażanie (FS) nie może być natychmiast przeprowadzona, próbki można przechowywać w krioprobówkach (z otworem wybitym u góry) w pudełkach, które są przechowywane w stojaku w kriogenicznym ciekłym azocie dewara (patrz Tabela materiałów). Ten pojemnik na ciekły azot powinien znajdować się w pomieszczeniu z czujnikami tlenu gazowego, aby uniknąć uduszenia w przypadku niedoboru tlenu.
      UWAGA: Wszystkie procedury opisane poniżej (kroki 5 i 6) muszą być wykonywane w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ponadto większość stosowanych odczynników jest niebezpieczna. Przed ich użyciem należy uważnie przeczytać karty charakterystyki substancji niebezpiecznej dostarczone przez producentów, a także zapytać urzędników ds. bezpieczeństwa o lokalne przepisy w celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z nimi. W celu prawidłowej utylizacji tych zużytych materiałów, a także prawidłowego korzystania z opisanego poniżej sprzętu, wymagane jest również zapoznanie się z procedurami bezpieczeństwa i higieny pracy lokalnego instytutu.

Rysunek 3: Schemat montażu wzorzystych dysków szafirowych pomiędzy dwoma aluminiowymi nośnikami dla HPF. (A) Przekroje konwencjonalnego nośnika "A", który musi być przycięty na głębszej stronie od 0,2 mm do 0,05 mm. (B) Szafirowy krążek o grubości 0,16 mm z alfanumerycznym wzorem wytrawionym na powierzchni jest montowany w dwóch aluminiowych nośnikach dla HPF, w następujący sposób: Szafirowy krążek umieszcza się na płaskiej stronie nośnika "B" z komórkami skierowanymi do góry. Posiekany nośnik "A" o głębokości 0,1 mm skierowany w stronę komórek umieszcza się na górze, aby zamknąć "kanapkę HPF". Aluminiowe nośniki i wzorzyste szafirowe tarcze są dostępne w handlu (patrz tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

5. FS komórek kriostacjonarnych

1. Napełnij maszynę FS (patrz Tabela materiałów) ciekłym azotem. Ustaw temperaturę na -90 °C i poczekaj, aż urządzenie osiągnie tę temperaturę.
2. Przygotuj pożywkę FS zawierającą 0.2% tetratlenku osmu (OsO₄) (v/v), 0.1% octanu uranylu (UA) (w/v) w acetonie destylowanym szkłem, podczas gdy maszyna FS stygnie.
   UWAGA: Aby przygotować (na przykład) 12 ml pożywki FS, wymieszaj 600 μl 4% OsO₄z 0,012 g UA w małym szklanym pojemniku. Mieszaninę tę rozpuścić w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 minut. Dodać pipetą 11,4 ml acetonu destylowanego ze szkła i dobrze wymieszać.
3. Napełnij probówki mikrowirówkowe o pojemności 1,5 ml 200-500 μl pożywki FS, zamknij pokrywę i przenieś je do maszyny FS. Odczekaj 10 minut, aż podłoże FS ostygnie.
4. Przenieś zamrożone "kanapki" zawierające szafirowe krążki z komórkami w ciekłym azocie za pomocą schłodzonej długiej pęsety do probówek zawierających podłoże FS.
   UWAGA: Używaj rękawic i okularów krioochronnych.
   UWAGA: "Kanapki" HPF mogą zostać samoistnie zdemontowane podczas ich przenoszenia. W takim przypadku upewnij się, że zamrożone krążki szafirów zostały przeniesione do probówek mikrowirówek. Aluminiowe nośniki można wyrzucić.
5. Uruchom FS w następujący sposób do następnego dnia²⁷: od -90 °C do -80 °C przez 8 godzin; od -80 °C do -50 °C przez 8 godzin; od -50 °C do -20 °C przez 2 godziny; od -20 °C do 0 °C przez 2 godziny.

6. Osadzanie żywicy w próbkach podstawionych przez zamrożenie

UWAGA: Wszystkie procedury opisane poniżej muszą być przeprowadzone w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Ponadto większość stosowanych odczynników jest niebezpieczna. Przed ich użyciem należy uważnie przeczytać karty charakterystyki substancji niebezpiecznej dostarczone przez producentów, a także zapytać urzędników ds. bezpieczeństwa o lokalne przepisy w celu zapewnienia bezpiecznego obchodzenia się z nimi. W celu prawidłowej utylizacji tych zużytych materiałów, a także prawidłowego korzystania z opisanego poniżej sprzętu, wymagane jest również zapoznanie się z procedurami bezpieczeństwa i higieny pracy lokalnego instytutu.

1. Wyjmij podstawione próbki z maszyny FS i umieść je na lodzie na 20 minut.
2. Próbki należy przechowywać w temperaturze pokojowej przez 20 minut i dokładnie umyć (3 razy po 10 minut) acetonem destylowanym ze szkła. Wyrzuć aluminiowe nośniki długimi pęsetami, jeśli nadal znajdują się w probówkach do mikrowirówek po FS.
3. Naciekać komórki (na pozostałych krążkach szafirowych) w czteroetapowej serii żywic epoksydowych, stosując 1-godzinną inkubację w 25%, 50% i 75% żywicy w acetonie destylowanym ze szkła, a następnie inkubację przez noc ze 100% żywicą. Wymień 100% żywicę następnego dnia na 1h.
4. Ostrożnie umieść szafirowe krążki w pierścieniach przepływowych zamontowanych w kąpielach odczynnikowych wypełnionych 100% żywicą. Pierścienie te są używane jako formy polimeryzacyjne dla 10 krążków szafirowych.
   UWAGA: Szafirowe krążki muszą być całkowicie dociśnięte do dołu, ze współrzędnymi skierowanymi do góry w czytelny sposób. Można to sprawdzić za pomocą lornetki przymocowanej do pochłaniacza oparów. Alternatywnie można zamiast tego użyć lornetki umieszczonej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Co ważne, na spodzie odczynników wygrawerowane są cyfry (1-10), które pomagają w identyfikacji próbek. Ponadto, w celu identyfikacji próbek, w bloku żywicy można umieścić papierową etykietę.
5. Próbki polimeryzować w piecu w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.

7. Usuwanie wzorzystych krążków szafirowych z bloków spolimeryzowanej żywicy

1. Wyjmij z piekarnika bloki twardej żywicy zawierające komórki.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Jeśli nie, pozwól blokom ostygnąć do temperatury pokojowej przed ich pokrojeniem.
2. Wytnij formy do osadzania żyletką, aby mieć dostęp do bloków żywicy. Usuń cylindryczne bloki żywicy za pomocą pęsety.
   UWAGA: Jeśli papierowa etykieta nie została dołączona do bloku żywicy przed polimeryzacją, ponumeruj bloki trwałym markerem i przechowuj je w probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
3. Zanurz końcówkę bloku żywicy zawierającego szafirowy krążek w polistyrenowym pudełku zawierającym ciekły azot, aż przestanie "bulgotać". Następnie zanurz końcówkę bloku żywicy we wrzącym_H2O.
4. Powtórz dwa poprzednie kroki tyle razy, ile potrzeba, aż szafirowy krążek spadnie z bloku żywicy.
   UWAGA: Używać okularów i rękawic krioochronnych.
   UWAGA: Jeśli to nie zadziała, użyj żyletki, aby usunąć trochę spolimeryzowanej żywicy wokół krążków przed ponowną próbą. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

8. Ukierunkowane przycinanie i ultracienkie cięcie dla TEM

1. Zidentyfikuj obszar na powierzchni bloku żywicy, w którym znajdują się interesujące go komórki, badając powierzchnię bloku przez lornetkę ultramikrotomu.
   UWAGA: Ujemny odcisk wzoru współrzędnych z wzorzystych dysków szafirowych jest zachowywany na powierzchni bloku. Pozwala to na identyfikację obszaru, w którym znajdują się interesujące komórki w celu ukierunkowanego przycinania. Obrazy LM muszą być odwrócone w pionie, aby ułatwić znalezienie tej samej pozycji powierzchni bloku.
2. Przytnij osadzoną monowarstwę komórkową zawierającą komórkę/komórki będące przedmiotem zainteresowania do małej płaskiej piramidy w kształcie trapezu (~ 200 μm × średniej wielkości 250 μm) za pomocą czystej żyletki.
3. Uzyskaj ultracienkie sekcje osadzonych komórek o długości fali 70 nm za pomocą noża diamentowego 35°.
4. Umieść sekcje na siatkach szczelinowych EM za pomocą bardzo cienkiej pęsety.
   UWAGA:: Należy unikać stosowania siatek siatki, ponieważ sekcje mogą być maskowane przez pręty siatki.
5. Przechowuj siatki w pudełku z siatką.
   UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać.

9. Analiza TEM ultracienkich przekrojów

1. Umieść siatkę szczelinową w uchwycie transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Uzyskuj obrazy o małym powiększeniu (przeglądowe), na których widoczny jest pełny profil komórki będącej przedmiotem zainteresowania.
   UWAGA:: Komórkę/komórki będące przedmiotem zainteresowania można odnaleźć z powrotem, używając profili komórek i lokalizacji komórek względem siebie jako odniesień, w porównaniu z widokami DIC uzyskanymi wcześniej przez LM.
2. Uzyskanie obrazów komórki lub komórek w dużym powiększeniu, aby spróbować znaleźć, na poziomie ultrastrukturalnym, cechy, które odpowiadają sygnałom fluorescencyjnym zaobserwowanym wcześniej przez LM.
   UWAGA: Obrazy montażowe można uzyskać w dużym powiększeniu, aby mieć przegląd w wysokiej rozdzielczości interesującej komórki / komórek. Ponadto często konieczne jest uzyskanie obrazów tej samej komórki w kolejnych odcinkach szeregowych, aby móc zrekonstruować komórkę w 3D przed porównaniem z obrazami fluorescencyjnymi.

Wyniki

Korzystając z przedstawionej tutaj procedury (Rysunek 1), komórki Huh7-Lunet stabilnie wyrażające polimerazę T7-RNA zostały wysiane na wzorzystych dyskach szafirowych, a następnie transfekowane plazmidem wyrażającym dwie domeny niestrukturalnego białka NS5A wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), oznaczonego GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Rysunek 4). Następnego dnia wzorzyste dyski szafirowe, na których rosły komórki, wyjęto z naczyń do hodowli komórkowych i zobrazowano za pomocą LM (Ryc. 4, Ryc. 2). Komórki wykazujące ekspresję AH-D1-GFP zostały zidentyfikowane przez obecność zielonej fluorescencji w cytozolu i zarejestrowane w celu zapisania ich pozycji we wzorcu współrzędnych krążków szafiru (ryc. 5A, 5B). Natychmiast po badaniu LM szafirowe krążki zawierające interesujące komórki zostały umieszczone między dwoma aluminiowymi nośnikami (Rysunek 3) i poddane krioimmobilizacji przez HPF. Komórki zostały następnie zamrożone, podstawione, a następnie zatopione w żywicy epoksydowej.

Po usunięciu krążków szafiru z bloków spolimeryzowanej żywicy, odcisk wzoru alfanumerycznego był widoczny na powierzchni bloku, co pozwoliło na odzyskanie obszarów, w których znajdowały się interesujące komórki. Reszta bloku żywicy została odcięta, aby wygenerować mały trapez, w którym znajdują się interesujące komórki. Z tego trapezu uzyskano seryjne ultracienkie przekroje, zebrane na siatkach szczelinowych EM i dalej analizowane przez TEM (Rysunek 5C). Zauważ, że ręczne szeregowe sekwencje sekcji, chociaż jest to wykonalne²⁸ jest pracochłonne i wymaga dobrze wyszkolonego i wykwalifikowanego personelu. Ważne jest również, aby komórki miały niską konfluencję, gdy są poddawane temu protokołowi CLEM (Rysunek 5A), aby zagwarantować szybkie rozpoznanie tej samej komórki wcześniej zidentyfikowanej przez LM. W przeciwnym razie większa konfluencja komórek może dramatycznie spowolnić pomyślne lokalizowanie komórek na poziomie EM.

Analiza TEM kilku ultracienkich odcinków komórki będącej przedmiotem zainteresowania (Ryc. 5D, 5E), wyrażająca AH-D1-GFP, ujawniła obecność w jej przestrzeni wewnątrzkomórkowej dużych nagromadzeń pęcherzyków o zmiennej morfologii, ograniczonych od otaczającego cytozolu pojedynczą dwuwarstwą lipidową (Ryc. 5E).

Rysunek 4: Schematyczne przedstawienie przepływu pracy przeprowadzonego w celu wykonania przykładu CLEM przedstawionego w Rysunek 5. Komórki Huh7-Lunet stabilnie eksprymujące polimerazę T7-RNA transfekowano plazmidem DNA kodującym amfipatyczną helisę (AH) i domenę 1 (D1) białka HCV NS5A, oznaczoną na jego C-końcu GFP (pTM_AH-D1-GFP). Ekspresja tej części białka NS5A jest kontrolowana transkrypcyjnie przez promotor T7 (T7 Pm) i translacyjnie przez element IRES (wewnętrzne miejsce wejścia rybosomu) wirusa zapalenia mięśnia sercowego (EMCV), wskazywany przez strukturę drugorzędową. Dwudziestoczterogodzinne komórki po transfekcji (24 hpt) rosnące na wzorzystych dyskach szafirowych i wyrażające AH-D1-GFP zostały wykryte przez LM i natychmiast poddane HPF-FS. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 5: Przykład procedury CLEM. (A) Komórki Huh7-Lunet stabilnie eksprymujące polimerazę T7 analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu przydzielenia komórek GFP-dodatnich wyhodowanych na wzorzystych dyskach szafirowych, 24 godziny po transfekcji plazmidem pTM_AH-D1-GFP. (B) Obraz o większym powiększeniu pojedynczej komórki zaznaczonej w białym przerywanym prostokącie, który ma być analizowany przez CLEM. (C) Obraz TEM ultracienkiego przekroju tej samej komórki po zatopieniu HPF, FS i żywicy. (D) Schematyczne przedstawienie szeregowych ultracienkich odcinków 70 nm na siatce szczelinowej EM zawierającej interesujące ogniwo. (E) Po lewej: przeglądy TEM dwóch sekcji komórki będącej przedmiotem zainteresowania. Po prawej: Obrazy TEM w dużym powiększeniu obszarów wewnątrzkomórkowych zaznaczonych w żółtych prostokątach po lewej stronie, ujawniające dużą liczbę pęcherzyków oddzielonych od cytozolu pojedynczą błoną. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metodologia CLEM w celu zbadania wpływu ekspresji białka wirusa na błony komórkowe była już z powodzeniem stosowana do wyjaśnienia struktur związanych z replikacją HCV, głównie pęcherzyków z podwójną błoną (DMV)²¹, a także do określenia krytycznych elementów budulcowych wymaganych do utworzenia tych struktur indukowanych przez HCV²³. Należy zauważyć, że w naszej pierwszej pracy z wykorzystaniem CLEM do badania replikacji HCV²¹ zastosowano nieco zmodyfikowaną wersję opisanego tutaj protokołu. W tym badaniu użyto konwencjonalnych krążków szafirowych o grubości 0,05 mm, bez wzoru alfanumerycznego, w których wzór referencyjny został utworzony poprzez pokrycie ich węglem z siatką szukacza na górze (patrz tabela materiałów). Ta wersja obecnego protokołu może być ostatecznie zastosowana, z tą zaletą, że nośnik "A" dla HPF może być używany bezpośrednio, bez konieczności jego skracania, jak na rysunku 3A. Alternatywnie, jak wspomniano w protokole, można zastosować grubszy nośnik "A" (patrz tabela materiałów) z wzorzystymi dyskami szafirowymi, bez potrzeby stosowania nośnika "B".

Co ciekawe, protokół ten może być stosowany nie tylko do badania próbek BSL-1, takich jak komórki transfekowane białkami wirusowymi, jak opisano tutaj i gdzie indziej^19,23, ale także do badania komórek zakażonych wirusem. Chociaż praca z ludzkimi patogenami jest zwykle ograniczona do laboratoriów BSL-2 i BSL-3, w niektórych krajach nadal możliwe jest przeprowadzenie krioimmobilizacji w tych warunkach bezpieczeństwa biologicznego. W laboratoriach BSL-2 i BSL-3, w których witryfikacja nie jest możliwa ze względu na lokalne przepisy lub brak maszyny HPF, komórki zakażone wirusem można nadal przygotować tą metodą, jeśli chemiczne wiązanie aldehydami zostanie przeprowadzone wcześniej, a mianowicie przed opuszczeniem obiektów BSL-2 lub BSL-3. Co więcej, aldehydy muszą być schładzane natychmiast po utrwaleniu, aby utrzymać fluorescencję, podczas gdy reszta protokołu jest identyczna z opisaną tutaj. Technikę tę można uznać za zbędną, ponieważ komórki są utrwalane dwukrotnie, chemicznie i poprzez witryfikację. Jednak ten protokół podwójnej fiksacji prowadzi rzeczywiście do znacznie lepszego zachowania DMV indukowanych przez HCV w porównaniu z DMV znajdującymi się w komórkach poddanych samej fiksacji chemicznej²¹.

W celu dalszych modyfikacji i rozwiązywania problemów czytelnik jest odsyłany do notatek w całej części protokołu tego rękopisu. Uwagi te opisują pułapki, których należy unikać, a także alternatywy pozwalające przezwyciężyć przypuszczalne trudności, które mogą pojawić się podczas wykonywania tej metody.

Głównym warunkiem zastosowania tej techniki jest maszyna HPF. Gdy krioimmobilizacja komórek za pomocą HPF nie jest możliwa (z powodu braku maszyny HPF) lub nie jest wymagana (gdy konserwacja membrany nie musi być optymalna), komórki można chemicznie utrwalić, a następnie przygotować i przeanalizować za pomocą EM 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,^{Rozdział 18,19}. Ta opcja nie wymaga użycia szafirowych krążków, ale naczyń do hodowli komórkowych z wzorami w siatkę do przenoszenia komórek lub klastrów komórek. Główną zaletą zastosowania tych szalek jest ich większa średnica w porównaniu do krążków szafirowych, pozwalająca na przesiewanie większych powierzchni. W związku z tym zastosowanie tego protokołu CLEM zostało z powodzeniem zastosowane do badania wpływu związku przeciwwirusowego przeciwko HCV¹⁵ lub do wizualizacji przegrupowań błon indukowanych przez niestrukturalne białka norowirusów¹⁹. Innym problemem, który może ograniczać wydajność tej metody, jest brak komercyjnego urządzenia FS. W takim przypadku zamiast tego można wykorzystać podstawowe domowe systemy FS. Chociaż automatyczne urządzenia FS mogą zmniejszyć liczbę nieszczęśliwych wypadków, urządzenia domowej roboty są z powodzeniem używane, na przykład w laboratoriach Kent McDonald's³⁰ i Paul Walther.

Jeśli chodzi o wiązanie chemiczne, opisany tutaj protokół zapewnia optymalne zachowanie struktur wewnątrzkomórkowych²⁰. W związku z tym, w przypadku, gdy dostępne są wyżej wymienione urządzenia HPF i FS, preferowane byłoby witryfikowanie interesujących komórek.

Przyszłe alternatywy dla tego podejścia CLEM obejmują możliwość wykorzystania tej metody nie tylko do pozyskiwania informacji 2D na poziomie ultrastrukturalnym, ale także do uzyskiwania informacji 3D na temat architektury zmian błon i organelli spowodowanych przez wirusy. Metody 3D-EM, w tym tomografia elektronowa (ET) i mikroskopia elektronowa ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM) (obszernie opisane w²⁹), mogą być również stosowane do komórek, które zostały przygotowane zgodnie z tym obecnym protokołem^21,31. Ponadto informacje 3D można było również uzyskać na poziomie LM, przy użyciu mikroskopu konfokalnego, który pozwala na akwizycję stosów z. W rzeczywistości ta opcja jest wysoce zalecana, gdy pożądana jest precyzyjna korelacja między zestawami danych LM i EM (patrz przykład¹⁷). Informacje zawarte w stosach z 3D pomagają poprawić korelację z obrazami TEM 2D. Tak więc w takim scenariuszu można wybrać najlepiej pasujące obrazy LM i EM, a następnie poddać je jednemu z dostępnych programów do korelacji, takich jak wtyczka ec-CLEM ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)³² lub wtyczka Landmark Correspondences Image J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), co skutkuje generowaniem nakładających się obrazów LM-EM.

Gdy informacje czasowe są potrzebne do zrozumienia kinetyki określonego zdarzenia, obrazowanie poklatkowe może być wykorzystane do monitorowania dynamiki żywych komórek w połączeniu z EM. Podczas interesującego zdarzenia komórki są natychmiast naprawiane, generując "zamrożoną migawkę", która może być następnie analizowana przez EM, dostarczając szczegółowych informacji ultrastrukturalnych o tym konkretnym momencie w momencie unieruchomienia. Aby uzyskać tę "zamrożoną migawkę", po obserwacji w czasie rzeczywistym, komórki mogą być albo chemicznie utrwalone33, albo unieruchomione^{kriologicznie6}. Ponieważ wiele procesów komórkowych zachodzi szybciej niż procesy dyfuzji wiązania chemicznego, jeśli to możliwe, należy przeprowadzić ultraszybkie zamrażanie. Należy jednak wziąć pod uwagę, że maszyny HPF różnią się efektywną rozdzielczością czasową³⁴.

Ponadto, chociaż protokół ten został opracowany do osadzania komórek w żywicy epoksydowej, ogniwa mogą być również zatopione w żywicach o niskiej lepkości, takich jak Lowicryls, LR White lub LR Gold. Zastosowanie tych pożywek do zatapiania pozwala na zachowanie antygenowości ^35,36, a także fluorescencji^37,38 i dlatego są one najczęściej stosowane do poosadzania w sekcji^{znakowania immunologicznego 39,40} i CLEM^{w sekcji 41,42,43,44}, gdzie LM jest wykonywany po osadzeniu. Oba podejścia (immuno-EM i CLEM w sekcji) muszą być kluczowe dla tych doświadczeń, w których niecharakterystyczne struktury można łatwo znaleźć za pomocą TEM i/lub jako kontrolę przeciwko błędnej korelacji między sygnałami LM i EM. Podobnie, znakowanie przeciwciałami, które można uwidocznić za pomocą obu metod obrazowania (LM i EM), można przeprowadzić⁴⁵ w celu, na przykład, identyfikacji transfekowanych komórek w LM (etap wstępnego osadzania) i uzyskania znacznie dokładniejszej lokalizacji sygnału GFP poprzez jego specyficzne znakowanie przez immuno-EM (etap po osadzeniu). Należy jednak wziąć pod uwagę, że przepuszczalność jest przeprowadzana przed LM, aby umożliwić dostęp przeciwciał do przestrzeni wewnątrzkomórkowej, co może skutkować nieoptymalnym zachowaniem architektury komórki na poziomie EM. Co ciekawe, protokół ten doskonale nadaje się również do eksperymentów wielokolorowych, które można osiągnąć przy użyciu innych znaczników fluorescencyjnych, innych niż GFP (jak pokazano tutaj). Podsumowując, istnieje wiele przypuszczalnych możliwości dostosowania tego protokołu, zarówno po stronie LM, jak i po stronie EM, w zależności od pytań, które są poruszane. W celu uzyskania wyczerpującego opisu innych alternatywnych protokołów czytelnik jest odsyłany do ^5,46. Niezależnie od tego, w jaki sposób połączone zostaną metody mikroskopii, razem uzyskamy informacje, które pozwolą nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób wirusy i ich białka oddziałują ze swoimi gospodarzami w prawdziwym życiu.

Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest zebranie odcinków szeregowych z interesujących komórek. Jak podkreślono w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników, wymaga to doświadczonego personelu, a także dużej cierpliwości. Co ważne, ten krok jest niezbędny, aby znaleźć ogniwa z powrotem na poziomie EM z dwóch powodów. Po pierwsze, w tego rodzaju protokole CLEM wykorzystującym wstępne zatapianie LM, współrzędne są widoczne tylko na poziomie LM i na powierzchni bloku żywicy po osadzeniu. Nie będą one jednak widoczne na sekcjach TEM. Dlatego ukierunkowane przycinanie bloku zadrukowaną stroną do dołu do obszarów zainteresowania (ROI) musi być wykonywane ostrożnie za pomocą żyletki, aby upewnić się, że uzyskane następnie sekcje zawierają komórki wyrażające daną FP. Po drugie, konieczne jest "przeskanowanie" kilku sekcji, aby znaleźć najlepszą nakładkę między LM a akwizycjami EM. W przeciwieństwie do metod, w których LM jest wykonywany na etapie po zasadzeniu, w tym przypadku nakładka LM-EM nie jest tak precyzyjna. Niska dokładność nakładania wynika z różnic w rozdzielczości osiowej między LM i EM, skurczu podczas przetwarzania próbki EM i ściskania podczas cięcia⁴². Niemniej jednak skuteczne metody śledzenia, takie jak wykorzystanie punktów orientacyjnych, pomagają odzyskać komórki. Obejmuje to położenie jednej komórki względem drugiej, a także kształt komórek i ich jądra. W związku z tym, jak wyjaśniono w protokole, obrazy DIC dostarczają "anatomicznych" informacji o komórkach, które mają kluczowe znaczenie dla poprawy korelacji. Alternatywnie, jądra lub inne dobrze rozpoznawalne organelle komórkowe (takie jak mitochondria lub kropelki lipidów) mogą być barwione przed LM i wykorzystywane jako punkty orientacyjne.

Na koniec warto wspomnieć, że chociaż manuskrypt ten koncentruje się na wykorzystaniu tej techniki do badań wirusologicznych, zakres tego projektu eksperymentalnego może zostać rozszerzony, aby zająć się bardziej ogólnymi kwestiami biologicznymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Sieciownik UV	Stratagene	400072	Stratalinker 1800, 230 Vac, wyposażony w żarówki UV 254 nm, 8 Watt/każda.
Wzorzyste krążki szafirowe	Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria	627	Mają średnicę 0,3 mm i grubość 0,16 mm, a także wytrawiony wzór alfanumeryczny, aby umożliwić zmianę lokalizacji komórek. Można je zamawiać tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Wąska i długa pęseta	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	72919-SS	"Style SS", do obsługi krążków szafirowych.
Pożywka do hodowli komórkowych	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	41965-062	Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM) uzupełniona 2 mM L-glutaminą, aminokwasami endogennymi, 100 jednostkami penicyliny na ml, 100 i mikro; g streptomycyny na ml i 10% płodowej surowicy cielęcej (DMEM kompletne, patrz poniżej). Opakowanie zawierające 10 butelek po 500 ml każda.
L-glutamina	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	25030-123	Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.
Aminokwasy endogenne	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	11140-068	Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.
Penicylina/Streptomycyna	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	15140-163	Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.
Surowica cielęca płodu	Sigma Aldrich, St. Louis, MI, USA	F7524	Butelka 50 ml
Mikroskop odwrócony	Olympus Deutschland, Hamburg, Niemcy	CKX41	Jest to mikroskop odwrócony z opcjami głowicy trójokularowej i możliwością ulepszania fluorescencji.
Komórki Huh7-Lunet stabilnie eksprymujące polimerazę RNA T7	Dostępne w laboratorium prof. dr Ralfa Bartenschlagera	Niedostępne	Skontaktuj się z prof. Bartenschlagerem pod adresem: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Odczynnik do transfekcji Mirus TransIT-LT1	Mirus Bio LLC, Madison, USA	MIR 2304	Szerokie spektrum, niska toksyczność, odczynnik do transfekcji DNA. Fiolka 0,4 ml
Odwrócony szerokokątny mikroskop fluorescencyjny	Carl Zeiss Microscopy GmbH, Niemcy	Zeiss Observer.Z1	Odwrócony mikroskop fluorescencyjny do eksperymentów z udziałem żywych kultur komórkowych.
1-heksadecen	Merck, Darmstadt, Niemcy	8220640100	Butelka 100 ml
Aluminiowe uchwyty "A" do obróbki wysokociśnieniowej (HPF)	Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria	241	Jest to uchwyt, który został użyty w tym protokole i ma 2 różne głębokości 0,1 i 0,2 mm. Można go zamówić tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Uchwyty aluminiowe "B" dla	Biura Inżynieryjnego HPF M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria	242	Jest to uchwyt, który został użyty w tym protokole. Ma grubość 0,3 mm. Można je zamawiać tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Aluminiowy uchwyt "A" do HPF (specjalny do pracy z wzorzystymi tarczami szafirowymi)	Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria	737	Jest to uchwyt, który może być używany samodzielnie z wzorzystym dyskiem szafirowym (jako alternatywa dla obecnego protokołu), bez potrzeby posiadania uchwytu "B" lub edycji uchwytu "A". Ma grubość 0,84 mm. Można go zamówić tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Tarcze szafirowe	Biuro Inżynieryjne M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria	405	Te szafirowe krążki są "konwencjonalne", o średnicy 0,3 mm i grubości 0,05 mm . Mogą być również używane do CLEM jako alternatywa zamiast wzorzystych krążków szafirowych.
Siatki szukacza	Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, Filadelfia, USA	LF135-Cu	135 są używane do tworzenia alfanumerycznego wzoru na "konwencjonalnych" krążkach szafirowych (opisanych powyżej) poprzez powlekanie węglowe, dzięki czemu można je stosować do CLEM. 100 siatek/fiolkę.
Maszyna HPF	ABRA Fluid AG, Widnau, Szwajcaria HPM	010	Ta maszyna HPF została użyta do tego protokołu.
Maszyna HPF	Leica Microsystems, Wiedeń, Austria	EMPACT 2	"EMPACT 2", jako alternatywa dla korzystania z maszyny HPM, że została ona użyta w tym protokole (opisanym powyżej).
Kriorurki	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	Z763667-500EA	Do długotrwałego przechowywania próbek unieruchomionych kriomobilizacją w ciekłym azocie. Opakowanie zawierające 500 kriowialiów.
Ciekły azot dewar	Cole-Parmer GmbH, Wertheim, Niemcy	GZ-05094-60	Do długotrwałego przechowywania próbek unieruchomionych kriomobilizacją w ciekłym azocie, wyposażony w krio-stojaki o pojemności 1600 krioprobówek.
Automatyczna maszyna do substytucji przez zamrażanie (AFS)	Leica Microsystems, Wiedeń, Austria	EM AFS2	Ta maszyna wykonuje techniki substytucji przez zamrażanie i progresywne obniżanie temperatury (PLT) oraz umożliwia zatapianie i polimeryzację żywic w niskiej temperaturze.
Tetratlenek osmu (OsO4)Mikroskopia	elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA	19150	4% roztwór wodny, jedno pudełko zawierające 10 x 2 ml ampułek.
Octan uranu (UA)	Serva, Heidelberg, Niemcy	77879.01	Butelka zawierająca 25 gr (UA)-2 H2O.
Sonicator	Bandelin Electronic, Berlin, Niemcy	329	"Sonorex Super RK 31" to ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca o dużej mocy do wodnego roztworu czyszczącego, która jest używana w tym protokole do mieszania OsO4 i Ua podczas przygotowywania podłoża FS.
Aceton destylowany szkłem	Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA	10015	Butelka 100 ml
Mikroskop stereoskopowy	Leica Microsystems, Wiedeń, Austria	Leica M80	Rutynowy mikroskop stereoskopowy do codziennych inspekcji, wyposażony w kamerę do robienia zdjęć.
Żywica epoksydowa	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	14120	Embed 812 to zestaw zawierający kilka składników, które należy ze sobą wymieszać w proporcjach podanych przez producentów.
Pierścienie przepływowe	Leica Microsystems, Wiedeń, Austria	16707157	Opakowanie zawierające 100 sztuk.
Kąpiele odczynnikowe	Leica Microsystems, Wiedeń, Austria	16707154	Opakowanie zawierające 100 sztuk.
Ultramikrotom	Leica Microsystems, Wiedeń, Austria	Leica EM UC7	Ultramikrotom do przygotowywania pół- i ultracienkich przekrojów w temperaturze pokojowej.
Nóż diamentowy Ultra 35 °.	Diatome Ltd., Nidau Szwajcaria	AGG339-735	Ten nóż ma krawędź o długości 3 mm.
Ultracienka pęseta	Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA	E78318	"Style 3X", do obsługi siatek EM.
Siatki szczelinowe EM	Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA	G2010-Cu	100 siatki / fiolkę.
Skrzynka do przechowywania siatki EM	Mikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA	71155	Ma pojemność na 100 siatek.