Artykuł metodologiczny

Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie

69.7K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/58154

⸱

7 września 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1European Molecular Biology Laboratory, 2Department of Infectious Diseases, Molecular Virology, Heidelberg University, 3Central Facility for Electron Microscopy, Ulm University, 4Heidelberg Partner Site, German Center for Infection Research

W tym artykule

Podsumowanie

Metoda korelacyjnej mikroskopii elektronów świetlnych (CLEM) jest stosowana do obrazowania indukowanych wirusem struktur wewnątrzkomórkowych za pomocą mikroskopii elektronowej (EM) w komórkach, które zostały wcześniej wybrane przez mikroskopię świetlną (LM). LM i EM są łączone jako hybrydowe podejście do obrazowania w celu uzyskania zintegrowanego obrazu interakcji wirus-gospodarz.

Streszczenie

Ze względu na swoją wysoką rozdzielczość, mikroskopia elektronowa (EM) jest niezbędnym narzędziem dla wirusologów. Jednak jedną z głównych trudności podczas analizy komórek zakażonych wirusem lub transfekowanych za pośrednictwem EM jest niska skuteczność infekcji lub transfekcji, co utrudnia badanie tych komórek. Aby przezwyciężyć tę trudność, można najpierw wykonać mikroskopię świetlną (LM) w celu przypisania subpopulacji zakażonych lub transfekowanych komórek. Tak więc, wykorzystując zastosowanie białek fluorescencyjnych (FP) połączonych z białkami wirusowymi, LM jest tutaj używany do rejestrowania pozycji komórek "transfekowanych pozytywnie", wyrażających FP i rosnących na podporze o alfanumerycznym wzorze. Następnie komórki są dalej przetwarzane na EM poprzez zamrażanie pod wysokim ciśnieniem (HPF), substytucję przez wymrażanie (FS) i zatapianie żywicy. Ultraszybki etap zamrażania zapewnia doskonałe zachowanie błony wybranych komórek, które można następnie analizować na poziomie ultrastrukturalnym za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM). W tym miejscu przedstawiono krok po kroku proces korelacyjnej mikroskopii świetlnej elektronów (CLEM), szczegółowo opisujący przygotowanie próbki, obrazowanie i korelację. Projekt eksperymentalny może być również zastosowany do odpowiedzi na wiele pytań z zakresu biologii komórki.

Wprowadzenie

Koncepcja łączenia dwóch metod mikroskopii w celu uzyskania lepszego obrazu konkretnego procesu biologicznego jest dość stara. Pierwsze badanie nad wirusami z wykorzystaniem „mikroskopii korelacyjnej” zostało opublikowane w 1960 roku w formie dwóch oddzielnych publikacji1,2. W badaniu tym autorzy analizowali zmiany w morfologii jądra wywołane przez adenowirusy za pomocą dwóch technik mikroskopowych. W pierwszej publikacji przedstawiono obserwacje z mikroskopii elektronowej (EM), opisujące szczegóły morfologiczne związane z infekcją adenowirusami1. W drugiej publikacji różne struktury zaobserwowane w EM skorelowano z obrazami z mikroskopii świetlnej (LM) przedstawiającymi wzory barwienia histochemicznego, aby zdefiniować naturę struktur wcześniej zaobserwowanych w EM2.

W tych wczesnych badaniach obserwacje przeprowadzano jednak na różnych zakażonych komórkach, przygotowanych w ramach niezależnych eksperymentów. „Korelacja” oznaczała w rzeczywistości połączenie informacji pochodzących z dwóch modalności obrazowania w celu zrozumienia określonego zjawiska, poprzez porównanie wszystkich wyników uzyskanych za pomocą różnych testów, aby zrozumieć dany proces biologiczny.

Obecnie termin mikroskopia korelacyjna, znana również jako korelacyjna mikroskopia świetlna i elektronowa (CLEM), jest stosowany w odniesieniu do coraz większej liczby metod (przegląd w referencjach3,4,5), których wspólną cechą jest to, że obie techniki obrazowania (LM i EM) są przeprowadzane na tym samym preparacie. Połączenie obu metod pozwala tym samym na multimodalną, wieloskalową i wielowymiarową analizę próbki3. Zaletą jest to, że LM może zapewnić szeroki przegląd wielu różnych komórek, umożliwiając identyfikację subpopulacji komórkowych wykazujących ekspresję interesującego białka lub białek w heterogenicznej populacji komórek. EM przełamuje limit rozdzielczości LM, dostarczając obraz o wyższej rozdzielczości konkretnego zdarzenia wewnątrzkomórkowego. Co więcej, EM umożliwia wizualizację niefluoryzującego kontekstu subkomórkowego, w tym wszystkich organelli ograniczonych błoną, dużych kompleksów makromolekularnych (np. rybosomów, centriolów, itd.) oraz elementów cytoszkieletu, dostarczając tym samym dodatkowych informacji przestrzennych, tzw. „przestrzeni referencyjnej”6, i nadając kontekst punktowi fluorescencyjnemu wykrytemu za pomocą LM.

W ciągu ostatnich kilku lat metoda CLEM stała się potężnym narzędziem nie tylko dla biologów komórkowych5, ale także dla wirusologów (przegląd w odniesieniu7) pragnących zrozumieć złożone oddziaływania wirus-komórka, które prowadzą do skutecznej propagacji wirusa. Zrozumienie, w jaki sposób wirusy modyfikują błony komórkowe i organelle dla własnych korzyści, jest zatem kluczowe dla opracowania leków przeciwwirusowych służących do eliminacji wirusów patogennych.

Opisano tutaj metodę CLEM, która umożliwia detekcję za pomocą mikroskopii świetlnej (LM) komórek eksponujących białka wirusowe połączone z białkiem fluorescencyjnym (FP). Komórki te są następnie kriounieruchamiane i dalej przygotowywane do analizy ultrastrukturalnej za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM), aby uzyskać nową wiedzę na temat tego, w jaki sposób ekspresja tych białek reorganizuje błony wewnątrzkomórkowe (Rycina 1). W większości opublikowanych do tej pory badań wirusologicznych metoda CLEM była przeprowadzana na komórkach utrwalonych chemicznie8,9,10,1,12,13,14,15,16,17,18,19. Wynika to głównie z konieczności inaktywacji materiału zakaźnego ze względów bezpieczeństwa biologicznego w laboratoriach o poziomie bezpieczeństwa 2 i 3 (BSL-2 i BSL-3), gdzie kriounieruchomienie komórek zazwyczaj nie jest możliwe. Jednak w przypadku zagadnień wymagających optymalnej konserwacji błon komórkowych wysoce zaleca się witryfikację za pomocą mrożenia wysokociśnieniowego (HPF)20. W takich przypadkach można zastosować opisany tutaj protokół CLEM. Co ciekawe, zwłaszcza podczas pracy z próbkami zakaźnymi, HPF można przeprowadzać na próbkach, które zostały wcześniej inaktywowane chemicznie, na przykład w laboratoriach BSL-2 i BSL-3. Połączenie utrwalania chemicznego z późniejszym HPF stanowi możliwość częściowego skorzystania z zalet metod krio-konserwacji21,2.

Przygotowanie komórek do mikroskopii elektronowej: schemat procesu fiksacji, odwodnienia i sekcjonowania.
Rycina 1Schematyczny przebieg analizy komórek za pomocą CLEM (Korelacyjna mikroskopia elektronowa i świetlna). Komórki hodowane na wzorowanych dyskach szafirowych są najpierw analizowane za pomocą LM w celu zlokalizowania komórek wykazujących ekspresję FP przed ich przygotowaniem do EM. Po zlokalizowaniu komórki są natychmiast utrwalane metodą HPF i FS, a następnie zatapiane w żywicy. Po polimeryzacji żywicy podłoże, na którym rosły komórki (=dyski szafirowe), musi zostać usunięte z bloku żywicy. Blok zawierający zatopione komórki jest przycinany do kształtu małego trapezu, z którego pozostałe komórki wykazujące ekspresję FP są przecinane nożem diamentowym. Ultracienkie przekroje są zbierane na siatkach szczelinowych i poddawane dalszej analizie za pomocą TEM w celu uzyskania informacji o ultrastrukturze tych komórek. Rysunek został zaadaptowany i zmodyfikowany za zgodą autora z literatury.29. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Protokół

1. Przygotowanie strukturyzowanych dysków szafirowych do hodowli komórkowej

  1. Przenieś wzorowane krążki szafirowe (patrz Tabela materiałów), z wytrawionym na jednej z powierzchni wzorem alfanumerycznym, do stożkowej probówki do wirowania o pojemności 15 mL.
    UWAGA: Alternatywnie można zastosować konwencjonalne krążki szafirowe o grubości 0,05 mm bez wzoru alfanumerycznego, w których wzór referencyjny tworzy się poprzez powlekanie ich węglem z nałożoną na wierzchu siatką orientacyjną. W tym celu należy je oczyścić etanolem przed nałożeniem wzoru węglowego.
  2. Dokładnie przemyj je etanolem. Rozłóż je w szalce Petriego na papierze filtracyjnym i pozostaw do wyschnięcia. Umieść je na szkiełku przedmiotowym w odstępach od siebie, używając do tego wąskich, długich pęset.
  3. Sprawdź pod mikroskopem odwróconym (powiększenie 4X), czy wzór współrzędnych jest czytelny na każdym krążku szafirowym.
    UWAGA: Jeśli tak nie jest, odwróć krążki szafirowe za pomocą pęsety.
  4. Przechowuj krążki szafirowe w szalce Petriego.
    UWAGA: Na tym etapie można przerwać procedurę.

2. Hodowla komórkowa na strukturyzowanych dyskach szafirowych

  1. Sterylizować wzorowane dyski szafirowe za pomocą naświetlacza UV (crosslinkera) przez 5 min.
  2. Przenieś szafirowe krążki do komory z laminarnym przepływem powietrza przeznaczonej do hodowli komórkowych. Zesterylizuj długą pęsetę etanolem wewnątrz komory.
  3. Dodać połowę pożywki do hodowli komórkowych (patrz Tabela materiałów) do naczynia hodowlanego. Ostrożnie przenieść dyski szafirowe za pomocą długiej pęsety do naczynia hodowlanego.
  4. Zasiać 1 x 105 Komórki Huh7-Lunet, stabilnie eksponujące polimerazę T7, resuspenderowane w pozostałej połowie pożywki hodowlanej, naniesione na szalkę hodowlaną.
    UWAGA: Należy obliczyć liczbę wysiewanych komórek w taki sposób, aby w punkcie końcowym eksperymentu stopień zrastania się komórek (konfluencja) nie przekraczał 20–30%. Wysoka gęstość komórek będzie utrudniać ich relokalizację na późniejszych etapach za pomocą mikroskopu elektronowego (EM). Ponadto zbyt wysoka konfluencja może doprowadzić do odrywania się komórek od dysków szafirowych.
  5. Należy sprawdzić, czy dyski szafirowe pozostają na dnie naczynia hodowlanego oraz czy współrzędne alfanumeryczne są nadal czytelne pod mikroskopem odwróconym.
    UWAGA: Jeśli krążki pływają w pożywce hodowlanej, należy użyć długiej pęsety, aby docisnąć je do dna, a w razie potrzeby odwrócić je do prawidłowej orientacji.
  6. Przeprowadzić transfekcję komórek następnego dnia, zgodnie z opisem w cytowanych referencjach.21,23 zgodnie z instrukcją producenta odczynnika do transfekcji.

3. Obrazowanie mikroskopowe komórek rosnących na wzorowanych dyskach szafirowych

  1. Przenieś dyski szafirowe po zakończeniu eksperymentu na metalową płytkę do obrazowania zawierającą 30–50 µL/pozycję pożywki bez wskaźnika pH, aby zredukować nieswoistą fluorescencję tła.
    UWAGA: Metalowa płytka opisana tutaj (Rysunek 2) została zaprojektowana w warsztacie Europejskiego Laboratorium Biologii Molekularnej (EMBL). W przypadku braku tej płytki lub podobnej, do mikroskopii świetlnej (LM) można użyć szklanych naczyń hodowlanych z płaskim dnem. Ważne jest zastąpienie standardowej pożywki hodowlanej pożywką bez wskaźnika pH. Należy również pamiętać, że należy unikać długich czasów ekspozycji, ponieważ mogą one powodować fotoblaknięcie, prowadząc do akumulacji reaktywnych form tlenu (ROS) i uszkodzeń fizjologicznych komórek24,25.
  2. Wykonaj obrazowanie komórek przy użyciu odwróconego fluorescencyjnego mikroskopu szerokopolowego.
    UWAGA: W przypadku użycia białka znakowanego zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP), jak pokazano w reprezentatywnych wynikach, należy zastosować filtry wzbudzenia 450–490 nm i emisji 50–50 nm.
  3. Najpierw wykonaj obraz komórek przy niskim powiększeniu (10–20X), aby zlokalizować komórki wykazujące ekspresję białek fluorescencyjnych (FP). Zapisz współrzędne strukturyzowanych dysków szafirowych, na których znajdują się interesujące komórki, wykorzystując mikroskopię kontrastu interferencyjnego (DIC).
    UWAGA: Zszycie kilku obszarów może pomóc w lepszym zobrazowaniu lokalizacji interesujących komórek. Należy również pamiętać, że opcjonalnie można tutaj zastosować mikroskopię fazowo-kontrastową.
  4. Wykonaj obrazy przy dużym powiększeniu (fluorescencyjne i DIC) (63–10X, obiektywy imersyjne olejowe) tych samych komórek, aby lepiej określić subkomórkową lokalizację badanego białka w przestrzeni wewnątrzkomórkowej.
    UWAGA: Obrazy DIC dostarczają informacji kontekstowych. Informacje te są często kluczowe dla późniejszej korelacji obrazów LM z mikrografiami EM, ponieważ ostateczna korelacja jest dokładniejsza dzięki „anatomicznym” punktom orientacyjnym komórki. Ponieważ niektóre dyski szafirowe mogą pęknąć podczas krioimmobilizacji, wysoce zaleca się przygotowanie powtórzeń w trzech kopiach dla każdego stanu. Ponadto niektóre komórki odrywają się od dysków podczas mrożenia wysokociśnieniowego (HPF) i kolejnych etapów protokołu, natomiast ultrastruktura innych komórek może zawierać artefakty w wyniku uszkodzeń spowodowanych mrożeniem. Dlatego za pomocą LM należy zobrazować co najmniej dwa obszary dysków, aby upewnić się, że ostatecznie dostępna będzie wystarczająca liczba komórek do analizy. Co istotne, te dwa obszary powinny znajdować się po przeciwnych stronach dysku. W ten sposób blok żywicy, w którym zatopiono komórki, można przeciąć na pół i uzyskać przekroje z obu tych obszarów.

Proces hodowli komórkowej i przygotowania próbek: szalka Petriego, preparat metalowy, konfiguracja mikroskopowa, analiza siatki.
Rycina 2Schemat obrazowania LM komórek rosnących na wzorowanych dyskach szafirowych. (A) Dyski szafirowe przenosi się za pomocą precyzyjnego pęsety na płytkę obrazującą. (B-C) Płytka ta została specjalnie zaprojektowana w warsztacie EMBL w Heidelbergu tak, aby pasowała do mikroskopu świetlnego, w którym można obrazować dyski szafirowe w pożywce do hodowli komórek bez wskaźnika pH. Składa się ona z metalnego szkiełka o wymiarach 75 mm x 25 mm x 1 mm, w którym wywiercono wiertłem o średnicy 3 mm od czterech do pięciu otworów dopasowanych do rozmiaru dysków szafirowych. Dodatkowo po obu stronach otworów wyfrezowano małe rowki w odległości 90° kąt. Dzięki tym otworom łatwiejszy jest dostęp do krążków za pomocą pęsety podczas ich manipulowania. Aby zapewnić optymalne warunki obrazowania, pod otworami przyklejono klejem UV szkiełka nakrywkowe nr 0 (o grubości od 0,085 do 0,13 mm), a następnie utwardzono je pod wpływem światła UV. (D) Zdjęcie przy dużym powiększeniu wzorowanego dysku szafirowego, przedstawiające wyryte na jego powierzchni współrzędne alfanumeryczne. Wzorowane dyski szafirowe są dostępne w sprzedaży (patrz Tabela materiałów). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

4. Krioimmobilizacja komórek hodowanych na wzorcowanych dyskach szafirowych za pomocą HPF

  1. Umieść aluminiowe nośniki "A" i "B" do HPF (patrz Tabela materiałów) w szalce Petri z papierem filtracyjnym nasączonym 1-heksadecenem. Zanurz wzorowane dyski szafirowe zawierające komórki w szalce Petri z 1-heksadecenem.
    UWAGA: Przesuń dyski nieco, aby wypłukać pożywkę hodowlaną komórek.
  2. Złóż dyski szafirowe pomiędzy aluminiowym nośnikiem "A" i "B" w uchwycie HPF w następujący sposób (Rysunek 3B). Na spodzie umieść nośnik "B" płaską stroną skierowaną do góry. Połóż dyski szafirowe na tej płaskiej stronie komórkami skierowanymi do góry. Dodaj nośnik "A" stroną o głębokości 0,1 mm skierowaną w stronę komórek.
    UWAGA: Ponieważ wzorowane dyski szafirowe są grubsze od konwencjonalnych dysków szafirowych, dostępny komercyjnie nośnik "A" (zaprojektowany do użytku z niewzorowanymi dyskami szafirowymi o grubości 0,05 mm) musiał zostać przycięty do 0,05 mm po stronie o głębokości 0,2 mm w warsztacie EMBL, aby pasował do uchwytu HPF (Rysunek 3A). W tym celu nośnik "A" zostanie włożony do końca metalowej rurki tak, aby jego strona 0,2 mm była odsłonięta i pozostała nieruchoma podczas przycinania. Przycięta strona zostaje następnie wyszlifowana tak, aby była płaska. Alternatywnie, na górze wzorowanego dysku szafirowego można zastosować specjalny nośnik aluminiowy (dostępny komercyjnie, patrz Tabela materiałów), w którym przypadku „kanapka” HPF składa się jedynie z dysku szafirowego i tego nośnika.
  3. Zamknij uchwyt urządzenia HPF i zamroź komórki.
    UWAGA: Ten protokół jest specyficzny dla konkretnego urządzenia HPF. Alternatywnie można zastosować inne urządzenia HPF6,26. W każdym przypadku należy brać pod uwagę istnienie maszyn nowej generacji od dostawców.
    OSTROŻNIE: Należy używać gogli ochronnych i zestawu słuchawek ochronnych przed hałasem.
  4. Umieść zamrożoną „kanapkę” w polistyrenowym pudełku z ciekłym azotem do tymczasowego przechowywania.
    OSTROŻNIE: Należy używać gogli i skonsultować się z lokalnymi specjalistami ds. bezpieczeństwa, aby uzyskać informacje o potencjalnych zagrożeniach podczas pracy z ciekłym azotem.
    1. Aby uniknąć pomyłek, umieść każdą „kanapkę” w oddzielnej probówce do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL (wewnątrz polistyrenowego pudełka) oznaczonej numerem.
      UWAGA: Protokół można w tym miejscu przerwać. Jeśli substytucja zamrażania (FS) nie może zostać niezwłocznie przeprowadzona, próbki można przechowywać w probówkach kriogenicznych (z otworem w górnej części) wewnątrz pudełek umieszczonych w statywie w kriogenicznym naczyniu Dewar z ciekłym azotem (patrz Tabela materiałów). To naczynie z ciekłym azotem powinno znajdować się w pomieszczeniu z czujnikami tlenu, aby uniknąć uduszenia w przypadku niedoboru tlenu.
      OSTROŻNIE: Wszystkie poniższe procedury (kroki 5 i 6) muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ponadto większość używanych odczynników jest niebezpieczna. Przed ich użyciem obowiązkowe jest uważne zapoznanie się z Kartami Charakterystyki Materiałów dostarczonymi przez producentów, a także zapytanie specjalistów ds. bezpieczeństwa o lokalne zasady bezpiecznego obchodzenia się z nimi. W celu prawidłowej utylizacji tych zużytych materiałów, jak i właściwego użytkowania opisanego poniżej sprzętu, wymagana jest również konsultacja z lokalnymi procedurami BHP instytutu.

Schemat procesu mikrowzorowania; konfiguracja komórkowa na dysku szafirowym, szczegółowe wymiary w skali mikrometrów.
Rycina 3Schemat montażu wzorcowanych dysków szafirowych pomiędzy dwoma aluminiowymi nośnikami do HPF. (A) Przekroje nośnika konwencjonalnego typu „A”, który musi zostać docięty po głębszej stronie z 0,2 mm do 0,05 mm. (B) Szafirowy dysk o grubości 0,16 mm z wytrawionym na powierzchni wzorem alfanumerycznym montuje się w dwóch aluminiowych uchwytach do HPF w następujący sposób: dysk szafirowy umieszcza się na płaskiej stronie uchwytu „B” komórkami skierowanymi do góry. Na górze umieszcza się docięty uchwyt „A”, stroną o głębokości 0,1 mm skierowaną w stronę komórek, aby zamknąć „kanapkę HPF”. Aluminiowe uchwyty oraz szafirowe dyski ze wzorem są dostępne w sprzedaży (patrz Tabela materiałów). Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.

5. FS komórek utrwalonych kriogenicznie

  1. Napełnij urządzenie FS (patrz Tabela materiałów) za pomocą ciekłego azotu. Ustawić temperaturę na -90 °C i należy poczekać, aż urządzenie osiągnie tę temperaturę.
  2. Przygotuj pożywkę FS zawierającą 0,2% czwutlenku osmu (OsO4) (v/v), 0,1% octanu uranylu (UA) (w/v) w acetonie destylowanym w szkle, podczas chłodzenia maszyny FS.
    UWAGA: Aby przygotować (na przykład) 12 ml pożywki FS, należy wymieszać 600 µL z 4% OsO₄4z 0,012 g UA w małym naczyniu szklanym. Mieszaninę tę rozpuścić w kąpieli ultradźwiękowej przez 5 min. Za pomocą pipety dodać 1,4 ml acetonu destylowanego w szkle i dokładnie wymieszać.
  3. Napełnić probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml ilością 20-500 µL po dodaniu pożywki FS zamknąć pokrywkę i przenieść je do urządzenia FS. Odczekać 10 min do ostygnięcia pożywki FS.
  4. Przenieść zamrożone „kanapki” zawierające krążki szafirowe z komórkami z ciekłego azotu do probówek zawierających pożywkę FS, używając schłodzonej długiej pęsety.
    UWAGA: Należy używać rękawic krioprotekcyjnych i gogli ochronnych.
    UWAGA: „Kanapki” HPF mogą ulec samorzutnemu rozmontowaniu podczas manipulacji. W takim przypadku należy upewnić się, że zamrożone dyski szafirowe zostały przeniesione do probówek do mikrocentryfugi. Nośniki aluminiowe można wyrzucić.
  5. Uruchomić FS w następujący sposób aż do następnego dnia27z -90 °C do -80 °C przez 8 h; od -80 °C do -50 °C przez 8 h; od -50 °C do -20 °C przez 2 h; od -20 °C Nie dostarczono tekstu źródłowego do tłumaczenia. Proszę o przesłanie treści, którą należy przetłumaczyć. 0 °C przez 2 h.

6. Zatapianie w żywicy próbek poddanych substytucji mrożeniowej

OSTRZEŻENIE: Wszystkie opisane poniżej procedury muszą być wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Ponadto większość użytych odczynników jest niebezpieczna. Przed ich użyciem należy dokładnie zapoznać się z kartami charakterystyki materiałów (MSDS) dostarczonymi przez producentów, a także zapytać inspektorów BHP o lokalne zasady, aby zapewnić bezpieczne obchodzenie się z nimi. W celu prawidłowej utylizacji tych zużytych materiałów, jak również właściwego użytkowania opisanego poniżej sprzętu, wymagane jest również zapoznanie się z procedurami bezpieczeństwa i higieny pracy obowiązującymi w lokalnym instytucie.

  1. Wyjąć próbki poddane substytucji z urządzenia FS i umieścić je na lodzie na 20 min.
  2. Próbki pozostawić w temperaturze pokojowej przez 20 min, a następnie dokładnie przemyć (3 razy po 10 min) acetonem destylowanym w szkle. Jeśli po FS aluminiowe nośniki nadal znajdują się w probówkach do mikrocentryfugi, usunąć je za pomocą długiej pęsety.
  3. Przeprowadzić infiltrację komórek (na pozostałych dyskach szafirowych) w serii żywicy epoksydowej w czterech etapach, inkubując przez 1 h w 25%, 50% i 75% żywicy w acetonie destylowanym w szkle, a następnie inkubując przez noc w 100% żywicy. Następnego dnia wymienić żywicę 10% na 1 h.
  4. Ostrożnie umieścić dyski szafirowe w pierścieniach przepływowych zamontowanych w kąpielach z odczynnikami wypełnionych 10% żywicą. Pierścienie te służą jako formy polimeryzacyjne dla 10 dysków szafirowych.
    UWAGA: Dyski szafirowe muszą zostać całkowicie dociśnięte do dna, tak aby współrzędne były czytelne i skierowane ku górze. Można to sprawdzić za pomocą binokulara przymocowanego do wyciągu z oparów. Alternatywnie można użyć binokulara wewnątrz komory bezpieczeństwa biologicznego. Co ważne, na dnie odczynników wygrawerowane są numery (1-10), które pomagają w identyfikacji próbek. Dodatkowo w bloku żywicy można umieścić papierową etykietę identyfikacyjną próbek.
  5. Polimeryzować próbki w piecu w temperaturze 60 °C przez 48 h.

7. Usuwanie wzorcowanych dysków szafirowych z spolimeryzowanych bloków żywicy

  1. Wyjmij z pieca utwardzone bloki żywiczne zawierające komórki.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można przerwać. W przeciwnym razie należy odczekać, aż bloki ostygną do temperatury pokojowej przed ich krojeniem.
  2. Przetnij formy zatopieniowe żyletką, aby uzyskać dostęp do bloków żywicznych. Usuń cylindryczne bloki żywiczne za pomocą pęsety.
    UWAGA: Jeśli przed polimeryzacją w bloku żywicznym nie umieszczono papierowej etykiety, należy ponumerować bloki permanentnym markerem i przechowywać je w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL. W tym miejscu protokół można przerwać.
  3. Zanurz końcówkę bloku żywicznego zawierającego dysk szafirowy w pudełku polistyrenowym z ciekłym azotem, aż przestanie „bulgotać”. Następnie zanurz końcówkę bloku żywicznego w wrzącej H2O.
  4. Powtarzaj dwa poprzednie kroki tak długo, aż dysk szafirowy oddzieli się od bloku żywicznego.
    OSTRZEŻENIE: Należy używać gogli i rękawic krioprotekcyjnych.
    UWAGA: Jeśli ta metoda nie zadziała, należy użyć żyletki, aby usunąć niewielką ilość spolimeryzowanej żywicy wokół dysków przed ponowną próbą. W tym miejscu protokół można przerwać.

8. Celowane przycinanie i wykonywanie ultracienkich przekrojów do TEM

  1. Zidentyfikuj obszar na powierzchni bloku żywicznego, w którym znajdują się interesujące komórki, badając powierzchnię bloku za pomocą okularów ultramikrotomu.
    UWAGA: Na powierzchni bloku zachowany jest negatywny odcisk wzoru współrzędnych z teksturowanych dysków szafirowych. Pozwala to na identyfikację obszaru, w którym znajdują się interesujące komórki, w celu ich ukierunkowanego przycięcia. Obrazy LM muszą zostać odwrócone pionowo, aby ułatwić odnalezienie tej samej pozycji na powierzchni bloku.
  2. Przytnij zatopioną monowarstwę komórek zawierającą interesującą komórkę lub komórki do małej, płaskiej piramidy o kształcie trapezu (średnia wielkość ~ 200 µm × 250 µm) za pomocą czystej żyletki.
  3. Wykonaj ultrawcieńkie przekroje o grubości 70 nm z zatopionych komórek, używając noża diamentowego o kącie 35°.
  4. Przenieś przekroje na siatki szczelinowe do EM za pomocą ultracienkich pincet.
    UWAGA:: Należy unikać stosowania siatek o splotach pełnych, ponieważ przekroje mogłyby zostać przesłonięte przez pręty siatki.
  5. Przechowuj siatki w pudełku na siatki.
    UWAGA: W tym miejscu protokół można przerwać.

9. Analiza ultracienkich przekrojów za pomocą TEM

  1. Umieść siatkę z otworami w uchwycie transmisyjnego mikroskopu elektronowego. Wykonaj obrazy przy niskim powiększeniu (przeglądowe), na których widoczny jest kompletny profil badanej komórki.
    UWAGA: Badane komórki można odnaleźć ponownie, wykorzystując profile komórek oraz ich wzajemne położenie jako punkty odniesienia, porównując je z widokami DIC uzyskanymi wcześniej za pomocą mikroskopii świetlnej (LM).
  2. Wykonaj obrazy przy wysokim powiększeniu badanych komórek, aby spróbować zidentyfikować na poziomie ultrastrukturalnym cechy odpowiadające sygnałom fluorescencyjnym zaobserwowanym wcześniej w LM.
    UWAGA: Przy wysokim powiększeniu można uzyskać obrazy montażowe, aby otrzymać wysokorozdzielczy przegląd badanych komórek. Ponadto często konieczne jest wykonanie obrazów tej samej komórki w kolejnych sekcjach seryjnych, aby umożliwić rekonstrukcję 3D komórki przed porównaniem jej z obrazami fluorescencyjnymi.

Wyniki

Stosując procedurę przedstawioną w niniejszym opracowaniu (Rysunek 1), komórki Huh7-Lunet stabilnie wykazujące ekspresję polimerazy RNA T7 wysiano na wzorcowanych dyskach szafirowych, a następnie transfectedowano plazmidem wykazującym ekspresję dwóch domen białka niestrukturalnego NS5A wirusa zapalenia wątroby typu C (HCV), znakowanych GFP (pTM_AH-D1-GFP) (Rysunek 4). Następnego dnia wzorcowane dyski szafirowe, na których rosły komórki, wyjęto z naczyń hodowlanych i zobrazowano za pomocą LM (Rysunek 4, Rysunek 2). Komórki wykazujące ekspresję AH-D1-GFP zidentyfikowano po obecności zielonej fluorescencji w cytozolu i zarejestrowano, aby zapisać ich pozycje w układzie współrzędnych wzorca dysków szafirowych (Rysunki 5A, 5B). Bezpośrednio po badaniu LM dyski szafirowe zawierające interesujące komórki umieszczono pomiędzy dwoma aluminiowymi nośnikami (Rysunek 3) i poddano krioimmobilizacji metodą HPF. Następnie komórki poddano substytucji mrożenia, a w dalszej kolejności zatopiono w żywicy epoksydowej.

Po usunięciu dysków szafirowych z spolimeryzowanych bloków żywicznych, na powierzchni bloku widoczny był odcisk wzoru alfanumerycznego, co pozwoliło na zlokalizowanie obszarów, w których znajdowały się interesujące nas komórki. Pozostałą część bloku żywicznego odcięto, aby otrzymać mały trapez zawierający poszukiwane komórki. Z tego trapezu wykonano seryjne ultracienkie przekroje, które zebrano na siatkach do slotów EM i poddano dalszej analizie za pomocą TEM (Rycina 5C). Należy zauważyć, że uzyskanie seryjnych przekrojów metodą manualną, choć możliwe28, jest pracochłonne i wymaga dobrze przeszkolonego oraz wykwalifikowanego personelu. Istotne jest również, aby komórki miały niską konfluencję podczas stosowania tego protokołu CLEM (Rycina 5A), aby zagwarantować szybkie rozpoznanie tej samej komórki, która została wcześniej zidentyfikowana za pomocą LM. W przeciwnym razie wyższa konfluencja komórek mogłaby znacznie spowolnić proces pomyślnego lokalizowania komórek na poziomie EM.

Analiza TEM kilku ultracienkich przekrojów analizowanej komórki (Rycina 5D, 5E), wykazującej ekspresję AH-D1-GFP, ujawniła obecność w przestrzeni wewnątrzkomórkowej dużych skupisk pęcherzyków o zróżnicowanej morfologii, oddzielonych od otaczającego cytozolu pojedynczą dwuwarstwą lipidową (Rycina 5E).

Schemat edycji genu HCV, przedstawiający ekspresję polimerazy RNA T7, proces transfekcji oraz analizę wyników.
Rysunek 4Schematyczny przedstawienie przebiegu prac w celu wykonania przykładu CLEM przedstawionego w Rycina 5. Komórki Huh7-Lunet stabilnie wykazujące ekspresję polimerazy RNA T7 zostały przetransfekowane plazmidem DNA kodującym amfipatyczną helisę (AH) oraz domenę 1 (D1) białka NS5A HCV, z GFP przyłączonym do końca C-końcowego (pTM_AH-D1-GFP). Ekspresja tej części białka NS5A jest kontrolowana transkrypcyjnie przez promotor T7 (T7 Pm), a translacyjnie przez element IRES (wewnętrzna sekwencja wejścia rybosomu) wirusa zapalenia mięśnia sercowo-mózgowego (EMCV), wskazaną przez strukturę drugorzędową. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji (24 hpt) komórki rosnące na wzorcowanych dyskach szafirowych i wykazujące ekspresję AH-D1-GFP zostały wykryte za pomocą LM, a następnie poddane analizie HPF-FS. Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.

Obrazy z mikroskopii jądra komórkowego, schemat przedstawiający przekroje komórkowe, analiza struktur podkomórkowych, skala nm.
Rysunek 5Przykład procedury CLEM. (A) Komórki Huh7-Lunet stabilnie eksponujące polimerazę T7, analizowane za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu wyznaczenia komórek GFP-dodatnich hodowanych na strukturyzowanych dyskach szafirowych, 24 h po transfekcji plazmidem pTM_AH-D1-GFP. (B) Obraz o większym powiększeniu pojedynczej komórki wybranej wewnątrz białego przerywanego prostokąta do analizy metodą CLEM. (C) Obraz TEM ultracienkiego przekroju tej samej komórki po HPF, FS i zatopieniu w żywicy. (D) Schematyczne przedstawienie seryjnych ultracienkich przekrojów o grubości 70 nm na siatce EM z nacięciem, zawierających badaną komórkę. (E) Po lewej: przekroje TEM dwóch sekcji badanej komórki. Po prawej: obrazy TEM o dużym powiększeniu obszarów wewnątrzkomórkowych zaznaczonych żółtymi prostokątami po lewej stronie, ukazujące liczne pęcherzyki oddzielone od cytozolu pojedynczą błoną. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metodologia CLEM w celu zbadania wpływu ekspresji białka wirusa na błony komórkowe była już z powodzeniem stosowana do wyjaśnienia struktur związanych z replikacją HCV, głównie pęcherzyków z podwójną błoną (DMV)21, a także do określenia krytycznych elementów budulcowych wymaganych do utworzenia tych struktur indukowanych przez HCV23. Należy zauważyć, że w naszej pierwszej pracy z wykorzystaniem CLEM do badania replikacji HCV21 zastosowano nieco zmodyfikowaną wersję opisanego tutaj protokołu. W tym badaniu użyto konwencjonalnych krążków szafirowych o grubości 0,05 mm, bez wzoru alfanumerycznego, w których wzór referencyjny został utworzony poprzez pokrycie ich węglem z siatką szukacza na górze (patrz tabela materiałów). Ta wersja obecnego protokołu może być ostatecznie zastosowana, z tą zaletą, że nośnik "A" dla HPF może być używany bezpośrednio, bez konieczności jego skracania, jak na rysunku 3A. Alternatywnie, jak wspomniano w protokole, można zastosować grubszy nośnik "A" (patrz tabela materiałów) z wzorzystymi dyskami szafirowymi, bez potrzeby stosowania nośnika "B".

Co ciekawe, protokół ten może być stosowany nie tylko do badania próbek BSL-1, takich jak komórki transfekowane białkami wirusowymi, jak opisano tutaj i gdzie indziej19,23, ale także do badania komórek zakażonych wirusem. Chociaż praca z ludzkimi patogenami jest zwykle ograniczona do laboratoriów BSL-2 i BSL-3, w niektórych krajach nadal możliwe jest przeprowadzenie krioimmobilizacji w tych warunkach bezpieczeństwa biologicznego. W laboratoriach BSL-2 i BSL-3, w których witryfikacja nie jest możliwa ze względu na lokalne przepisy lub brak maszyny HPF, komórki zakażone wirusem można nadal przygotować tą metodą, jeśli chemiczne wiązanie aldehydami zostanie przeprowadzone wcześniej, a mianowicie przed opuszczeniem obiektów BSL-2 lub BSL-3. Co więcej, aldehydy muszą być schładzane natychmiast po utrwaleniu, aby utrzymać fluorescencję, podczas gdy reszta protokołu jest identyczna z opisaną tutaj. Technikę tę można uznać za zbędną, ponieważ komórki są utrwalane dwukrotnie, chemicznie i poprzez witryfikację. Jednak ten protokół podwójnej fiksacji prowadzi rzeczywiście do znacznie lepszego zachowania DMV indukowanych przez HCV w porównaniu z DMV znajdującymi się w komórkach poddanych samej fiksacji chemicznej21.

W celu dalszych modyfikacji i rozwiązywania problemów czytelnik jest odsyłany do notatek w całej części protokołu tego rękopisu. Uwagi te opisują pułapki, których należy unikać, a także alternatywy pozwalające przezwyciężyć przypuszczalne trudności, które mogą pojawić się podczas wykonywania tej metody.

Głównym warunkiem zastosowania tej techniki jest maszyna HPF. Gdy krioimmobilizacja komórek za pomocą HPF nie jest możliwa (z powodu braku maszyny HPF) lub nie jest wymagana (gdy konserwacja membrany nie musi być optymalna), komórki można chemicznie utrwalić, a następnie przygotować i przeanalizować za pomocą EM 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,Rozdział 18,19. Ta opcja nie wymaga użycia szafirowych krążków, ale naczyń do hodowli komórkowych z wzorami w siatkę do przenoszenia komórek lub klastrów komórek. Główną zaletą zastosowania tych szalek jest ich większa średnica w porównaniu do krążków szafirowych, pozwalająca na przesiewanie większych powierzchni. W związku z tym zastosowanie tego protokołu CLEM zostało z powodzeniem zastosowane do badania wpływu związku przeciwwirusowego przeciwko HCV15 lub do wizualizacji przegrupowań błon indukowanych przez niestrukturalne białka norowirusów19. Innym problemem, który może ograniczać wydajność tej metody, jest brak komercyjnego urządzenia FS. W takim przypadku zamiast tego można wykorzystać podstawowe domowe systemy FS. Chociaż automatyczne urządzenia FS mogą zmniejszyć liczbę nieszczęśliwych wypadków, urządzenia domowej roboty są z powodzeniem używane, na przykład w laboratoriach Kent McDonald's30 i Paul Walther.

Jeśli chodzi o wiązanie chemiczne, opisany tutaj protokół zapewnia optymalne zachowanie struktur wewnątrzkomórkowych20. W związku z tym, w przypadku, gdy dostępne są wyżej wymienione urządzenia HPF i FS, preferowane byłoby witryfikowanie interesujących komórek.

Przyszłe alternatywy dla tego podejścia CLEM obejmują możliwość wykorzystania tej metody nie tylko do pozyskiwania informacji 2D na poziomie ultrastrukturalnym, ale także do uzyskiwania informacji 3D na temat architektury zmian błon i organelli spowodowanych przez wirusy. Metody 3D-EM, w tym tomografia elektronowa (ET) i mikroskopia elektronowa ze skaningową wiązką jonów (FIB-SEM) (obszernie opisane w29), mogą być również stosowane do komórek, które zostały przygotowane zgodnie z tym obecnym protokołem21,31. Ponadto informacje 3D można było również uzyskać na poziomie LM, przy użyciu mikroskopu konfokalnego, który pozwala na akwizycję stosów z. W rzeczywistości ta opcja jest wysoce zalecana, gdy pożądana jest precyzyjna korelacja między zestawami danych LM i EM (patrz przykład17). Informacje zawarte w stosach z 3D pomagają poprawić korelację z obrazami TEM 2D. Tak więc w takim scenariuszu można wybrać najlepiej pasujące obrazy LM i EM, a następnie poddać je jednemu z dostępnych programów do korelacji, takich jak wtyczka ec-CLEM ICY (http://icy.bioimageanalysis.org/)32 lub wtyczka Landmark Correspondences Image J (http://imagej.net/Landmark_Correspondences), co skutkuje generowaniem nakładających się obrazów LM-EM.

Gdy informacje czasowe są potrzebne do zrozumienia kinetyki określonego zdarzenia, obrazowanie poklatkowe może być wykorzystane do monitorowania dynamiki żywych komórek w połączeniu z EM. Podczas interesującego zdarzenia komórki są natychmiast naprawiane, generując "zamrożoną migawkę", która może być następnie analizowana przez EM, dostarczając szczegółowych informacji ultrastrukturalnych o tym konkretnym momencie w momencie unieruchomienia. Aby uzyskać tę "zamrożoną migawkę", po obserwacji w czasie rzeczywistym, komórki mogą być albo chemicznie utrwalone33, albo unieruchomionekriologicznie6. Ponieważ wiele procesów komórkowych zachodzi szybciej niż procesy dyfuzji wiązania chemicznego, jeśli to możliwe, należy przeprowadzić ultraszybkie zamrażanie. Należy jednak wziąć pod uwagę, że maszyny HPF różnią się efektywną rozdzielczością czasową34.

Ponadto, chociaż protokół ten został opracowany do osadzania komórek w żywicy epoksydowej, ogniwa mogą być również zatopione w żywicach o niskiej lepkości, takich jak Lowicryls, LR White lub LR Gold. Zastosowanie tych pożywek do zatapiania pozwala na zachowanie antygenowości 35,36, a także fluorescencji37,38 i dlatego są one najczęściej stosowane do poosadzania w sekcjiznakowania immunologicznego 39,40 i CLEMw sekcji 41,42,43,44, gdzie LM jest wykonywany po osadzeniu. Oba podejścia (immuno-EM i CLEM w sekcji) muszą być kluczowe dla tych doświadczeń, w których niecharakterystyczne struktury można łatwo znaleźć za pomocą TEM i/lub jako kontrolę przeciwko błędnej korelacji między sygnałami LM i EM. Podobnie, znakowanie przeciwciałami, które można uwidocznić za pomocą obu metod obrazowania (LM i EM), można przeprowadzić45 w celu, na przykład, identyfikacji transfekowanych komórek w LM (etap wstępnego osadzania) i uzyskania znacznie dokładniejszej lokalizacji sygnału GFP poprzez jego specyficzne znakowanie przez immuno-EM (etap po osadzeniu). Należy jednak wziąć pod uwagę, że przepuszczalność jest przeprowadzana przed LM, aby umożliwić dostęp przeciwciał do przestrzeni wewnątrzkomórkowej, co może skutkować nieoptymalnym zachowaniem architektury komórki na poziomie EM. Co ciekawe, protokół ten doskonale nadaje się również do eksperymentów wielokolorowych, które można osiągnąć przy użyciu innych znaczników fluorescencyjnych, innych niż GFP (jak pokazano tutaj). Podsumowując, istnieje wiele przypuszczalnych możliwości dostosowania tego protokołu, zarówno po stronie LM, jak i po stronie EM, w zależności od pytań, które są poruszane. W celu uzyskania wyczerpującego opisu innych alternatywnych protokołów czytelnik jest odsyłany do 5,46. Niezależnie od tego, w jaki sposób połączone zostaną metody mikroskopii, razem uzyskamy informacje, które pozwolą nam lepiej zrozumieć, w jaki sposób wirusy i ich białka oddziałują ze swoimi gospodarzami w prawdziwym życiu.

Najważniejszym krokiem w tej metodzie jest zebranie odcinków szeregowych z interesujących komórek. Jak podkreślono w sekcji dotyczącej reprezentatywnych wyników, wymaga to doświadczonego personelu, a także dużej cierpliwości. Co ważne, ten krok jest niezbędny, aby znaleźć ogniwa z powrotem na poziomie EM z dwóch powodów. Po pierwsze, w tego rodzaju protokole CLEM wykorzystującym wstępne zatapianie LM, współrzędne są widoczne tylko na poziomie LM i na powierzchni bloku żywicy po osadzeniu. Nie będą one jednak widoczne na sekcjach TEM. Dlatego ukierunkowane przycinanie bloku zadrukowaną stroną do dołu do obszarów zainteresowania (ROI) musi być wykonywane ostrożnie za pomocą żyletki, aby upewnić się, że uzyskane następnie sekcje zawierają komórki wyrażające daną FP. Po drugie, konieczne jest "przeskanowanie" kilku sekcji, aby znaleźć najlepszą nakładkę między LM a akwizycjami EM. W przeciwieństwie do metod, w których LM jest wykonywany na etapie po zasadzeniu, w tym przypadku nakładka LM-EM nie jest tak precyzyjna. Niska dokładność nakładania wynika z różnic w rozdzielczości osiowej między LM i EM, skurczu podczas przetwarzania próbki EM i ściskania podczas cięcia42. Niemniej jednak skuteczne metody śledzenia, takie jak wykorzystanie punktów orientacyjnych, pomagają odzyskać komórki. Obejmuje to położenie jednej komórki względem drugiej, a także kształt komórek i ich jądra. W związku z tym, jak wyjaśniono w protokole, obrazy DIC dostarczają "anatomicznych" informacji o komórkach, które mają kluczowe znaczenie dla poprawy korelacji. Alternatywnie, jądra lub inne dobrze rozpoznawalne organelle komórkowe (takie jak mitochondria lub kropelki lipidów) mogą być barwione przed LM i wykorzystywane jako punkty orientacyjne.

Na koniec warto wspomnieć, że chociaż manuskrypt ten koncentruje się na wykorzystaniu tej techniki do badań wirusologicznych, zakres tego projektu eksperymentalnego może zostać rozszerzony, aby zająć się bardziej ogólnymi kwestiami biologicznymi.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Jesteśmy bardzo wdzięczni pracownikom Electron Microscopy Core Facilities (EMCF) w EMBL (Heidelberg) oraz na Uniwersytecie w Heidelbergu. Chcielibyśmy również podziękować Ulrike Herian, Stephanie Kallis i Andrei Hellwig (Uniwersytet w Heidelbergu), a także Eberhardtowi Schmidtowi i Renate Kunz (Uniwersytet w Ulm) za fachową pomoc techniczną. Prace R.B. i jego zespołu (U.H. i I.R.-B.) były wspierane przez Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB1129, TP11 i TRR83, TP13.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Sieciownik UVStratagene400072Stratalinker 1800, 230 Vac, wyposażony w żarówki UV 254 nm, 8 Watt/każda.
Wzorzyste krążki szafiroweBiuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria627Mają średnicę 0,3 mm i grubość 0,16 mm, a także wytrawiony wzór alfanumeryczny, aby umożliwić zmianę lokalizacji komórek. Można je zamawiać tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Wąska i długa pęsetaElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA72919-SS"Style SS", do obsługi krążków szafirowych.
Pożywka do hodowli komórkowychThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA41965-062Zmodyfikowana pożywka Eagle firmy Dulbecco (DMEM) uzupełniona 2 mM L-glutaminą, aminokwasami endogennymi, 100 jednostkami penicyliny na ml, 100 i mikro; g streptomycyny na ml i 10% płodowej surowicy cielęcej (DMEM kompletne, patrz poniżej). Opakowanie zawierające 10 butelek po 500 ml każda.
L-glutaminaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA25030-123Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.
Aminokwasy endogenneThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA11140-068Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.
Penicylina/StreptomycynaThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA15140-163Opakowanie zawierające 20 butelek po 100 ml każda.
Surowica cielęca płoduSigma Aldrich, St. Louis, MI, USAF7524Butelka 50 ml
Mikroskop odwróconyOlympus Deutschland, Hamburg, NiemcyCKX41Jest to mikroskop odwrócony z opcjami głowicy trójokularowej i możliwością ulepszania fluorescencji.
Komórki Huh7-Lunet stabilnie eksprymujące polimerazę RNA T7Dostępne w laboratorium prof. dr Ralfa BartenschlageraNiedostępneSkontaktuj się z prof. Bartenschlagerem pod adresem: ralf.bartenschlager@med.uni-heidelberg.de.
Odczynnik do transfekcji Mirus TransIT-LT1Mirus Bio LLC, Madison, USAMIR 2304Szerokie spektrum, niska toksyczność, odczynnik do transfekcji DNA. Fiolka 0,4 ml
Odwrócony szerokokątny mikroskop fluorescencyjnyCarl Zeiss Microscopy GmbH, NiemcyZeiss Observer.Z1Odwrócony mikroskop fluorescencyjny do eksperymentów z udziałem żywych kultur komórkowych.
1-heksadecenMerck, Darmstadt, Niemcy8220640100Butelka 100 ml
Aluminiowe uchwyty "A" do obróbki wysokociśnieniowej (HPF)Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria241Jest to uchwyt, który został użyty w tym protokole i ma 2 różne głębokości 0,1 i 0,2 mm. Można go zamówić tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Uchwyty aluminiowe "B" dlaBiura Inżynieryjnego HPF M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria242Jest to uchwyt, który został użyty w tym protokole. Ma grubość 0,3 mm. Można je zamawiać tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Aluminiowy uchwyt "A" do HPF (specjalny do pracy z wzorzystymi tarczami szafirowymi)Biuro inżynierskie M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria737Jest to uchwyt, który może być używany samodzielnie z wzorzystym dyskiem szafirowym (jako alternatywa dla obecnego protokołu), bez potrzeby posiadania uchwytu "B" lub edycji uchwytu "A". Ma grubość 0,84 mm. Można go zamówić tylko na e-mail: martin-wohlwend@bluewin.ch.
Tarcze szafiroweBiuro Inżynieryjne M. Wohlwend, Sennwald, Szwajcaria405Te szafirowe krążki są "konwencjonalne", o średnicy 0,3 mm i grubości 0,05 mm . Mogą być również używane do CLEM jako alternatywa zamiast wzorzystych krążków szafirowych.
Siatki szukaczaMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, Filadelfia, USALF135-Cu135 są używane do tworzenia alfanumerycznego wzoru na "konwencjonalnych" krążkach szafirowych (opisanych powyżej) poprzez powlekanie węglowe, dzięki czemu można je stosować do CLEM. 100 siatek/fiolkę.
Maszyna HPFABRA Fluid AG, Widnau, Szwajcaria HPM010Ta maszyna HPF została użyta do tego protokołu.
Maszyna HPFLeica Microsystems, Wiedeń, AustriaEMPACT 2"EMPACT 2", jako alternatywa dla korzystania z maszyny HPM, że została ona użyta w tym protokole (opisanym powyżej).
KriorurkiThermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USAZ763667-500EADo długotrwałego przechowywania próbek unieruchomionych kriomobilizacją w ciekłym azocie. Opakowanie zawierające 500 kriowialiów.
Ciekły azot dewarCole-Parmer GmbH, Wertheim, NiemcyGZ-05094-60Do długotrwałego przechowywania próbek unieruchomionych kriomobilizacją w ciekłym azocie, wyposażony w krio-stojaki o pojemności 1600 krioprobówek.
Automatyczna maszyna do substytucji przez zamrażanie (AFS)Leica Microsystems, Wiedeń, AustriaEM AFS2Ta maszyna wykonuje techniki substytucji przez zamrażanie i progresywne obniżanie temperatury (PLT) oraz umożliwia zatapianie i polimeryzację żywic w niskiej temperaturze.
Tetratlenek osmu (OsO4)Mikroskopiaelektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA191504% roztwór wodny, jedno pudełko zawierające 10 x 2 ml ampułek.
Octan uranu (UA)Serva, Heidelberg, Niemcy77879.01Butelka zawierająca 25 gr (UA)-2 H2O.
SonicatorBandelin Electronic, Berlin, Niemcy329"Sonorex Super RK 31" to ultradźwiękowa kąpiel czyszcząca o dużej mocy do wodnego roztworu czyszczącego, która jest używana w tym protokole do mieszania OsO4 i Ua podczas przygotowywania podłoża FS.
Aceton destylowany szkłemMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA10015Butelka 100 ml
Mikroskop stereoskopowyLeica Microsystems, Wiedeń, AustriaLeica M80Rutynowy mikroskop stereoskopowy do codziennych inspekcji, wyposażony w kamerę do robienia zdjęć.
Żywica epoksydowaElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA14120Embed 812 to zestaw zawierający kilka składników, które należy ze sobą wymieszać w proporcjach podanych przez producentów.
Pierścienie przepływoweLeica Microsystems, Wiedeń, Austria16707157Opakowanie zawierające 100 sztuk.
Kąpiele odczynnikoweLeica Microsystems, Wiedeń, Austria16707154Opakowanie zawierające 100 sztuk.
UltramikrotomLeica Microsystems, Wiedeń, AustriaLeica EM UC7Ultramikrotom do przygotowywania pół- i ultracienkich przekrojów w temperaturze pokojowej.
Nóż diamentowy Ultra 35 °.Diatome Ltd., Nidau
Szwajcaria		AGG339-735Ten nóż ma krawędź o długości 3 mm.
Ultracienka pęsetaElectron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USAE78318"Style 3X", do obsługi siatek EM.
Siatki szczelinowe EMMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USAG2010-Cu100 siatki / fiolkę.
Skrzynka do przechowywania siatki EMMikroskopia elektronowa Sciences, Hatfield, PA, USA71155Ma pojemność na 100 siatek.
Te siatki o siatce

Bibliografia

  1. Morgan, C., Godman, G. C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. I. Electron microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 373-382 (1960).
  2. Godman, G. C., Morgan, C., Breitenfeld, P. M., Rose, H. M. A correlative study by electron and light microscopy of the development of type 5 adenovirus. II. Light microscopy. Journal of Experimental Medicine. 112, 383-402 (1960).
  3. Caplan, J., Niethammer, M., Taylor, R. M., Czymmek, K. J. The power of correlative microscopy: multi-modal, multi-scale, multi-dimensional. Current Opinion in Structural Biology. 21, 686-693 (2011).
  4. de Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up. Nature Methods. 12, 503-513 (2015).
  5. Müller-Reichert, T., Verkade, P. Correlative light and electron microscopy III, First edition. , Elsevier/Academic Press. Cambridge, MA. (2017).
  6. Brown, E., Mantell, J., Carter, D., Tilly, G., Verkade, P. Studying intracellular transport using high-pressure freezing and Correlative Light Electron Microscopy. Seminars in Cell and Developmental Biology. 20, 910-919 (2009).
  7. Bykov, Y. S., Cortese, M., Briggs, J. A., Bartenschlager, R. Correlative light and electron microscopy methods for the study of virus-cell interactions. FEBS Letters. , (2016).
  8. Spuul, P., et al. Assembly of alphavirus replication complexes from RNA and protein components in a novel trans-replication system in mammalian cells. Journal of Virology. 85, 4739-4751 (2011).
  9. Nagel, C. H., Dohner, K., Binz, A., Bauerfeind, R., Sodeik, B. Improper tagging of the non-essential small capsid protein VP26 impairs nuclear capsid egress of herpes simplex virus. PLoS One. 7, 44177(2012).
  10. Sharma, M., Kamil, J. P., Coughlin, M., Reim, N. I., Coen, D. M. Human cytomegalovirus UL50 and UL53 recruit viral protein kinase UL97, not protein kinase C, for disruption of nuclear lamina and nuclear egress in infected cells. Journal of Virology. 88, 249-262 (2014).
  11. Kallio, K., et al. Template RNA length determines the size of replication complex spherules for Semliki Forest virus. Journal of Virology. 87, 9125-9134 (2013).
  12. Martinez, M. G., Snapp, E. L., Perumal, G. S., Macaluso, F. P., Kielian, M. Imaging the alphavirus exit pathway. Journal of Virology. 88, 6922-6933 (2014).
  13. Lebrun, M., et al. Varicella-zoster virus induces the formation of dynamic nuclear capsid aggregates. Virology. 454-455, 311-327 (2014).
  14. Madela, K., et al. A simple procedure to analyze positions of interest in infectious cell cultures by correlative light and electron microscopy. Methods in Cell Biology. 124, 93-110 (2014).
  15. Berger, C., et al. Daclatasvir-like inhibitors of NS5A block early biogenesis of hepatitis C virus-induced membranous replication factories, independent of RNA replication. Gastroenterology. 147, 1094-1105 (2014).
  16. van der Schaar, H. M., et al. Illuminating the Sites of Enterovirus Replication in Living Cells by Using a Split-GFP-Tagged Viral Protein. mSphere. 1, (2016).
  17. Vale-Costa, S., et al. Influenza A virus ribonucleoproteins modulate host recycling by competing with Rab11 effectors. Journal of Cell Science. 129, 1697-1710 (2016).
  18. Wang, L., et al. Visualization of HIV T Cell Virological Synapses and Virus-Containing Compartments by Three-Dimensional Correlative Light and Electron Microscopy. Journal of Virology. 91, (2017).
  19. Doerflinger, S. Y., et al. Membrane alterations induced by nonstructural proteins of human norovirus. PLOS Pathogens. 13, 1006705(2017).
  20. Dahl, R., Staehelin, L. A. High-pressure freezing for the preservation of biological structure: theory and practice. Journal of Electron Microscopy Technique. 13, 165-174 (1989).
  21. Romero-Brey, I., et al. Three-dimensional architecture and biogenesis of membrane structures associated with hepatitis C virus replication. PLOS Pathogens. 8, 1003056(2012).
  22. Sosinsky, G. E., et al. The combination of chemical fixation procedures with high pressure freezing and freeze substitution preserves highly labile tissue ultrastructure for electron tomography applications. Journal of Structural Biology. 161, 359-371 (2008).
  23. Romero-Brey, I., et al. NS5A Domain 1 and Polyprotein Cleavage Kinetics Are Critical for Induction of Double-Membrane Vesicles Associated with Hepatitis C Virus Replication. MBio. 6, 00759(2015).
  24. Dixit, R., Cyr, R. Cell damage and reactive oxygen species production induced by fluorescence microscopy: effect on mitosis and guidelines for non-invasive fluorescence microscopy. The Plant Journal. 36, 280-290 (2003).
  25. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Annals of the New York Academy of Sciences. 1011, 45-56 (2004).
  26. McDonald, K. L., Morphew, M., Verkade, P., Muller-Reichert, T. Recent advances in high-pressure freezing: equipment- and specimen-loading methods. Methods in Molecular Biology. 369, 143-173 (2007).
  27. Walther, P., Ziegler, A. Freeze substitution of high-pressure frozen samples: the visibility of biological membranes is improved when the substitution medium contains water. Journal of Microscopy. 208, 3-10 (2002).
  28. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1-340 (1986).
  29. Romero-Brey, I., Bartenschlager, R. Viral Infection at High Magnification: 3D Electron Microscopy Methods to Analyze the Architecture of Infected Cells. Viruses. 7, 6316-6345 (2015).
  30. McDonald, K. L., Webb, R. I. Freeze substitution in 3 hours or less. Journal of Microscopy. 243, 227-233 (2011).
  31. Villinger, C., Neusser, G., Kranz, C., Walther, P., Mertens, T. 3D Analysis of HCMV Induced-Nuclear Membrane Structures by FIB/SEM Tomography: Insight into an Unprecedented Membrane Morphology. Viruses. 7, 5686-5704 (2015).
  32. Paul-Gilloteaux, P., et al. eC-CLEM: flexible multidimensional registration software for correlative microscopies. Nature Methods. 14, 102-103 (2017).
  33. Polishchuk, R. S., Mironov, A. A. Correlative video light/electron microscopy. Current Protocols in Cell Biology Supplement. , Chapter 4, Unit 4 8(2001).
  34. McDonald, K. L. A review of high-pressure freezing preparation techniques for correlative light and electron microscopy of the same cells and tissues. Journal of Microscopy. 235, 273-281 (2009).
  35. Newman, G. R., Jasani, B., Williams, E. D. A simple post-embedding system for the rapid demonstration of tissue antigens under the electron microscope. The Histochemical Journal. 15, 543-555 (1983).
  36. Schwarz, H., Humbel, B. M. Influence of fixatives and embedding media on immunolabelling of freeze-substituted cells. Scanning Microscopy. 3, Supplement. Discussion 63-54 57-63 (1989).
  37. Luby-Phelps, K., Ning, G., Fogerty, J., Besharse, J. C. Visualization of identified GFP-expressing cells by light and electron microscopy. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 51, 271-274 (2003).
  38. Nixon, S. J., et al. A single method for cryofixation and correlative light, electron microscopy and tomography of zebrafish embryos. Traffic. 10, 131-136 (2009).
  39. McDonald, K. L. Rapid embedding methods into epoxy and LR White resins for morphological and immunological analysis of cryofixed biological specimens. Microscopy and Microanalysis. 20, 152-163 (2014).
  40. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods in Cell Biology. 88, 45-58 (2008).
  41. Kukulski, W., et al. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. Journal of Cell Biology. 192, 111-119 (2011).
  42. Peddie, C. J., et al. Correlative and integrated light and electron microscopy of in-resin GFP fluorescence, used to localise diacylglycerol in mammalian cells. Ultramicroscopy. 143, 3-14 (2014).
  43. Hampoelz, B., et al. Pre-assembled Nuclear Pores Insert into the Nuclear Envelope during Early Development. Cell. 166, 664-678 (2016).
  44. Lemercier, N., et al. Microtome-integrated microscope system for high sensitivity tracking of in-resin fluorescence in blocks and ultrathin sections for correlative microscopy. Scientific Reports. 7, 13583(2017).
  45. Takizawa, T., Powell, R. D., Hainfeld, J. F., Robinson, J. M. FluoroNanogold: an important probe for correlative microscopy. Journal of Biological Chemistry. 8, 129-142 (2015).
  46. Romero-Brey, I. 3D electron microscopy (EM) and correlative light electron microscopy (CLEM) methods to study virus-host interactions. Methods in Molecular Biology: Influenza Virus Methods & Protocols. Yamauchi, Y. , Springer. (2018).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Mrożenie pod wysokim ciśnieniembiałka fluorescencyjnetransmisyjna mikroskopia elektronowasubstytucja zamrażaniazatapianie w żywicydyski szafiroweśledzenie białek wirusowychzastosowania w biologii komórki
Korelacyjna mikroskopia świetlno-elektronowa (CLEM) do śledzenia i obrazowania struktur związanych z białkami wirusowymi w komórkach unieruchomionych kriogenicznie
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.