Artykuł metodologiczny

Unieruchomienie płuc pod stałym ciśnieniem w celu oceny rozedmy płuc u myszy

DOI:

10.3791/58197

⸱

26 września 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Respiratory Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Juntendo University, 2Pharmaceutical Planning Group, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Prezentowany tutaj jest użyteczny protokół do unieruchomienia płuc, który tworzy stabilne warunki do oceny histologicznej próbek płuc z mysiego modelu rozedmy płuc. Główną zaletą tego modelu jest to, że może naprawić wiele płuc przy tym samym stałym ciśnieniu bez zapadania się płuc lub opróżniania.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozedma płuc jest istotną cechą przewlekłej obturacyjnej choroby płuc (POChP). Badania z udziałem mysiego modelu rozedmy płuc wymagają optymalnego ustabilizowania płuc w celu uzyskania wiarygodnych próbek histologicznych płuc. Ze względu na charakter składu strukturalnego płuc, który składa się w dużej mierze z powietrza i tkanki, istnieje ryzyko, że zapadnie się lub opróżni podczas procesu utrwalania. Istnieją różne metody unieruchamiania płuc, z których każda ma swoje zalety i wady. Przedstawiona tutaj metoda fiksacji płuc wykorzystuje stałe ciśnienie, aby umożliwić optymalną ocenę tkanki w badaniach z wykorzystaniem modelu płuc myszy z rozedmą płuc. Główną zaletą jest to, że może naprawić wiele płuc z tym samym schorzeniem w tym samym czasie. Próbki płuc uzyskuje się od myszy narażonych na przewlekły dym papierosowy. Zespolenie płuc wykonuje się za pomocą specjalistycznego sprzętu, który umożliwia wytwarzanie stałego ciśnienia. To stałe ciśnienie utrzymuje płuca w rozsądnie napompowanym stanie. W ten sposób metoda ta generuje histologiczną próbkę płuc, która jest odpowiednia do oceny łagodnej rozedmy płuc wywołanej dymem papierosowym.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

POChP jest jedną z głównych przyczyn zgonów na świecie1. Dym papierosowy jest najważniejszą przyczyną POChP, ale mechanizmy patogenezy pozostają nie do końca poznane. POChP wykazuje dwie główne cechy, w tym postępujące ograniczenie przepływu powietrza i nieprawidłową odpowiedź zapalną płuc. Rozedma płuc często występuje w płucach pacjentów z POChP2. Patologiczne zmiany rozedmy płuc charakteryzują się zniszczeniem ściany wyrostka zębodołowego3. Do generowania modeli POChP in vivo wykorzystano kilka gatunków zwierząt (np. psy, świnki morskie, małpy i gryzonie)4. Mysz stała się jednak najczęściej wykorzystywana w budowie modeli POChP. Ma to wiele zalet, w tym niski koszt, możliwość modyfikacji genetycznej, dostępność obszernych informacji genomicznych, dostępność przeciwciał i możliwość korzystania z różnych szczepów myszy5. Obecnie nie ma modelu mysiego, który mógłby naśladować pełne cechy POChP u ludzi; w związku z tym poszczególni badacze muszą wybrać, który model jest najbardziej odpowiedni dla konkretnego badania POChP6. Model myszy z rozedmą płuc jest jednym z wielu obecnie dostępnych modeli myszy z POChP. Dodatkowe modele obejmują mysi model zaostrzenia, model ogólnoustrojowych chorób współistniejących oraz model podatności na POChP7.

Model myszy z emrozedmową może być generowany przez kilka rodzajów czynników egzogennych, w tym czynniki chemiczne i ekspozycję na dym papierosowy4. Narażenie na chemikalia (np. elastazę) powoduje ciężki rodzaj rozedmy płuc, podczas gdy dym papierosowy powoduje łagodną rozedmę płuc 8,9. Uważa się, że dym papierosowy jest główną przyczyną patogenezy POChP; dlatego wybór dymu papierosowego jako środka do stworzenia modelu myszy z POChP jest rozsądny10. W wielu badaniach wykorzystano dym papierosowy do wywołania rozedmy płuc u myszy. Na przykład, Nikula i in. z powodzeniem stworzyli model myszy z rozedmą płuc z samicami myszy B6C3F1, wystawiając je na działanie dymu papierosowego przez 7 lub 13 miesięcy11. Ustaliliśmy również model myszy z rozedmą płuc za pomocą białka markera starzenia / SMP-30 KO myszy 12. Bardzo ważne jest wykonanie metody unieruchomienia płuc, która może prawidłowo uwidocznić ten łagodny model rozedmy płuc poprzez ekspozycję na dym papierosowy.

Ustalono różne metody unieruchamiania płuc13. Nie ma jednak złotego standardu metody utrwalania tkanki płucnej do oceny rozedmy płuc14. Kilka badań przeprowadzonych w tym laboratorium wykazało, że przedstawiony tutaj system mocowania jest przydatny poprzez stworzenie stabilnych warunków do oceny rozedmy płuc < class = "xref" > 12 < sup class="xref" > 15 < class = "xref" > 16, 17,< sup class="xref">18. Główną zaletą obecnego systemu jest to, że może on naprawić wiele płuc z tym samym schorzeniem w tym samym czasie bez zapadania się płuc lub deflacji. Obecny system stabilizacji płuc wykorzystuje specjalny sprzęt, który umożliwia napompowanie próbek płuc pod odpowiednim stałym ciśnieniem przez dany okres. To specjalne wyposażenie składa się z trzech części, w tym dolnego pojemnika, górnego pojemnika i pompy. Próbki płuc umieszcza się w dolnym pojemniku, który jest podłączony do środków utrwalających pod ciśnieniem, co powoduje różnicę ciśnień 25 cmH2O w poziomie środków między górnym a dolnym pojemnikiem19.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Następujące metody zostały zatwierdzone przez Komitety ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Szkoły Medycznej Uniwersytetu Juntendo. Przestrzegano Wytycznych dotyczących Prawidłowego Przeprowadzania Eksperymentów na Zwierzętach, Japońskiej Rady Naukowej, 1 czerwca 2006 r. W tej metodzie występują trzy główne etapy: 1) sekcja myszy, 2) wykrwawienie płuc oraz 3) utrwalenie tkanek płuc wspomagane specjalistycznym sprzętem. Zazwyczaj próbki płuc są przetwarzane do osadzenia po 48 godzinach utrwalania12,15,16,17,18.

1. Sekcja myszy

  1. Zmierz masę ciała myszy, a następnie określ ilość pentobarbitalu do podawania.
  2. Pentobarbital wstrzyknąć dootrzewnowo w dawce 70 mg/kg masy ciała i potwierdzić znieczulenie przy braku reakcji na uszczypnięcie palca.
  3. Wstrzyknąć igłę pod kątem 45°, aż wniknie ona w skórę i mięsień. Narysować tłok i potwierdzić podciśnienie powietrza, a następnie wstrzyknąć pentobarbital.
  4. Potwierdź znieczulenie przez brak ruchu odruchowego.
    UWAGA: Użycie znieczulonej myszy w przeciwieństwie do myszy poddanej eutanazji jest zalecane w celu pełnego wykrwawienia płuc.
  5. Przetnij skórę myszy i mięsień brzucha na linii przyśrodkowej, kierując się w obszar głowowy.
  6. Ciąć na boki, aby zapewnić szerszą przestrzeń roboczą.

2. Wykrwawienie płuc

  1. Odsłoń warstwę membrany i przebij ją kleszkami.
  2. Otwórz przestrzeń piersiową i przetnij obszar mostka, dzięki czemu płuca i serce są wyraźnie widoczne.
  3. Przetnij serce w lewym przedsionku i prawej komorze.
  4. Wprowadzić kaniulę (24 G) do prawej komory i skierować ją do obszaru głowowego, aż dotrze do tętnicy płucnej, jak pokazano na Rysunek 1.
  5. Włącz pompę i pozwól 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) krążyć (około 200 ml / h), aż cała tkanka płucna zmieni kolor na biały.

3. Utrwalenie tkanki płucnej

  1. Usuń tchawicę, płuca i serce.
  2. Uwolnij wszystkie trzy narządy, przecinając otaczające tkanki łączne.
  3. Zawiąż prawe oskrzela główne nicią do szwów i odetnij wszystkie płaty prawego płuca.
  4. (Opcjonalnie): płaty prawego płuca składają się z czterech części. Wytnij te części z prawego głównego oskrzela i podziel części do przetworzenia jako zamrożone próbki tkanek.
  5. Włożyć serce i płaty lewego płuca do środków utrwalających, znajdujących się w strzykawce o pojemności 10 ml.
    UWAGA: Środki utrwalające są niebezpieczne. Nosić odpowiedni sprzęt ochronny (np. długie gumowe rękawice) i pracować w dobrze wentylowanym pomieszczeniu.
  6. Stwórz stan podciśnienia za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml, aby napompować płuco, jak pokazano na Rysunek 2.
  7. Włóż kaniulę (20 G) do tchawicy i zawiąż węzeł.
  8. Napompuj płuco środkami utrwalającymi, aby sprawdzić, czy nie ma wycieków, za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml.
  9. Przenieś do urządzenia do unieruchamiania ciśnienia w płucach, jak pokazano na Rysunek 3.
  10. Po utrwaleniu miesiączki należy usunąć próbkę płuc, wiążąc tchawicę węzłem.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jak opisano wcześniej, specjalistyczny sprzęt, który generuje stałe ciśnienie, można podzielić na trzy części (Rysunek 3A). Dolna część to punkt, w którym należy wprowadzić próbkę płuc (Rysunek 4A). Płuco jest połączone za pomocą kaniuli (20 G) z końcówką przepływu formaliny za pomocą trójdrożnego kurka zatrzymującego (Rysunek 4B). Ciśnienie jest generowane z różnych poziomów powierzchni środków mocujących międz...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiona tutaj procedura utrwalania płuc gryzoni nie jest nowa; System ten ma jednak kilka zalet. Po pierwsze, może naprawić wiele płuc (maksymalnie 20) z tym samym schorzeniem w tym samym czasie. Towarzystwo Patologii Toksykologicznej podaje, że ciśnienie do wkraplania grawitacyjnego waha się od 22–25 cmH2O22. Warto zauważyć, że w kilku badaniach przeprowadzono fiksację płuc pod ciśnieniem 25 cmH2O 13,19,23,24,25,26,27, która została przyjęta w naszym ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają do zadeklarowania żadnych sprzecznych interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ta praca była częściowo wspierana przez JSPS KAKENHI Grant Number 26461199 (T. Sato) oraz Institute for Environmental and Gender-Specific Medicine, Juntendo University Graduate School of Medicine, Grant Number E2920 (T. Sato). Fundator nie brał udziału w projektowaniu obecnych metod ani w pisaniu manuskryptu.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
10% formalina (neutralny roztwór buforowy formaliny)Wako060-01667
Kleszcze gięteHammacherHSC187-11
Kaniula, rozmiar 20GTerumoSR-FS2032
Kaniula, rozmiar 22GTerumoSR-OT2225CKaniula do wykrwawiania płuc
Kleszcze HammacherHSC184-10
KimtowelPapier nippon Crecia (Kimberly Clark)61000
KimwipeNippon Paper Crecia (Kimberly Clark)62011
Dolny pojemnik (materiał ze szkła akrylowego)Tokyo ScienceWykonany na zamówienieelement urządzenia ciśnieniowego
Pompa rolkowaNissin Scientific CorpNRP-75Pompa do wykrwawiania płuc
Pompa rolkowa RP-2000Eyela (Tokio Rikakikai Co., Ltd)160200Pompa do urządzeń ciśnieniowych
Rurka silikonowa i Oslash; 9 mmSansyo94-0479Element urządzenia ciśnieniowego
Somnopentyl (64,8 mg / ml)Kyoritsu SeiyakuSOM02-YA1312Pentobarbital Sód
Nożyczki chirurgiczneHammacherHSB014-11
Nić do szwów, rozmiar 0NescosutureGA01SW
Strzykawka, 1 mlTerumoSS-01T
Strzykawka, 1 ml z igłąTerumoSS-01T2613S
Strzykawka, 10 mlTerumoSS-10ESZ
Zawór trójdrogowyTerumoTS-TR1K01
Górny pojemnik (materiał ze szkła akrylowego)Tokyo ScienceWykonany na zamówienieelement urządzenia ciśnieniowego

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vogelmeier, C. F., et al. Global strategy for the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive lung disease 2017 report. GOLD Executive Summary. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 195 (5), 557-582 (2017).
  2. Pauwels, R. A., Rabe, K. F. Burden and clinical features of chronic obstructive pulmonary disease (COPD). Lancet. 364 (9434), 613-620 (2004).
  3. Spurzem, J. R., Rennard, S. I. Pathogenesis of COPD. Seminars in Respiratory and Critical Care Medicine. 26 (2), 142-153 (2005).
  4. Vlahos, R., Bozinovski, S., Gualano, R. C., Ernst, M., Anderson, G. P. Modelling COPD in mice. Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 12-17 (2006).
  5. Vlahos, R., Bozinovski, S. Recent advances in pre-clinical mouse models of COPD. Clinical Science (Lond). 126 (4), 253-265 (2014).
  6. Stevenson, C. S., Belvisi, M. G. Preclinical animal models of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Expert Review of Respiratory Medicine. 2 (5), 631-643 (2008).
  7. Stevenson, C. S., Birrell, M. A. Moving towards a new generation of animal models for asthma and COPD with improved clinical relevance. Pharmacology and Therapeutics. 130 (2), 93-105 (2011).
  8. Vandivier, R. W., Ghosh, M. Understanding the Relevance of the Mouse Cigarette Smoke Model of COPD: Peering through the Smoke. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 3-4 (2017).
  9. Wright, J. L., Cosio, M., Churg, A. Animal models of chronic obstructive pulmonary disease. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 295 (1), L1-L15 (2008).
  10. Rennard, S. I., Togo, S., Holz, O. Cigarette smoke inhibits alveolar repair: a mechanism for the development of emphysema. Proceedings of the American Thoracic Society. 3 (8), 703-708 (2006).
  11. Nikula, K. J., et al. A mouse model of cigarette smoke-induced emphysema. Chest. 117, 246S-247S (2000).
  12. Sato, T., et al. Senescence marker protein-30 protects mice lungs from oxidative stress, aging, and smoking. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 174 (5), 530-537 (2006).
  13. Braber, S., Verheijden, K. A., Henricks, P. A., Kraneveld, A. D., Folkerts, G. A comparison of fixation methods on lung morphology in a murine model of emphysema. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (6), L843-L851 (2010).
  14. Hsia, C. C., et al. An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: standards for quantitative assessment of lung structure. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 181 (4), 394-418 (2010).
  15. Kasagi, S., et al. Tomato juice prevents senescence-accelerated mouse P1 strain from developing emphysema induced by chronic exposure to tobacco smoke. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 290 (2), L396-L404 (2006).
  16. Koike, K., et al. Complete lack of vitamin C intake generates pulmonary emphysema in senescence marker protein-30 knockout mice. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 298 (6), L784-L792 (2010).
  17. Koike, K., et al. Vitamin C prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in mice and provides pulmonary restoration. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 50 (2), 347-357 (2014).
  18. Suzuki, Y., et al. Hydrogen-rich pure water prevents cigarette smoke-induced pulmonary emphysema in SMP30 knockout mice. Biochemical and Biophysical Research Communications. 492 (1), 74-81 (2017).
  19. Saad, M., Ruwanpura, S. M. Tissue Processing for Stereological Analyses of Lung Structure in Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Methods in Molecular Biology. 1725, 155-162 (2018).
  20. Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. The American Review of Respiratory Disease. 95 (5), 765-773 (1967).
  21. Saetta, M., et al. Destructive index: a measurement of lung parenchymal destruction in smokers. The American Review of Respiratory Disease. 131 (5), 764-769 (1985).
  22. Renne, R., et al. Recommendation of optimal method for formalin fixation of rodent lungs in routine toxicology studies. Toxicologic Pathology. 29 (5), 587-589 (2001).
  23. Schneider, J. P., Ochs, M. Alterations of mouse lung tissue dimensions during processing for morphometry: a comparison of methods. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology. 306 (4), L341-L350 (2014).
  24. Wright, J. L. Relationship of pulmonary arterial pressure and airflow obstruction to emphysema. Journal of Applied Physiology. 74 (3), 1320-1324 (1993).
  25. Wright, J. L., Churg, A. Cigarette smoke causes physiologic and morphologic changes of emphysema in the guinea pig. The American Review of Respiratory Disease. 142 (6 Pt 1), 1422-1428 (1990).
  26. Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
  27. Wright, J. L., et al. Airway remodeling in the smoke exposed guinea pig model. Inhalation Toxicology. 19 (11), 915-923 (2007).
  28. Limjunyawong, N., Mock, J., Mitzner, W. Instillation and Fixation Methods Useful in Mouse Lung Cancer Research. Journal of Visualized Experiments. (102), e52964(2015).
  29. Roos, A. B., Berg, T., Ahlgren, K. M., Grunewald, J., Nord, M. A method for generating pulmonary neutrophilia using aerosolized lipopolysaccharide. Journal of Visualized Experiments. (94), (2014).
  30. Laucho-Contreras, M. E., Taylor, K. L., Mahadeva, R., Boukedes, S. S., Owen, C. A. Automated measurement of pulmonary emphysema and small airway remodeling in cigarette smoke-exposed mice. Journal of Visualized Experiments. (95), 52236(2015).
  31. Nakanishi, Y., et al. Clarithromycin prevents smoke-induced emphysema in mice. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 179 (4), 271-278 (2009).
  32. Maeno, T., et al. CD8+ T Cells are required for inflammation and destruction in cigarette smoke-induced emphysema in mice. Journal of Immunology. 178 (12), 8090-8096 (2007).
  33. Sato, M., et al. Optimal fixation for total preanalytic phase evaluation in pathology laboratories: a comprehensive study including immunohistochemistry, DNA, and mRNA assays. Pathology International. 64 (5), 209-216 (2014).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Ocena rozedmymodel p uc mysichekspozycja na dym tytoniowypompa perfuzyjnautrwalanie formalinpreparat histologicznypowi kszenie przestrzeni powietrznychknockout SMP30

Powiązane artykuły