Przygotowanie peptydu argininowo-glicynowego asparaginianu (RGD) znakowanego 68Ga do angiogenezy

Podsumowanie

Integryna_{α v}β₃ jest rodzajem białka adhezyjnego, które ulega silnej ekspresji na aktywowanych komórkach śródbłonka przechodzących angiogenezę. W związku z tym ocena integralności integryny jest bardzo interesująca w onkologii. W tym miejscu przedstawiamy metodę otrzymywania ⁶⁸radiopeptydów znakowanych Ga oraz metodę oceny jej skuteczności biologicznej.

Streszczenie

Integryna_{α v}β₃ jest heterodimeryczną cząsteczką adhezyjną biorącą udział w migracji komórek nowotworowych i angiogenezie. Integryna ulega nadekspresji w angiogennych komórkach śródbłonka guza, gdzie zwykle ma niskie stężenie. Ta specyficzna ekspresja α_vβ₃ sprawia, że jest to ważny biomarker dla leków antyangiogennych i obrazowych. Pozytonowa tomografia emisyjna (PET) jako metoda obrazowania funkcjonalnego dostarcza informacji o zmianach biochemicznych i fizjologicznych in vivo, ze względu na wyjątkową wysoką czułość w skali nanomolowej. W związku z tym radiofarmaceutyki PET na bazie radiometali spotkały się z dużym zainteresowaniem ze względu na nieinwazyjną ocenę ilościową angiogenezy guza. W artykule przedstawiono ogólnoustrojowy protokół przygotowania nowego peptydu znakowanego radiometalem do oceny angiogenezy. Protokół ten zawiera informacje o wiarygodności radiochemicznej, lipofilowości, wychwytie komórek, stabilności surowicy i właściwościach farmakokinetycznych . Peptyd ⁶⁸Ga-RGD jest jednym z reprezentatywnych ligandów PET w kierunku integryny α_vβ₃. W tym miejscu przedstawiamy protokół przygotowania peptydu ⁶⁸Ga-RGD i oceny jego skuteczności biologicznej.

Wprowadzenie

Angiogeneza to proces biologiczny, który charakteryzuje się rozwojem nowych naczyń krwionośnych. Wśród wielu czynników angiogenetycznych, integryna α_vβ₃ jest związana z inwazyjnością, ponieważ integryna jest silnie eksprymowana w angiogennych naczyniach nowotworowych, ale nie występuje w normalnych tkankach¹_.

Znakowane radioaktywnie peptydy wiążące receptory z domeną asparaginianu glicyny argininy (RGD), która ma wysokie powinowactwo do receptorów integryny α_{vβ 3}, są uważane za obiecujące środki do obrazowania angiogenezy^2,3,4,5,6,7. Stworzono kilka radiofarmaceutyków dla PET, a ich właściwości biologiczne zostały potwierdzone w różnych modelach zwierzęcych^8,9,10,11. Jeśli chodzi o radionuklidy, ⁶⁸Ga ma kilka zalet w porównaniu z innymi izotopami promieniotwórczymi. Po pierwsze, jest łatwo dostępny dla użytkowników i jest korzystny ekonomicznie, ponieważ cyklotron nie jest wymagany. Po drugie, ⁶⁸radiofarmaceutyków na bazie Ga zapewnia wysoką rozdzielczość przestrzenną w porównaniu z tomografią komputerową z emisją pojedynczych fotonów (SPECT), co pozwala na dokładniejszą kwantyfikację. Wreszcie, okres półtrwania ^{wynoszący 67,71 minut wynoszący 68}Ga może być wystarczający do przygotowania małych peptydów lub białek.

Aby wytworzyć stabilny kompleks z ⁶⁸Ga, opracowano wiele chelatorów. Reprezentatywnymi chelatorami są: kwas 1,4,8,11-tetraazacyklotetradekantetraoctowy (TETA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekan-1,4,7,10-tetraoctowy (DOTA), kwas 1,4,7-triazacyklonono-1,4,7-trioctowy (NOTA), kwas dietylenotriaminopentaoctowy (DTPA) i kwas N,N'-di(2-hydroksybenzylo)etylenodiamino-N,N'-diacenowy (HBED). Doniesiono, że NOTA tworzy wysoce stabilny kompleks o ⁶⁸Ga (stała stabilności logarytmicznej 30,98)^12,13,14.

Celem niniejszego badania jest dostarczenie zwięzłego protokołu do opracowania nowego radiopeptydu (Rysunek 1). Jako przykład przygotowujemy ⁶⁸peptydów RGD znakowanych Ga i przedstawiamy metody biologicznej oceny tych analogów w modelu ksenoprzeszczepu.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z Wytycznymi dotyczącymi opieki i użytkowania zwierząt badawczych zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Komitet Badań nad Zwierzętami Koreańskiego Instytutu Nauk Radiologicznych i Medycznych. Wszystkie odczynniki i rozpuszczalniki zostały zakupione i używane bez dalszego oczyszczania. Peptydy NOTA-RGD przygotowano zgodnie z metodami literaturowymi¹⁵.

UWAGA: ⁶⁸Ga emituje zarówno promieniowanie pozytonowe, jak i gamma. Wszystkie eksperymenty, w tym bezpośredni lub pośredni kontakt z substancjami promieniotwórczymi, muszą być przeprowadzane wyłącznie przez przeszkolony i uprawniony personel. Podczas obchodzenia się z materiałami promieniotwórczymi należy używać odpowiedniego sprzętu ochronnego, osłony, plakietki i pierścieni dozymetru promieniowania oraz miernika pomiarowego.

1. Radioznakowanie peptydów RGD za pomocą ⁶⁸GaCl₃

Uwaga: ⁶⁸Ga (t_1/2 = 68 min, β⁺ = 89%, a EC = 11%) uzyskano z generatora ⁶⁸Ga/⁶⁸Ge.

1. Eluować ⁶⁸GaCl₃ z generatora za pomocą 4 ml 0,05 M HCl.
2. Przedmywać azotem gazowym w temperaturze 80 °C przez 30 minut w celu wysuszenia ⁶⁸GaCl₃ (333 kBq, 1 ml) w fiolce reakcyjnej o pojemności 5 ml.
3. Dodać roztwór peptydu RGD (100 μg) w 1 M octanie sodu (100 μl, pH 5-6) do fiolki reakcyjnej zawierającej ⁶⁸GaCl₃ z kroku 1.2.
4. Podgrzewać mieszaninę reakcyjną w temperaturze 80 °C przez 5 minut. Następnie ostudź do temperatury pokojowej.
5. Oczyść surowy produkt za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Użyj następującego systemu: kolumna C-18, natężenie przepływu 0,5 ml/min, nachylenie gradientu acetonitrylu 1,17%/min (5% - 40% w 30 min) i składniki elucji: A = 0,1% kwas trifluorooctowy (TFA) w acetonitrylu, B = 0,1% TFA w wodzie.
   UWAGA: HPLC jest wyposażony w detektor matrycowy fotodiodowy i detektor radioaktywności. Peptyd ⁶⁸Ga-RGD zebrano w czasie retencji wynoszącym 12,5 minuty (Ryc. 2).
6. Oczyść powstały peptyd ⁶⁸Ga-RGD za pomocą systemu ekstrakcji do fazy stałej.
   1. Przepuścić roztwór przez wkład C18 z odwróconymi fazami i przemyć 2 ml soli fizjologicznej.
   2. Elute ⁶⁸Ga-RGD-peptyd z 0,7 ml 95% etanolu. Usunąć rozpuszczalnik w temperaturze 80 °C w gazowym azocie przez 20 minut i rozpuścić w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) przed użyciem.
   3. Przefiltrować produkt znakowany radioaktywnie przez sterylny filtr 0,22 μm i sporządzić w 1 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej.
7. Sprawdzić wydajność radiochemiczną metodą chromatografii radioaktywnej (TLC).
   1. Umieścić 1 μl na natychmiastowej płytce do chromatografii cienkowarstwowej (ITLC, 10 cm długości). Rozwinąć płytkę w komorze zawierającej eluent (wodny roztwór 0,1 M kwasu cytrynowego, pH 5,0) w odległości 9 cm od plamki.
      UWAGA: Współczynnik retencji dla peptydu ⁶⁸Ga-RGD wynosi 0, a współczynnik retencji dla nieprzereagowanego ⁶⁸Ga³⁺ wynosi 1.
8. Obliczyć końcową aktywność właściwą ze stosunku promieniotwórczości odpowiadającej promieniotwórczości niepromieniowej jako MBq/nmol.
   UWAGA: Po wstrzyknięciu 100 μl sformułowanego peptydu ⁶⁸Ga-RGD do HPLC, ilość składnika nieradioaktywnego obliczono na podstawie standardowej krzywej kalibracyjnej przy użyciu nieradioaktywnego peptydu Ga-RGD.

2. Wychwyt komórkowy in vitro

Uwaga: Ludzkie komórki glejaka Uppsala 87 Malignant Glioma (U87MG) zostały wyhodowane w zmodyfikowanym pożywce Eagle's (DMEM) firmy Dulbecco, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% penicyliny-streptomycyny. Komórki hodowano na szalkach o średnicy 150 mm w temperaturze 37 °C w wilgotnej atmosferze o stężeniu 5% CO_{2 .} Komórki pobrano lub podzielono przez trypsynizację: 0,25% (w/v) trypsyny i 0,02% (w/v) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 min.

1. Umieść komórki U87MG w 6-dołkowych płytkach o gęstości 1 x 10⁶ komórek / dołek.
2. Inkubować komórki z peptydem ⁶⁸Ga-RGD (111 kBq) w temperaturze 37 °C przez 30, 60, 90 i 120 minut. Przygotować próbki w trzech egzemplarzach.
3. Umyj komórki 2x 2 ml PBS i zbierz przez trypsynizację. Stosować 0,25% (w/v) trypsyny i 0,02% (w/v) kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA) w PBS w temperaturze 37 °C przez 3 - 5 minut.
4. Zebrać zawiesinę komórek (500 μl) i odmierzyć w liczniku γ.
5. Obliczyć procentowy wychwyt związku przez komórki w procentach (liczby w komórkach/całkowita liczba).

3. Stabilność surowicy in vitro

1. Dodaj 500 μl świeżo przygotowanej surowicy mysiej, 500 μl surowicy ludzkiej i 500 μl PBS. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.
2. Ocena za pomocą ITLC w określonych odstępach czasu (30, 60, 90 i 120 min). Umieścić 1 - 2 μL podwielokrotności mieszaniny na płytce ITLC (faza ruchoma: 0,1 M kwas cytrynowy). Rozwinąć płytkę jak w kroku 1.7.
   UWAGA: Oczekuje się, że ⁶⁸Ga³⁺ będzie przemieszczał się wraz z czołem rozpuszczalnika, podczas gdy znakowany związek pozostanie w punkcie początkowym.

4. Oznaczanie lipofilowości

1. Dodać ⁶⁸peptydów Ga-RGD (3,7 MBq, 3,7 μL) do układu oktanol-PBS (1:1, v/v, łącznie 1 ml).
2. Mieszać fiolki energicznie przez 5 minut w temperaturze pokojowej i odwirowywać przy 10 000 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Pobrać 100 μl próbek z każdej warstwy i zmierzyć radioaktywność za pomocą licznika γ. Podana wartość logarytmu P opiera się na średniej z trzech próbek.

5. Model guza

Uwaga: Do tego badania użyto nagich myszy BALB/c (6 - 8 tygodni, samica, n = 23). Myszy wykorzystano następnie do badań PET (n = 3) i biodystrybucji (n = 20), gdy objętość guza osiągnęła 200 - 300 mm^{3 3} (1 - 2 tygodnie po implantacji).

1. Załaduj komórki nowotworowe do strzykawek insulinowych o pojemności 28 G, 1/2 cala.
2. Wstrzyknij komórki U87MG (5 x 10⁶) w 100 μl PBS w obszar lewego ramienia.
3. Znieczulij mysz 2% izofluranem w gazowym tlenie podczas wstrzykiwania komórek.
   1. Upewnij się, że mysz została znieczulona przez utratę odruchu wycofania pedału po uszczypnięciu kleszczami między palcami prawej tylnej stopy. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.

6. Kwantyfikacja in vivo integryny α_vβ₃ za pomocą PET

1. Znieczulij myszy 2% izofluranem w tlenie.
   1. Upewnij się, że mysz została znieczulona przez utratę odruchu wycofania pedału po uszczypnięciu kleszczami między palcami prawej tylnej stopy. Nie pozostawiaj zwierzęcia bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą na mostku.
2. Umieść głowicę na środku suwnicy PET.
3. Podawać dożylnie roztwór ^{peptydu 68}Ga-RGD (7,4 MBq, 200 μL) do mysiego modelu ksenoprzeszczepu przez żyłę ogonową przez 1 minutę.
4. W tym samym czasie wykonaj skanowanie PET w trybie listy (skanowanie dynamiczne) przez 150 min.
   UWAGA: Surowe dane PET zostały zrekonstruowane w zdefiniowanym przez użytkownika przedziale czasowym (tj. co 30 minut). Po badaniu PET wykonano badanie mikrotomografią komputerową (CT) (50 kVp promieniowania rentgenowskiego, 0,16 mA) w celu korekcji tłumienia.

7. Biodystrybucja ex vivo

1. Wstrzyknąć ^{peptyd 68}Ga-RGD (0,37 MBq, 200 μL) do żyły ogonowej mysiego modelu ksenoprzeszczepu. Podczas wstrzyknięć znieczulić mysz 2% izofluranem w gazowym tlenie.
   Uwaga: Nagie myszy BALB/c, jak opisano w sekcji 5, podzielono na cztery grupy i uśmiercono w różnych punktach czasowych (n = 5 na grupę).
2. Obudź myszy natychmiast po podaniu peptydu ⁶⁸Ga-RGD i poświęć je po 30, 60, 90 i 120 minutach po wstrzyknięciu z eutanazją dwutlenku węgla.
   UWAGA: Interesujące tkanki zostały pobrane. Wybrane cele to krew, mięśnie, serce, płuca, wątroba, śledziona, żołądek, jelita, nerki, kości i guz.
3. Zważyć tkankę i zmierzyć radioaktywność za pomocą licznika γ.
   UWAGA: Wyniki wyrażono jako procentową dawkę wstrzykniętej na gram tkanki (% ID/g).

Wyniki

Chelatowanie ⁶⁸GaCl₃ z peptydem NOTA-RGD przebiegło sprawnie, a wydajność znakowania radiochemicznego wyniosła 99%. Zanieczyszczenia reakcji zostały skutecznie usunięte, co przedstawiono na Rysunku 2. Czystość radiochemiczna ⁶⁸Ga-RGD-peptydu była wyższa niż 99%, a aktywność właściwa na koniec syntezy wynosiła 90 - 130 MBq/nmol (Rysunek 3).

Dyskusja

W niniejszym badaniu wprowadziliśmy protokół przygotowania radiopeptydu ukierunkowanego na integrynę α_vβ₃ oraz jej ocenę biologiczną. Tradycyjne opracowywanie leków wiąże się ze skomplikowaną procedurą. Wymaga to dużej ilości materiału referencyjnego i stosunkowo długiego czasu oceny. Chociaż proponowana metodyka nie może zastąpić delikatnego procesu oceny, system ten może być stosowany do celów przesiewowych. Proponowany system znacznie skróciłby czas i obniżył koszty.

W...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
68Ga/68Ge generator	ITG	Company-10	mCi
Roztwór chlorowodoru	Sigma-aldrich	84429
Octan sodu	Sigma-aldrich	S2889
C18 wkład z odwróconymi fazami	Wody	WAT020515
0,22-μ m sterylny filtr	Milllipore	SLGV033RS
Skaner Radio-TLC	Bioscan	AR2000
ITLC papier	Agilent	SGI001
Kwas cytrynowy	Sigma-aldrich	251275
HPLC	Waters-Waters		1525 system zawierający pompę binarną, matrycę fotodiodową (Waters 2998), detektor radioaktywności (Raytest, Gabi)
Acetonitryl	J.T. Baker	14-650-359
Kwas trifluorooctowy	Sigma-aldrich	302031
Dulbecco's modified Eagle media	Thermo fisher scientific	11965092
płodowa surowica bydlęca	Termo fisher scientific	16000044
T175 kolby	Corning	CLS431080
Trypsin-EDTA (0,25%)	Thermo fisher scientific	25200072
penicylina-streptomycyna	Thermo fisher scientific	15240112
γ-counter	Perkin		Wizard 3
Insunlin	Becton Dickinson	326105
Pompa Synringe	Harvard Aparatura	70-4500
mikro-PET/CT	Siemens Inveon	-

Elmer-1480