Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Przejściowa ekspresja w buraka ćwikłowym biofarmaceutycznej szczepionki kandydackiej przeciwko cukrzycy typu 1

7.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59298

⸱

19 marca 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biotechnology, University of Verona

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj prezentujemy protokół produkcji doustnej szczepionki przeciwko cukrzycy typu 1 w jadalnej roślinie.

Streszczenie

Molekularne rolnictwo roślin to wykorzystanie roślin do produkcji interesujących molekuł. Z tego punktu widzenia rośliny mogą być wykorzystywane zarówno jako bioreaktory do produkcji, a następnie oczyszczania produktu końcowego, jak i do bezpośredniego doustnego dostarczania białek heterologicznych w przypadku stosowania jadalnych gatunków roślin. W niniejszej pracy przedstawiono opracowanie potencjalnej szczepionki doustnej przeciwko cukrzycy typu 1 (T1D) w jadalnych systemach roślinnych przy użyciu technologii rekombinacji DNA opartej na zdekonstruowanych wirusach roślinnych, dostarczanej z infiltracją próżniową. Nasze wyniki pokazują, że burak ćwikłowy jest odpowiednim gospodarzem dla przejściowej ekspresji autoantygenu pochodzenia ludzkiego związanego z cukrzycą typu 1, uważanego za obiecującego kandydata na szczepionkę przeciwko cukrzycy typu 1. Liście wytwarzające autoantygen zostały dokładnie scharakteryzowane pod kątem ich odporności na trawienie żołądkowe, obecności resztkowego ładunku bakteryjnego oraz ich wtórnego profilu metabolicznego, dając przegląd procesu produkcji pod kątem potencjalnego wykorzystania roślin do bezpośredniego doustnego dostarczania heterologicznego białka. Nasza analiza wykazała prawie całkowitą degradację liofilizowanej kandydackiej szczepionki doustnej po symulowanym trawieniu żołądka, co sugeruje, że wymagana jest strategia kapsułkowania w produkcji szczepionki pochodzenia roślinnego.

Wprowadzenie

Od czasu rewolucji w biologii molekularnej roślin w latach 80-tych, systemy roślinne do produkcji biofarmaceutyków mogą być rozważane jako alternatywa dla tradycyjnych systemów opartych na komórkach mikrobiologicznych i ssaków1. Rośliny mają kilka zalet w porównaniu z tradycyjnymi platformami, z których najważniejszymi są skalowalność, opłacalność i bezpieczeństwo2. Rekombinowany produkt może być oczyszczony z przekształconej tkanki roślinnej, a następnie podawany pozajelitowo lub doustnie, a ponadto przekształcona roślina jadalna może być używana bezpośrednio do podawania doustnego. Droga doustna jednocześnie wspomaga odporność błony śluzowej i ogólnoustrojowej oraz eliminuje potrzebę stosowania igieł i specjalistycznego personelu medycznego. Co więcej, podawanie doustne eliminuje skomplikowane przetwarzanie na dalszych etapach, które zwykle stanowi 80% całkowitych kosztów produkcji rekombinowanego białka3. Wszystkie te zalety można przełożyć na oszczędności w produkcji, dostawach i pracy, zmniejszając koszty każdej dawki, dzięki czemu lek jest dostępny dla większości światowej populacji.

Kilka strategii, zarówno dla stabilnej transformacji, jak i przejściowej ekspresji, zostało opracowanych dla produkcji rekombinowanych białek w roślinach. Wśród nich wysokowydajny, zdekonstruowany system ekspresji oparty na wirusach roślinnych (np. magnICON) zapewnia doskonałą wydajność, prowadząc do wysokich plonów rekombinowanych białek w stosunkowo krótkich skalach czasowych4. Opisano wiele przykładów przejściowej ekspresji przy użyciu systemu ekspresji opartego na wirusach roślinnych w roślinach Nicotiana benthamiana, które są gospodarzem produkcji złotego standardu. Jednak ta roślina modelowa nie jest uważana za gatunek jadalny ze względu na alkaloidy i inne toksyczne metabolity, które gromadzą się w jej liściach.

W tej pracy opisujemy porównanie między dwoma jadalnymi systemami roślinnymi, burakiem ćwikłowym (Beta vulgaris cv Moulin Rouge) i szpinakiem (Spinacea oleracea cv Industria), dla ekspresji dwóch kandydujących form izoformy 65 kDa dekarboksylazy kwasu glutaminowego (GAD65), przeprowadzonego przez wektory oparte na wirusach roślinnych5. GAD65 jest głównym autoantygenem związanym z cukrzycą typu 1 (T1D) i jest obecnie badany w badaniach klinicznych na ludziach w celu zapobiegania lub opóźniania cukrzycy typu 1 poprzez indukowanie tolerancji6. Produkcja GAD65 w roślinach została szeroko zbadana na modelowych gatunkach roślin, takich jak Nicotiana tabacum i N. benthamiana4,5,6,7. W tym miejscu opisujemy zastosowanie jadalnych gatunków roślin do produkcji cząsteczki w tkankach, które mogą być przeznaczone do bezpośredniego podawania doustnego. Z technicznego punktu widzenia zbadaliśmy i wybraliśmy system do agroinfiltracji roślin oraz platformę roślin jadalnych do produkcji GAD65, oceniając różne parametry: poziomy ekspresji białek rekombinowanych, resztkowy ładunek mikrobiologiczny w tkance roślinnej przeznaczonej do podawania doustnego, odporność GAD65 na trawienie żołądkowe oraz biorównoważność przekształconych roślin z typem dzikim.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Uprawa buraków i szpinaku

  1. Rośliny buraka ćwikłowego (B. vulgaris cv Moulin Rouge) i szpinaku (S. oleracea cv Industria) należy uprawiać w komorze wzrostu, stosując 150 μE natężenia światła, wilgotności względnej 65%, 12 godzin cyklu jasnego/ciemnego w temperaturze 23/21 °C.
  2. Po wykiełkowaniu nasion rośliny nawozić dwa razy w tygodniu roztworem 1 g/l dostępnego w handlu nawozu (Tabela Materiałów). Do agroinfiltracji używaj pięciotygodniowego szpinaku i sześciotygodniowych buraka ćwikłowego.

2. Przejściowa ekspresja dzięki zdekonstruowanej technologii opartej na wirusach roślinnych

  1. Budowa wektorów ekspresji roślinnej
    1. Wprowadź wektory - moduł 5' (pICH20111), moduły 3' (pICH31070.GAD65mut, pICH31070.∆87G65mut i pICH7410.eGFP), przygotowane zgodnie z wcześniejszym opisem1,2,7, oraz moduł integrazy (pICH14011) - w Agrobacterium tumefaciens Szczep GV3101 przy użyciu standardowych technik. Rosnąć na podłożu LB zawierającym 50 μg/ml ryfampicyny i odpowiednich antybiotykach specyficznych dla wektora (50 μg/ml karbenicyliny dla pICH20111, pICH14011 i pICH7410.eGFP, 50 μg/ml kanamycyny dla pICH31070) przez 2 dni w temperaturze 28 °C.
    2. Przebadać kolonie metodą PCR kolonii przy użyciu następujących specyficznych starterów dla każdego wektora: 5'-ATCTAAGCTAGGGTACCTCG-3' i 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' dla obu modułów 3' pICH31070.GAD65mut i pICH31070.∆87G65mut, o temperaturze wyżarzania 55 °C i czasie wydłużenia 110 s, 5'-TGAAGTTCATCTGCACCAC-3' i 5'-ACACCGTAAGTCTATCTCTTC-3' dla trzeciego modułu 3' pICH7410.eGFP, o temperaturze wyżarzania 53 °C i czasie wydłużenia 30 s, 5'-AATGTCGATAGTCTCGTACG-3' i 5'-TCCACCTTTAACGAAGTCTG-3' dla modułu 5', o temperaturze wyżarzania 53 °C i czasie wydłużenia 20 s oraz 5'-GGCAACCGTTATGCGAATCC-3' i 5'-GATGCGTTCCGCAACGAACT-3' dla modułu integrazy o temperaturze wyżarzania 57 °C i czasie wydłużenia 45 s.
    3. Przeprowadzić reakcję PCR w całkowitej objętości 20 μl, stosując następujący specyficzny cykl reakcji: 5 minut początkowej denaturacji w temperaturze 95 °C, 35 cykli po 30 s w temperaturze 95 °C, 30 s w temperaturze wyżarzania i etapu wydłużania w temperaturze 72 °C (temperatura wyżarzania i czas wydłużania są specyficzne dla każdej pary starterów) i końcowy etap wydłużania trwający 7 minut w temperaturze 72 °C.
  2. Agroinfiltracja strzykawkowa
    1. Zaszczepić trzy transformanty A. tumefaciens w 50 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml ryfampicyny i następujące odpowiednie antybiotyki specyficzne dla wektora: 50 μg/ml karbenicyliny dla A. tumefaciens transformowanych za pomocą pICH20111, pICH14011 lub pICH7410.eGFP lub 50 μg/ml kanamycyny dla A. tumefaciens transformowanych za pomocą pICH31070. Rosnąć przez wytrząsanie przez noc w temperaturze 28 °C.
    2. Osadzać osadzane kultury bakteryjne przez odwirowywanie przy 4 500 x g przez 20 minut i ponownie zawiesić je w 100 ml (lub dwóch objętościach początkowej kultury bakteryjnej) buforu infiltracyjnego zawierającego 10 mM kwasu 4-morfolinoetanosulfonowego (MES; pH 5,5) i 10 mMMgSO4, bez uwzględnienia OD600. Zawiesiny inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 3 godziny.
    3. Wymieszaj równe objętości zawiesin bakteryjnych zawierających jeden z trzech modułów, GAD65mut, ∆87GAD65mut lub moduł eGFP 3', z modułem 5' i modułem integrazy. Mieszankę zawiesinową należy stosować do infiltracji strzykawką liści buraka ćwikłowego i szpinaku.
    4. Umieścić 5 ml zawiesiny w strzykawce bez igły. Przyciśnij końcówkę strzykawki do spodniej strony liścia zarówno w przypadku szpinaku, jak i buraka ćwikłowego, a w międzyczasie delikatnie przeciwciśnij drugą stronę liścia.
    5. Nafiltruj pierwsze trzy całkowicie rozwinięte liście, zaczynając od wierzchołka dla każdej rośliny. Oznacz liście agroinfiltrowane papierową etykietą na łodydze liścia. Umieść rośliny w komorze wzrostowej w standardowych warunkach.
      UWAGA: Ze względów zdrowotnych i bezpieczeństwa należy nosić okulary ochronne i rękawice podczas procesu infiltracji.
    6. Zbierz liście przesączone od 4 do 14 dni po infekcji (dpi) i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowywać tkankę roślinną w temperaturze -80 °C.
  3. Agroinfiltracja próżniowa
    1. Hodować oddzielnie trzy transformanty A. tumefaciens w 50 ml pożywki LB zawierającej 50 μg/ml ryfampicyny i odpowiedniego antybiotyku specyficznego dla wektora, wytrząsając przez noc w temperaturze 28 °C.
    2. Osad kultur bakteryjnych przez noc przez odwirowanie przy 4 500 x g przez 20 min. Zawiesić osad w 1 l buforu infiltracyjnego do OD600 0,35 i inkubować zawiesiny w temperaturze RT przez 3 godziny.
    3. Dodać 0,01% v/v detergentu (polisorbatu 20) do każdej zawiesiny. Wymieszaj równe objętości zawiesin bakteryjnych zawierających jeden z trzech modułów, GAD65mut, ∆87GAD65mut lub moduł eGFP 3', z modułem 5' i modułem integrazy.
    4. Umieścić jedną roślinę (sześciotygodniowy burak ćwikłowy, patrz sekcja 1) w uchwycie. Odwrócić uchwyt i umieścić go na zlewce zawierającej kąpiel infiltracyjną (2 l), aby zanurzyć liście w zawiesinie infiltracyjnej.
      UWAGA: Upewnij się, że wszystkie liście są całkowicie zanurzone w zawiesinie bakteryjnej. W razie potrzeby podnieś poziom, dodając dodatkowe zawieszenie infiltracji.
    5. Przenieść kąpiel infiltracyjną z zanurzoną rośliną do komory infiltracyjnej i zamknąć ją. Włączyć pompę próżniową i otworzyć zawór wlotu podciśnienia w komorze rozsączającej.
    6. Gdy ciśnienie w komorze rozsączającej spadnie do 90 mbar, utrzymuj próżnię przez 3 minuty. Zwolnij podciśnienie na 45 s. Gdy komora infiltracyjna powróci do ciśnienia atmosferycznego, otwórz komorę i wyjmij naciekającą roślinę z kąpieli bakteryjnej.
    7. Umieść rośliny w komorze wzrostowej w standardowych warunkach.
    8. Zbierz liście przesiąknięte agroinfiltracją o maksymalnej ekspresji dpi, w zależności od rekombinowanego białka, i zamroź je w ciekłym azocie. Przechowywać tkankę roślinną w temperaturze -80 °C.

3. Analiza ekspresji białek rekombinowanych

  1. Ekstrakcja całkowitego białka rozpuszczalnego (TSP)
    1. Zmielić strzykawkę lub naciekane próżniowo liście buraków ćwikłowych i szpinaku, zebrane w krokach 2.2.6 i 2.3.8, na drobny proszek w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Przenieść proszek do plastikowych tubek o pojemności 15 ml i przechowywać materiał w temperaturze -80 °C.
    2. Dodać 900 μl buforu ekstrakcyjnego (50 mM fosforanu sodu o pH 8,0, 20 mM pirosiarczynu sodu) do 300 mg proszku z liści.
      UWAGA: Wybrany stosunek masy tkanki roślinnej (mg) do objętości buforu (μL) wynosi 1:3.
    3. Homogenizować mieszaninę przez wirowanie przez 1 minutę, a następnie odwirować przy 30 000 x g przez 40 minut w temperaturze 4 °C.
    4. Zebrać supernatant do czystej probówki i przechowywać go w temperaturze -80 °C.
  2. Wizualizacja i kwantyfikacja eGFP w zakładzie
    1. Umieścić 100 μl każdego ekstraktu TSP otrzymanego z liści wykazujących ekspresję eGFP, w trzech kontrpróbach technicznych, na 96-dołkową płytkę.
    2. Umieść 96-dołkową płytkę w czytniku fluorescencyjnym i rozpocznij pomiar. Użyj zestawu filtrów 485/535 nm wymaganego do wykrywania fluorescencji eGFP.
    3. W celu bezwzględnego oznaczania ilościowego, na tej samej płytce należy przygotować krzywą kalibracyjną obciążającą różne ilości (62,5, 125, 500, 750 i 1000 ng) oczyszczonego eGFP.
  3. Test kwasu bicunchoninowego (BCA) do oznaczania ilościowego TSP
    1. Wymieszać 50 części odczynnika A (tabela materiałów) z 1 częścią odczynnika B (tabela materiałów). Przygotować wystarczającą objętość świeżego roztworu roboczego BCA dla próbek, które mają być oznaczone><, oraz dla wzorców kalibracyjnych. UWAGA: Objętość roztworu roboczego BCA wymagana dla każdej próbki wynosi 1,9 ml. Do standardowej procedury z 9 wzorcami (w tym ślepą próbą) wymagane jest 17,1 ml roztworu roboczego BCA.
    2. Odpipetować 0,1 ml każdego wzorca (w tym ślepą próbę), a następnie ekstrahować łyżeczkę do oznaczonej probówki.
      UWAGA: Jako wzorce kalibracyjne należy przygotować świeży zestaw wzorców albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w zakresie 10-1 000 μg/ml, najlepiej przy użyciu tego samego rozcieńczalnika co próbki, takiego jak woda. Ślepa próba składa się z 0,1 ml rozcieńczalnika używanego do wzorca kalibracyjnego i przygotowania próbki.
    3. Dodaj 1,9 ml roztworu roboczego BCA i dokładnie wymieszaj. Przykryć probówki i inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
    4. Schłodzić probówki do temperatury suchej temperatury. Zmierzyć absorbancję wszystkich próbek przy długości fali 562 nm w ciągu 10 minut
      UWAGA: Nawet przy RT rozwój kolorów jest kontynuowany. Nie zostanie wprowadzony żaden istotny błąd, jeśli pomiary absorbancji wszystkich probówek zostaną wykonane w ciągu 10 minut.
    5. Odjąć wartość absorbancji ślepej próby wynoszącą 562 nm od odczytów wzorców i ekstraktów TSP.
    6. Wykreślić odczyt 562 nm z korekcją ślepą dla każdego wzorca na podstawie jego stężenia. Określ stężenie białka w każdym ekstrakcie TSP.
  4. Wykonaj barwienie żelem Coomassie zgodnie z wcześniejszym opisem w Gecchele et al.8.
  5. Analiza Western blot
    1. Przeprowadź analizę western blot zgodnie z wcześniejszym opisem w Gecchele et al.8.
    2. Po elektroforetycznym oddzieleniu białek przenieś je na membranę nitrocelulozową przy użyciu standardowych technik. Przygotować roztwór blokujący, mieszając 4% mleko z solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) o pH 7,4. Zablokować membranę 10 ml roztworu blokującego w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.
    3. Przygotować pierwszorzędowe przeciwciało królika w stosunku 1:10 000 dla anty-GAD65/67 i anty-LHCB2 oraz w stosunku 1:20 000 dla anty-eGFP w 5 ml roztworu blokującego z 0,1% detergentem. Inkubować błonę z przygotowanymi roztworami przeciwciał pierwszorzędowych przez noc w temperaturze 4 °C lub przez 4 godziny w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu.
    4. Wyrzuć przeciwciało pierwszorzędowe i przemyj membranę 3 razy po 5 minut roztworem blokującym zawierającym 0,1% detergentu.
    5. Przygotować sprzężone przeciwciało antykrólicze z peroksydazą chrzanową (HRP) w stosunku 1:10 000 w roztworze blokującym z 0,1% detergentem. Inkubować błonę przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej przy stałym mieszaniu.
    6. Wyrzuć przeciwciało drugorzędowe i przemyj membranę 5 razy przez 5 minut za pomocą PBS-T (PBS uzupełniony 0,1% detergentem).
    7. Inkubować membranę z dostępnym w handlu roztworem luminolu zgodnie z instrukcjami producenta. Wykryj sygnał za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego.

4. Przetwarzanie materiału roślinnego

  1. Zbierz ziarenka próżniowe z agrowinfiltracją ∆87GAD65mut liście buraka ćwikłowego o ekspresji w momencie ekspresji (11 dpi) i zamroź je w ciekłym azocie.
  2. Liofilizować zamrożone liście przez 72 godziny w temperaturze -50 °C i 0,04 mbar. Przechowywać je w temperaturze -80 °C.
  3. Zmiel liście na drobny proszek i przechowuj je w temperaturze pokojowej w szczelnie zamkniętym pojemniku z żelem krzemionkowym, aby wykluczyć wilgoć.

5. Symulacja trawienia żołądka i analiza integralności komórek

  1. Symulacja trawienia żołądka
    1. Odważyć 100 mg zmielonych liofilizowanych liści buraka ćwikłowego i ponownie zawiesić w 6 ml PBS (pH 7,4).
    2. Doprowadzić pH próbki do 2 za pomocą 6 M HCl.
    3. Dodać 4 mg/ml pepsyny z błony śluzowej żołądka świń w 10 mM HCl, aby uzyskać końcowe stężenie pepsyny 1 mg/ml lub stosunek 1:20 do całkowitych rozpuszczalnych białek. Wstrząsać próbką w temperaturze 37 °C przez 120 minut.
    4. Dostosować próbki do pH 8 za pomocą 1 M NaOH w celu dezaktywacji pepsyny.
    5. Odwirować 750 μl podwielokrotności każdej próbki przy 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać oddzielnie supernatant i ponownie zawiesić osad w jednej objętości supernatantu buforu ładującego (1,5 M Tris HCl, pH 6,8, 3% SDS, 15% glicerolu i 4% 2-merkaptoetanolu).
      UWAGA: Ze względów zdrowotnych i bezpieczeństwa należy nosić rękawice i pracować pod wyciągiem w celu przygotowania próbki.
    6. Przeanalizuj zarówno supernatant, jak i zawieszony osad za pomocą analizy western blot8.
  2. Analiza integralności komórek
    1. Przygotować dwie próbki po 100 mg zmielonych liofilizowanych liści buraka ćwikłowego i ponownie zawiesić obie w 6 ml PBS (pH 7,4).
    2. Doprowadzić pH tylko jednej próbki do 2 za pomocą 6 M HCl. Wstrząsnąć obiema próbkami w temperaturze 37 °C przez 120 minut.
    3. Odwirować 750 μl podwielokrotności każdej próbki w temperaturze 20 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać oddzielnie supernatant i ponownie zawiesić osad w jednej objętości supernatantu buforu ładującego.
    4. Analizować zarówno supernatant, jak i zawieszony osad za pomocą analizy western blot.

6. Test obciążenia biologicznego

  1. Odważyć 100 mg liofilizowanych liści buraka ćwikłowego. Zawiesić proszek w 8 ml sterylnego PBS (pH 7,4) i wirować przez 1 minutę.
  2. Przygotować pożywkę LB bez antybiotyków lub zawierającą (i) po 50 μg/ml ryfampicyny, (ii) po 50 μg/ml ryfampicyny i karbenicyliny, (iii) po 50 μg/ml ryfampicyny i kanamycyny lub (iv) po 50 μg/ml ryfampicyny, karbenicyliny i kanamycyny.
  3. Umieść 1 ml każdego liofilizowanego homogenatu liściowego w jednym z 5 selektywnych pożywek LB.
  4. Inkubować wszystkie płytki przez 3 dni w temperaturze 28 °C.
  5. Policz kolonie Agrobacterium wyhodowane na każdym talerzu.
  6. Oblicz i zdefiniuj resztkowy ładunek bakteryjny jako liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) na ml liofilizowanego homogenatu liściowego (CFU/ml).

7. Ekstrakcja metabolitów

  1. Ekstrakcja metabolitów pierwotnych
    1. Odważyć 30 mg sproszkowa∆nego z liści buraka ćwikłowego o temperaturze -80 °C w plastikowej tubie o pojemności 2 ml w temperaturze -80 °C.
    2. Dodać 750 μl zimnego metanolu/chloroformu 70/30 (v/v) i wirować przez 30 s. Inkubować w temperaturze -20 °C przez 2 godziny
      UWAGA: Wszystkie rozpuszczalniki i dodatki muszą być klasy LC-MS.
    3. Dodać 600 μl zimnej wody i odwirować w temperaturze 17 900 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut. Zebrać i przenieść górną fazę wodno-alkoholową do nowej probówki o pojemności 2 ml. Odrzucić dolną fazę chloromrówkową i interfazę.
    4. Umieścić próbki w koncentratorze próżniowym na 3 godziny w celu odparowania rozpuszczalników.
    5. Rozpuścić osad otrzymany z kroku 7.1.4 w 300 μl 50/50 (v/v) acetonitrylu/wody i poddać próbki sonikacji przez 3 minuty.
    6. Przepuść roztwory przez filtry membranowe 0,2 μm i umieść je w przezroczystych, stałych szklanych rurkach o pojemności 300 μl.
  2. Ekstrakcja metabolitów wtórnych
    1. Odważyć 300 mg sproszkowa∆nego z liści buraka ćwikłowego o pojemności -80 °C w plastikowej tubie o pojemności 15 ml w temperaturze -80 °C.
    2. Dodać 3 ml metanolu, wirować przez 30 s i sonikować przy 40 kHz przez 15 min.
      UWAGA: Wszystkie rozpuszczalniki i dodatki muszą być klasy LC-MS.
    3. Odwirować próbki w temperaturze 4 500 x g w temperaturze 4 °C przez 10 minut i przenieść supernatanty do nowych probówek o pojemności 15 ml.
    4. Rozcieńczyć 100 μl ekstraktu w stosunku 1:3 (v/v) wodą i przepuścić roztwór przez filtr membranowy 0,2 μm.
    5. Umieścić roztwór w przezroczystej, stałej szklanej probówce o pojemności 300 μl.
  3. Polarna ekstrakcja lipidów
    1. Odważyć 200 mg sproszkow∆anego z liści buraka ćwikłowego w temperaturze -80 °C w plastikowej tubie o pojemności 15 ml w temperaturze -80 °C.
    2. Dodać 200 μl wody, a następnie 2 ml metanolu, a następnie przechowywać na lodzie przez 1 h.
      UWAGA: Wszystkie rozpuszczalniki i dodatki muszą być klasy LC-MS.
    3. Wirować przez 30 s i sonikować przy 40 kHz przez 15 minut.
    4. Odwirować próbki przy 4 500 x g w temperaturze 4 °C przez 25 minut. Zebrać i przenieść fazę chloroformową do probówek o pojemności 2 ml. Odrzucić górną fazę wodno-alkoholową i fazę pośrednią.
    5. Umieścić próbki w koncentratorze próżniowym na 3 godziny w celu odparowania rozpuszczalnika.
    6. Rozpuścić osad otrzymany z kroku 7.3.5 w 600 μl metanolu.
    7. Rozcieńczyć 100 μl ekstraktu w stosunku 1:5 (v/v) metanolem i przepuścić roztwór przez filtr membranowy 0,2 μm.
    8. Umieścić roztwór w przezroczystej, stałej szklanej probówce o pojemności 300 μl.

8. Chromatografia cieczowa, spektrometria mas, analiza i przetwarzanie danych

  1. Skonfiguruj system LC-MS zgodnie z zaleceniami dostawcy.
    UWAGA: Sekcja LC składa się z autosamplera sprzężonego z HPLC wyposażonego w kolumnę ochronną C18 (75 x 2,1 mm, wielkość cząstek 5 μm) przed kolumną C18 (150 x 2,1 mm, wielkość cząstek 3 μm) do analizy metabolitów wtórnych i lipidów polarnych, natomiast z kolumną ochronną HILIC (7,5 x 2,1 mm, 3 μm) przed kolumną HILIC (150 x 2,1 mm, wielkość cząstek 2,7 μm). MS jest spektrometrem masowym z pułapką jonową wyposażonym w źródła jonizacji elektronrozpylającej (ESI) lub jonizacji chemicznej pod ciśnieniem atmosferycznym (APCI).
  2. Przygotować odpowiednie rozpuszczalniki do gradientów HPLC. Do analizy metabolitów pierwotnych należy użyć 20 mM mrówczanu amonu jako rozpuszczalnika A; 95% acetonitryl, 5% woda plus 10 mM mrówczanu amonu jako rozpuszczalnik B. Do analizy metabolitów wtórnych należy użyć wody plus 0,05% kwasu mrówkowego (A) i acetonitrylu plus 0,05% kwasu mrówkowego (B). Do polarnej analizy lipidów użyj wody plus 0,05% kwasu mrówkowego (A) i 100% acetonitrylu (B).
    UWAGA: Rozpuszczalniki i dodatki muszą być klasy LC-MS.
  3. Do elucji metabolitów należy wykorzystać gradienty podane w tabeli 1. Ustaw natężenie przepływu na 0,2 ml/min. Wstrzyknąć 10 μl każdej próbki zarówno w przypadku metabolitów wtórnych, jak i lipidów polarnych, natomiast w przypadku metabolitów pierwotnych należy wstrzyknąć 5 μl.
  4. Przygotować próbkę do kontroli jakości (QC) poprzez zmieszanie równych porcji różnych próbek, aby uzyskać reprezentatywną mieszaninę dla każdego warunku doświadczalnego. Przeanalizuj próbkę kontroli jakości podczas eksperymentu, aby monitorować wydajność urządzenia. W szczególności należy wstawić analizę próbki QC po każdej partii 10 próbek.
  5. Losowo dobieraj próbki, aby uniknąć efektów sterowanych przez instrumenty.
  6. Po 9 analizach należy wstawić metodę czyszczenia kolumny i analizę ślepej próby natychmiast po.
    UWAGA: Wykonać powolny gradient między dwoma rozpuszczalnikami z izokratyczną elucją, przy wysokim procencie najsilniejszego rozpuszczalnika. Ślepa próba polega na wstrzyknięciu czystego metanolu: wody (50/50, v/v) w celu poprawy odtwarzalności czasu retencji w poniższej analizie.
  7. Ustaw przyrząd tak, aby uzyskiwał widma masowe w naprzemiennych trybach jonizacji dodatniej i ujemnej, korzystając z parametrów wymienionych w tabeli 2.
    UWAGA: Inne parametry zależą od konkretnej platformy.
  8. Wykonaj następne przetwarzanie danych, jak wyjaśniono w Dal Santo et al.9.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

W niniejszej pracy przedstawiono schemat opracowania doustnej szczepionki w jadalnych tkankach roślinnych. Głównym celem pracy jest ekspresja białka docelowego w jadalnym gatunku rośliny gospodarza oraz charakterystyka potencjalnej doustnej szczepionki.

Pierwszy etap obejmował ocenę przydatności technologii ekspresji opartej na wirusach roślinnych do produkcji białek rekombinowanych w jadalnych systemach roślinnych. W tym celu w...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym badaniu przeprowadziliśmy wstępną analizę projektu potencjalnej szczepionki doustnej przeciwko cukrzycy autoimmunologicznej. Białko docelowe dla tego eksperymentu było zmutowaną formą ludzkiej dekarboksylazy glutaminianu 65 kDa, której produkcja i funkcjonalność są łatwo wykrywalne i mierzalne12. W jego ekspresji w różnych jadalnych tkankach roślinnych pośredniczyły wektory5, które pośredniczą w wysokim poziomie produkcji białek rekombinowanych w bardzo krótkim czasie...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez Wspólny Projekt "Wykorzystanie roślin do produkcji jadalnej szczepionki autoimmunologicznej przeciwko cukrzycy (eDIVA)" (ID projektu: 891854) finansowany przez Uniwersytet w Weronie w ramach zaproszenia 2014.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,2-μ m Filtry membranowe Minisart RC4Sartorius-Stedim17764
2– merkaptoetanolSigmaM3148Toksyczny; 4 % do przygotowania buforu ładującego z glicerolem, SDS i
kwasem 4-morpholineethanosulfonowym Tris-HCl (MES)SigmaM8250pH 5,5
96-dołkowa płytkaSarstedt833924
Kwas octowySigma27221
acetonitryl LC-MS gatunekSigma34967
AcetosyringoneSigmaD134406Toksyczny – 0,1 M zapas w DMSO
Agar Klasa bakteriologicznaApplichemA094915 g / L do produkcji pożywki LB (pH 7,5 z NaOH) z ekstraktem drożdżowym, NaCl i tryptonem
Mrówczan amonuSigma70221
Przeciwciało anty-eGFPABCamab290
Przeciwciało anty-65/67SigmaG5163
Przeciwciało anty-LHCB2AgriseraAS01 003
Brilliant Blue R-250SigmaB7920
C18 ColumnGrace    -Alltima HP C18 (150 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Kolumna
C18 Kolumna ochronnaGrace    -Alltima HP C18 (7,5 mm x 2,1 mm; 5 μ m) Strażnik  Kolumna
CalMag GrowerPeter Excel15-5-15Nawóz
Karbenicylina disodowaDuchefa BiochemieC0109toksycznej
chemiluminescencjiBioRad1708370ChemiDoc Dotykowy system obrazowania
ChloroformSigmaC2432
DetergentSigmaP5927Polisorbat 20
Czytnik fluorescencyjnyPerkin-Elmer  1420-011VICTOR Multilabel Counter
Kwas mrówkowy LC-MS klasySigma94318
GlicerolSigmaG551615 % do wykonania buforu ładującego z Tris-HCl, SDS i 2– merkaptoetanol
Polimeraza GoTaq G2PromegaM7841
HClSigmaH1758
kolumna HILICGrace    -Ascentis Express HILIC (150 mm x 2,1 mm; wielkość cząstek 2,7 μ m) Kolumna
HILIC Strażnik KolumnaŁaska    -Vision HT HILIC (7,5 mm x 2,1 mm; 3 μ m) Strażnik  Kolumna
Sprzężone przeciwciało antykrólicze przeciwko peroksydazie chrzanowej (HRP)SigmaA6154Nie zamrażać/rozmrażać zbyt wiele razy
HPLC AutosamplerBeckman Coulter    -System Gold 508 Autosampler
HPLC SystemBeckman Coulter    -System Gold 128 Moduł rozpuszczalnika HPLC
IsopropanolSigma24137Łatwopalny
siarczan kanamycynySigmaK4000Toksyczny
KClSigmaP95412 g / L z NaCl, Na2< / sub>HPO4 i KH2PO4 do produkcji PBS
KH2PO4 SigmaP97912,4 g/L z NaCl, Na2HPO4 i KCl do przygotowania
roztworu Luminol
Ge HealthcareRPN2232Przygotuj roztwór, korzystając z zestawu komercyjnego ECL Prime Western Blotting System
Liofilizator5PascalLIO5P0000DGT
Spektrometr masyBruker Daltonika  -Bruker Esquire 6000; spektrometr masowy był wyposażony w źródło ESI, a analizator był pułapką jonową
MetanolSigma32213
MgSO4SigmaM7506
Roztwór blokujący mlekoRistora    -3 % w PBS
Na2HPO4SigmaS7907Stosować z NaH2PO4 do wytworzenia buforu fosforanu sodu
NaClSigmaS301480 g/L z KCl, Na2HPO4 i KH2PO4 do wytworzenia PBS; 10 g/L do uzyskania pożywki LB (pH 7,5 z NaOH) z ekstraktem drożdżowym, Trypton i agar Klasa bakteriologiczna
NaH2PO4SigmaS8282  Stosować z Na2HPO4 do wytwarzania buforu fosforanu sodu; 14,4 g/L do produkcji PBS
NaOHSigmaS8045
Membrana nitrocelulazowaGe Healthcare10600002
Pepsyna z błony śluzowej żołądka świńSigmaP7000
Podłoże peroksydazy ECLGE HealthcareRPN2235Materiał wrażliwy na światło
Prasa próżniowa z pompąVWR111400000098
Odczynnik ASigmaB9643Użyj 50 części tego odczynnika z 1 częścią odczynnika B do przygotowania roztworu roboczego BCA
Odczynnik BSigmaB9643Użyj 1 części tego odczynnika z 50 częściami odczynnika A do przygotowania roztworu roboczego BCA
RyfampicynaDuchefa BiochemieR0146Toksyczny – 25 mg / ml w DMSO
SDS (dodecylosiarczan sodu)SigmaL3771Łatwopalny, toksyczny, - 10 % zapasu; 3 % do wykonania buforu ładującego z Tris-HCl, glicerolem i 2– merkaptoetanol
Pirosiarczyn soduSigma7681-57-4
System SonicatorSoltec090.003.0003Sonica® 2200 MH; częstotliwość 40 kHz
StrzykawkaTerumo    -
Przezroczyste stałe 300-&mikro; L wkładka szklanerurki Thermo Scientific11573680
Trizma BaseSigmaT1503Dostosuj pH za pomocą 1N HCl, aby uzyskać bufor Tris-HCl, użyj 1,5M Tris-HCl (pH 6,8), aby uzyskać bufor ładujący z SDS, glicerolem i 2– merkaptoetanol
TryptonFormediumTRP0310 g / L do przygotowania pożywki LB (pH 7,5 z NaOH) z ekstraktem drożdżowym, NaCl i agarem Koncentrator próżniowy klasy bakteriologicznej
Heto3878 F1-3System Speed-vac
Woda LC-MS klasaSigma39253
Ekstrakt drożdżowySigmaY13335 g/l do przygotowania pożywki LB (pH 7,5 z NaOH) z tryptonem, NaCl i agarem Klasa bakteriologiczna
System obrazowania bufora ładującego PBS

Bibliografia

  1. Merlin, M., Pezzotti, M., Avesani, L. Edible plants for oral delivery of biopharmaceuticals. British Journal of Clinical Pharmacology. 83 (1), 71-81 (2017).
  2. Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: The green perspective. BioMed Research International. , (2014).
  3. Menkhaus, T. J., Bai, Y., Zhang, C., Nikolov, Z. L., Glatz, C. E. Considerations for the recovery of recombinant proteins from plants. Biotechnology Progress. 20 (4), 1001-1014 (2004).
  4. Avesani, L., Bortesi, L., Santi, L., Falorni, A., Pezzotti, M. Plant-made pharmaceuticals for the prevention and treatment of autoimmune diseases: Where are we? Expert Review of Vaccines. 9 (8), 957(2010).
  5. Marillonnet, S., Thoeringer, C., Kandzia, R., Klimyuk, V., Gleba, Y. Systemic Agrobacterium tumefaciens-mediated transfection of viral replicons for efficient transient expression in plants. Nature Biotechnology. 23, (2005).
  6. Ludvigsson, J. Update on treatment of type 1 diabetes in childhood. Current Pediatric Reviews. 1 (2), 118-127 (2013).
  7. Merlin, M., et al. Enhanced GAD65 production in plants using the MagnICON transient expression system: Optimization of upstream production and downstream processing. Biotechnology Journal. 11 (4), 542-553 (2016).
  8. Gecchele, E., Merlin, M., Brozzetti, A., Falorni, A., Pezzotti, M., Avesani, L. A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems. Journal of Visualized Experiments. 23 (97), (2015).
  9. Dal Santo, S., et al. The terroir concept interpreted through grape berry metabolomics and transcriptomics. Journal of Visualized Experiments. 5 (116), (2016).
  10. Chen, Q., et al. Agroinfiltration as an effective and scalable strategy of gene delivery for production of pharmaceutical proteins. Advanced Techniques in Biology and Medicine. 1 (1), (2013).
  11. Bertini, E., et al. Design of a type-1 diabetes vaccine candidate using edible plants expressing a major autoantigen. Frontiers in Plant Science. 9, Article 572 (2018).
  12. Avesani, L., et al. Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65). Transgenic Research. 12 (2), 203-212 (2003).
  13. Sepúlveda-Jiménez, G., Rueda-Benítez, P., Porta, H., Rocha-Sosa, M. A red beet (Beta vulgaris) UDP-glucosyltransferase gene induced by wounding, bacterial infiltration and oxidative stress. Journal of Experimental Botany. 56, jxb/eri036 (2005).
  14. Renukuntla, J., Vadlapudi, A. D., Patel, A., Boddu, S. H. S., Mitra, A. Approaches for enhancing oral bioavailability of peptides and proteins. International Journal of Pharmaceutics. 447, 75-93 (2013).
  15. Mustafa, A. Z. Encapsulation importance in pharmaceutical area, how it is done and issues about herbal extraction. , Available from: https://www.researchgate.net/publication/271702091_Encapsulation_importance_in_pharmaceutical_area_how_it_is_done_and_issues_about_herbal_extraction (2015).
  16. Kamei, N., et al. Complexation hydrogels for intestinal delivery of interferon beta and calcitonin. Journal of Controlled Release. 134, 98-102 (2009).
  17. Tuesca, A., et al. Complexation hydrogels for oral insulin delivery: effects of polymer dosing on in vivo efficacy. Journal of Pharmaceutical Sciences. 97, 2607-2618 (2008).
  18. Twyman, R. M., Schillberg, S., Fischer, R. Optimizing the yield of recombinant pharmaceutical proteins in plants. Current Pharmaceutical Design. 19, 5486-5494 (2013).
  19. Dhama, K., et al. Plant-based oral vaccines for human and animal pathogens – a new era of prophylaxis: current and future perspectives. Journal of Experimental Biology and Agricultural Sciences. 447 (0), 75-93 (2013).
  20. Hefferon, K. Reconceptualizing cancer immunotherapy based on plant production systems. Future science. O3, FSO217 (2017).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

szczepionka doustnainfiltracja pr niowaAgrobacteriumWestern blottrawienie o dkoweliofilizacjabia ko rekombinowane
Przejściowa ekspresja w buraka ćwikłowym biofarmaceutycznej szczepionki kandydackiej przeciwko cukrzycy typu 1
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.