Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

12.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/59502

⸱

7 czerwca 2019

 ,  , 
1Division of Genetics, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, 2Department of Medicine, Harvard Medical School

W tym artykule

Podsumowanie

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Streszczenie

Rak piersi jest chorobą niejednorodną, prawdopodobnie spowodowaną złożonymi interakcjami między różnymi komórkami pochodzenia i zdarzeniami onkogennymi. Modele mysie odgrywają zasadniczą rolę w uzyskiwaniu wglądu w te złożone procesy. Chociaż opracowano wiele modeli mysich w celu zbadania udziału różnych zdarzeń onkogennych i komórek pochodzenia w nowotworzeniu piersi, modele te często nie są specyficzne dla typu komórki lub narządu lub nie mogą indukować inicjacji nowotworzenia sutka w sposób kontrolowany czasowo. W tym miejscu opisujemy protokół generowania nowego typu mysich modeli raka piersi opartych na doprzewodowym wstrzyknięciu adenowirusa z ekspresją Cre (Ad-Cre) do mysich gruczołów sutkowych (MG). Ze względu na bezpośrednie wstrzyknięcie Ad-Cre do przewodów sutkowych, podejście to jest specyficzne dla MG, bez niepożądanej indukcji raka w innych narządach. Zabieg iniekcji doprzewodowej może być wykonywany u myszy na różnych etapach rozwoju MG (dzięki czemu pozwala na czasową kontrolę indukcji raka, począwszy od ~3-4 tygodnia życia). Swoistość typu komórki można osiągnąć poprzez zastosowanie różnych promotorów specyficznych dla typu komórki do stymulowania ekspresji Cre w wektorze adenowirusowym. Pokazujemy, że luminalne i podstawne komórki nabłonka sutka (MEC) mogą być ściśle ukierunkowane na manipulację genetyczną opartą na Cre / loxP poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie Ad-Cre pod kontrolą odpowiednio promotora keratyny 8 lub keratyny 5. Włączając warunkowy reporter Cre (np. Reporter Rosa26-YFP indukowany przez Cre / loxP), pokazujemy, że MEC ukierunkowane na Ad-Cre i pochodzące z nich komórki nowotworowe można śledzić, podążając za komórkami reporterowo-dodatnimi po wstrzyknięciu doprzewodowym.

Wprowadzenie

Ogólnym celem tej metody jest opracowanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzyknięciu Ad-Cre do mysiego MG. Podejście genetyczne oparte na rekombinacji Cre/loxP jest szeroko stosowane do modelowania ludzkiego raka piersi u myszy. Pierwsza generacja mysich modeli raka piersi opartych na Cre/loxP jest generowana przy użyciu transgenicznych myszy z ekspresją Cre pod kontrolą promotorów specyficznych dla MEC (np. MMTV-Cre dla luminalnych MEC i części podstawowych MEC, Wap-Cre i Blg-Cre dla luminalnych progenitorów i pęcherzyków płucnych luminalnych MEC, K14-Cre dla podstawowych i części luminalnych MECs1,2,3,4,5)6,7,8,9. Jednakże, podczas gdy te transgeniczne linie Cre umożliwiają przestrzenną kontrolę ekspresji Cre (tj. w różnych podzbiorach MEC), nie pozwalają na czasową kontrolę ekspresji Cre i manipulacji genetycznej za pośrednictwem Cre / loxP. Druga generacja mysich modeli raka piersi opartych na Cre/loxP wykorzystuje indukowalne podejścia do aktywności/ekspresji Cre (np. zastosowanie fuzji receptora Cre-estrogen [CreER], która może indukować rekombinację Cre/loxP tylko po podaniu tamoksyfenu), w wyniku czego te narzędzia genetyczne umożliwiają zarówno przestrzenną, jak i czasową kontrolę aktywacji zdarzeń onkogennych w MEC (np. Modele oparte na K8-CreER- i K5-CreER)10,11,12. W obu generacjach mysich modeli raka piersi, jako promotory używane do napędzania ekspresji Cre lub CreER (np. Krt8, Krt5) mogą być również aktywne w komórkach nabłonkowych innych narządów (tj. są specyficzne dla typu komórki, ale nie są specyficzne dla narządu) lub mają nieszczelną ekspresję w typach komórek innych niż komórki nabłonkowe (np. MMTV, który ma nieszczelną aktywność w komórkach krwiotwórczych szpiku kostnego), Takie podejścia mogą prowadzić do rozwoju niechcianego raka (nowotworów) w innych narządach. Jeśli te nieoczekiwane nowotwory powodują śmiertelność u dotkniętych nimi myszy, pierwotny cel modelowania raka piersi u tych myszy może być zabroniony (np. zdarzenia onkogenne wywołane MMTV-Cre mogą prowadzić do nowotworów układu krwiotwórczego i wczesnej śmierci myszy z powodu nieszczelności promotora MMTV w komórkach krwiotwórczych)4.

Tutaj przedstawiamy podejście do modelowania raka piersi u myszy, które pozwala zarówno na manipulację zdarzeniami onkogennymi w sposób kontrolowany czasowo, zarówno dla typu komórki, jak i narządu. Podejście to opiera się na doprzewodowym wstrzyknięciu Ad-Cre do mysich MG (a zatem jest specyficzne dla narządu). Ekspresję Cre można kontrolować za pomocą różnych promotorów specyficznych dla subpopulacji MEC osadzonych w wektorze adenowirusowym (np. Krt8 dla luminalnych MEC, Krt5 dla podstawowych MEC, osiągając w ten sposób swoistość dla typu komórki). Indukcja raka w MG może być czasowo kontrolowana przez wstrzyknięcie Ad-Cre myszom w różnym wieku, począwszy od 3-4 tygodnia życia (okres dojrzewania) do stadium dorosłego.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) z Brigham and Women's Hospital.

1. Generowanie i utrzymywanie myszy z klapkami

  1. Uzyskaj istotny dla raka piersi warunkowy nokaut warunkowy (np. Trp53tm1Brn [określany jako Trp53L/L], Brca1tm1Aash [Brca1L/L]) lub warunkowe linie myszy knock-in (np. Gt(ROSA)26Sortm1(Pik3ca*H1047R)Egan) z repozytorium The Jackson Laboratory (JAX) lub NCI Mouse Models of Human Cancer Consortium (MMHCC). Ponadto, aby ułatwić pogoń za MEC, które ulegają rekombinacji za pośrednictwem Cre, można również uzyskać warunkową linię Cre-reporter z JAX (np. Gt(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos [określane jako R26Y]).
  2. Rozmnażać myszy homozygotyczne Trp53 L/L z homozygotycznymi myszami reporterowymi R26Y lub z homozygotycznymi myszami przenoszącymi allele reporterowe R26Y i wszelkie dodatkowe floksowane allele warunkowego nokautu lub knock-in dla różnych modeli myszy, w celu uzyskania heterozygotycznego męskiego i żeńskiego potomstwa F1.
  3. Krzyżuj heterozygotyczne samce i samice myszy F1 w celu uzyskania samic myszy ze związkiem F2, które są homozygotyczne dla każdego allelu (jako myszy eksperymentalne), a także homozygotycznych samic tylko z R26Y (jako myszy kontrolne). Myszy z genotypem F2 w oparciu o startery PCR i warunki cykliczne wymienione poniżej, poprzez ustawienie dwóch standardowych reakcji PCR 20 μL (przy użyciu Taq 5X Master Mix) w dwóch różnych probówkach PCR, jednej ze starterami R26Y, a drugiej ze starterami Trp53L. Używaj dorosłych myszy (zwykle w wieku około 2-4 miesięcy) do wszystkich hodowli.
    1. W przypadku R26Y należy przeprowadzić PCR w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, następnie w temperaturze 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę przez 35 cykli, a następnie w temperaturze 72 °C przez 3 minuty i utrzymywać w temperaturze 14 °C. Należy użyć starterów (i) R26YFP-1: AAA GTC GCT CTG AGT TGT TAT; (ii) R26YFP-2: GCG, AAG, AGT, TTTG, TCC, TCA, ACC; (iii) R26YFP-3: GGA GCG GGA GAA ATG GAT ATG.
      UWAGA: Pojedyncze prążki PCR o długości 250 pz wskazują na homozygotę R26Y, pojedyncze prążki PCR o długości 500 pz wskazują na typ dziki (WT), a dwa prążki PCR (R26Y: 250 pz, WT: 500 pz) wskazują na heterozygotę R26Y (Figura 1A).
      W przypadku Trp53L należy przeprowadzić PCR w temperaturze 94 °C przez 3 minuty, następnie w temperaturze 94 °C przez 30 s, 60 °C przez 30 s i w temperaturze 72 °C przez 1 minutę przez 35 cykli, a następnie w temperaturze 72 °C przez 3 minuty i utrzymywać w temperaturze 14 °C. Stosować startery (i) p53F2-10 1F: CAC AAA AAC AGG TTA AAC CCA G; (ii) P53F2-10 1R: AGC ACA TAG GAG GCA GAG AC.
      UWAGA: Pojedyncze prążko PCR 370 pz wskazuje na homozygotę Trp53L/L, pojedyncze prążko PCR 288 pz wskazuje na Trp53 +/+ WT, a dwa prążki PCR (WT: 288 pz, Trp53L: 370 pz) wskazują na heterozygotę Trp53 L/+ (Rysunek 1B).

2. Przygotowanie przedoperacyjne

  1. Wszystkie narzędzia chirurgiczne należy sterylizować w autoklawie na 1 dzień przed zabiegiem.
  2. Przygotować 0,1% błękitu bromofenolowego w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanem (PBS) i przechowywać w temperaturze 4 °C. Rozcieńczyć Ad-Cre, który będzie używany do wstrzykiwania doprzewodowego w pożywce DMEM 0,01 M CaCl2 i błękitem bromofenolowym w stosunku 1:10 (tj. mieszanina do wstrzykiwań).
    UWAGA: Zastosowany tutaj Ad-Cre został uzyskany z University of Iowa Viral Vector Core, z podstawowym mianem wirusa ~1010–1011 pfu/ml.
  3. Znieczulić samicę myszy (pokolenie F2 opisane w kroku 1.2, wiek od 3 do 4 tygodni do dorosłego osobnika) za pomocą komory izofluranowej i nałożyć maść do oczu. Podczas zabiegu należy znieczulać mysz w sposób ciągły, upewniając się, że wdycha 1%–2,5% izofluranu w tlenie. Sprawdzaj głębokość znieczulenia co najmniej co 15 minut, wykonując uszczypnięcie palca u nogi. Uważnie monitoruj mysz pod kątem zmian w częstości oddechów, odpowiednio dostosowując poziom izofluranu, jeśli to konieczne.
  4. Meloksykam należy wstrzyknąć podskórnie w postaci środka przeciwbólowego w dawce 5 mg/kg mc. przed zabiegiem chirurgicznym.
  5. Odsłoń miejsce operacji brodawki sutkowej, nakładając kilka kropli kremu do depilacji; usuń nadmiar kremu i luźne włosy za pomocą miękkich ręczników papierowych.
    UWAGA: Wykonaj ten krok w obszarze oddzielonym od miejsca, w którym ma być wykonana operacja. Nie zaleca się golenia, aby uniknąć uszkodzenia brodawek sutkowych. Zachowaj ostrożność, aby usunąć chemiczny środek do depilacji w odpowiednim czasie. Pozostawienie środka na zbyt długo może spowodować oparzenie chemiczne skóry
  6. Najpierw zdezynfekuj miejsce operowane jodoforami, następnie 70% alkoholem, a na końcu nałóż jodofory peelingujące. Zrób to okrężnymi ruchami od środka obszaru roboczego w kierunku obrzeża za pomocą gąbki z gazy lub aplikatora z bawełnianą końcówką. Powtórz cykl 3x–4x.

3. Iniekcja wewnątrzprzewodowa

  1. Stosuj techniki aseptyczne podczas całego zabiegu chirurgicznego.
  2. Wykonaj nacięcie na skórze na długości ~1 cm między dwoma czwartymi pachwinowymi MG (Ryc. 2). Ostrożnie oddziel płat skóry (z MG) od otrzewnej ciemieniowej, aby uwidocznić drzewo przewodowe sutka.
  3. Ostrożnie przytrzymaj sutek kleszczami zegarmistrzowskimi i usuń zewnętrzną sutek bez przecinania pobliskiej skóry, używając nożyczek do mikropreparacji.
  4. Załaduj ~3–5 μl mieszaniny iniekcyjnej Ad-Cre do strzykawki Hamilton o pojemności 25 μl z przymocowaną metalową igłą piasty 33 G. Oszacować objętość mieszaniny do wstrzykiwań w strzykawce na podstawie niebieskiego barwnika zawartego w mieszaninie.
    UWAGA: Mniejszą objętość (np. 3 μl) należy stosować podczas wstrzykiwania do MG u samic w wieku 3–4 tygodni i większą objętość (np. 10 μL) podczas wstrzykiwania do MG samic karmiących.
  5. Delikatnie przytrzymaj krawędź płata skóry delikatną, zakrzywioną pęsetą i powoli wstrzyknij mieszaninę do wstrzykiwań Ad-Cre do brodawki, w międzyczasie monitorując rozprzestrzenianie się niebieskiego barwnika w drzewie przewodowym sutka. Utrzymuj szybkość wtrysku na jak najniższym poziomie, aby uniknąć uszkodzenia prześwitu kanałowego.
    UWAGA: Wstrzyknięty płyn (jak ilustruje dołączony niebieski barwnik bromofenolowy) rozprzestrzeniający się po całym drzewie przewodowym bez wycieku do komory zrębu wskazuje na udane wstrzyknięcie wewnątrzprzewodowe.
  6. Delikatnie wyjąć igłę z brodawki, aby uniknąć wycieku wstrzykniętego płynu.
  7. Zbadać dystalną stronę (tj. z dala od brodawki sutkowej) MG lub okolice wstrzykiwanego sutka. Należy zauważyć, że pęczniejący niebieski barwnik (tj. barwnik dyfundujący do pobliskiego zrębu) wskazuje na wstrzyknięcie poduszeczki tłuszczowej sutka, a nie na udane wstrzyknięcie doprzewodowe.
  8. Zamknij rany chirurgiczne (od kroku 3.2) w skórze za pomocą klipsów do ran.

4. Opieka pooperacyjna

  1. Wyjmij mysz ze znieczulenia i umieść ją na poduszce grzewczej w czystej klatce w celu odzyskania sprawności.
  2. Meloksykam należy podać ponownie podskórnie w dawce 5 mg/kg mc., 24 godziny po zabiegu.
  3. Monitoruj ogólny stan zwierzęcia i szukaj oznak infekcji w miejscu nacięcia przez 5 dni.
  4. Klipsy na rany usuwa się ~7-10 dni po zabiegu.

5. Monitorowanie rozwoju guza sutka

  1. Monitoruj myszy, którym wstrzyknięto szczepienie dwa razy w tygodniu za pomocą badania palpacyjnego pod kątem jakichkolwiek oznak rozwoju guza sutka.
  2. Gdy guz jest wyczuwalny, codziennie monitoruj mysz i mierz rozmiar guza, aż osiągnie eksperymentalny punkt końcowy, określony na podstawie wielkości (np. osiągnięcie 10%-15% masy ciała myszy) lub stanu (np. owrzodzenie lub martwica) guza lub ogólnego stanu zdrowia myszy (np. śpiączka, konający).
  3. Poddaj mysz eutanazji przez uduszenie dwutlenkiem węgla, a następnie metodę wtórną (np. zwichnięcie szyjki macicy).
  4. Wyizoluj tkanki guza sutka i przeanalizuj je za pomocą cytometrii przepływowej, immunofluorescencji lub profilowania ekspresji (np. przez sekwencjonowanie RNA [RNAseq] lub mikromacierz), jak opisano wcześniej12.
  5. Wykonaj analizę cytometrii przepływowej przez bramkowanie dla komórek ujemnych pod względem linii (Lin-: ujemny dla markerów linii CD45 [marker leukocytów], CD31 [marker komórek śródbłonka] i TER119 [marker erytrocytów]) i przeanalizuj komórki w guzie na podstawie ich ekspresji YFP, CD24 i CD29.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Reprezentatywne wyniki genotypowania PCR dla alleli R26Y oraz Trp53L przedstawiono na Rysunku 1.

Choć w zasadzie wszystkie 10 gruczołów mlekowych (MG) może zostać poddanych procedurze wstrzyknięcia do przewodów, w praktyce do iniekcji zazwyczaj wybiera się dwa czwarte gruczoły pachwinowe ze względu na ich łatwiejszy dostęp i większe rozmiary (Rysunek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Sukces tego podejścia do indukowania guzów sutka z różnych subpopulacji MEC zależy nie tylko od wyboru odpowiednich promotorów specyficznych dla typu komórki (w celu stymulowania ekspresji Cre), ale także od samej procedury iniekcji doprzewodowej. Ideą tego podejścia jest to, że wstrzyknięte wirusy Ad-Cre są zatrzymywane w drzewie przewodowym, które jest ukrytą strukturą ze światłem, a zatem tylko MEC są narażone na wirusy i są zainfekowane przez Ad-Cre. Ze względu na ograniczoną przestrzeń światła w przewodach sutkowych...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez National Institutes of Health (NIH) grant R01 CA222560 oraz przez Nagrodę Departamentu Obrony za przełom W81XWH-18-1-0037.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Igła o rozmiarze 337803-05Styl punktowy 3
7mm klips refleksyjnyBraintree ScientificRF7 CS
Adenowirus, Ad-K5-CreUniversity of Iowa Wektor wirusowyRdzeń Ad5-bk5-Cre (VVC-Berns-1547)
Adenowirus, Ad-K8-CreUniversity of Iowa Wektor wirusowyCore Ad5mK8-nlsCre
AlkoholFisherHC800-1GALPrzygotuj się do 70% użycia
biotynylowany CD31eBiosciences13-0311-85
biotynylowany CD45eBiosciences13-0451-85
biotynylowany TER119eBiosciences13-5921-85
Bromofenol BlueSigma-AldrichB0126-25G
CD24-AF-700BD Pharmingen564237
CD24-PEeBiosciences12-0242-83
CD29-APCeBiosciences17-0291-82
CD29-PEeBiosciences12-0291-82
Balsam do depilacjiNair9 uncji
Strzykawka HamiltonHamilton7636-010,025 ml
JodoforyBetadina10% Powidon-jod
IzofluranBaxterNDC 10019-360-401-2,5%
LoxicamNorbrookNDC 55529-040-105 mg / ml
Smar Maść do oczuAkornNDC 17478-062-35
Nożyczki do mikropreparacjiPentair9MKleszcze zegarmistrzowskie
Pęseta do mikropreparacjiDumontM5
Taq 5X Master MixNew England BiolabsM0285L
Hamilton

Bibliografia

  1. Wagner, K. U., et al. Cre-mediated gene deletion in the mammary gland. Nucleic Acids Research. 25 (21), 4323-4330 (1997).
  2. Selbert, S., et al. Efficient BLG-Cre mediated gene deletion in the mammary gland. Transgenic Research. 7 (5), 387-396 (1998).
  3. Jonkers, J., et al. Synergistic tumor suppressor activity of BRCA2 and p53 in a conditional mouse model for breast cancer. Nature Genetics. 29 (4), 418-425 (2001).
  4. van Bragt, M. P., Hu, X., Xie, Y., Li, Z. RUNX1, a transcription factor mutated in breast cancer, controls the fate of ER-positive mammary luminal cells. eLife. 3, e03881(2014).
  5. Tao, L., van Bragt, M. P., Li, Z. A Long-Lived Luminal Subpopulation Enriched with Alveolar Progenitors Serves as Cellular Origin of Heterogeneous Mammary Tumors. Stem Cell Reports. 5 (1), 60-74 (2015).
  6. Xu, X., et al. Conditional mutation of Brca1 in mammary epithelial cells results in blunted ductal morphogenesis and tumour formation. Nature Genetics. 22 (1), 37-43 (1999).
  7. Li, Z., et al. ETV6-NTRK3 fusion oncogene initiates breast cancer from committed mammary progenitors via activation of AP1 complex. Cancer Cell. 12 (6), 542-558 (2007).
  8. Liu, X., et al. Somatic loss of BRCA1 and p53 in mice induces mammary tumors with features of human BRCA1-mutated basal-like breast cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (29), 12111-12116 (2007).
  9. Molyneux, G., et al. BRCA1 basal-like breast cancers originate from luminal epithelial progenitors and not from basal stem cells. Cell Stem Cell. 7 (3), 403-417 (2010).
  10. Koren, S., et al. PIK3CA induces multipotency and multi-lineage mammary tumours. Nature. 525 (7567), 114-118 (2015).
  11. Van Keymeulen, A., et al. Reactivation of multipotency by oncogenic PIK3CA induces breast tumour heterogeneity. Nature. 525 (7567), 119-123 (2015).
  12. Tao, L., Xiang, D., Xie, Y., Bronson, R. T., Li, Z. Induced p53 loss in mouse luminal cells causes clonal expansion and development of mammary tumours. Nature Communications. 8, 14431(2017).
  13. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage Tracing of Mammary Epithelial Cells Using Cell-Type-Specific Cre-Expressing Adenoviruses. Stem Cell Reports. 2 (6), 770-779 (2014).
  14. Sutherland, K. D., et al. Cell of origin of small cell lung cancer: inactivation of Trp53 and Rb1 in distinct cell types of adult mouse lung. Cancer Cell. 19 (6), 754-764 (2011).
  15. Shackleton, M., et al. Generation of a functional mammary gland from a single stem cell. Nature. 439 (7072), 84-88 (2006).
  16. The Cancer Genome Atlas Network. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).
  17. Nik-Zainal, S., et al. The life history of 21 breast cancers. Cell. 149 (5), 994-1007 (2012).
  18. Abba, M. C., et al. A Molecular Portrait of High-Grade Ductal Carcinoma In Situ. Cancer Research. 75 (18), 3980-3990 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Wtryskiwanie adenowirusapromotor keratyny 8promotor keratyny 5cytometria przepływowareporter Rosa26-YFPkomórki nabłonka gruczołu mlekowegomodel raka piersi
Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.