Monitorowanie interakcji GPCR-β-arrestin1/2 w żywych systemach w czasie rzeczywistym w celu przyspieszenia odkrywania leków

Podsumowanie

Interakcje GPCR-β-aresztin to nowa dziedzina w odkrywaniu leków GPCR. Dokładne, precyzyjne i łatwe do skonfigurowania metody są niezbędne do monitorowania takich interakcji w żywych systemach. Pokazujemy test komplementacji strukturalnej do monitorowania interakcji GPCR-β-arrestin w żywych komórkach w czasie rzeczywistym i można go rozszerzyć na dowolny GPCR.

Streszczenie

Interakcje między receptorami sprzężonymi z białkiem G (GPCR) a β-aresztinami są istotnymi procesami o bardzo ważnych implikacjach fizjologicznych. Obecnie charakterystyka nowych leków pod kątem ich interakcji z β-aresztinami i innymi białkami cytozolowymi jest niezwykle cenna w dziedzinie odkrywania leków GPCR, szczególnie podczas badań agonizmu tendencyjnego GPCR. W tym miejscu pokazujemy zastosowanie nowatorskiego testu komplementacji strukturalnej do dokładnego monitorowania interakcji receptor-β-aresztin w żywych systemach w czasie rzeczywistym. Metoda ta jest prosta, dokładna i może być łatwo rozszerzona na dowolny interesujący GPCR, a także ma tę zaletę, że pokonuje niespecyficzne interakcje ze względu na obecność promotora o niskiej ekspresji obecnego w każdym systemie wektorowym. Ten test komplementacji strukturalnej zapewnia kluczowe cechy, które umożliwiają dokładne i precyzyjne monitorowanie interakcji receptor-β-aresztyna, dzięki czemu nadaje się do badania tendencyjnego agonizmu dowolnego układu GPCR, a także kodów "fosforylacji" c-końca GPCR napisanych przez różne kinazy GPCR (GRK) i potranslacyjne modyfikacje aresztin, które stabilizują lub destabilizują kompleks receptor-β-aresztyna.

Wprowadzenie

GPCRs stanowią cel prawie 35% obecnych leków na rynku^1,2 a jasne zrozumienie ich farmakologii jest kluczowe w rozwoju nowych leków terapeutycznych³. Jednym z kluczowych aspektów odkrywania leków GPCR, szczególnie podczas opracowywania tendencyjnych agonistów, jest charakterystyka nowych ligandów w kierunku interakcji receptor-β-arrestin⁴ i β-arrestin interakcji z innymi białkami cytozolowymi, takimi jak clathrin⁵.

Udokumentowano, że sygnalizacja zależna od β-arrestin odgrywa kluczową rolę w zaburzeniach neurologicznych, takich jak choroba afektywna dwubiegunowa, duża depresja i schizofrenia⁶ a także poważne skutki uboczne niektórych leków, takich jak morfina⁷.

Obecne metody używane do monitorowania tych interakcji zazwyczaj nie reprezentują rzeczywistych endogennych poziomów badanych białek, w niektórych przypadkach wykazują słaby sygnał, fotowybielanie i w zależności od GPCR konfiguracja może być technicznie trudna⁸. Ten nowatorski test komplementacji strukturalnej wykorzystuje wektory promotorowe o niskiej ekspresji w celu naśladowania endogennych poziomów fizjologicznych i zapewnia wysoką czułość w porównaniu z obecnymi metodami⁹. Korzystając z tego podejścia, możliwe było łatwe scharakteryzowanie interakcji receptora galaniny-β-aresztyny1/2, a także β-aresztyny2-klatryny¹⁰. Metodologia ta może być szeroko stosowana do każdego GPCR o szczególnym znaczeniu, w którym β-aresztiny odgrywają kluczową funkcję fizjologiczną lub ich sygnalizacja jest istotna w niektórych chorobach.

Protokół

1. Strategia projektowania podkładów

1. Zaprojektuj startery do wprowadzenia interesujących genów do wektorów pBiT1.1-C [TK/LgBiT], pBiT2.1-C [TK/SmBiT], pBiT1.1-N [TK/LgBiT] i pBiT2.1-N [TK/SmBiT].
2. Wybierz co najmniej jedno z tych trzech miejsc jako jedno z dwóch unikalnych enzymów restrykcyjnych potrzebnych do klonowania kierunkowego ze względu na obecność kodonu stop w ramce, który dzieli miejsce multiklonowania, jak pokazano w Rysunek 1¹¹.
3. Włącz sekwencję nukleotydów do starterów, jak pokazano w Tabeli 1, aby zakodować reszty łącznika pokazane na czerwono w Tabeli 2¹¹.
4. W przypadku wektorów pBiT1.1-C [TK/LgBiT] i pBiT2.1-C [TK/SmBiT] upewnij się, że starter 5 ́ zawiera kodon ATG i silną sekwencję konsensusu Kozaka (GCCGCCACC).
5. Dla wektorów pBiT1.1-N [TK/LgBiT] i pBiT2.1-N [TK/SmBiT] upewnij się, że starter 3 ́ zawiera kodon stop.
   UWAGA: Każdy wektor zawiera promotor HSV-TK w celu zminimalizowania niespecyficznych asocjacji i zmniejszenia artefaktów eksperymentalnych, a także każdy wektor ma kasetę ekspresji oporności na ampicylinę u bakterii.

2. PCR

1. Przygotuj i uruchom reakcje PCR w celu amplifikacji wstawionego DNA interesującego genu przy użyciu starterów zaprojektowanych od kroku 1. Ważne jest, aby używać polimerazy DNA o wysokiej wierności, aby zminimalizować mutacje.
2. Użyj dokładnie następującej kolejności, aby przygotować 50 μL reakcji PCR. Dodać 35,5 μl wody destylowanej, 5 μl 10x buforu polimerazy, 5 μl mieszaniny dNTP (po 2,5 mM), 1 μl matrycy plazmidu (200 ng/μL), 1,25 μl starterów do przodu i do tyłu (10 μM) i 1 μl polimerazy o wysokiej wierności (5 U/μL).
3. Za pomocą termocyklera skonfiguruj następujący program amplifikacji DNA.
   1. Denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 min.
   2. Powtórz 25 razy następujący cykl termiczny: 95 °C przez 30 s, 60 °C przez 1 minutę, 72 °C przez 2 minuty na 1 kbp, aby zostać amplifikowanym.
   3. Uruchomić końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C przez 10 minut.
   4. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C w termocyklerze.
      UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie polimerazy o wysokiej wierności w celu zminimalizowania mutacji punktowych, szczególnie tych występujących podczas amplifikacji długich sekwencji. W miarę jak amplikon staje się dłuższy, stopień dokładności replikacji DNA maleje. W przypadku reakcji PCR wybierz temperaturę wyżarzania w oparciu o temperaturę topnienia obszaru, w którym oligonukleotydy bezpośrednio hybrydyzują z matrycą DNA, a nie z całą sekwencją startera.
4. Oczyszczanie produktu metodą PCR
   1. Odizoluj produkt PCR od reszty reakcji PCR za pomocą zestawu od producenta preferencyjnego¹². Produkt PCR jest teraz gotowy do trawienia restrykcyjnego.

3. Trawienie DNA

1. Do mineralizacji produktu PCR należy przygotować 50 μl reakcji trawienia w następujący sposób.
   1. Za pomocą probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 12 μl wody destylowanej.
   2. Dodaj 5 μl buforu 10x o najlepszej kompatybilności z obydwoma enzymami restrykcyjnymi.
   3. Z kroku 2.4 dodać 30 μl produktu PCR
   4. Na koniec dodaj 1,5 μl każdego enzymu restrykcyjnego.
   5. Krótko wymieszać wirowo i inkubować w temperaturze 37,5 °C przez noc.
2. Do trawienia plazmidu biorcy należy przygotować 50 μl reakcji trawienia w następujący sposób:
   1. Za pomocą probówki o pojemności 1,5 ml dodaj 23 μl wody destylowanej.
   2. Dodaj 5 μl buforu 10x o najlepszej kompatybilności z obydwoma enzymami restrykcyjnymi.
   3. Dodać 15 μl plazmidu biorcy (200 ng/μL).
   4. Dodać 1,5 μl każdego enzymu restrykcyjnego.
   5. Krótko wymieszać przez wir i inkubować w temperaturze 37,5 °C przez noc.
      UWAGA: Ważne jest, aby użyć 3 μg plazmidu biorcy w celu uzyskania wystarczającej ilości materiału po oczyszczeniu DNA w żelu agarozowym. Istotne jest również pozostawienie trawienia DNA na noc przy użyciu obu enzymów w celu uzyskania wysokiej wydajności klonowania.

4. Oczyszczanie i klonowanie żelu agarozowego DNA

1. Przygotuj 1% żel agarozowy, aby uruchomić strawiony plazmid DNA i wstawki, a następnie przystąp do cięcia odpowiednich prążków. Po oczyszczeniu odpowiednich pasm wektorowych i insertowych12 należy określić stężenie DNA za pomocą spektrofotometru.
2. Wykonaj ligację DNA, aby połączyć wstawkę z plazmidem biorcy.
3. Przygotować reakcje ligacji około 100 ng całkowitego DNA, w tym 50 ng wektora plazmidowego.
4. Ustaw stosunek plazmidu do wstawienia biorcy na poziomie około 1:3; można go obliczyć za pomocą kalkulatora wstawień wektorowych¹³.
5. Równolegle ustanawia się kontrole ujemne. Na przykład ligacja DNA plazmidu biorcy bez żadnej wstawki dostarczy informacji o tym, ile tła jest obecne w niestrawionym lub samoligaturującym plazmidzie biorcy.

5. Transformacja klonów

1. Umieścić probówkę z komórkami DH5α z zamrażarki w temperaturze -80 °C i natychmiast przenieść ją na lód na 20 minut.
2. Po tym czasie weź 55 μl komórek DH5α i dodaj 4 μl reakcji ligacji i wymieszaj, przesuwając probówkę i przechowuj na lodzie przez 45 minut.
3. Umieścić probówkę w łaźni wodnej uprzednio ogrzanej w temperaturze 42 °C dokładnie przez 48 s i natychmiast umieścić probówki z powrotem na lodzie na kolejne 3 minuty.
4. Dodać 600 μl pożywki Luria Bulion (LB) uprzednio podgrzanej w temperaturze 37,5 °C i inkubować z wytrząsaniem przez 1 godzinę przy 200 obr./min.
5. Przenieś 200 μl na płytkę agarową zawierającą ampicylinę 100 μg/ml i delikatnie rozprowadź po powierzchni z płynem, który jest w większości wchłonięty.
6. Inkubuj płytki przez noc, aby zobaczyć kolonie następnego ranka. Plazmid biorcy na płytce wkładki powinien mieć znacznie więcej kolonii niż sama płytka plazmidu biorcy.

6. Izolacja gotowego plazmidu

1. Wybierz 3-10 pojedynczych kolonii bakteryjnych i przenieś do 1 ml pożywki LB zawierającej ampicylinę (100 μg/ml) i inkubuj przez 6 godzin.
2. Pobrać 200 μl zawiesiny bakteryjnej i przenieść do 5 ml pożywki LB zawierającej takie samo stężenie ampicyliny jak w kroku 6.1 i inkubować przez noc w temperaturze 37,5 °C z wytrząsaniem przy 200 obr./min.
3. Korzystając z zestawu do oczyszczania DNA miniprep, wykonaj oczyszczanie DNA miniprep przy użyciu 5 ml LB wyhodowanego przez noc, postępując zgodnie z instrukcjami producenta¹⁴.
4. Aby zidentyfikować udane ligacje, należy skonfigurować reakcje PCR w taki sam sposób, jak w sekcji 2, używając DNA uzyskanego z kroku 6.3 jako matrycy z tymi samymi starterami, co w sekcji 2 podczas pierwszego PCR. Dodatnie klony będą wytwarzać produkty PCR o odpowiednim rozmiarze.
5. Po dużym oczyszczeniu DNA z dodatnich klonów, należy przeprowadzić diagnostyczne trawienie restrykcyjne 500 ng oczyszczonego DNA z enzymami użytymi na etapie klonowania i uruchomić strawione produkty na 1% żelu agarozowym. Powinny istnieć dwa pasma: jeden rozmiar wektora, a drugi rozmiar nowej wstawki.
6. Sprawdź sekwencję konstrukcji, sekwencjonując przy użyciu następujących starterów: Naprzód 5'- aaggtgacgcgtgtggcctcgaac-3' i odwrotne 5'-gcatttttcactgcattctagtt-3'.
   UWAGA: Gdy DNA jest replikowane za pomocą PCR, zawsze istnieje możliwość wystąpienia błędów podczas amplifikacji, nawet przy użyciu polimerazy o wysokiej wierności, dlatego bardzo ważne jest sekwencjonowanie końcowych konstruktów.

7. Transfekcja i ekspresja białka

1. Na uprzednio pokrytej poli-L-lizyną białej 96-dołkowej płytce wykonaj wysiew komórek na dzień przed transfekcją w ilości 2,5 x 10⁴ komórek na dołek przy użyciu zmodyfikowanego podłoża Eagle's firmy Dulbecco uzupełnionego 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U / ml penicyliny G i 100 μg / ml streptomycyny.
2. Używaj tylko 60 dołków wewnętrznych, aby zminimalizować możliwość wystąpienia gradientów termicznych na płycie i efektów krawędziowych spowodowanych parowaniem. Dodać 200 μl sterylnej wody destylowanej do 36 studzienek zewnętrznych i 150 μl do przestrzeni między studzienkami i inkubować przez noc w temperaturze 37,5 °C i 5% CO₂ .
3. Następnego ranka wykonaj transfekcję przy użyciu 100 ng całkowitego DNA (po 50 ng każdy konstrukt).
4. Ustaw cztery różne kombinacje plazmidów (receptor: β-arrestin) zgodnie z Rysunek 2b.
5. Dla każdej kombinacji plazmidów należy użyć 20 μl zmodyfikowanego minimum niezbędnego podłoża Eagle'a buforowanego HEPES przy użyciu 0,3 μl odczynnika do transfekcji lipidowej na studzienkę.
6. Dodać 20 μl mieszaniny odczynnika do transfekcji lipidowej i DNA do każdej studzienki i mieszać płytkę w kółko przez 10 sekund.
7. Zmienić świeżą pożywkę po 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37,5 °C i 5% CO₂ .
8. Inkubować płytkę przez 24 godziny w temperaturze 37,5 °C i 5% CO₂ .

8. Monitorowanie interakcji receptor-β-arrestin1/2 w komórkach HEK293

1. Odessać pożywkę i dodać 100 μl zmodyfikowanej pożywki Eagle's Minimum Essential Medium buforowanej HEPES do każdej studzienki i pozostawić płytkę ustabilizowaną w temperaturze pokojowej przez 10 minut.
2. Przygotuj substrat furimazyny, łącząc 1 objętość 100x substratu z 19 objętościami buforu rozcieńczającego LCS (20-krotne rozcieńczenie)¹¹, tworząc 5-krotny zapas do zmieszania z pożywką do hodowli komórkowych.
3. Dodaj 25 μl 5x furimazyny do każdej studzienki i delikatnie mieszaj w kółko przez 10 sekund.
4. Mierz luminescencję przez 10 minut, aby ustabilizować sygnał przy RT.
   UWAGA: Wykorzystanie tego sygnału bazowego do normalizacji odpowiedzi każdej studzienki pomoże zmniejszyć zmienność spowodowaną różnicami w liczbie komórek posianych w każdym dołku, a także różnicami w wydajności transfekcji itp. Po obliczeniu należy uśrednić znormalizowaną odpowiedź z dołków replikacyjnych dla danego leczenia farmakologicznego.
5. Przygotuj 13,5-krotny roztwór liganda w zmodyfikowanym Eagle's Minimum Essential Media buforowanym HEPES.
6. W przypadku eksperymentów w temperaturze pokojowej z 10 μl 13,5-krotnego dodania liganda, należy dodać związki za pomocą wtryskiwaczy lub pipety wielokanałowej i wymieszać płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej (20 s przy 200 obr./min).
7. W przypadku eksperymentów w temperaturze 37,5 °C z 10 μl 13,5-krotnego dodatku liganda, należy użyć wtryskiwaczy do dozowania związków i mieszania za pomocą wytrząsarki orbitalnej instrumentu. W przypadku niestosowania wtryskiwaczy należy zdjąć płytkę z luminometru, dodać ligandy i wymieszać płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej (20 s przy 200 obr./min).
   UWAGA: Użyj wtryskiwaczy i wytrząsarki w przyrządzie detekcyjnym, aby zminimalizować wahania temperatury związane z wyjmowaniem płytki z luminometru. Do tego testu można użyć standardowych luminometrów laboratoryjnych. Użyj czasu całkowania 0,25–2 s.

Wyniki

Zastosowano przedstawioną tutaj procedurę w celu monitorowania oddziaływań pomiędzy prototypowym GPCR a dwiema izoformami β-arrestyny. Konstrukcje receptora peptidu podobnego do glukagonu (GLP-1r) przygotowano przy użyciu starterów zawierających miejsca restrykcyjne dla enzymów NheI i EcoRI, a następnie sklonowano do wektorów pBiT1.1-C [TK/LgBiT] oraz pBiT2.1-C [TK/SmBiT]; w przypadku β-arrestyn wykorzystano dwa dodatkowe wektory, pBiT1.1-N [TK/LgBiT] oraz pBiT2.1-N [TK/SmBiT], stosując miejsca restrykcyjne BgIII i EcoRI...

Dyskusja

Korzystając z przedstawionej tutaj metody, interakcje między dowolnym GPCR a β-arrestin1/2 można monitorować w żywych systemach w czasie rzeczywistym za pomocą tego testu komplementacji strukturalnej GPCR-β-arrestin. W związku z tym udało nam się zaobserwować różnicową rekrutację β-aresztyny między dwiema izoformami β-aresztyny przez GLP-1r (prototyp GPCR klasy B A), zaobserwowaliśmy również dysocjację kompleksu receptor-β-arrestin kilka minut po osiągnięciu maksymalnego sygnału luminescencyjnego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Antybiotyki penicylina streptomycyna	Welgene	LS202-02	penicyliny/streptomycyny
Inkubator	JEIO Tech	IB-05G	(kurtka powietrzna), podstawowa
Pożywka do hodowli komórkowych	Welgene	LM 001-05	DMEM Pożywka do hodowli komórkowych
Pożywka do transfekcji kultur komórkowych	Gibco	31985-070	Optimem 1X pożywka
Inkubator CO2	NUAIRE	NU5720	Inkubator CO2 z bezpośrednim ogrzewaniem
Cyfrowa łaźnia wodna	Lab Tech	LWB-122D	Cyfrowa kąpiel wodna lab tech
Odczyt dowodu polimerazy DNA	ELPIS Biotech	EBT-1011	PfU
Zestaw do oczyszczania DNA	polimerazy DNA Cosmogenetech	CMP0112	miniprepLaboPass Plazmidowa
polimeraza Taq	Enzynomics	P750	nTaq Polimeraza DNA
Ograniczenie enzymu BglII	New England Biolabs	R0144L	BglII
Bufor restrykcyjny	New England Biolabs	B72045	CutSmart 10X Buffer
Ograniczenie enzymu EcoRI	New England Biolabs	R3101L	EcoRI-HF
Ograniczenie enzymu NheI	Nowa Anglia Biolabs	R01315	NheI
Ograniczenie enzymów XhoI	New England Biolabs	R0146L	XhoI
Płodowa surowica bydlęca	Gibco Canada	12483020	Płodowa surowica bydlęca
Żel/PCR DNA MiniKit	Real Biotech Corporation	KH23108	HiYield Gel/PCR DNA MiniKit
Ligaza	ELPIS Biotech	EBT-1025	T4 Ligaza DNA
świetlny	Olympus	CKX53SF	Mikroskop CKX53 Odczynnik
transfekcji lipidów	Olympus Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000
Luminometr	Biotek/Fisher Scientific	12504386	Synergy 2 Wielomodowe czytniki mikropłytek
System NanoBiT Promega		N2014	System startowy NanoBiT PPI MCS
Podłoże nanolucyferazy	Promega	N2012	Nano-Glo System testowy żywych komórek
PCR Termocykler	Eppendorf	6336000015	Master cycler Nexus SX1
Poli-L-lizyna	Sigma Aldrich	P4707-50ML	Roztwór poli-L-lizyny
Trypsyna EDTA	Gibco	25200-056	Trysyna EDTA 10X
Hodowla białych komórek 96-dołkowe płytki	Corning	3917	Płytka testowa 96-dołkowa

Inkubator bakteryjny do hodowli komórkowych enzymu Mikroskop do