Tutaj pokazujemy, jak skonfigurować tani woltoamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który może być używany z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiarów przezprzeznabłonkowego/śródbłonkowego oporu elektrycznego.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Proste podejście do wykonywania pomiarów TEER za pomocą samodzielnie wykonanego woltoamperomierza z programowalną częstotliwością wyjściową
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Transepitelial/śródbłonkowy opór elektryczny (TEER) jest używany od lat 80. do określania zbieżności i przepuszczalności modelowych systemów barierowych in vitro. W większości przypadków elektrody pałeczkowe są używane do określania impedancji elektrycznej między górną i dolną komorą systemu wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych zawierających monowarstwy komórkowe. Membrana filtrująca umożliwia komórkom przyleganie, polaryzację i interakcję poprzez budowanie ścisłych połączeń. Technika ta została opisana na wielu różnych liniach komórkowych (np. komórkach bariery krew-mózg, bariery krew-płyn mózgowo-rdzeniowy lub przewodu pokarmowego i płucnego). Urządzenia pomiarowe TEER można łatwo nabyć u różnych dostawców sprzętu laboratoryjnego. Istnieją jednak bardziej opłacalne i konfigurowalne rozwiązania, które można sobie wyobrazić, jeśli odpowiedni woltamperomierz jest montowany samodzielnie. Ogólnym celem tej publikacji jest stworzenie niezawodnego urządzenia z programowalną częstotliwością wyjściową, które może być używane z dostępnymi na rynku elektrodami pałeczkowymi do pomiaru TEER.
Wprowadzenie
Komórki nabłonkowe i śródbłonkowe funkcjonują jako granice komórkowe, oddzielając wierzchołkową i podstawno-boczną stronę ciała. Jeśli są one połączone ścisłymi połączeniami, pasywna dyfuzja substancji przez przestrzenie parakomórkowe jest ograniczona1, co powoduje powstanie selektywnie przepuszczalnej bariery. Opracowano kilka systemów sztucznej bariery2 wykorzystujących mikronaczyniowe komórki śródbłonka (HBMEC, bariera krew-mózg3,4,5,6,7), komórki nabłonka splotu naczyniówkowego (HIBCPP/PCPEC, bariera krew-płyn mózgowo-rdzeniowy8,9, 10,11,12,13,14), komórki gruczolakoraka jelita grubego (Caco-2, modele przewodu pokarmowego15) lub linie komórkowe dróg oddechowych/pęcherzyków płucnych (modele płucne16,17). Systemy te zazwyczaj składają się z komórek hodowanych w monowarstwie na przepuszczalnych membranach (tj. systemach wkładów filtracyjnych), aby umożliwić dostęp do strony wierzchołkowej i podstawnej. Ważne jest, aby integralność systemu modelowego odpowiadała warunkom in vivo. W związku z tym opracowano kilka technik analizy funkcji bariery poprzez pomiar parakomórkowej dyfuzji związków znakujących w warstwie komórkowej. Substancje te obejmują znakowaną radioaktywnie sacharozę, albuminę znakowaną barwnikiem, inulinę znakowaną zgodnie z FITC lub znakowaną barwnikiem dektrans2. Jednak barwniki chemiczne mogą sprawić, że komórki nie będą nadawały się do dalszych eksperymentów. Do nieinwazyjnego monitorowania systemów barierowych można wykorzystać pomiar przeznabłonkowego/przezśródbłonkowego oporu elektrycznego (TEER) na monowarstwie komórkowej2,18,19. Ponieważ na bipolarne systemy elektrod wpływa impedancja polaryzacji elektrod na granicy faz elektroda-elektrolit, pomiary tetrapolarne są zwykle stosowane w celu przezwyciężenia tego ograniczenia20. Technika podkładania to czterozaciskowe wykrywanie (4T), które zostało po raz pierwszy opisane w 1861 roku przez Williama Thomsona (Lorda Kelvina)21. Krótko mówiąc, prąd jest wstrzykiwany przez parę elektrod przewodzących prąd, podczas gdy druga para elektrod wykrywających napięcie służy do pomiaru spadku napięcia20. Obecnie tak zwane elektrody pałeczkowe składają się z pary podwójnych elektrod, z których każda zawiera granulkę srebra/chlorku srebra do pomiaru napięcia i srebrną elektrodę do przepuszczania prądu2. Impedancja elektryczna jest mierzona między przedziałem wierzchołkowym a podstawno-bocznym z warstwą ogniwa pomiędzy nimi (ryc. 1). Sygnał fali prostokątnej o częstotliwości zwykle 12,5 Hz jest przykładany do elektrod zewnętrznych i mierzony jest wynikowy prąd przemienny (AC). Dodatkowo spadek potencjału w warstwie ogniwa jest mierzony przez drugą (wewnętrzną) parę elektrod. Impedancja elektryczna jest następnie obliczana zgodnie z prawem Ohma. Wartości TEER są normalizowane przez pomnożenie impedancji i powierzchni warstwy komórkowej i są zwykle wyrażane jako Ω ∙ cm2.
Istnieją systemy, w których ogniwa i elektrody są rozmieszczone w bardziej wyrafinowany sposób, ale są również oparte na zasadzie pomiaru 4T i mogą być używane z tymi samymi urządzeniami pomiarowymi. Na przykład systemy EndOhm, w których umieszczony jest filtr, zawierają komorę i nasadkę z parą koncentrycznych elektrod o takiej samej strukturze jak elektroda pałeczkowa. Kształt elektrod pozwala na bardziej równomierny przepływ gęstości prądu przez membranę, zmniejszając w ten sposób różnice między odczytami. Jeszcze bardziej złożona (ale też dokładniejsza) jest komora Usinga, w której warstwa komórek oddziela dwie komory wypełnione roztworem Ringera22. Sama komora może być zagazowana tlenem, CO2 lub N2 i mieszana lub uzupełniana substancjami doświadczalnymi. Gdy zachodzi transport jonów przez warstwę komórkową, różnica potencjałów może być mierzona przez dwie elektrody wykrywające napięcie w pobliżu tkanki. Napięcie to jest niwelowane przez dwie elektrody przewodzące prąd umieszczone obok warstwy ogniwa. Zmierzony prąd da następnie transport jonów netto, a rezystancję transnabłonkową, która odzwierciedla integralność bariery, można określić22. Pomiar TEER może być również stosowany w systemach body-on-a-chip, które reprezentują modele tkanki barierowej23,24. Systemy te naśladują warunki in vivo komórek i często składają się z kilku typów komórek, ułożonych jedna na drugiej w warstwach.
Poniższy protokół wyjaśnia, jak skonfigurować ekonomiczny i niezawodny woltamperomierz z programowalną częstotliwością wyjściową, który nie powoduje statystycznie istotnych różnic w TEER w porównaniu z dostępnymi na rynku systemami pomiarowymi.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Protokół
1. Montaż podstawowego woltoamperomierza do pomiaru TEER
- Przygotuj standardową ładowarkę USB jako zasilacz 5 V DC, przedłużacz USB, mikrokontroler, który będzie służył jako programowalny generator fal prostokątnych, dwa standardowe multimetry, które są w stanie mierzyć prąd i napięcie przemienne jako średnią kwadratową (True-RMS), cztery z wtykami bananowymi, przedłużacz telefoniczny ze złączem żeńskim RJ14 wraz z sześcioma pinami z wewnętrznymi czterema przewodowymi (6P4C), dwa krótkie, końcówka połyskowa, rezystor wstępny 120 kΩ, końcówki kablowe i końcówki lutownicze. Wymagane narzędzia to ściągacz izolacji, zaciskarka i lutownica.
- Najpierw podłącz rozszerzenie USB do płytki mikrokontrolera.
- Zdejmij izolację końcową z dwóch krótkich. jedną stronę na bezpośrednio do pinów 0 i 2 mikrokontrolera lub do końcówek lutowniczych, które z kolei są zatrzaskiwane na odpowiednich pinach. Zaciśnij drugie końce do końcówek kablowych i podłącz je do końcówki połyskowej, jak pokazano na Rysunek 1.
- Podłącz wtyki bananowe do multimetrów. Zdejmij izolację i zaciśnij drugi koniec każdego z czterech.
- Przetnij przedłużacz telefoniczny na dwie części, a następnie zdemontuj i zaciśnij przewody po stronie zawierającej złącze żeńskie. Sprawdź ciągłość przewodów i styków.
- Pierwszy multimetr będzie służył do pomiaru prądu w μA (należy pamiętać, że tryb AC musi być ustawiony wyraźnie). Podłącz go szeregowo za pomocą rezystora wstępnego 120 kΩ do pinów piątego i szóstego złącza RJ14, odpowiadających parze elektrod zewnętrznych elektrody pałeczki.
- Na koniec połącz drugi multimetr, który będzie używany do pomiaru transnabłonkowego spadku napięcia w mV, przez zacisk połysku do pinów trzeciego i czwartego złącza RJ14, odpowiadających wewnętrznej parze elektrod elektrody pałeczki.
- W razie potrzeby zamontuj instalację w obudowie.
2. Programowanie mikrokontrolera
- W razie potrzeby zmodyfikuj podany kod źródłowy (dodatkowy plik kodowania 1). W podanej formie piny 0 i 2 będą przełączać się między masą a +5 V z połowicznym czasem oscylacji 40 ms. W ten sposób zostanie wygenerowany sygnał fali prostokątnej o amplitudzie 5 V i częstotliwości około 12,5 Hz. Rzeczywiste wartości mogą się różnić ze względu na niedokładność emitera czasu mikrokontrolera.
- Podłącz mikrokontroler do komputera stacjonarnego przez port USB i prześlij kod źródłowy z pasującym oprogramowaniem25.
3. Zapis oscylogramów napięć (opcjonalnie)
- Omiń piny piąty i szósty złącza RJ14 rezystorem testowym 1 kΩ i podłącz do oscyloskopu.
- Sprawdź częstotliwość, napięcie szczytowe i przebieg. Digitalizacja i eksport danych.
- W razie potrzeby zapisz oscylogramy z urządzenia referencyjnego (EVOM) i samodzielnie zmontowanego woltamperomierza dla porównania.
UWAGA: W tym przypadku dane zostały zarejestrowane za pomocą cyfrowego zakresu pamięci HM 208. Będąc bardzo prostym oscyloskopem cyfrowym, obraz mógł być wewnętrznie zdigitalizowany (zamrożony), ale musiał zostać wykreślony za pomocą analogowego rejestratora PM 8143 X-Y. Obraz został następnie zeskanowany.
4. Hodowla komórek i pomiar TEER
- Nasienne komórki ludzkiego brodawczaka splotu naczyniówkowego (HIBCPP) na wkładkach filtracyjnych do hodowli komórkowych o wielkości porów 3 μm w DMEM/F12 (patrz tabela materiałów) zawierających 10% płodowej surowicy cielęcej9. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze nasyconej wodą zawierającej 5% CO2 zgodnie z opisem Dinner et al.9.
- Gdy filtry osiągną impedancję 70 Ω ∙ cm2, zmień na DMEM/F12 bez surowicy i zdefiniuj punkt czasowy jako Dzień 0.
- Podłącz elektrodę do portu RJ14 samodzielnie zmontowanego woltamperomierza i podłącz zasilacz USB. Ustaw multimetry odpowiednio w trybie napięcia AC (mV) i trybu prądu AC (μA).
- Alternatywnie podłącz elektrodę do dostępnego w handlu urządzenia referencyjnego i włącz zgodnie z instrukcjami producenta.
- Sterylizuj elektrodę w 80% etanolu przez 10 minut i równoważ w odpowiednim medium przez kolejne 10 minut.
- Umieść elektrodę w obu komorach systemu wkładów filtracyjnych do hodowli komórkowych (dłuższa część elektrody w dolnej komorze i krótsza część w górnej komorze) zawierających warstwę ogniw HIBCPP, aż wartości pomiarowe pozostaną stałe.
- W przypadku urządzenia referencyjnego należy zanotować impedancję bezpośrednio lub obliczyć impedancję zgodnie z prawem Ohma (R = U/I) dla woltamperomierza do samodzielnego montażu. Należy pamiętać, że kąt elektrody ma wpływ na pomiary.
- Powtórz pomiar TEER (kroki 3−6) od dnia 0 do dnia 4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Wyniki
W celu porównania działania woltamperometru zbudowanego samodzielnie z jego komercyjnym odpowiednikiem, zarejestrowano oscylogram napięcia obu urządzeń.
Jak pokazano na Ryc. 2A, urządzenie referencyjne wygenerowało sygnał prostokątny o amplitudzie 80 mV i czasie oscylacji 80 ms, co odpowiada częstotliwości 12,5 Hz, podczas pracy pod obciążeniem z rezystorem testowym 1 kΩ.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Zanim woltamperomierz własnej produkcji będzie mógł być używany w codziennej rutynie, konieczne jest sprawdzenie urządzenia pod kątem prawidłowego działania. W naszym przypadku zaprogramowany był półczas oscylacji wynoszący 40 ms (12,5 Hz), ale efektywny czas oscylacji okazał się wynosić 60 ms (16,7 Hz). Ta niedokładność emitera czasu mikrokontrolera nie miała wykrywalnego wpływu na pomiary TEER. Najlepszym rozwiązaniem może być określenie rzeczywistej częstotliwości za pomocą ustawienia częstotliwości jednego z multimet...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych ani innych konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować Hermanowi Liggesmeyerowi i Marvinowi Bende za ich fachowe porady w dziedzinie elektrotechniki i informatyki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 120 kOhm | Wyposażenie ogólne (ogólne) | ||
| wtykowe bananowe | Wyposażenie ogólne (ogólne) | ||
| Wyposażenie ogólne (ogólne) | |||
| Elektroda pałeczki | Merck Millicell | MERSSTX01 | |
| Elektroda pałeczki (alternatywna) | WPI World Precision Instruments | STX2 | |
| Narzędzie | Narzędzie ogólne | ||
| Digispark / ATtiny85 | AZ-Delivery Vertriebs GmbH | Digispark Rev.3 Kickstarter | |
| DMEM:F12 | Gibco (Thermo Fisher) | 31330038 | |
| Surowica cielęca płodu (FCS)/Surowica bydlęca płodu (FBS) | Life Technologies | 10270106 | |
| Wkłady filtracyjne 3µ m półprzezroczysty | Greiner Bioone | 662631 | |
| HIBCPP | Hiroshi Ishikawa / Horst Schroten | ||
| Ściągacz | Narzędzie ogólne | ||
| Końcówka połysku Wyposażenie | ogólne | ||
| Oscyloskop | HAMEG | Cyfrowy zakres pamięci HM 208 | |
| Ploter | PHILIPS | PM 8143 Rejestrator X-Y | |
| Oprogramowanie Arduino | https://www.arduino.cc | Arduino 1.8.9 | |
| Lutownica | Narzędzie ogólne | ||
| Końcówki | Wyposażenie ogólne | ||
| telefoniczny ze złączem | Wyposażenie ogólne (ogólne) | ||
| Rezystor testowy | Merck Millicell | MERSSTX04 | |
| Multimetry True-RMS | Ładowarka | ||
| Wyposażenie ogólne (ogólne) | |||
| Końcówki | Wyposażenie ogólne (ogólne) |
Bibliografia
- Matter, K., Balda, M. S. Functional analysis of tight junctions. Methods. 30, 228-234 (2003).
- Srinivasan, B., et al. TEER measurement techniques for in vitro barrier model systems. Journal of Laboratory Automation. 20, 107-126 (2015).
- Daniels, B. P., et al. Immortalized human cerebral microvascular endothelial cells maintain the properties of primary cells in an in vitro model of immune migration across the blood brain barrier. Journal of Neuroscience Methods. 212, 173-179 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 19, 1872-1874 (2005).
- Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Scientific Reports. 4, 4160(2014).
- Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 30, 19-28 (2001).
- Muruganandam, A., Herx, L. M., Monette, R., Durkin, J. P., Stanimirovic, D. B. Development of immortalized human cerebromicrovascular endothelial cell line as an in vitro model of the human blood-brain barrier. Federation of American Societies for Experimental Biology Journal. 11, 1187-1197 (1997).
- Ishiwata, I., et al. Establishment and characterization of a human malignant choroids plexus papilloma cell line (HIBCPP). Human Cell. 18, 67-72 (2005).
- Dinner, S., et al. A Choroid Plexus Epithelial Cell-based Model of the Human Blood-Cerebrospinal Fluid Barrier to Study Bacterial Infection from the Basolateral Side. Journal of Visualized Experiments. , (2016).
- Schwerk, C., et al. Polar invasion and translocation of Neisseria meningitidis and Streptococcus suis in a novel human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier. PLoS One. 7, e30069(2012).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11, 323-336 (2009).
- Gath, U., Hakvoort, A., Wegener, J., Decker, S., Galla, H. J. Porcine choroid plexus cells in culture: expression of polarized phenotype, maintenance of barrier properties and apical secretion of CSF-components. European Journal of Cell Biology. 74, 68-78 (1997).
- Haselbach, M., Wegener, J., Decker, S., Engelbertz, C., Galla, H. J. Porcine Choroid plexus epithelial cells in culture: regulation of barrier properties and transport processes. Microscopy Research and Technique. 52, 137-152 (2001).
- Strazielle, N., Ghersi-Egea, J. F. Physiology of blood-brain interfaces in relation to brain disposition of small compounds and macromolecules. Molecular Pharmaceutics. 10, 1473-1491 (2013).
- Hilgendorf, C., et al. Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport. Journal of Pharmaceutical Sciences. 89, 63-75 (2000).
- Mathia, N. R., et al. Permeability characteristics of calu-3 human bronchial epithelial cells: in vitro-in vivo correlation to predict lung absorption in rats. Journal of Drug Targeting. 10, 31-40 (2002).
- Fuchs, S., et al. Differentiation of human alveolar epithelial cells in primary culture: morphological characterization and synthesis of caveolin-1 and surfactant protein-C. Cell and Tissue Research. 311, 31-45 (2003).
- Furie, M. B., Cramer, E. B., Naprstek, B. L., Silverstein, S. C. Cultured endothelial cell monolayers that restrict the transendothelial passage of macromolecules and electrical current. The Journal of Cell Biology. 98, 1033-1041 (1984).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96, 736-749 (1989).
- Yeste, J., et al. Geometric correction factor for transepithelial electrical resistance measurements in Transwell and microfluidic cell cultures. Journal of Physics D Applied Physics. 49 (37), 3754(2016).
- Northrup, E. VI: The Measurement of Low Resistance. Methods of Measuring Electrical Resistance. , McGraw-Hill. 100-131 (1912).
- Li, H., Sheppard, D. N., Hug, M. J. Transepithelial electrical measurements with the Ussing chamber. Journal of Cystic Fibrosis. 3 (Suppl 2), 123-126 (2004).
- Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15, 145-150 (2013).
- Esch, M. B., et al. On chip porous polymer membranes for integration of gastrointestinal tract epithelium with microfluidic 'body-on-a-chip' devices. Biomedical Microdevices. 14, 895-906 (2012).
- Arduino IDE. Arduino Web Editor. , https://www.arduino.cc/en/Main/Software (2019).
- Benson, K., Cramer, S., Galla, H. J. Impedance-based cell monitoring: barrier properties and beyond. Fluids and Barriers of the CNS. 10, 5(2013).
- Hufnagl, M. Time Resolved Transepithelial Impedance Spectroscopy Of Caco 2 Monolayers Relying on Lithographically Patterned Basolateral Electrode Cell Arrays. , University of Vienna. (2010).
- Guimerà, A., Gabriel, G., Parramon, D., Calderón, E., Villa, R. Portable 4 Wire Bioimpedance Meter with Bluetooth Link. World Congress on Medical Physics and Biomedical Engineering. International Federation of Medical and Biological Engineering Proceedings. Dössel, O., Schlegel, W. C. 25/7, Springer. Berlin, Heidelberg. (2009).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
