Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki

7.1K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60171

⸱

6 października 2019

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology, University Medical Center Hamburg-Eppendorf (UKE), 2University Eye Hospital, Center For Ophthalmology, University Hospital Tübingen

W tym artykule

Podsumowanie

Tutaj przedstawiono krok po kroku protokół przygotowania i uprawy rozszczepionych guzików rogówki u świń. Ponieważ ten typowy dla organoorganizacji model hodowli narządów wykazuje wskaźnik umieralności komórek w ciągu 15 dni, porównywalny z ludzkimi rogówkami dawców, stanowi on pierwszy model umożliwiający długotrwałą hodowlę rogówek innych niż ludzkie bez dodawania toksycznego dekstranu.

Streszczenie

Eksperymentalne badania nad komórkami śródbłonka rogówki wiążą się z kilkoma trudnościami. Ludzkie rogówki dawców są rzadkie i rzadko dostępne do badań eksperymentalnych, ponieważ są zwykle potrzebne do przeszczepu. Hodowle komórek śródbłonka często nie przekładają się dobrze na sytuacje in vivo. Ze względu na cechy biostrukturalne rogówek innych niż ludzkie, obrzęk zrębu podczas hodowli powoduje znaczną utratę komórek śródbłonka rogówki, co utrudnia prowadzenie hodowli przez dłuższy czas. Środki pęczniejące, takie jak dekstran, są stosowane w celu przeciwdziałania tej reakcji. Powodują jednak również znaczną utratę komórek śródbłonka. W związku z tym stworzono model hodowli narządowej ex vivo, który nie wymaga środków pęczniejących. Ze świńskich oczu z lokalnej rzeźni przygotowano rozszczepione guziki rogówki. Po częściowej trepanacji rogówki usunięto zewnętrzne warstwy rogówki (nabłonek, warstwa Bowmana, części zrębu). To znacznie zmniejsza utratę komórek śródbłonka rogówki wywołaną masywnym obrzękiem zrębu i fałdowaniem błony Descemeta w dłuższych okresach uprawy oraz poprawia ogólne zachowanie warstwy komórek śródbłonka. Po kolejnej całkowitej trepanacji rogówki usunięto rozszczepiony guzik rogówki z pozostałej opuszki oka i rozpoczęto uprawę. Gęstość komórek śródbłonka oceniano w czasie obserwacji do 15 dni po przygotowaniu (tj. w dniach 1, 8, 15) za pomocą mikroskopii świetlnej. Zastosowana technika przygotowania pozwala na lepsze zachowanie warstwy komórek śródbłonka, co jest możliwe dzięki mniejszemu obrzękowi tkanki zrębu, co skutkuje powolnym i liniowym tempem zaniku rozszczepionych guzików rogówki, porównywalnym z ludzkimi rogówkami dawcy. Ponieważ ten ustandaryzowany, typowy model badawczy upraw organicznych po raz pierwszy pozwala na stabilną hodowlę przez co najmniej dwa tygodnie, jest on cenną alternatywą dla ludzkich rogówek dawców dla przyszłych badań różnych czynników zewnętrznych w odniesieniu do ich wpływu na śródbłonek rogówki.

Wprowadzenie

Zabiegi transplantacji rogówki należą do najczęściej wykonywanych przeszczepów na świecie1. Ze względu na poważny niedobór ludzkich rogówek dawców, badania eksperymentalne dotyczące komórek śródbłonka rogówki w ludzkich rogówkach są trudne do przeprowadzenia1. Jednak wprowadzenie roztworów do irygacji i innych substancji stosowanych w oku, okulistycznych urządzeń lepkosprężystych, a także narzędzi i technik chirurgicznych (np. przyrządów i technik fakoemulsyfikacji, energii ultradźwiękowej) wymaga ważnych i obszernych badań dotyczących ich wpływu na śródbłonek rogówki przed zastosowaniem klinicznym.

Istnieje niewiele alternatyw dla ludzkich rogówek do badań. Modele badawcze na zwierzętach są bardzo cenne, ale jednocześnie bardzo zasobożerne i coraz częściej kwestionowane etycznie. Główną wadą hodowli komórkowych in vitro jest ich ograniczona translacja do ludzkiego oka. Wyniki uzyskane z hodowli komórkowych mogą być niezgodne z warunkami in vivo, ponieważ komórki mogą ulegać śródbłonkowi mezenchymalnemu przejściu (EMT), co skutkuje morfologią podobną do fibroblastów spowodowaną utratą polarności komórek oraz zmianami w kształcie komórki i ekspresji genów2.

Podczas gdy poprzednie modele ex vivo opisywały okresy uprawy do zaledwie 120 godzin, niedawno wprowadzono nową technikę przygotowania do stworzenia modelu hodowli śródbłonka rogówki świni poprzez hodowlę świeżych rogówek świni przez co najmniej 15 dni3,4,5,6. Jeśli nabłonek rogówki i części zrębu zostaną usunięte (łącznie około 300 μm) z rogówki przed uprawą, obrzęk zrębu zmniejsza się w rozszczepionych guzikach rogówki, co skutkuje mniejszą utratą komórek śródbłonka i dobrze zachowaną warstwą komórek śródbłonka po upływie do 15 dni, podczas gdy niepodzielone guziki rogówki wykazują znaczną utratę komórek śródbłonka z powodu nierównomiernego obrzęku zrębu i tworzenia się fałdów Descemeta. Banki oczu zwykle stosują osmotyczne środki zmniejszające obrzęki, takie jak dekstran, w celu zmniejszenia obrzęku rogówki przed przeszczepem. Wykazano jednak, że czynniki te wywołują zwiększoną utratę komórek śródbłonka7,8,9.

Ten artykuł ma na celu wizualizację tego ustandaryzowanego modelu badań ex vivo w szczegółowym protokole krok po kroku, aby umożliwić przyszłym badaczom prowadzenie badań nad śródbłonkiem rogówki za pomocą podzielonych guzików rogówki. Model ten stanowi prostą metodę testowania substancji i technik stosowanych w oku, takich jak okulistyczne urządzenia wiskoelastyczne, roztwory irygacyjne i energia ultradźwiękowa lub inne procedury, w których interesujący jest śródbłonek rogówki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Niniejszy protokół jest zgodny z wytycznymi etycznymi naszej instytucji. Zgodnie ze statutami komisji etycznej naszej instytucji, przed rozpoczęciem eksperymentów nie było konieczne uzyskanie zgody etycznej, ponieważ wszystkie rogówki świńskie zostały pozyskane z lokalnej rzeźni.

1. Hodowla organów

  1. Przygotowanie oczu świni.
    1. Z lokalnej rzeźni pozyskać oczy świni usunięte krótko po śmierci, ale przed obróbką termiczną. Transportować oczy do laboratorium i przetworzyć je w ciągu kilku godzin. Podczas transportu przechowywać oczy w temperaturze pokojowej (około 21 °C) przed rozpoczęciem procedury.
    2. Przed dezynfekcją usunąć wszystkie przydatki oczodołu (mięśnie gałki ocznej, spojówki, tkankę tłuszczową), używając nożyczek okulistycznych i pęsety typu colibri. Oddzielić i odrzucić wszystkie oczy z oczywistymi urazami, uszkodzeniami zewnętrznymi (np. cięciem nożem) lub widocznymi zmętnieniami rogówki.
    3. Przygotować 5% roztwór jodyny w PBS (1:20) w sterylnym kubku, dodając 3 mL 7,5% powidonu jodowego do 57 mL roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanowo (PBS). Przygotować również osobny sterylny kubek zawierający 60 mL czystego PBS.
      UWAGA: Całkowita ilość użytego roztworu jodyny w PBS oraz wielkość kubka zależą od liczby rogówek przeznaczonych do sekcji. Pięć do sześciu oczu wymaga około 60 mL 5% roztworu jodyny w PBS do prawidłowej dezynfekcji.
    4. Umieścić od pięciu do sześciu oczu w 5% roztworze jodyny w PBS na łącznie 5 min, aby prawidłowo zdezynfekować powierzchnię oczu. Delikatnie mieszać co minutę, aby upewnić się, że powierzchnia oczu jest całkowicie zanurzona i w pełni zdezynfekowana w roztworze jodyny.
    5. Po 5 min przenieść zdezynfekowane oczy do przygotowanego kubka z czystym PBS. Ponownie delikatnie wymieszać, aby usunąć roztwór jodyny w PBS z powierzchni oczu.
      UWAGA: Krok ten należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza, aby zapobiec kontaminacji zdezynfekowanych oczu.
  2. Przygotowanie płytek do hodowli komórkowej.
    UWAGA: Poniższe kroki należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
    1. Rozmrozić 2 mL płodowej surowicy cielęcej (FCS). Napełnić strzykawkę (5 mL) surowicą FCS za pomocą tępej kaniuli. Przesłać zawartość strzykawki przez filtr strzykawkowy (0,22 µm) do 80 mL pożywki hodowlanej I wolnej od dekstranu (minimum essential medium [MEM] z solami Earle'a, penicyliną/streptomycyną, L-glutaminą [200 mM], amfoterycyną B [250 µg/mL], buforem Hepes [1 M] [50x], NaHCO3 oraz wodą destylowaną), aby zapobiec ewentualnej kontaminacji bakteryjnej FCS. Wymieszać roztwór, aby zapewnić równomierne rozłożenie substratu.
    2. Napełnić każdy dołek płytki do hodowli komórkowej z 12 dołkami 3 mL mieszaniny substratu.
  3. Wykonanie sekcji i inkubacja.
    UWAGA: Krok ten należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Nie dotykać śródbłonka rogówki żadnymi instrumentami.
    1. Przenieść gałkę oczną z kubka z PBS do uchwytu na gałkę oczną rogówką do góry i umieścić ją pod mikroskopem chirurgicznym okulistycznym. Użyć strzykawki wypełnionej 0,9% NaCl, aby zastosować lekkie ssanie do oka nad uchwytem, w celu unieruchomienia oka w pozycji do sekcji.
    2. Użyć trepanu (ø 7,5 mm) z ustandaryzowaną wkładką, która zapewnia, że głębokość trepanacji nie przekroczy 300 µm, aby wykonać powierzchowne nacięcie centralnej części rogówki (Rycina 1A).
    3. Użyć pęsety typu colibri i jednorazowego skalpela z ostrzem trójkątnym, aby wyciąć i usunąć częściowo trepanowaną część rogówki poziomo przez zrostkę. Odrzucić oddzieloną część rogówki składającą się z nabłonka rogówki, błony Bowmana i części zrostki.
      UWAGA: Należy ściśle zachować poziomy kierunek cięcia, aby uzyskać równomierną grubość pozostałej zrostki.
    4. Umieścić powierzchownie szew 10-0 (poliamid 6 10-0) w zrostce, aby móc odróżnić stronę śródbłonka od strony zrostki podczas eksperymentów (Rycina 1B). Zapobiec penetracji śródbłonka rogówki. Odrzucić gałkę oczną, jeśli śródbłonek zostanie przebity.
      UWAGA: Przebicie śródbłonka rogówki igłą do szycia będzie widoczne jako wyciek płynu z przedniej komory oka przez kanał szwu.
    5. Użyć trepanu bez wkładki, aby pogłębić nacięcie do pełnej głębokości, aż do osiągnięcia przedniej komory oka (Rycina 1C). Po całkowitym przebiciu rogówki można odczuć wyraźny spadek oporu oraz zauważyć wyciek płynu z przedniej komory oka.
      UWAGA: Użyć noża typu hockey, jeśli po trepanacji rozdzielony guzik rogówkowy pozostaje przyczepiony z jednej strony.
    6. Przenieść uzyskany rozdzielony guzik rogówkowy, składający się obecnie z części zrostki (Rycina 2), błony Descemeta i śródbłonka rogówki, do pożywki hodowlanej (pożywka hodowlana I + FCS, patrz sekcja 1.2) w płytce do hodowli komórkowej z 12 dołkami, stroną oznaczoną szwem do dołu, tak aby śródbłonek rogówki był skierowany do góry.
      UWAGA: Jeśli strona śródbłonka będzie skierowana do dołu, śródbłonek może ulec uszkodzeniu.
    7. Przypisać indywidualny numer do każdego rozdzielonego guzika rogówkowego w celu identyfikacji podczas obserwacji i odpowiednio oznakować dołki na płytce do hodowli komórkowej.
    8. Inkubować napełnione płytki do hodowli komórkowej w inkubatorze w standardowych warunkach w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2 i względnej wilgotności powietrza 95%. Wymienić pożywkę hodowlaną (pożywka hodowlana I + FCS) w 8 dniu, jeśli okres inkubacji przekroczy 7 dni.
      UWAGA: Procedura inkubacji z użyciem rozdzielonych guzików rogówkowych została zwalidowana do 15 dni.

Schemat sekwencyjny testowania materiałów na powierzchniach zakrzywionych, przedstawiający etapy deformacji A-D.
Rysunek 1: Disekcja rogówki świni w celu uzyskania rozdzielonych guzików rogówkowych. (A) Po trepanacji rogówki przy użyciu trepanu z wkładką w celu wykonania cięcia na głębokość 300 µm oraz usunięciu nabłonka i części tkanki zrębowej, (B) w zrębie zostaje umieszczony powierzchowny szew, bez przebicia śródbłonka rogówki, w celu późniejszej identyfikacji strony zrębowej. (C) Pełnej trepanacji pozostałej części rogówki towarzyszy (D) usunięcie uzyskanego rozdzielonego guzika rogówkowego z gałki ocznej. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

2. Mikroskopia i badanie śródbłonka

  1. Wykonaj badanie bez barwienia.
    UWAGA: Badanie bez barwienia można przeprowadzać wielokrotnie (np. podczas cotygodniowych kontroli w dniu 1., 8. i 15.). Jednakże liczenie bez barwienia pozwala jedynie na ocenę gęstości komórek śródbłonka, a nie parametrów morfologicznych.
    1. Wlej 3 mL hipotonicznego zrównoważonego roztworu soli (hBSS, skład patrz w Tabeli materiałów) do każdego dołka 12-dołkowej płytki hodowlanej. Ostrożnie umieść pojedynczy wycinek rogówki w hBSS, aby wywołać obrzęk komórek śródbłonka rogówki i poprawić ich widoczność podczas liczenia.
      UWAGA: Upewnij się, że strona śródbłonka jest zwrócona w stronę mikroskopu. W przypadku użycia odwróconego mikroskopu fazowego strona śródbłonka musi być skierowana w dół. Płytka hodowlana nie powinna być przesuwana podczas badania, aby zapobiec uszkodzeniu komórek śródbłonka.
    2. Pozostaw komórki do napęcznienia na 1-2 min przed wykonaniem zdjęcia śródbłonka za pomocą kamery przymocowanej do mikroskopu. Wykonaj co najmniej trzy fotografie z co najmniej trzech różnych obszarów, aby uzyskać reprezentatywny obraz rzeczywistego stanu śródbłonka rogówki. Dodaj pasek skali o rzeczywistej długości 100 µm do późniejszej analizy gęstości komórek śródbłonka rogówki oraz parametrów morfologicznych.
    3. Aby zapobiec uszkodzeniom osmotycznym, usuń wycinek rogówki z hBSS po maksymalnie 5 min i przenieś go z powrotem do pożywki hodowlanej3.
  2. Wykonaj badanie z barwieniem.
    UWAGA: Barwienie kończy eksperymenty, ponieważ stosowane substancje barwiące są cytotoksyczne. Dlatego barwienie można przeprowadzać wyłącznie na koniec okresu obserwacji w celu oceny parametrów morfologicznych (figur reformacji, formacji rozet, komórek zabarwionych alizaryną czerwienią).
    1. Przygotuj 0,25% roztwór błękitu trypanu oraz 0,2% roztwór alizaryny czerwieni S do procedury barwienia.
      1. W celu przygotowania 0,25% roztworu błękitu trypanu, rozcieńcz 0,4% roztwór błękitu trypanu roztworem 0,9% NaCl.
        UWAGA: Na przykład, aby otrzymać 20 mL 0,25% roztworu błękitu trypanu, rozcieńcz 12,5 mL 0,4% roztworu błękitu trypanu 7,5 mL roztworem 0,9% NaCl. Roztwór błękitu trypanu można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka tygodni lub miesięcy.
      2. Aby otrzymać 0,2% roztwór alizaryny czerwieni S, rozpuść 100 mg proszku alizaryny czerwieni S w 50 mL roztworu 0,9% NaCl przy ciągłym mieszaniu i podgrzewaniu do 50 °C na mieszadle magnetycznym z funkcją grzania. Aby usunąć ewentualne osady, przefiltruj otrzymany roztwór. Dostosuj pH roztworu alizaryny czerwieni S do wartości pH 4,2, dodając odpowiednio wodorotlenek sodu lub kwas solny.
        UWAGA: Przed każdym zastosowaniem roztworu alizaryny czerwieni S upewnij się, że pH zostało skorygowane do 4,2 i że w roztworze nie ma osadów. Roztwór można przechowywać w temperaturze pokojowej. Nie przechowuj roztworu dłużej niż 4 tygodnie.
    2. Umieść wycinki rogówki w szalkach Petriego stroną śródbłonka skierowaną do góry, aby zabarwić komórki śródbłonka. Za pomocą pipety powoli nanieś roztwór 0,25% błękitu trypanu kropla po kropli na śródbłonek rogówki przez 90 s.
      UWAGA: Błękit trypanu pozwala na identyfikację uszkodzonych komórek rogówki z przepuszczalną błoną, ponieważ barwi ich jądra.
    3. Ostrożnie wypłucz wycinek rogówki 3x w 0,9% NaCl w małej zlewce szklanej. Ponownie, za pomocą pipety powoli nanieś 0,2% roztwór alizaryny czerwieni S kropla po kropli na śródbłonek rogówki przez 90 s.
      UWAGA: Alizaryna czerwień S barwi błonę Descemeta, co pomaga uwidocznić granice komórek w nieuszkodzonych komórkach śródbłonka rogówki oraz uwidocznić zniszczone komórki, gdy widoczna staje się leżąca pod nimi błona Descemeta. Umożliwia to również łatwą identyfikację większych obszarów zniszczenia.
    4. W celu zbadania zabarwionego śródbłonka rogówki postępuj zgodnie z krokami opisanymi dla liczenia bez barwienia w sekcji 2.1.

3. Analiza gęstości komórek śródbłonka rogówki oraz parametrów morfologicznych

  1. Nanieś kwadraty do liczenia na zdjęcia za pomocą oprogramowania do edycji grafiki (Tabela materiałów).
    1. Uruchom oprogramowanie i otwórz obraz śródbłonka rogówki, wybierając Plik | Otwórz | Wybierz.
    2. Nanieś na obraz kwadrat o długości boku wynoszącej w rzeczywistej skali 100 µm.
      UWAGA: Kolejne kroki sekcji 3.1.2 można pominąć, jeśli oprogramowanie do przeglądania pozwala na nanoszenie kwadratów do liczenia bezpośrednio na zdjęcie. Długość boku kwadratu zależy od rozdzielczości obrazów wykonanych kamerą mikroskopu i można ją obliczyć na podstawie paska skali.
      1. Wytnij pasek skali z fotografii wykonanej mikroskopem: wybierz Narzędzie zaznaczania prostokątnego na pasku narzędzi lub naciśnij M, obramuj pasek skali, a następnie wybierz Edycja | Kadruj lub naciśnij Ctrl + X.
      2. Kliknij Plik | Nowy (lub naciśnij Ctrl + N). W wyświetlonym oknie wybierz Schowek z listy rozwijanej Typ dokumentu. Wyświetlona liczba pikseli to długość boku kwadratu do liczenia. Zanotuj odpowiadającą liczbę pikseli dla pozostałych zdjęć i kliknij OK.
      3. Wybierz Plik | Nowy (lub Ctrl + N). W wyświetlonym oknie wprowadź szerokość i długość (w pikselach) kwadratu do liczenia zgodnie z długością paska skali. Wybierz kolor tła Biały, a następnie naciśnij OK.
      4. Kliknij Zaznacz | Zaznacz wszystko (lub Ctrl + A). Wybierz Edycja | Kopiuj (lub Ctrl + C).
      5. Wybierz obraz śródbłonka rogówki otwarty w kroku 3.1.1. Wybierz Edycja | Wklej (lub Ctrl + V), aby wstawić kwadrat na zdjęcie śródbłonka rogówki.
      6. Wybierz warstwę kwadratu i dostosuj przezroczystość. Wybierz Warstwa | Styl warstwy | Opcje mieszania | Ustaw Krycie na 30% | OK.
      7. Zapisz obraz z naniesionym kwadratem o długości boku wynoszącej w rzeczywistej skali 100 µm. Powtórz czynność dla pozostałych zdjęć potrzebnych do analizy.
  2. Oceń gęstość komórek śródbłonka oraz parametry morfologiczne.
    1. Otwórz obrazy z naniesionymi kwadratami w programie ImageJ (wersja 1.50i) i użyj wtyczki CellCounter do policzenia komórek wewnątrz kwadratu. Uruchom ImageJ, wybierz Plik | Otwórz (lub Ctrl + O) | Wybierz obraz.
      UWAGA: ImageJ oraz wtyczka CellCounter to darmowe oprogramowanie dostępne do pobrania w Internecie.
    2. Wybierz Plugins | Cell_Counter | Cell Counter | Initialize. Policz komórki śródbłonka i zapisz wynik. Na dwóch przeciwległych bokach kwadratu policz komórki przecięte krawędzią kwadratu. Nie licz komórek przeciętych na pozostałych dwóch bokach.
    3. Przeanalizuj co najmniej sześć kwadratów na jedną rogówkę z różnych obszarów (np. trzy zdjęcia, dwa kwadraty na zdjęcie) i wyznacz średnią gęstość komórek śródbłonka rogówki na kwadrat (100 µm2). Ekstrapoluj gęstość komórek śródbłonka z 100 µm2 do 1 mm2, mnożąc wynik przez 100.
  3. W celu oceny zmian morfologicznych, policz w naniesionych kwadratach figury reformacji (styk ≥4 komórek/granic komórkowych zamiast trzech), formacje rozetkowe (charakterystyczny wygląd w kształcie rozety, pięć lub więcej promieniście rozmieszczonych komórek otaczających zniszczoną komórkę) lub obszary zabarwione alizaryną czerwienią (zniszczone komórki).
    UWAGA: Alternatywnie, w przypadku dobrze zachowanych próbek, do analizy morfologicznej może być przydatne zastosowanie większych kwadratów (np. 200 x 200 µm2), aby uzyskać bardziej reprezentatywne wyniki.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Przedstawiona technika sekcji zakłada częściowe usunięcie tkanki zrębu, co skutkuje cieńszą próbką rogówki, a tym samym mniejszym obrzękiem zrębu (Rycina 1 i Rycina 2). Mniejszy obrzęk zrębu indukuje słabsze siły ścinające i zgniatające, które negatywnie wpływają na endotel rogówki, co prowadzi do niższych wskaźników utraty komórek endotelialnych6. Podzielone przyciski rogówkowe wykazują znacznie lepiej za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten zapewnia metodę przygotowania rozszczepionych guzików rogówki świń, która stanowi znormalizowany i tani model hodowli śródbłonka rogówki ex vivo do celów badawczych6. Rozszczepione guziki rogówki świń wykazały zmniejszenie gęstości komórek śródbłonka porównywalne z utratą komórek śródbłonka obserwowaną w ludzkich rogówkach dawców hodowanych w bankach oczu w okresie dwóch tygodni 6,10,11,12.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ustanowienie prezentowanego modelu badawczego było wspierane przez KMU-innovativ (FKZ: 13GW0037F) Federalnego Ministerstwa Edukacji i Badań Naukowych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Temat
Oczy świnilokalne abbatoir
Substancje
Alizaryn czerwony SSigma-Aldrich, USA
Pożywka hodowlana 1, #F9016Biochrom GmbH, Niemcy
PBS firmy Dulbecco (1x)Gibco, USA
Surowica cielęca płoduBiochrom GmbH, Niemcy
Kwas solny (HCl) roztwórwłasnej produkcji
Hipotoniczny zbilansowany roztwór soliwłasnej produkcjina 1 l H2O: NaCl 4,9 g; KCl 0,75 g; CaCl x H2O 0,49 g; MgCl2 x H2O 0,3 g; Octan sodu x 3 H2O 3,9 g; Cytrynian sodu x 2 H2O 1,7 g
Jod powidon 7,5%, BraunolB. Braun Melsungen AG, Niemcy
Chlorek sodu (NaCl) 0,9%B. Braun Melsungen AG, Niemcy
Roztwór wodorotlenku sodu (NaOH)własnej produkcji
Błękit trypanowy 0,4%Sigma-Aldrich, Stany Zjednoczone
Materiały i Instrumenty
Accu-jet proBrand GmbH, Niemcy
Szkło zlewki 50 mlSchott AG, Niemcy
Kaniula wraz z filtrem (5 µ m) 18GBecton Dickinson, Stany Zjednoczone
Płytka do hodowli komórkowej (12 dołków)Corning Inc., Stany Zjednoczone
Kleszczyki ColibriGeuder AG, Niemcy
Nożyczki do rogówkiGeuder AG, Niemcy
PipetaEppendorf AG, Niemcy
Oprawka do żarówki do oczuL. Klein, Niemcy
Nożyczki do oczuGeuder AG, Niemcy
Składany filtr & 185 mmWhatman, Stany Zjednoczone
Nóż hokejowyGeuder AG, Niemcy
Szklana butelka laboratoryjna z nakrętką 100 mlSchott AG, Niemcy
Mieszadło magnetyczneCarl Roth GmbH & Co. KG, Niemcy
Filtr MillexGV (5 & Mikro; m)Merck Millopore Ltd., USA
Uchwyt igłyGeuder AG, Niemcy
Szalki PetriegoVWR International, USA
Końcówki do pipetSarstedt AG & Co., Niemcy
Skalpel (jednorazowy), trójkątne ostrzeAesculap AG & Co. KG, Niemcy
Pipeta serologiczna 10 mlSarstedt AG & Co., Niemcy
Pipeta serologiczna 5 mlSarstedt AG & Co., Niemcy
Sterylne kubkiGreiner Bio-One, Ö sterreich
Sterylne rękawiczkiPaul Hartmann AG, Niemcy
Sterylna serweta chirurgicznaPaul Hartmann AG, Niemcy
Nożyczki do ściegówGeuder AG, Niemcy
Szew Ethilon 10-0 Polyamid 6Ethicon Inc., Stany Zjednoczone
Strzykawka (5 ml)Becton Dickinson, USA
Trepanacja i Oslash; 7,5 mmwłasnej produkcji
Kleszcze wiążąceGeuder AG, Niemcy
Papier wagowyneoLab Migge GmbH, Niemcy
Equipment & Oprogramowanie
lornetkowy mikroskop chirurgicznyCarl Zeiss AG, Niemcy
Kamera zamontowana na mikroskopieOlympus, Japonia
CellSens Entry (oprogramowanie)Olympus, Japonia
Źródło zimnego światłaSchott AG, Niemcy
InkubatorHeraeus GmbH, Niemcy
Mikroskop kontrastowy z odwróconymi fazamiOlympus GmbH, Niemcy
Mieszadło magnetyczne z funkcją grzaniaIKA-Werke GmbH & Co. KG, Niemcy
pH-metr pHenomenalVWR International, USA
Photoshop CS2Adobe Systems, USA
Waga precyzyjnaOhaus Europe GmbH, Szwajcaria

Bibliografia

  1. Gain, P., et al. Global Survey of Corneal Transplantation and Eye Banking. JAMA Ophthalmology. 134 (2), 167-173 (2016).
  2. Roy, O., et al. Understanding the process of corneal endothelial morphological change in vitro. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (2), 1228-1237 (2015).
  3. Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P., Schroeter, J. Endothelial cell density in porcine corneas after exposure to hypotonic solutions. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 245 (1), 143-147 (2007).
  4. Schroeter, J., Meltendorf, C., Ohrloff, C., Rieck, P. Influence of temporary hypothermia on corneal endothelial cell density during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 246 (3), 369-372 (2008).
  5. Schroeter, J., Ruggeri, A., Thieme, H. Impact of temporary hyperthermia on corneal endothelial cell survival during organ culture preservation. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253 (5), 753-758 (2015).
  6. Kunzmann, B. C., et al. Establishment Of A Porcine Corneal Endothelial Organ Culture Model For Research Purposes. Cell and Tissue Banking. 19 (3), 269-276 (2018).
  7. Redbrake, C., et al. A histochemical study of the distribution of dextran 500 in human corneas during organ culture. Current Eye Research. 16 (5), 405-411 (1997).
  8. Zhao, M., et al. Poloxamines for Deswelling of Organ-Cultured Corneas. Ophthalmic Research. 48 (2), 124-133 (2012).
  9. Filev, F., et al. Semi-quantitative assessments of dextran toxicity on corneal endothelium: conceptual design of a predictive algorithm. Cell and Tissue Banking. 18 (1), 91-98 (2017).
  10. Pels, E., Schuchard, Y. Organ-culture preservation of human corneas. Documenta Ophthalmologica. 56 (1-2), 147-153 (1983).
  11. Borderie, V. M., Kantelip, B. M., Delbosc, B. Y., Oppermann, M. T., Laroche, L. Morphology, Histology and Ultrastructure of Human C31 Organ-Cultured Corneas. Cornea. 14 (3), 300-310 (1995).
  12. Linke, S. J., et al. Thirty years of cornea cultivation: long-term experience in a single eye bank. Acta Opthalmologica. 91 (6), 571-578 (2013).
  13. Schroeter, J., et al. Arbeitsrichtlinien - Gute Fachliche Praxis für Hornhautbanken [Procedural guidelines. Good tissue practice for cornea banks]. Ophthalmologe. 106 (3), 265-276 (2009).
  14. Dohlman, C. H., Hedbys, B. O., Mishima, S. The swelling pressure of the corneal stroma. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 1, 158-162 (1962).
  15. Xuan, M., et al. Proteins of the corneal stroma: importance in visual function. Cell and Tissue Research. 364 (1), 9-16 (2016).
  16. Sperling, S. Human Corneal Endothelium in Organ Culture - The Influence of Temperature and Medium of Incubation. Acta Opthalmologica. 57 (2), 269-276 (1979).
  17. Schroeter, J. Endothelial Evaluation in the Cornea Bank. Developments in Ophthalmology. 43, 47-62 (2009).
  18. Pels, E., Schuchard, Y. The Effects of High Molecular Weight dextran on the Presevation of Human Corneas. Cornea. 3 (3), 219-227 (1985).
  19. van der Want, H. J. L., Pels, E., Schuchard, Y., Olesen, B., Sperling, S. Electron Microscopy of Cultured Human Corneas Osmotic Hydration and the Use of dextran Fraction (dextran T 500) in Organ Culture. Archives of Ophthalmology. 101 (12), 1920-1926 (1983).
  20. Thuret, G., Manissolle, C., Campos-Guyotat, L., Guyotat, D., Gain, P. Animal compound-free medium and poloxamer for human corneal organ culture and Deswelling. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (3), 816-822 (2005).
  21. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Staining of endothelial cells does not change the result of cell density. Cell and Tissue Banking. 20 (2), 327-328 (2019).
  22. Wenzel, D. A., Kunzmann, B. C., Hellwinkel, O., Druchkiv, V., Spitzer, M. S., Schultheiss, M. Effects of perfluorobutylpentane (F4H5) on corneal endothelial cells. Current Eye Research. , (2019).
  23. Olsson, I. A. S., Franco, N. H., Weary, D. M., Sandøe, P. The 3Rs principle - mind the ethical gap! ALTEX Proceedings, 1/12, Proceedings of WC8. , 333-336 (2012).
  24. Sanchez, I., Martin, R., Ussa, F., Fernandez-Bueno, I. The parameters of the porcine eyeball. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 249 (4), 475-482 (2011).
  25. Kim, M. K., Hara, H. Current status of corneal xenotransplantation. International Journal of Surgery. 23 (Pt B), 255-260 (2015).
  26. Fujita, M., et al. Comparison of Proliferative Capacity of Genetically-Engineered Pig and Human. Ophthalmic Research. 49 (3), 127-138 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Komórki nabłonka rogówkiredukcja obrzęku zrazikagęstość komórek nabłonkaocena w mikroskopii świetlnejhipotoniczny zrównoważony roztwór solibarwienie błękitem trypanubarwienie czerwienią alizarynową Sinkubacja hodowli komórkowych
Model hodowli śródbłonka śródbłonka rogówki świni przy użyciu podzielonych guzików rogówki
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.