Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Kwantyfikacja koenzymu A w komórkach i tkankach

8.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60182

⸱

27 września 2019

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

W tym artykule

Podsumowanie

Ta metoda opisuje przygotowanie próbki z hodowanych komórek i tkanek zwierzęcych, ekstrakcję i derywatyzację koenzymu A w próbkach, a następnie wysokociśnieniową chromatografię cieczową w celu oczyszczenia i kwantyfikacji derywatyzowanego koenzymu A poprzez absorbancję lub detekcję fluorescencji.

Streszczenie

Pojawiające się badania wykazały, że dostarczanie komórkowego koenzymu A (CoA) może stać się ograniczające, co ma szkodliwy wpływ na wzrost, metabolizm i przeżycie. Pomiar komórkowego CoA jest wyzwaniem ze względu na jego stosunkowo niską liczebność i dynamiczną konwersję wolnego CoA do tioestrów CoA, które z kolei uczestniczą w licznych reakcjach metabolicznych. Opisano metodę, która pozwala ominąć potencjalne pułapki podczas przygotowywania próbki, aby uzyskać test o szerokim liniowym zakresie wykrywania, który jest odpowiedni do stosowania w wielu laboratoriach biomedycznych.

Wprowadzenie

Koenzym A (CoA) jest niezbędnym kofaktorem we wszystkich żywych organizmach i jest syntetyzowany z kwasu pantotenowego, zwanego również pantotenianem (sól kwasu pantotenowego) lub witaminą B5. CoA jest głównym wewnątrzkomórkowym nośnikiem kwasów organicznych, w tym kwasów krótkołańcuchowych, takich jak octan i bursztynian, kwasów rozgałęzionych, takich jak propionian i metylomalonian, długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, takich jak palmitynian i oleinian, bardzo długołańcuchowych kwasów tłuszczowych, takich jak wielonienasycone kwasy tłuszczowe i ksenobiotyków, takich jak kwas walproinowy. Kwas organiczny tworzy enzymatyczne wiązanie tioestrowe z CoA, aby umożliwić jego wykorzystanie jako substratu w ponad 100 reakcjach w metabolizmie pośrednim1. Tioestry CoA są również regulatorami allosterycznymi i aktywatorami transkrypcji. Teraz docenia się2 że całkowita podaż CoA w komórkach jest regulowana3,4; w związku z tym dostępność CoA może być ograniczona, a niedobory CoA mogą być katastrofalne, czego przykładem są dziedziczne zaburzenia genetyczne, które wpływają na biosyntezę CoA5. Kinaza pantotenianowa katalizuje pierwszy etap biosyntezy CoA (Rysunek 1), a neurodegeneracja związana z kinazą pantotenianową, zwana PKAN, jest spowodowana mutacjami w genie PANK2 6. Syntaza CoA, kodowana przez gen COASYN, katalizuje ostatnie dwa etapy biosyntezy CoA (Rysunek 1), a neurodegeneracja związana z białkiem COASY, zwana CoPAN, jest spowodowana mutacją w genie COASYN 7. Zarówno PKAN, jak i CoPAN są dziedzicznymi chorobami neurodegeneracyjnymi związanymi z akumulacją żelaza w mózgu i niedoborami CoA leżącymi u podstaw patologii chorobowych.

Poziomy komórkowe całkowitego CoA różnią się między tkankami8 i całkowite CoA mogą wzrastać lub zmniejszać się w różnych stanach fizjologicznych, patologicznych i farmakologicznych. Poziom CoA w wątrobie wzrasta podczas przechodzenia ze stanu podawanego na czczo 9, a poziom CoA w wątrobie jest nienormalnie wysoki u otyłych myszy z niedoborem leptyny10. Stężenie CoA w wątrobie zmniejsza się w odpowiedzi na przewlekłe spożycie etanolu11. Poziomy CoA w mózgu w mysim modelu z nokautem Pank2 są obniżone w okresie okołoporodowym, ale później, w stadium dorosłym, zawartość CoA w mózgu jest równoważna poziomom typu dzikiego, co wskazuje na adaptacyjną reakcję CoA podczas rozwoju12. Manipulowanie zawartością CoA w tkance za pomocą metod transgenezy lub dostarczania genów wpływa na funkcje metaboliczne i neuronalne13,14,15. Przedkliniczny rozwój potencjalnych terapii PKAN lub CoPAN obejmuje pomiary CoA komórek lub tkanek jako wskaźniki skuteczności16,17,18,19,20. Ocena wszystkich tych warunków i ich metabolicznych lub funkcjonalnych konsekwencji wymaga ilościowej metody pomiaru całkowitego CoA.

Dokładny, wiarygodny test do pomiaru CoA w próbkach biologicznych jest technicznym wyzwaniem w wielu laboratoriach. Niestety, nie ma dostępnych sond do oceny lub ilościowego oznaczania CoA lub tioestrów CoA w nienaruszonych komórkach, chociaż analogi naturalnych tioestrów CoA były szeroko stosowane jako sondy mechanistyczne w badaniach estrów CoA z wykorzystaniem enzymów21. Konwersja CoA, z ugrupowaniem wolnego sulfhydrylu (-SH), do tioestru CoA (lub odwrotnie) jest szybka w komórkach lub tkankach zwierzęcych podczas przenoszenia do innego środowiska i podczas lizy komórek. Liczne syntetazy acylo-CoA i tioesrazy acylo-CoA w komórkach pośredniczą w wzajemnych konwersjach w puli CoA, a dodatkowe enzymy, które wykorzystują tioestry CoA jako substraty, pozostają aktywne w próbkach biologicznych do czasu schłodzenia środkami chemicznymi lub fizycznymi. Odciążanie grup acylowych z CoA do karnityny przez acylotransferazy jest jednym z przykładów w sieci reakcji, które mogą zmienić rozkład tioestrów CoA / CoA. Znaczniki radioaktywne mogą być używane do pomiaru szybkości syntezy CoA w komórkach. Obecne metody pomiaru CoA i pochodnych CoA w próbkach biologicznych zostały poddane przeglądowi22 i obejmują sprzężone testy spektrofotometryczne enzymatyczne, wysokociśnieniową chromatografię cieczową i procedury oparte na spektrometrii mas. Jednak metody te często koncentrują się na konkretnych gatunkach molekularnych CoA i są ślepe na zmienność całkowitej puli CoA. Sprzężone testy enzymatyczne na ogół wymagają większych ilości materiału wejściowego ze względu na niską czułość wykrywania i mają ograniczony zakres liniowości.

Nasze laboratorium opracowało niezawodną procedurę oznaczania całkowitej zawartości CoA w hodowanych komórkach i tkankach zwierzęcych. Strategia obejmuje hydrolizę wszystkich tioestrów CoA w celu uzyskania tylko wolnego CoA podczas przygotowywania próbki, a nie podejmowanie wysiłków w celu utrzymania i analizy całego spektrum gatunków CoA. Procedura jest kompilacją indywidualnych opublikowanych metod przygotowania próbki, derywatyzacji CoA, oczyszczania i identyfikacji po wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz kwantyfikacji derywatyzowanego CoA przez absorbancję lub detekcję fluorescencji23,24,25. Oznaczenia CoA uzyskane przy użyciu tej procedury umożliwiły nam zrozumienie regulacji CoA i opracowanie podejścia terapeutycznego do leczenia niedoborów CoA.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Procedura na zwierzętach, o której mowa w tym protokole, została przeprowadzona zgodnie z protokołami 323 i 556 i specjalnie zatwierdzona przez St. Jude Children's Research Hospital Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Przygotowanie roztworów

UWAGA: Używaj ultraczystej wody do wszystkich roztworów i gdy jest to określone w procedurach.

  1. Przygotuj 1 mM wodorotlenku potasu (KOH) w wodzie.
  2. Przygotować 0,25 M KOH w wodzie.
  3. Przygotuj 1 M Trizma-HCl w wodzie i dostosuj do pH 8,0.
  4. Przygotować 100 mM monobromobimanu (mBBr) w acetonitrylu (Optima Grade). Roztwory podstawowe mBBr są stabilne w temperaturze -20 °C przez wiele miesięcy, pod warunkiem, że są przechowywane w ciemności, ponieważ ekspozycja na światło może fotolizować monobromobiman do bimane26.
  5. Przygotować bufor płuczący do ekstrakcji do fazy stałej (SPE) kolumna: 50% metanol (Optima Grade) + 2% kwas octowy.
  6. Przygotować bufor elucyjny do kolumny SPE: 95% etanol (klasa HPLC) zawierający 50 mM mrówczanu amonu.

2. Przygotowanie wzorca CoA-bimane

  1. Kup wysokiej jakości wzorzec CoA z renomowanego źródła (np. Avanti Polar Lipids, Inc.).
  2. Przygotować roztwór podstawowy CoA o wysokim stężeniu w 20 mM Tris, pH 8. Ilość CoA w wsadzie o wysokim stężeniu określa się lub potwierdza za pomocą absorbancji spektrofotometrycznej przy λ260 nm (Ɛ = 16 800 M-1∙cm-1). Dodaj 4-krotny molowy nadmiar mBBr; Wir na wysokim poziomie przez 10 s. Na przykład dla 10 mM CoA w buforze dodaj 40 mM mBBr. Mbbr dodaje się w nadmiarze, aby zapewnić, że cały CoA jest derywatyzowany.
  3. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 godziny w ciemności bez wstrząsania w celu uzyskania CoA z mBBr. mBBr reaguje z grupą tiolową CoA i jest zależny od pH i temperatury27. Dodanie mBBr przekształca CoA w rozpuszczalny w wodzie fluorescencyjny (lub absorbent ultrafioletowy) CoA-bimane (CoA-bimane; Rysunek 2).
  4. Dodaj 100 μl kwasu octowego i wiruj na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję.
  5. Wirować przy 2 000 x g przez 15 minut, aby usunąć wszelkie środki strącające.
  6. Oczyścić supernatant za pomocą kolumny SPE w celu usunięcia nieprzereagowanego mBBr (opisanego poniżej). Filtracja i odwirowanie eluatu nie jest konieczne po oczyszczeniu kolumny SPE (sekcja 5.8).
  7. Zebrać eluat z kolumny SPE zawierającej CoA-bimane do wstępnie zważonej probówki, wysuszyć w gazowym azocie, zważyć i skonstruować wzorcową krzywą kalibracyjną ze znanymi ilościami CoA-bimane.
    1. Sprawdzić wzorzec CoA-bimane pod względem czystości za pomocą HPLC (patrz poniżej) z detekcją absorbancji zarówno w λ260 (ugrupowanie adeninowe), jak i λ393 (ugrupowanie bimanowe) oraz zbieżnością obu pików w chromatogramie.
    2. Potwierdzić ilość wzorca CoA-bimane w wsadzie o wysokim stężeniu, używając λ260 nm (Ɛ = 16 800 M-1∙cm-1).
  8. Zarejestrować czas retencji HPLC w celu identyfikacji CoA-bimane w próbkach doświadczalnych przy użyciu wzorca CoA-bimane.
  9. Podwielokrotności surowca o wysokim stężeniu wzorca CoA-bimane należy przechowywać w sposób chroniony przed światłem i przechowywany w temperaturze -20 °C przez okres do 2 lat. Unikaj wielokrotnego rozmrażania i ponownego zamrażania.

3. Ekstrakcja i derywatyzacja CoA w hodowanych komórkach

  1. Zbierz przylegające komórki w hodowli, gdy zbliżasz się do późnych gęstości subkonfluencji. Na przykład ludzkie komórki HepG2 / C3A są hodowane do gęstości 6-8 x 106 lub komórki HEK 293T są hodowane do gęstości ~ 1,3 x 107 na 100 mm szalki.
    1. Rutynowo używaj zduplikowanych lub potrójnych kultur do oznaczania CoA. Inkubować oddzielne szalki hodowlane równolegle z kulturami komórek próbki, aby określić liczbę komórek żywotnych. Obliczyć ilość CoA na 10 6-10 7 komórek po oczyszczeniu HPLC.
  2. Odessać pożywkę hodowlaną z naczynia. Szybko umyj komórki na naczyniu lodowatą solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS), aby usunąć wszelkie pozostałości pożywki i odessać PBS z naczynia. Szybko umyj komórki lodowatą wodą, aby usunąć resztki PBS i szybko odessać wodę z naczynia. Unikaj naruszania przylegających komórek podczas dodawania PBS lub wody.
  3. Dodaj 1 ml lodowatej wody do naczynia hodowlanego. Zeskrob komórki do zimnej wody w naczyniu i przenieś zawiesinę komórek do szklanej probówki zawierającej 400 μl 0,25 M KOH i 1,5 ml wody.
    1. Mieszaninę energicznie mieszać wirem na wysokich obrotach przez 10 s. Następnie szczelnie przykryć folią parafinową i inkubować w temperaturze 55 °C przez 1 godzinę bez wstrząsania w łaźni wodnej. Odczyn pH próbki powinien wynosić ≥ 12. Wysokie pH jest ważne dla hydrolizy tioestrów CoA i w razie potrzeby można je dostosować za pomocą dodatkowych porcji KOH.
  4. Zebrać wyhodowane komórki rosnące w zawiesinie przez odwirowanie z małą prędkością: 136 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Przemyć raz lodowatym PBS, następnie krótko przemyć ponownie zimną wodą, a na koniec ponownie zawiesić w 2,5 ml zimnej wody plus 400 μl 0,25 M KOH. Wymieszać energicznie i inkubować w temperaturze 55 °C, jak opisano powyżej.
  5. Dodać 160 μl 1 M Trizma-HCl i 10 μL 100 mM mBBr i mieszać wirowo na wysokich obrotach przez 10 s. To sprawia, że pH wynosi około 8, aby wspomóc reakcję mBBr z wolnym CoA. Przykryć próbki i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemności, aby mBBr zareagował z tiolem CoA.
  6. Dodać 100 μl kwasu octowego i mieszać wirowo na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję
  7. Wirować przy 2 000 x g przez 15 minut w celu usunięcia wytrąconych resztek komórek.
  8. Usuń i zachowaj supernatant w szklanej probówce w celu oczyszczenia kolumny SPE, która jest opisana poniżej.

4. Ekstrakcja i derywatyzacja CoA w tkankach

  1. Rozciąć kawałki tkanek zwierzęcych o średnicy około 0,5 cm lub mniejszej i krótko osuszyć (1-2 s) na bibule chłonnej, a następnie błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przetworzenia. CoA w tkankach jest hydrolizowany lub przekształcany w tioester, jeśli nie jest zamrażany błyskawicznie. Ten krok jest ważny, aby uzyskać maksymalną wydajność CoA w tkankach.
  2. Przed rozpoczęciem analizy należy szybko zważyć zamrożone fragmenty tkanek (5–60 mg) i zanotować masę każdej próbki. To oznaczenie mokrej masy stosuje się do obliczenia zawartości CoA po oczyszczeniu metodą HPLC. Unikaj całkowitego rozmrożenia kawałków tkanki.
  3. Dodać 2 ml 1 mM KOH do szklanej probówki (np. jednorazowej 13 mm x 100 mm) przeznaczonej do wprowadzenia sondy i rozerwania tkanki za pomocą homogenizatora wirnik-stojan. Trzymaj probówkę na lodzie do czasu użycia. Ma to na celu zapewnienie, że próbki są homogenizowane w niskiej temperaturze, a CoA nie ulega zniszczeniu z powodu ciepła wytwarzanego podczas homogenizacji.
  4. Przenieść i homogenizować tkankę (30 – 40 mg) w szklanej probówce (zawierającej zimny 1 mM KOH) przez 30 s. Unikać całkowitego rozmrożenia tkanki.
  5. Dodać 500 μl 0,25 M KOH; wirować na wysokich obrotach przez 10 s i trzymać na lodzie, aż wszystkie próbki zostaną zhomogenizowane. Spowoduje to podbicie próbki powyżej 12 w celu hydrolizy tioestrów CoA w celu uzyskania całkowitego CoA (wolne CoA + hydrolizowane tioestry CoA).
  6. Próbki inkubować w temperaturze 55 °C przez 2 godziny w łaźni wodnej bez wstrząsania w celu podtrzymania hydrolizy.
  7. Dodać 150 μl 1 M Trizma-HCl i 10 μL 100 mM mBBr; wirować na wysokich obrotach przez 10 sekund. To sprawia, że pH wynosi około 8, aby wspierać reakcję mBBr z wolnym CoA.
  8. Próbki inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godziny w ciemności, aby upewnić się, że cały CoA jest derywatyzowany za pomocą mBBr.
  9. Dodać 100 μl kwasu octowego i wirować na wysokich obrotach przez 10 sekund, aby zatrzymać reakcję.
  10. Wirować przy 2,000 x g przez 15 minut, aby osadzać wytrącone resztki komórek.
  11. Usuń i zachowaj supernatant w szklanej probówce w celu oczyszczenia kolumny SPE (opisanej poniżej).

5. Oczyszczanie próbki za pomocą kolumny do ekstrakcji do fazy stałej (SPE)

  1. W temperaturze pokojowej zrównoważyć każdą jednorazową kolumnę z żelem krzemionkowym 2-(2-pirydylo)-etylowym (o pojemności 1 ml) z 1 ml buforu do mycia, aby upewnić się, że pirydylowa grupa funkcyjna jest protonowana i będzie działać jako wymieniacz anionowy. Żel z krzemionki 2-(2-pirydylo)-etylowej jest słabym wymieniaczem anionowym, który jest idealny dla CoA-bimane przy zasadowym pH. Żel krzemionkowy 2-(2-pirydylo)-etylowy ma pKa 6, a elucja odbywa się pH ≥ Rozdział 7.
  2. Dodać supernatant próbki (krok 4.11) do kolumny i zebrać eluat.
  3. Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml buforu do przemywania w celu usunięcia wszelkich niezatrzymanych gatunków.
  4. Przemyć kolumnę raz 1 ml wody.
  5. Przemyć kolumnę dwukrotnie 1 ml buforu elucyjnego do oddzielnej szklanej probówki (12 mm x 75 mm) w celu zebrania CoA-bimane.
  6. Wysuszyć próbkę CoA-bimane w probówce pod gazowym azotem do sucha. Wysuszona próbka jest stabilna w temperaturze pokojowej do czasu dalszego wykorzystania. Zamknij i całkowicie przykryj tubę i przechowuj.
  7. Gdy próbka jest gotowa do analizy HPLC, należy ponownie zawiesić ją w 300 μl wody i energicznie mieszać wirem na wysokich obrotach przez 10 sekund.
  8. Przenieść zawieszoną próbkę do filtra probówkowego wirówkowego (octan celulozy 0,22 μm, wielkość 2 ml) i wirować przy 5 000 x g przez 10 minut w celu usunięcia wszelkich środków strącających.
  9. Przefiltrowaną próbkę przenieść do szklanej fiolki nadającej się do wstrzykiwania metodą HPLC.

6. Oczyszczanie i pomiar CoA-bimane metodą HPLC

  1. Przygotuj. Bufor A: 50 mM KH2PO4, pH 4,6; Bufor B: acetonitryl (stopień optima).
  2. Włącz system HPLC.
    UWAGA: System HPLC w naszym laboratorium to moduł separacji Waters e2695 wyposażony w detektor absorbancji 2489 Ultraviolet-Visible (UV-Vis) oraz detektor fluorescencji 2475 sterowany za pomocą oprogramowania Empower 3. System posiada również automatyczny wtryskiwacz próbek.
  3. Wstrzyknąć każdą próbkę (np. 20 μl) w celu rozdzielenia na kolumnę Gemini C18, 3 μm 100 A, 4,6 mm x 150 mm przy użyciu programu w tabeli 1 przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min. Temperatura kolumny wynosi 25 °C. Zmierzyć absorbancję detektora UV/światła widzialnego przy λ393 nm, a detekcję fluorescencyjną przy λex = 393 nm, λem = 470 nm. Czas retencji określa się, przeprowadzając wzorcową krzywą CoA-bimane przed każdym zestawem próbek.
  4. Zapisać obszar pod pikiem CoA-bimane dla każdej próbki i porównać z krzywą wzorcową w celu obliczenia pmol CoA-bimane wstrzykniętego do kolumny HPLC. Krzywa wzorca absorbancji CoA-bimane jest stosowana do próbek tkanek, a krzywa wzorca fluorescencji CoA-bimane jest używana do próbek kultur tkankowych.
  5. Ponieważ wartości CoA-bimane reprezentują całkowity CoA dla każdej próbki, znormalizuj do liczby żywotnych komórek dla próbek hodowlanych lub mg mokrej masy dla próbek tkanek (Rysunek 6). Alternatywnie należy obliczyć całkowite wartości CoA po normalizacji zawartości DNA lub białka dla każdej próbki. Zawartość DNA lub białka można oznaczyć oddzielnie za pomocą podwielokrotności próbki, które są usuwane podczas przygotowywania próbki przed dodaniem KOH.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Opracowano stosunkowo szybką i niezawodną metodę wykrywania całkowitego poziomu CoA w hodowlach komórkowych i tkankach, polegającą na pochodnowieniu grupy tiolowej CoA za pomocą mBBr w celu uzyskania czynnika fluorescencyjnego, a następnie oczyszczaniu pochodnej CoA-bimanu za pomocą HPLC w fazie odwróconej. W pierwszej kolejności tworzona jest krzywa standardowa, w której poszczególnie wstrzykuje się znane i zwiększające się ilości standardu CoA-bimanu, a następnie nanosi pole pod szczytami na chromatogramach CoA-bimanu ...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym miejscu demonstrujemy wiarygodną procedurę oznaczania ilościowego całkowitego CoA w komórkach i tkankach zwierzęcych krok po kroku z szerokim zakresem detekcji liniowej, która jest dostępna w wielu laboratoriach wyposażonych w HPLC z detektorem wyjściowym absorbancji lub fluorescencji. Alternatywnie, spektrometria mas jest powszechną techniką oceny CoA i tioestrów CoA, ale nie jest powszechnie dostępna ze względu na koszt oprzyrządowania i specjalistyczną wiedzę wymaganą do opracowania metodologii i interpretacji d...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

MWF, CS i SJ napisali artykuł, MWF i CS dostarczyli dane i liczby, COR zaprojektował eksperymenty i krytycznie zrecenzował manuskrypt. SJ i COR są wynalazcami w oczekującym zgłoszeniu patentowym (PCT/US17/39037) "Małocząsteczkowe modulatory kinaz pantotenianowych" posiadanym przez St. Jude Children's Research Hospital, który obejmuje związek PZ-2891, o którym mowa w tym artykule.

Podziękowania

Autorzy dziękują za finansowanie sponsorowanych badań prowadzonych przez CoA Therapeutics, Inc., spółkę zależną BridgeBio LLC, GM34496 grantów National Institutes of Health oraz American Libańsko-Syryjskie Organizacje Charytatywne.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Żel krzemionkowy 2-(2-pirydylo)-etylowy Kolumna SPEMillipore-Sigma54127-U
koenzym AAvanti Polar Lipids870700
Gemini C18 3 μ m 100 i Aring; Kolumna HPLCPhenomenex00F-4439-E0
monobromobimanThermoFisher ScientificM-1378
Sonda Omni-Tip zakłócacz tkanekOmni International32750H
ParafilmFisherS37440
PowerGen 125 zmotoryzowany homogenizator stojana wirnikaThermoFisher ScientificNC0530997
Spin-X filtr probówkowy wirówkowyCoStar8161
Trizma-HClFisherT395-1
Detektor fluorescencyjny Waters 2475Wody2475
Wody 2489 Detektor UV-VisWody2489
Wody E2695 Moduł separacyjnyWodye2695

Bibliografia

  1. Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
  2. Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
  3. Jackowski, S., Rock, C. O. Regulation of coenzyme A biosynthesis. Journal of Bacteriology. 148, 926-932 (1981).
  4. Robishaw, J. D., Berkich, D. A., Neely, J. R. Rate-limiting step and control of coenzyme A synthesis in cardiac muscle. Journal of Biological Chemistry. 257, 10967-10972 (1982).
  5. Di Meo, I., Carecchio, M., Tiranti, V. Inborn errors of coenzyme A metabolism and neurodegeneration. Journal of Inherited Metabolic Disease. 42, 49-56 (2019).
  6. Zhou, B., et al. A novel pantothenate kinase gene (PANK2) is defective in Hallervorden-Spatz syndrome. Nature Genetics. 28, 345-349 (2001).
  7. Dusi, S., et al. Exome sequence reveals mutations in CoA synthase as a cause of neurodegeneration with brain iron accumulation. American Journal of Human Genetics. 94, 11-22 (2014).
  8. Dansie, L. E., et al. Physiological roles of the pantothenate kinases. Biochemical Society Transactions. 42, 1033-1036 (2014).
  9. Leonardi, R., Rehg, J. E., Rock, C. O., Jackowski, S. Pantothenate kinase 1 is required to support the metabolic transition from the fed to the fasted state. PLoS ONE. 5, 11107(2015).
  10. Leonardi, R., Rock, C. O., Jackowski, S. Pank1 deletion in leptin-deficient mice reduces hyperglycaemia and hyperinsulinaemia and modifies global metabolism without affecting insulin resistance. Diabetologia. 57, 1466-1475 (2014).
  11. Israel, B. C., Smith, C. M. Effects of acute and chronic ethanol ingestion on pantothenate and CoA status of rats. The Journal of Nutrition. 117, 443-451 (1987).
  12. Garcia, M., Leonardi, R., Zhang, Y. M., Rehg, J. E., Jackowski, S. Germline deletion of pantothenate kinases 1 and 2 reveals the key roles for CoA in postnatal metabolism. PLoS One. 7, 40871(2012).
  13. Corbin, D. R., et al. Excess coenzyme A reduces skeletal muscle performance and strength in mice overexpressing human PANK2. Molecular Genetics and Metabolism. 120, 350-362 (2017).
  14. Shumar, S. A., Kerr, E. W., Fagone, P., Infante, A. M., Leonardi, R. Overexpression of Nudt7 decreases bile acid levels and peroxisomal fatty acid oxidation in the liver. Journal of Lipid Research. 60, 1005-1019 (2019).
  15. Shumar, S. A., et al. Induction of neuron-specific degradation of Coenzyme A models pantothenate kinase-associated neurodegeneration by reducing motor coordination in mice. PLoS ONE. 10, 0130013(2015).
  16. Zano, S. P., Pate, C., Frank, M., Rock, C. O., Jackowski, S. Correction of a genetic deficiency in pantothenate kinase 1 using phosphopantothenate replacement therapy. Molecular Genetics and Metabolism. 16, 281-288 (2015).
  17. Sharma, L. K., et al. A therapeutic approach to pantothenate kinase associated neurodegeneration. Nature Communications. 9, 4399(2018).
  18. Alvarez-Cordoba, M., et al. Pantothenate Rescues Iron Accumulation in Pantothenate Kinase-Associated Neurodegeneration Depending on the Type of Mutation. Molecular Neurobiology. 56, 3638-3656 (2019).
  19. Arber, C., et al. iPSC-derived neuronal models of PANK2-associated neurodegeneration reveal mitochondrial dysfunction contributing to early disease. PLoS One. 12, 0184104(2017).
  20. Di Meo, I., et al. Acetyl-4'-phosphopantetheine is stable in serum and prevents phenotypes induced by pantothenate kinase deficiency. Scientific Reports. 7, 11260(2017).
  21. Nishikawa, T., Edelstein, D., Brownlee, M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications. Kidney International Supplements. 77, 26-30 (2000).
  22. Tsuchiya, Y., Pham, U., Gout, I. Methods for measuring CoA and CoA derivatives in biological samples. Biochemical Society Transactions. 42, 1107-1111 (2014).
  23. Demoz, A., Netteland, B., Svardal, A., Mansoor, M. A., Berge, R. K. Separation and Detection of Tissue Coash and Long-Chain Acyl-Coa by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography after Precolumn Derivatization with Monobromobimane. Journal of Chromatography. 635, 251-256 (1993).
  24. Shimada, K., Mitamura, K. Derivatization of Thiol-Containing Compounds. Journal of Chromatography B. 659, 227-241 (1994).
  25. Minkler, P. E., Kerner, J., Ingalls, S. T., Hoppel, C. L. Novel isolation procedure for short-, medium-, and long-chain acyl-coenzyme A esters from tissue. Analytical Biochemistry. 376, 275-276 (2008).
  26. Newton, G. L., Fahey, R. C. Determination of biothiols by bromobimane labeling and high-performance liquid chromatography. Methods in Enzymology. 251, 148-166 (1995).
  27. Radkowsky, A. E., Kosower, E. M. Bimanes .17. (Haloalkyl)-1,5-Diazabicyclo[3.3.0]Octadienediones (Halo-9,10-Dioxabimanes) - Reactivity toward the Tripeptide Thiol, Glutathione. Journal of the American Chemical Society. 108, 4527-4531 (1986).
  28. Zhang, Y. M., et al. Chemical knockout of pantothenate kinase reveals the metabolic and genetic program responsible for hepatic coenzyme A homeostasis. Chemistry & Biology. 14, 291-302 (2007).
  29. Tokutake, Y., Onizawa, N., Katoh, H. Toyoda A,Chohnan S. Coenzyme A and its thioester pools in fasted and fed rat tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications. 402, 158-162 (2010).
  30. Shibata, K., Nakai, T., Fukuwatari, T. Simultaneous high-performance liquid chromatography determination of coenzyme A, dephospho-coenzyme A, and acetyl-coenzyme A in normal and pantothenic acid-deficient rats. Analytical Biochemistry. 430, 151-155 (2012).
  31. Chohnan, S., Takamura, Y. A simple micromethod for measurement of CoASH and its use in measuring the intracellular levles of CoASH and short chain acyl-CoAs in Escherichia coli K12 cells. Agricultural and Biological Chemistry. 55, 87-94 (1991).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Oznaczanie ilo ci koenzymu Aekstrakcja w fazie sta ejanaliza HPLCderbywatyzacja mBBrhydroliza wodorotlenkiem potasuprzygotowanie hodowli kom rkowychhomogenizacja tkanekdetekcja fluorescencyjnaanaliza krzywej wzorcowejpomiar tioestr w CoA
Kwantyfikacja koenzymu A w komórkach i tkankach
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.