Artykuł metodologiczny

Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę

18.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60432

⸱

17 listopada 2019

 ,  , 
1Department of Molecular, Cellular and Developmental Biology, University of Colorado, 2Linda Crnic Institute for Down Syndrome, University of Colorado School of Medicine

W tym artykule

Podsumowanie

Opisany jest proces proteomiki do identyfikacji partnerów interakcji białkowych z frakcji subkomórkowej jądrowej za pomocą wzbogacenia immunopowinowactwa danego białka i bezznacznikowej spektrometrii mas. Przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowywanie próbek wspomagane filtrem, oczyszczanie offline, spektrometrię mas i dalszy potok bioinformatyczny.

Streszczenie

Spektrometria mas oczyszczania immunopowinowactwa (IP-MS) stała się solidną ilościową metodą identyfikacji interakcji białko-białko. Niniejsza publikacja przedstawia kompletny przebieg proteomiki interakcji, przeznaczony do identyfikacji interakcji białko-białko o niskiej liczebności z jądra, które można również zastosować do innych przedziałów subkomórkowych. Ten przepływ pracy obejmuje frakcjonowanie subkomórkowe, immunoprecypitację, przygotowanie próbek, czyszczenie offline, spektrometrię mas bez znaczników w jednym ujęciu oraz dalszą analizę obliczeniową i wizualizację danych. Nasz protokół jest zoptymalizowany pod kątem wykrywania przedziałowych interakcji o niskiej liczebności, które są trudne do zidentyfikowania na podstawie lizatów całych komórek (np. interakcji czynników transkrypcyjnych w jądrze) poprzez immunoprecypitację endogennych białek z frakcjonowanych przedziałów subkomórkowych. Przedstawiony tutaj proces przygotowania próbki zawiera szczegółowe instrukcje dotyczące przygotowania ekstraktu jądrowego z komórek HeLa, oczyszczania powinowactwa immunologicznego endogennego białka przynęty oraz ilościowej analizy spektrometrii mas. Omawiamy również kwestie metodologiczne dotyczące przeprowadzania immunoprecypitacji na dużą skalę w eksperymentach profilowania interakcji opartych na spektrometrii mas i podajemy wytyczne dotyczące oceny jakości danych w celu odróżnienia prawdziwie dodatnich interakcji białkowych od interakcji niespecyficznych. Podejście to zostało zademonstrowane poprzez badanie interaktomu jądrowego kinazy CMGC, DYRK1A, kinazy białkowej o niskiej liczebności ze słabo zdefiniowanymi oddziaływaniami w jądrze.

Wprowadzenie

Ludzki proteom wykazuje ogromną różnorodność strukturalną i biochemiczną poprzez tworzenie stabilnych kompleksów wielopodjednostkowych i przejściowe interakcje białko-białko. W związku z tym identyfikacja partnerów interakcji dla białka będącego przedmiotem zainteresowania jest powszechnie wymagana w badaniach mających na celu rozwikłanie mechanizmu molekularnego. Niedawne postępy w protokołach oczyszczania powinowactwa i pojawienie się oprzyrządowania do szybkiej spektrometrii mas o wysokiej rozdzielczości umożliwiły łatwe mapowanie krajobrazów interakcji białek w jednym bezstronnym eksperymencie.

Protokoły interakcji białek często wykorzystują ektopowe systemy ekspresji z konstruktami fuzyjnymi oznaczonymi powinowactwem do identyfikacji interakcji białkowych bez konieczności wysokiej jakości przeciwciał rozpoznających interesujące białko1,2. Jednak metody oparte na znacznikach epitopów mają kilka wad. Fizyczne interakcje z epitopem mogą prowadzić do wykrycia niespecyficznych białek oczyszczających3. Dodatkowo, fuzja tych znaczników epitopów z N- lub C-końcem białka może blokować natywne interakcje białko-białko lub zakłócać fałdowanie białek, aby promować niefizjologiczne konformacje4. Co więcej, ektopowe systemy ekspresji zazwyczaj wykazują nadekspresję białka przynęty w stężeniach suprafizjologicznych, co może prowadzić do identyfikacji sztucznych interakcji białkowych, szczególnie w przypadku genów wrażliwych na dawkę5. Aby obejść te problemy, endogenne białko przynęty może być immunoprecypitowane wraz z powiązanymi oddziałującymi białkami ofiary, zakładając dostępność wysokiej jakości przeciwciała, które rozpoznaje białko natywne.

Tu znajduje się proces proteomiki interakcji do wykrywania interaktomu jądrowego białka endogennego na przykładzie kinazy białkowej CMGC DYRK1A. Zakłócenie liczby kopii, poziomu aktywności lub ekspresji DYRK1A może spowodować poważną niepełnosprawność intelektualną u ludzi i śmiertelność zarodka u myszy6,7,8,9. DYRK1A wykazuje dynamiczną regulację czasoprzestrzenną10, oraz compartmentalized protein interactions11,12, wymagając podejść zdolnych do wykrywania partnerów interakcji o niskiej liczebności specyficznych dla różnych przedziałów subkomórkowych.

Ten protokół wykorzystuje frakcjonowanie komórkowe ludzkich komórek HeLa na frakcje cytozolu i nukleoplazmy, immunoprecypitację, przygotowanie próbki do spektrometrii mas oraz przegląd bioinformatycznego potoku do oceny jakości danych i wizualizacji wyników, z skryptami R dostarczonymi do analizy i wizualizacji (Rysunek 1). Wszystkie pakiety oprogramowania proteomicznego wykorzystywane w tym przepływie pracy są dostępne bezpłatnie do pobrania lub można uzyskać do nich dostęp za pośrednictwem interfejsu internetowego. Aby uzyskać dodatkowe informacje na temat oprogramowania i metod obliczeniowych, szczegółowe samouczki i instrukcje są dostępne pod podanymi linkami.

Protokół

UWAGA: Wszystkie kompozycje i mieszaniny proteaz są przedstawione w Tabeli 1.

1. Przygotowanie komórek

UWAGA: Materiał wyjściowy 1−10 mg lizatu jądrowego na kontrpróbę jest pożądany dla tego podejścia opartego na immunoprecypitacji spektrometrii mas (IP-MS). Ilości komórek zostaną podane dla 1 mg immunoprecypitacji jądrowej w kontrolach potrójnych i potrójnych.

  1. W przypadku stosowania przylegającej linii komórkowej, przed zbiorem należy wyhodować komórki do 90% zbieżności w szalkach 3 x 15 cm na replikę.
    UWAGA: Zaleca się wykonanie co najmniej trzech powtórzonych immunoprecypitacji dla przynęty i warunków kontrolnych. Protokół ten zakłada użycie kontroli "tylko koraliki", które kontrolują obfite niespecyficzne interakcje z koralikami, zaczynając od sekcji 4. Przydatne mogą być inne typy kontrolek. Są one szczegółowo opisane w sekcji dyskusji.
    1. Umyj płytki 2x solą fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) i trypsynizuj komórki za pomocą 3 ml 0,25% trypsyny na 15 cm płytkę. Wirować komórki w temperaturze 1,200 x g przez 5 minut i zdekantować trypsynę.
  2. W przypadku komórek zawiesinowych należy osiągnąć podobną skalę/gęstość, aby osiągnąć 70-80 mg białka całkowitego.
    1. Granulki rozpylać w temperaturze 1 200 x g i temperaturze 4 °C przez 5 min. Ostrożnie zdekantować podłoże.
      UWAGA: Na tym etapie można łączyć granulki, aby umożliwić wydajne przetwarzanie przy użyciu frakcjonowania subkomórkowego na dużą skalę opisanego w sekcji 2.
  3. Przemyć osad komórkowy 2x PBS + 5 mM MgCl2 uzupełnionym inhibitorami proteazy (PI) i inhibitorami fosfatazy (PhIs) (patrz Tabela 1).
    UWAGA: Granulki komórkowe mogą być błyskawicznie zamrażane w ciekłym azocie i przechowywane w temperaturze -80 °C do momentu przygotowania do frakcjonowania.

2. Przygotowanie ekstraktu jądrowego

UWAGA: Inhibitory proteazy i fosfatazy powinny być dodane do frakcjonowanych w ciągu 30 minut od użycia.

  1. W przypadku zamrożenia rozmrażaj granulki komórek przez 15 minut w 1x objętości granulek zimnego buforu A + PI / PhIs. Umieścić osad komórkowy na nutatorze w temperaturze 4 °C, aby ułatwić ponowne zawieszenie podczas rozmrażania. W przeciwnym razie ponownie zawieś osad komórkowy z kroku 1.3 do 1x bufor woluminu A + PI / PhIs.
    1. Osad w temperaturze 2 000 x g i 4 °C przez 10 minut. Zdekantować bufor.
  2. Zawiesić komórki z 5-krotnością objętości upakowanych komórek z buforem A i inkubować na lodzie przez 20 minut.
  3. Osad w temperaturze 2 000 x g i 4 °C przez 10 minut. Zdekantuj bufor i ponownie zawieś z 2x oryginalnie upakowanym buforem objętościowym komórek A + PIs/ PhIs i zanurz ~7x za pomocą "A"/luźnego tłuczka.
  4. Odwirowywać lizat przez 10 minut w temperaturze 2 000 x g i temperaturze 4 °C.
  5. Ostrożnie odpipetować supernatant i błyskawicznie zamrozić ciekłym azotem. Przechowywać lizat w temperaturze -80 °C. Supernatantem z tego etapu jest cytozolowa frakcja subkomórkowa.
    UWAGA: Na tym etapie pastylkę jądrową można uratować poprzez błyskawiczne zamrożenie ciekłym azotem i przechowywanie w temperaturze -80 °C
  6. Zawiesić osad z 0,9x objętością osadu buforu B + PI/PhIs i mieszać na nutatorze przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  7. Aby zlizować jądra, odrzuć 20x mocniejszym tłuczkiem "B".
  8. Mieszać lizat jądrowy na nutatorze przez 30 minut w temperaturze 4 °C, tak aby był jednorodny.
  9. Odwirować lizat jądrowy przez 30 minut w temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C. Odpipetować supernatant i zachować jako rozpuszczalny ekstrakt białka jądrowego.
    UWAGA: Obróbka nukleazowa powstałego osadu jądrowego pozwala na odzyskanie frakcji białkowej związanej z chromatyną.
  10. Dializować rozpuszczalny ekstrakt jądrowy w stosunku do buforu C + PI przez 3 godziny w temperaturze 4 °C.
    1. Wyciąć rurkę dializacyjną o odpowiedniej długości o szerokości 24 mm z odciętą masą cząsteczkową 8 kDa. Zacisnąć jedną stronę rurki i załadować nukleoplazmę do probówki. Po załadowaniu lizatu zacisnąć drugi koniec i zanurzyć w czystym szklanym pojemniku zawierającym bufor C + PI.
  11. Odwirować dializowany ekstrakt jądrowy/nukleoplazmę w temperaturze 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut. Podwielokrotność 3 x 20 μl objętości ekstraktu jądrowego do walidacji frakcjonowania za pomocą western blot. Ekstrakt jądrowy używany do analizy IP-MS może być podany na porcje i błyskawicznie zamrożony w ciekłym azocie i przechowywany w temperaturze -80 °C, jeśli jest to konieczne.

3. Walidacja frakcjonowania subkomórkowego

  1. Wykonaj test białka, aby określić stężenie białka w lizacie jądrowym. Test białka z kwasem bicinchoninowym zapewnia wystarczającą czułość do dalszego stosowania.
  2. Załaduj 20 μg frakcji cytozolowej i jądrowej na żel SDS-PAGE w celu analizy western blot, jak opisano wcześniej13. Pomiń pasy podczas załadunku, aby uniknąć błędnej charakterystyki próbki.
  3. Zbadaj western blot pod kątem p84 (THOC1) jako markera jądrowego i GAPDH jako markera cytozolowego. Określić zakres frakcjonowania przez stosunek markera cytozolowego we frakcji jądrowej i odwrotnie.
    UWAGA: Można stosować przeciwciała przeciwko innym markerom jądrowym i cytozolowym.

4. Immunoprecypitacja endogennego białka przynęty jądrowej

UWAGA: Zaleca się używanie rurek o niskiej retencji od tego momentu. Zmniejszy to niespecyficzne wiązanie z probówkami podczas obchodzenia się z próbką i pozwoli uniknąć niepotrzebnych strat próbki. Dodatkowo należy upewnić się, że klasa LCMSH2O jest używana do przygotowania dla pozostałych etapów.

  1. Przygotować mieszaninę kulek białkowych A/G dla każdej kontrpróby, łącząc 12,5 μl objętości kulek zarówno dla białka-A, jak i białka-G w probówkach do mikrowirówek. Przechowuj zapasy kulek jako zawiesinę zawierającą 20% etanolu. Określić stężenie kulek w zawiesinie % (v/v) i odpipetować niezbędną objętość za pomocą końcówki pipety, która została nacięta na końcówce, aby upewnić się, że kulki mogą dostać się do końcówki.
  2. Mieszaninę kulek białkowych A/G przemyć 2x 300 μl buforu IP 1. Wirować kulki w temperaturze 1 500 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę i zdekantować bufor.
  3. Przygotuj kulki A/G przeciwciało-białko: Aby związać przeciwciało z kulkami, dodaj 300 μl buforu IP 1 i 10 μg pożądanego przeciwciała. Pozostawić mieszaninę kulek i przeciwciał na nutatorze w temperaturze 4 °C przez noc. W przypadku kontroli tylko z kulkami nie dodawaj żadnych przeciwciał.
    UWAGA: Jako punkt wyjścia można użyć łącznie 10 μg przeciwciała na kontrpróbę, ale dokładna ilość będzie musiała zostać zoptymalizowana dla każdego pojedynczego przeciwciała i skali lizatu użytego w eksperymencie
  4. Rozmrozić lizaty jądrowe z etapu 2.10 w łaźni wodnej i rozdzielić odpowiednie objętości do probówek wirówek do mikrowirówek o niskiej retencji w celu uzyskania 1 mg białka na kontrpróbę.
    1. Wirować lizat o sile 16 000 x g przez 30 minut i przenieść supernatant do nowej probówki.
    2. Dodać 1 μl benzonazy (250 jednostek/μl) na 1 mg lizatu jądrowego i rozdrabniać na nutatorze w temperaturze 4 °C przez 10-15 min.
  5. Przygotuj kulki do wstępnego oczyszczenia lizatu. Dodaj 12,5 μl każdego białka A i białka G do 1,5 ml probówek o niskiej retencji, jak w kroku 4.1. Przemyć 2x za pomocą IP Wash Buffer 1 + PIs i zdekantować bufor.
  6. Dodać 1 mg lizatu jądrowego do kulek z kroku 4.5. Inkubować podczas kołysania na nutatorze przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
    1. Odwirować wstępnie oczyszczone lizaty w temperaturze 1 500 x g i temperaturze 4 °C przez 1 min.
    2. Podczas gdy lizaty jądrowe inkubują się z kulkami w kroku 4.5.1, przemyj kulki A/G przeciwciało-białko 2x buforem IP 1 + PI. Odwirować przy 1 500 x g i temperaturze 4 °C przez 1 minutę i zdekantować bufor.
  7. Przenieść wstępnie oczyszczony lizat jądrowy z kroku 4.6.1 na kulki A/G przeciwciało-białko. Inkubować podczas kołysania na nutatorze w temperaturze 4 °C przez 4 godziny. Wirować po inkubacji w temperaturze 1 500 x g i w temperaturze 4 °C przez 1 min.
  8. Przenieść supernatant do probówek oznaczonych jako przepływ dla każdej kontrpróby.
  9. Przemyć kulki A/G przeciwciała-białka 1 ml buforu IP 2 + PI. Odwirować w temperaturze 1 500 x g i w temperaturze 4 °C przez 1 minutę, zdekantować bufor i powtórzyć w sumie 3 razy.
  10. Umyj kulki 2x 1 ml IP Buffer 1+ PI, odwirowując jak w poprzednim kroku. Upewnij się, że cały bufor został usunięty po ostatnim praniu.
  11. Eluować 2x po 20 μl 0,1 M glicyny (pH 2,75) przez 30 minut. Upewnij się, że probówki kołyszą się podczas inkubacji z buforem elucyjnym. Wirować w temperaturze 750 x g i temperaturze 4 °C przez 1 minutę i odpipetować supernatant po każdych 30 minutach inkubacji.
    UWAGA: Podczas gdy opisana tutaj metoda glicyny o niskim pH wymywa większość białek przynęty, niektóre interakcje przeciwciało-antygen wymagają bardziej rygorystycznych warunków buforowych.
  12. Błyskawiczne zamrażanie eluuje w ciekłym azocie i przechowuje w temperaturze -80 °C.

5. Przygotowanie próbki

UWAGA: Insulina wzbogacona w próbki elucyjne immunoprecypitacji pomaga w odzyskiwaniu białek podczas wytrącania kwasu trichlorooctowego (TCA) i przetwarzaniu próbek, co jest ważne dla endogennych białek przynęty o niskiej obfitości.

  1. Rozmrozić eluaty w temperaturze pokojowej, jeśli są zamrożone.
    1. Umieścić próbki na lodzie i dodać 10 μl insuliny 1,0 mg/ml na każde 100 μl eluatu. Zmieszaj, a następnie natychmiast dodaj 10 μl 1% deoksycholanu sodu. Ponownie wymieszać próbkę i dodać 30 μl 20% TCA, a następnie jeden ostatni wir.
    2. Próbki inkubować na lodzie przez 20 minut, a następnie odwirować przy 21 000 x g w temperaturze 4 °C przez 30 minut.
    3. Odessać supernatant i dodać 0,5 ml acetonu, który został wstępnie schłodzony do temperatury -20 °C. Odwirować, a następnie wirować w temperaturze 21 000 x g i temperaturze 4 °C przez 30 minut. Powtórzyć ten krok.
    4. Zassać supernatant i wysuszyć na powietrzu osad pozostały na dnie probówki.
  2. Przygotuj próbkę do spektrometrii mas przy użyciu zmodyfikowanej metody Filter Aided Sample Prep (FASP), zoptymalizowanej pod kątem ograniczenia obsługi próbki, jak opisano poniżej14.
    1. Zawiesić osad białkowy z kroku 5.1.4 za pomocą 30 μl buforu alkilacyjnego SDS (patrz tabela 1). Inkubować próbkę w bloku grzewczym o temperaturze 95 °C przez 5 minut. Pozostaw do ostygnięcia w temperaturze pokojowej przez 15 minut przed przejściem do następnego kroku.
    2. Do każdej próbki dodać 300 μl roztworu UA i 30 μl 100 mM TCEP. Załaduj ten roztwór do filtra odśrodkowego 30k. Obracać filtr odśrodkowy przy 21 000 x g w temperaturze pokojowej przez 10 min.
      UWAGA: Białko przynęty i jego domniemane interakcje powinny być w tym momencie związane z filtrem. Jednak przepływ może zostać utrzymany w przypadku wystąpienia problemu z filtrem.
    3. Umyć filtr 250 μl UA i odwirować przy 21 000 x g przez 10 minut. Zdekantować przepływ i powtórzyć w sumie 3 razy.
    4. Umyj filtr 100 μl 100 mM Tris pH 8,5 i odwiruj przy 21 000 x g przez 10 minut. Zdekantuj przepływ i powtórz w sumie 3x.
    5. Dodać 3 μl 1 μg/μL Lys C zawieszony w 0,1 M Tris pH 8,5. Napełnij filtry do poziomu 100 μl i pozostaw do wytrawienia na 1 godzinę w temperaturze 37 °C, kołysząc się na nutatorze.
    6. Dodać 1 μl 1 μg/ μL trypsyny MS. Delikatnie wymieszać i pozostawić trypsynę do inkubacji z próbką przez noc w temperaturze 37 °C, kołysząc się na nutatorze.
    7. Wirować przy 21 000 x g przez 20 minut, aby wymyć peptyd z filtra.
      UWAGA: W celu odzyskania całego eluatu może być wymagane wiele rund wirowania. Jeśli nie zostanie to zrobione, istnieje możliwość poważnej utraty próbki.
  3. Odsolić peptydy za pomocą kolumn wirowych C18. Postępuj zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta.
  4. Zawiesić liofilizowany peptyd w 7 μl 0,1% TFA w 5% acetonitrylu. Sonikować próbkę przez 3 minuty, aby upewnić się, że peptydy zostały ponownie zawieszone. Wirować z prędkością 14 000 x g przez 10 minut.
  5. Przenieść zawieszony peptyd do odpowiedniej fiolki z próbką w celu załadowania do systemu chromatografii cieczowej ze spektrometrią mas (LC/MS).

6. Przydatność systemu LC/MS

UWAGA: Ze względu na małą skalę i ogólnie mniejszą obfitość białka z próbek oczyszczonych o powinowactwie, bardzo ważne jest, aby platforma LC/MS działała z maksymalną czułością i wytrzymałością.

  1. Dodać 1 ml kwasu mrówkowego klasy LC/MS do 1 litra wody klasy LC/MS dla fazy ruchomej A i dodać 1 ml kwasu mrówkowego klasy LC/MS do 1 litra acetonitrylu klasy LC/MS dla fazy ruchomej B.
  2. Przygotuj lub zainstaluj kolumnę kapilarną o długości 75 μm z topionej krzemionki wypełnioną żywicą C18 o odwróconych fazach <2 μm o długości ≥250 mm. Najlepsze wyniki uzyska się przy bezpośrednim wstrzyknięciu próbek do kolumny.
  3. Oczyść system ultra sprawnej chromatografii cieczowej (UPLC) świeżymi fazami ruchomymi. Po zainstalowaniu kolumny C18 ustalić stabilne natężenie przepływu i elektronatryskiwać odpowiednim emiterem (tj. 20 μm id x 360 μm od przyciągniętym do końcówki 10 μm). Utrzymuj kolumnę w temperaturze 40−60 °C.
  4. Przetestuj ogólną wydajność systemu LC/MS, wstrzykując złożony standard kontroli jakości, taki jak 100-200 ng lizatu tryptycznego HeLa z całych komórek. Eluować z odpowiednim gradientem dla złożonej próbki (tj. 2-3 godziny gradientowego czasu elucji). Ustal podstawową wydajność systemu identyfikacji peptydów i białek.
    UWAGA: Aby uzyskać najlepsze wyniki, identyfikacje 3 000-5 000 lub więcej białek z 20 000-35 000 unikalnych peptydów zapewni optymalną wydajność dla próbek eksperymentalnych.
  5. W celu rutynowego stosowania systemu LC/MS należy wstrzyknąć 100-200 fmol lub mniej pojedynczego wzorca trawienia białka, takiego jak albumina surowicy bydlęcej (BSA). Elute o krótkim gradiencie (tj. 20−30 min).
    UWAGA: Wielokrotne wstrzyknięcia trawienia białka pomogą ustalić podstawową wydajność systemu LC/MS, a powtórzenie wstrzyknięcia po każdej próbce IP-MS zapewnia miarę wydajności systemu w całym eksperymencie i pozwala na wykrycie dryfu instrumentu, który może zniekształcić eksperymenty bez znaczników. Linia bazowa wybranych indywidualnych intensywności pików i kształtów pików będzie informować o wydajności MS, LC i kolumny.
  6. Aby uniknąć przeciążenia kolumny analitycznej, należy załadować niewielką część (15−30% całości) próbki doświadczalnej na kolumnę i oddzielić za pomocą gradientu odpowiedniego dla próbek złożonych (tj. 2−3 h). Jeżeli liczba identyfikacji białek jest niezadowalająca, należy załadować całą próbkę do kolumny.
  7. Uruchom pojedynczy wzorzec trawienia białka między próbkami, aby monitorować wydajność systemu LC/MS i przenoszenie próbek. W zależności od próbek może być wymaganych wiele wzorców, aby zmniejszyć przenoszenie próbek.

7. Przetwarzanie danych

  1. Pobierz pakiet oprogramowania proteomicznego MaxQuant, który można znaleźć pod adresem https://www.maxquant.org/.
    UWAGA: Zostanie to wykorzystane do przetworzenia pliku danych RAW MS z kroku 6.6 na tabele danych identyfikatorów białek, nazw genów i wartości ilościowych związanych z ich identyfikacją do dalszej analizy.
    1. Wybierz opcję Załaduj w nagłówku podrzędnym Dane wejściowe na karcie Dane pierwotne. Otwórz lokalizację pliku, w której są przechowywane pliki MS raw, i wybierz pliki RAW dla każdego uruchomienia MS/MS.
    2. Kliknij zakładkę Specyficzne dla grupy i wybierz Trawienie. Z listy enzymów wybierz LysC i kliknij strzałkę w prawo, aby dodać ten enzym do listy, która będzie używana w wyszukiwaniu. Następnie wybierz Instrument i upewnij się, że właściwy typ instrumentu pojawia się na liście rozwijanej u góry ekranu. Pozostałe parametry wyszukiwania specyficzne dla grupy pozostaw w ustawieniach standardowych.
    3. Kliknij zakładkę Parametry globalne i wybierz Sekwencje. Dodaj odpowiedni plik FASTA dla taksonomii, która będzie używana w tym wyszukiwaniu. Peptydy nie zostaną prawidłowo przypisane, jeśli nie zostanie to zrobione. W przypadku ludzkiego proteomu pobierz plik FASTA z UniProt pod adresem https://www.uniprot.org/help/human_proteome.
    4. Na karcie Global Parameters (Parametry globalne) kliknij opcję Protein Quantification (Kwant Białka). Z menu rozwijanego Peptydy do kwantyfikacji wybierz opcję Unikalne + Razor.
      UWAGA: MaxQuant oferuje alternatywną kwantyfikację białek poprzez bezwzględną kwantyfikację opartą na intensywności (iBAQ) i kwantyfikację bez znaczników (LFQ). Jednak informacje o liczbie peptydów są wystarczające do dalszej analizy w tym protokole15.
    5. W lewym dolnym rogu interfejsu MaxQuant wybierz liczbę procesorów, które mają być używane do wyszukiwania. Będzie to miało bezpośredni wpływ na długość czasu wymaganego do uruchomienia, więc wybierz do tego jak najwięcej). Kliknij przycisk Start w lewym dolnym rogu ekranu, aby rozpocząć uruchamianie. Wybierz kartę Wydajność w górnej części ekranu, aby wyświetlić postęp wyszukiwania.
  2. Po zakończeniu przebiegu otwórz plik proteingroups.txt w Perseus, platformie obliczeniowej proteomiki lub innym programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych, aby wyświetlić dane16.
    1. Użyj Perseusa, aby usunąć typowe zanieczyszczenia i uderzenia w odwrócone sekwencje białek. Postępuj zgodnie ze szczegółową dokumentacją Perseusa pod adresem http://www.coxdocs.org/doku.php?id=perseus:user:use_cases:interactions.
      UWAGA: Otwarcie pliku proteingroups.txt w oprogramowaniu analitycznym (np. Excel) spowoduje automatyczne uszkodzenie niektórych nazw genów i białek.
  3. Analizowanie danych eksperymentalnych przy użyciu repozytorium zanieczyszczeń do oczyszczania powinowactwa (CRAPome). Zarejestruj konto w tym repozytorium http://crapome.org/ i postępuj zgodnie z samouczkiem w razie potrzeby17,18.
    1. Skorzystaj z przepływu pracy Analizuj swoje dane znajdującego się na stronie głównej CRAPome. Wybierz zewnętrzne kontrolki, które odpowiadają systemowi oczyszczania powinowactwa używanemu w tym eksperymencie interakcji.
      UWAGA: Te kontrolki mogą być używane do obliczania wtórnego wzbogacenia zmiany, co jest przydatne do wykrywania typowych zanieczyszczeń.
    2. Wygeneruj plik wejściowy z proteingroups.txt danych wyjściowych z MaxQuant za pomocą Perseusa lub odpowiedniej aplikacji do obsługi arkuszy kalkulacyjnych. Szczegółowe informacje na temat formatowania ręcznego można znaleźć na stronie http://crapome.org/?q=fileformatting. Alternatywnie użyj dostarczonego skryptu języka R "export_CRAPomeSAINT_Input_File.R", aby wygenerować plik wejściowy SAINT/CRAPome. Zobacz README.txt w dodatkowych plikach kodowania.
    3. Przeprowadź analizę, aby określić wzbogacenie w fałd i prawdopodobieństwo SAINT (Analiza istotności INTeractome) dla każdego białka przynęty w immunoprecypitacji. Upewnij się, że w menu rozwijanym w obszarze FC-A wybrano opcję "Elementy sterujące użytkownika", w menu rozwijanym FC-B wybrano opcję "Elementy sterujące CRAPome" lub "Wszystkie elementy sterujące", a w celu wygenerowania prawdopodobieństwa SAINT wybrano wynik prawdopodobieństwa. Po zakończeniu przebiegu wyświetl dane wyjściowe, które są dostępne w obszarze "Wyniki analizy" wraz z identyfikatorem zadania. Pobierz macierz danych z "Wyniki analizy" w celu przyszłego wykreślania i wizualizacji danych.
  4. Wykreśl białka jako funkcję FC-A (adresy IP vs. kontrole użytkownika) i prawdopodobieństwo SAINT, postępując zgodnie ze skryptami R, jak podano w Supplemental Coding Files.
    UWAGA: Zestaw skryptów R służy do tworzenia wykresów prawdopodobieństwa FC-A w porównaniu z SAINT i iBAQvs. log 2 (obfitość białka), pokolorowanych skorygowanym zakresem wartości p z empirycznej analizy Bayesa intensywności bez znaczników. Szczegóły różnicowej analizy statystycznej i wykresu znajdują się w README.txt i skrypcie R "main_differential_analysis. r" w dodatkowych plikach kodowania.
  5. Oceń, gdzie znane białka wpływające na interakcje białka przynęty są uszeregowane według FC-A i SAINT. Jako punkt wyjścia należy przyjąć wartość odcięcia FC-A > 3.00 i SAINT > 0.7 dla eksperymentów z pojedynczą przynętą w trzech egzemplarzach.
    UWAGA: Wybór punktów odcięcia dla interaktora o "wysokim poziomie zaufania" i interaktora o "niskim poziomie ufności" musi być oparty na informacjach biologicznych.

8. Wizualizacja danych

UWAGA: Istnieje wiele programów, które mogą skutecznie wizualizować dane proteomiczne (np. R, Perseus, Cytoscape, STRING-DB). Analizowanie połączeń między trafieniami o wysokim poziomie ufności i funkcjonalnym wzbogacaniem tych interaktorów może być przydatną strategią ustalania priorytetów trafień w celu dalszej walidacji i charakterystyki funkcjonalnej.

  1. Pobierz Cytoscape, narzędzie do wizualizacji sieci o otwartym kodzie źródłowym pod adresem https://cytoscape.org/download.html19.
  2. Przygotuj plik wejściowy dla danych interakcji jako plik rozdzielany tabulatorami sformatowany z trzema kolumnami: przynęta (węzeł źródłowy), ofiara (węzeł docelowy), typ interakcji (typ krawędzi). Można to zrobić w Perseusie lub dowolnym wybranym programie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych.
  3. Wybierz ikonę Importuj tabelę z pliku w lewym górnym rogu programu (oznaczoną strzałką w dół i macierzą w ikonie). Cytoscape automatycznie wypełni dane interakcji w sieci gotowej do niestandardowego formatowania i projektowania.
  4. Wybierz kartę Styl na panelu sterowania dla Cytoscape i kliknij kwadraty w kolumnie Def, aby dostosować atrybut dla całej sieci. Zaznacz określone węzły lub krawędzie w sieci, a następnie zaznacz kwadrat w kolumnie Byp. menu stylu, aby pominąć ustawienia domyślne i dostosować tylko wybrane obiekty. Możesz też kliknąć menu rozwijane u góry menu stylów, aby wyświetlić wstępnie ustawione formaty sieci.
    UWAGA: Dane interakcji białko-białko STRING-db mogą być obecnie zintegrowane z tą siecią albo ręcznie za pomocą pliku wejściowego, albo za pomocą różnych narzędzi do wzbogacania dostępnych jako wtyczki w Cytoscape, http://apps.cytoscape.org/20. Zalecana wtyczka cytoscape do analizy wzbogacania znajduje się pod adresem http://apps.cytoscape.org/apps/cluego21.
  5. Aby zwiększyć zaufanie do zestawu danych wygenerowanego w tym przepływie pracy, należy przeprowadzić wzajemne eksperymenty IP-MS lub IP-western, które są ukierunkowane na białka ofiary będące przedmiotem zainteresowania jako przynętę.

Wyniki

Większość masy białek zidentyfikowanej w eksperymencie IP-MS składa się z białek nieswoistych. Z tego względu jednym z kluczowych wyzwań w eksperymencie IP-MS jest interpretacja tego, które białka są interaktorami o wysokim stopniu pewności, a które interaktorami nieswoistymi. Aby zademonstrować kluczowe parametry wykorzystywane w ocenie jakości danych, w badaniu przeanalizowano potrójne immunoprecypitacje z 5 mg ekstraktu jądrowego HeLa z wykorzystaniem kontroli z samymi kuleczkami. Pierwszą wewnętrzną weryfikacją zapewniającą wiarygodność eksperymentu IP-MS jest sprawdzenie, czy białko przynęty (bait) znajduje się wśród białek o najwyższym stopniu wzbogacenia, zidentyfikowanych zarówno na podstawie krotności zmiany (fold-change) względem kontroli, jak i prawdopodobieństwa SAINT. W tym przypadku przynęta DYRK1A znalazła się wśród trzech najsilniej wzbogaconych białek względem kontroli (Rysunek 2A,B). W badaniu interaktomu jądrowego DYRK1A z wykorzystaniem czterech niezależnych przeciwciał, próg FC-A >3,0 oraz próg prawdopodobieństwa SAINT >0,7 stanowiły rygorystyczne kryteria identyfikacji zarówno nowych, jak i wcześniej zwalidowanych interaktorów2. Po zastosowaniu tych kryteriów w niniejszym eksperymencie zaobserwowano wyraźne oddzielenie interaktorów o wysokim stopniu pewności od >95% współoczyszczonych białek zidentyfikowanych jako nieswoiste (Rysunek 2A,B). Zastosowanie zarówno progu wzbogacenia (fold change), jak i progu prawdopodobieństwa zwiększa rygorystyczność analizy, wymagając spójnie wysokiego wzbogacenia identyfikatorów białek we wszystkich powtórzeniach biologicznych.

Oprócz punktacji statystycznej, przepływ analizy CRAPome mapuje również wcześniej zgłoszone interakcje na dane przynęta-ofiara (bait-prey)23. Choć takie mapowanie może być przydatne przy wyznaczaniu progów dla interakcji o wysokiej i niskiej wiarygodności, wcześniej zgłoszone interakcje mogą uzyskać niskie wyniki w zakresie FC-A i prawdopodobieństwa SAINT, co potencjalnie wskazuje, że wiele znanych interakcji danej przynęty może występować tylko w konkretnych typach komórek, kontekstach lub organellach. Dla przykładowego zbioru danych DYRK1A wartości FC-A interaktorów iREF były tak niskie jak 0,45, co oznacza bardzo niski poziom wzbogacenia w stosunku do kontroli (Rysunek 2C). Aby uniknąć wzrostu liczby wyników fałszywie dodatnich, progowanie statystyczne powinno być przeprowadzane w sposób, który priorytetyzuje rygorystyczność nad redukcją wyników fałszywie ujemnych. Należy zauważyć, że wykrycie tych interakcji było niezależne od poziomu obfitości białek (Rysunek 2C). Obliczona bezwzględna liczba kopii każdej interakcji iREF w komórkach HeLa nie wykazała korelacji z poziomami wykrycia partnera interakcji metodą IP-MS24.

Cytoscape służy jako skuteczne narzędzie do wizualizacji wielu warstw danych o oddziaływaniach19. W opisanym tutaj eksperymencie immunoprecypitacji DYRK1A, połączone zastosowanie FC-A > 3.0 oraz SAINT > 0.9 zredukowało listę wysokoufałych interaktorów do sześciu białek (Rycina 2D). Jednakże przy zastosowaniu samego progu FC-A > 3.0 do sieci dodano osiem dodatkowych białek. Te dodatkowe białka interaktory wykazują wysoką łączność z interaktorami już obecnymi w sieci, co sugeruje, że są one powiązane w podobnych kompleksach lub pełnią podobne role funkcjonalne. W tym celu do sieci włączono dowody z bazy STRING-DB dotyczące oddziaływań białko-białko, przedstawione jako niebieskie przerywane linie20. Choć ten eksperyment z pojedynczą przynętą przeprowadzony w trzech powtórzeniach dostarcza ograniczonej próbki pełnej sieci oddziaływań DYRK1A, zastosowanie dodatkowych przynęt, powtórzeń oraz integracja dużych publicznych zbiorów danych mogą posłużyć do rozszerzenia sieci wysokoufałych oddziaływań. Progi statystyczne będą zatem specyficzne dla każdego pojedynczego eksperymentu i będą wymagały dokładnej oceny.

Przebieg pracy z ekstraktami jądrowymi; schemat; immunoprecypitacja, spektrometria mas, analiza danych, badania białek.
Rysunek 1: Reprezentatywny schemat proteomiczny dla subkomórkowej immunoprecypitacji połączonej ze spektrometrią mas (IP-MS). Komórki hoduje się w 4-litrowych kolbach o okrągłym dnie lub w 15-centymetrowych naczyniach do hodowli tkanek, a następnie zbiera się je w tym samym czasie w celu frakcjonowania subkomórkowego. Komórki frakcjonuje się na frakcję cytozolową, jądrową oraz osad jądrowy, a immunoprecypitacje przeprowadza się z 1–10 mg lizatu jądrowego, wykorzystując jedno lub wiele przeciwciał rozpoznających tę samą białkową przynętę (bait). Przed analizą metodą spektrometrii mas w trybie single shot przeprowadza się przygotowanie próbek z użyciem filtracji (FASP) oraz offline’owe oczyszczanie próbek. Do przetwarzania danych w celu uzyskania interpretowalnych wyników oddziaływań wykorzystuje się odpowiedni potok obliczeniowy (computational pipeline). Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza oddziaływań białkowych z DYRK1A; wykresy, wykresy punktowe, diagram sieci dla danych białkowych.
Rysunek 2: Reprezentatywne dane dla eksperymentu IP-MS z użyciem jednej przynęty i jednego przeciwciała. (A) Wyniki FC-A oraz prawdopodobieństwa SAINT z przepływu analizy CRAPome dla optymalnego eksperymentu z wykorzystaniem pojedynczego przeciwciała przeciwko kinazie DYRK1A (n = 3). Do porównania wykorzystano kontrole zawierające wyłącznie kuleczki. Czerwone linie ciągłe reprezentują wartości progowe ustalone dla FC-A > 3.0 oraz SAINT > 0.7. (B) Wyjściowe szacunki zawartości białek z programu MaxQuant (iBAQ) w funkcji stosunku log2 zawartości białek w próbce IP DYRK1A do kontroli, z kolorowaniem według zakresu skorygowanej wartości p z analizy empirycznego Bayesa dla intensywności bezetykietowych. (C) FC-A i szacowana liczba kopii białek wymienionych jako białka oddziałujące w bazie danych iRef23,24(D) Wizualizacja sieci interaktorów DYRK1A w programie Cytoscape. Węzły niebieskie = FC-A > 3.0, SAINT > 0.7. Pomarańczowe węzły = FC-A > 3.0. Czarne krawędzie = białka zidentyfikowane jako interaktory w eksperymencie IPMS. Niebieska przerywana krawędzie = interakcja SAINT między białkiem ofiarą (poziom ufności > .150). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.

Mieszanina inhibitorów proteaz (PI)
OdczynnikStężenie końcowe
Pirosiarczyn sodu1 mM
Benzamidyna1 mM
Ditiotreitol (DTT)1 mM
Fluorek fenylometanosulfonylowy (PMSF)0,25 mM
mieszanina inhibitorów fosfataz (PhI)
OdczynnikStężenie końcowe
Mikrocystyna LR1 µM
Ortowanadan sodu0,1 mM
Fluorek sodu5 mM
Bufory do frakcjonowania subkomórkowego:
Bufor A pH 7,9
OdczynnikStężenie końcowe
HEPES10 mM
MgCl21,5 mM
KCl10 mM
Bufor B pH 7,9
OdczynnikStężenie końcowe
HEPES20 mM
MgCl21,5 mM
NaCl420 mM
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)0,4 mM
Glicerol25% (v/v)
Bufor C pH 7,9
OdczynnikStężenie końcowe
HEPES20 mM
MgCl22 mM
KCl10 mM
Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)0,4 mM
Glicerol20% (v/v)
Bufory do immunoprecypitacji:
Bufor IP 1
OdczynnikStężenie końcowe
HEPES20 mM
KCl150 mM
EDTA0,1 mM
NP-400,1% (v/v)
Glicerol10% (v/v)
Bufor do immunoprecypitacji (IP) 2
OdczynnikStężenie końcowe
HEPES20 mM
KCl50 mM
EDTA0,1 mM
NP-400,1% (v/v)
Glicerol10% (v/v)
Bufor do alkilowania z SDS o pH 8,5
OdczynnikStężenie końcowe
SDS4% (v/v)
Chloroacetamid40 mM
TCEP10 mM
Tris10 mM
UA pH 8,5
OdczynnikStężenie końcowe
Mocznik8 M
Tris0,1 M
* należy użyć H2O klasy HPLC

Tabela 1: Składy buforów

Dodatkowe pliki kodu.Aby pobrać ten plik, kliknij tutaj.

Dyskusja

Opisany tutaj przepływ pracy proteomiki zapewnia skuteczną metodę identyfikacji interaktorów białkowych o wysokim poziomie ufności dla białka będącego przedmiotem zainteresowania. Takie podejście zmniejsza złożoność próbki poprzez frakcję subkomórkową i koncentruje się na zwiększeniu partnerów interakcji identyfikacyjnych poprzez solidne przygotowanie próbki, czyszczenie próbki w trybie offline i rygorystyczną kontrolę jakości systemu LC-MS. Opisana tutaj dalsza analiza danych pozwala na prostą ocenę statystyczną białek zidentyfikowanych jako współoczyszczające się z przynętą. Jednak ze względu na dużą liczbę zmiennych eksperymentalnych (skala, linia komórkowa, wybór przeciwciał), każdy eksperyment wymaga innych punktów odcięcia i rozważań dotyczących wizualizacji i wzbogacania danych.

Pierwszym założeniem projektowym w eksperymencie IP-MS jest wybór przeciwciał, które zostaną wykorzystane do kooczyszczania białka będącego przedmiotem zainteresowania wraz z jego oddziałującymi partnerami. Chociaż w ciągu ostatnich kilku dekad dostępność komercyjnych przeciwciał rozszerzyła się na większe części ludzkiego proteomu, nadal istnieje wiele białek, dla których odczynniki są ograniczone. Co więcej, przeciwciała, które zostały zwalidowane do zastosowań takich jak wykrywanie western blot, mogą nie być zdolne do selektywnego wzbogacania białka docelowego w eksperymencie immunoprecypitacyjnym. Przed przeprowadzeniem eksperymentu proteomicznego interakcji na dużą skalę sugeruje się wykonanie IP z 90% zlewającej się 10-centymetrowej płytki lub równoważnej liczby komórek i sondowanie docelowego białka za pomocą western blotting. Jeśli do immunoprecypitacji dostępne jest więcej niż jedno przeciwciało, sugeruje się dodatkowo wybór wielu przeciwciał rozpoznających epitopy w różnych częściach białka. Wiązanie przeciwciała z białkiem przynęty może zablokować niezbędny interfejs wiązania dla domniemanych partnerów oddziałujących. Wybór wtórnego epitopu dla białka przynęty zwiększy pokrycie profilu interakcji zidentyfikowanego w eksperymencie opartym na spektrometrii mas.

Drugą ważną kwestią jest wybór odpowiedniej kontroli w celu odróżnienia interakcji o wysokim poziomie ufności od interakcji o niskim poziomie ufności lub interakcji niespecyficznych od tych zidentyfikowanych jako oczyszczające za pomocą przynęty. Najbardziej rygorystyczną kontrolą w eksperymencie IP-MS jest zakończenie immunoprecypitacji z linii komórkowej CRISPR KO przynęty. Taka kontrola umożliwia identyfikację i odfiltrowanie niespecyficznych białek, które wiążą się bezpośrednio z przeciwciałem, a nie z białkiem przynęty. W przypadkach, w których wytworzenie linii komórkowej CRISPR KO każdego białka przynęty nie jest możliwe, można zastosować kontrolę kulek IgG tego samego izotypu przeciwciała przynęty. W eksperymentach wykorzystujących panel przeciwciał reprezentujących wiele gatunków, użycie kontroli tylko kulek może być właściwe, ale zwiększy odsetek wyników fałszywie dodatnich zidentyfikowanych jako interaktorzy o wysokim poziomie zaufania.

Wybór linii komórkowej użytej w eksperymencie IP-MS zależy od kilku kluczowych czynników. Ekspresja i lokalizacja białek są w dużej mierze zależne od typu komórki. Podczas gdy szacunki ekspresji RNA można znaleźć dla większości genów w wielu powszechnie stosowanych liniach komórkowych, ekspresja białka jest słabo skorelowana z ekspresją RNA i musi być określona eksperymentalnie25. Należy unikać linii komórkowych, w których białko przynęty ulega ekspresji w bardzo niskiej liczbie kopii, aby uniknąć problemów związanych z drastycznym wzrostem skali hodowli komórkowej, który może być wymagany. Należy jednak zauważyć, że przygotowanie próbki można zoptymalizować pod kątem wykrywania białek o bardzo niskiej liczebności. Metoda przygotowania próbki wspomaganej filtrem (FASP), choć solidna, może spowodować ponad 50% utratę peptydu w próbce. Jednogarnkowe przygotowanie próbek ze wzmocnieniem fazy stałej (SP3) to wydajna metoda generowania próbek do analizy spektrometrii mas, która minimalizuje straty próbek26. Zwiększony odzysk możliwy dzięki metodzie przygotowania próbki SP3 może być użyteczną alternatywą w tym procesie oznaczania ilościowego białek, które znajdują się w pobliżu granicy wykrywalności.

Ten przepływ pracy proteomiki został zastosowany w wielu przynętach jądrowych, w tym kinazach, ligazach ubikwityny E3 i rusztowaniach kompleksów wielopodjednostkowych. Zakładając prawidłową walidację odczynników przeciwciał, pomyślne wykonanie tego procesu pracy spowoduje wykrycie partnerów interakcji jądrowej białek o wysokim poziomie ufności dla białka będącego przedmiotem zainteresowania.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez grant Grand Challenge dla W.M.O. z Linda Crnic Institute for Down syndrome oraz przez umowę o współpracy DARPA 13-34-RTA-FP-007. Chcielibyśmy podziękować Jessemu Kurlandowi i Kirze Cozzolino za ich wkład w czytanie i komentowanie manuskryptu.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0,25% trypsyna, 0,1% EDTAThermo Fisher Scientific25200056
1,5 ml probówki do mikrowirówek o niskim czynszuFisher Scientific02-681-320
4-20% Mini PROTEAN TGX Prefabrykowane żele białkoweBio-Rad4561096
aceton (HPLC)Thermo Fisher ScientificA949SK-4
Amicon Ultra 0,5 ml 30k kolumnafiltracyjnaMillipore SigmaUFC503096
BenzamidineSigma-Aldrich12072
benzonazaSigma-AldrichE1014
ChloroacetamidSigma-AldrichC0267
Zamknięcie rurki do dializyCaroline Biological Supply Company684239
DTTSigma-Aldrich10197777001
Przeciwciało EDTASigma-AldrichEDS
GAPDHSanta Cruz BiotechnologySc-47724
GlicerolFisher Scientific887845
GlycineSigma-AldrichG8898
HeLa QC tryptic digestPierce88329
HEPESFisher ScientificAAJ1692630
insulinaThermo Fisher Scientific12585014
jodoacetamidSigma-AldrichI1149
KONTES Homogenizator do odbłąk 7 mlVWRKT885300-0007
Tłuczek o dużym prześwicie 7mlVWRKT885301-0007
Endopeptydaza lizylowa CVWR125-05061
ChlorekmagnezuSigma-Aldrich208337
Microcystinenzo nauki przyrodniczeALX-350-012-C100
Nonidet P 40 Roztwór zastępczyPrzeciwciało Sigma-Aldrich98379
p84GeneTexGTX70220
buforowanych
PierceThermo Fisher Scientific23227
Pierce BSA Protein Digest, klasa MSKolumny wirujące Thermo Fisher Scientific88341LCMS QC
Pierce C18Thermo Fisher ScientificPI-89873
Proteaza Pierce Trypsyna, MS GradeThermo Fisher Scientific90057Do przygotowania próbek spektrometrii mas
PMSFSigma-AldrichP7626
ChlorekpotasuSigma-AldrichP9541
Białko A Sepharoza CL-4BGE Healthcare Bio-Sciences17-0780-01
Białko G Sepharose 4 Fast FlowGE Healthcare Bio-Sciences17-0618-01
SDSSigma-AldrichL3771
Końcówka emitera krzemionkiPico TIPFS360-20-10
Tłuczek mały Clearance 7mlVWRKT885302-0007
Chlorek soduSigma-AldrichS3014
Fluorek soduSigma-Aldrich201154
Pirosiarczyn soduSigma-Aldrich31448
Ortowanadan soduSigma-AldrichS6508
Spectra/ Por 8 kDa 24 mm rurka do dializyThomas Scientific3787K17
TC Dish 150, StandardSarstedt83.3903Naczynie do hodowli tkankowych dla komórek adherentnych
TCASigma-AldrichT9159
TCEPThermo ScientificPG82080
TFAThermo Fisher Scientific28904
Thermo Scientific Orbitrap Fusion MSThermo Fisher Scientific
Trizma BaseSigma-AldrichT6066
MocznikThermo Fisher Scientific29700
Wody ACQUITY Klasa M Wody UPLCWody
ACQUITY UPLC M-Class Kolumna odwrócona faza 1,7 i mikro; m Sferyczna hybryda (1,7 &mikro; m, 75 i mikro; m x 250 mm)Wody186007484kolumnie nanoflow C18
Zestaw do oznaczania białek BCA fosforanami

Bibliografia

  1. Varjosalo, M., et al. The protein interaction landscape of the human CMGC kinase group. Cell Reports. 3, 1306-1320 (2013).
  2. Kimple, M. E., Brill, A. L., Pasker, R. L. Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Current Protocols in Protein Science. 73, (2013).
  3. Mahmood, N., Xie, J. An endogenous 'nonspecific' protein detected by a His-tag antibody is human transcription regulator YY1. Data in Brief. 2, 52(2015).
  4. Zordan, R. E., Beliveau, B. J., Trow, J. A., Craig, N. L., Cormack, B. P. Avoiding the ends: internal epitope tagging of proteins using transposon Tn7. Genetics. 200, 47-59 (2015).
  5. Gibson, T. J., Seiler, M., Veitia, R. A. The transience of transient overexpression. Nature Methods. 10, 715-721 (2013).
  6. Bronicki, L. M., et al. Ten new cases further delineate the syndromic intellectual disability phenotype caused by mutations in DYRK1A. European Journal of Human Genetics. 23, 1482-1487 (2015).
  7. Antonarakis, S. E. Down syndrome and the complexity of genome dosage imbalance. Nature Reviews Genetics. , (2016).
  8. Dowjat, W. K., et al. Trisomy-driven overexpression of DYRK1A kinase in the brain of subjects with Down syndrome. Neuroscience Letters. 413, 77-81 (2007).
  9. Fotaki, V., et al. Dyrk1A haploinsufficiency affects viability and causes developmental delay and abnormal brain morphology in mice. Molecular and Cellular Biology. 22, 6636-6647 (2002).
  10. Hämmerle, B., Elizalde, C., Tejedor, F. J. The spatio-temporal and subcellular expression of the candidate Down syndrome gene Mnb/Dyrk1A in the developing mouse brain suggests distinct sequential roles in neuronal development. European Journal of Neuroscience. 27, 1061-1074 (2008).
  11. Funakoshi, E., et al. Overexpression of the human MNB/DYRK1A gene induces formation of multinucleate cells through overduplication of the centrosome. BMC Molecular and Cell Biology. 4, 12(2003).
  12. Yu, D., Cattoglio, C., Xue, Y., Zhou, Q. A complex between DYRK1A and DCAF7 phosphorylates the C-terminal domain of RNA polymerase II to promote myogenesis. Nucleic Acids Research. , 1-14 (2019).
  13. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  14. Wiśniewski, J. R., Zougman, A., Nagaraj, N., Mann, M. Universal sample preparation method for proteome analysis. Nature Methods. 6, 359-362 (2009).
  15. Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics. Nature Protocols. 11, 2301-2319 (2016).
  16. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nature Methods. 13, 731-740 (2016).
  17. Mellacheruvu, D., et al. The CRAPome: A contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nature Methods. 10, 730-736 (2013).
  18. Choi, H., et al. SAINT: Probabilistic scoring of affinity purificationg-mass spectrometry data. Nature Methods. 8, 70-73 (2011).
  19. Shannon, P., et al. Cytoscape: a software environment for integrated models of biomolecular interaction networks. Genome Research. 13, 2498-2504 (2003).
  20. Szklarczyk, D., et al. The STRING database in 2017: quality-controlled protein-protein association networks, made broadly accessible. Nucleic Acids Research. 45, 362-368 (2017).
  21. Bindea, G., et al. ClueGO: a Cytoscape plug-in to decipher functionally grouped gene ontology and pathway annotation networks. Bioinformatics. 25, 1091-1093 (2009).
  22. Guard, S. E., et al. The nuclear interactome of DYRK1A reveals a functional role in DNA damage repair. Scientific Reports. 9, 6539(2019).
  23. Razick, S., Magklaras, G., Donaldson, I. M. iRefIndex: A consolidated protein interaction database with provenance. BMC Bioinformatics. 9, 405(2008).
  24. Kulak, N. A., Pichler, G., Paron, I., Nagaraj, N., Mann, M. Minimal, encapsulated proteomic-sample processing applied to copy-number estimation in eukaryotic cells. Nature Methods. 11, 319-324 (2014).
  25. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165, 535-550 (2016).
  26. Hughes, C. S., et al. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology. Molecular Systems Biology. 10, 757(2014).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

frakcjonowanie subkom rkoweoczyszczanie immunoafinicyjneanaliza spektrometri masoddzia ywania bia ko bia koekstrakt j drowy HeLakinaza DYRK1Awalidacja przeciwciaocena jako ci danych
Bezznacznikowa spektrometria mas immunoprecypitacji do profilowania interaktomii jądrowej na dużą skalę
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki Korzystania

Zasady

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.