Artykuł metodologiczny

Pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego w hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T metodą cytometrii przepływowej

DOI:

10.3791/60475

⸱

26 grudnia 2019

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Oncology UNIL CHUV, Ludwig Institute for Cancer Research Lausanne, University of Lausanne, 2Swiss Institute for Experimental Cancer Research (ISREC), School of Life Sciences, Swiss Federal Institute of Technology Lausanne (EPFL), 3Center of Experimental Therapeutics, Department of Oncology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois, 4Hematology Service, Department of Oncology, Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (CHUV)

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tutaj opisujemy wiarygodną metodę pomiaru masy mitochondriów i potencjału błonowego w hodowanych ex vivo hematopoetycznych komórkach macierzystych i limfocytach T.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Delikatna równowaga między spoczynkiem, samoodnawianiem się i różnicowaniem jest kluczem do zachowania puli krwiotwórczych komórek macierzystych (HSC) i utrzymania produkcji wszystkich dojrzałych komórek krwi przez całe życie. W ostatnich latach metabolizm komórkowy stał się kluczowym regulatorem funkcji i losu HSC. Wcześniej wykazaliśmy, że modulacja metabolizmu mitochondrialnego wpływa na los HSC. W szczególności, poprzez chemiczne rozprzęgnięcie łańcucha transportu elektronów, byliśmy w stanie utrzymać funkcję HSC w warunkach hodowli, które normalnie indukują szybkie różnicowanie. Jednak ograniczenie liczby HSC często wyklucza stosowanie standardowych testów do pomiaru metabolizmu HSC, a tym samym przewidywania ich funkcji. W tym miejscu przedstawiamy prosty test cytometrii przepływowej, który umożliwia wiarygodny pomiar potencjału błony mitochondrialnej i masy mitochondrialnej w rzadkich komórkach, takich jak HSC. Omówiono izolację HSC ze szpiku kostnego myszy oraz pomiar masy mitochondrialnej i potencjału błonowego po hodowli ex vivo. Jako przykład pokazujemy modulację tych parametrów w HSC poprzez leczenie modulatorem metabolicznym. Co więcej, rozszerzamy zastosowanie tej metodologii na ludzkie limfocyty T pochodzące z krwi obwodowej i ludzkie limfocyty naciekające nowotwór (TIL), wykazując dramatyczne różnice w ich profilach mitochondrialnych, co może odzwierciedlać różne funkcje limfocytów T. Uważamy, że ten test może być stosowany w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji modulatorów metabolizmu mitochondrialnego w różnych typach komórek w różnych kontekstach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hematopoetyczne komórki macierzyste (HSC) to niewielka populacja komórek znajdujących się w szpiku kostnym, zapewniająca produkcję krwi i homeostazę przez całe życie organizmu. HSC pośredniczą w tym procesie, dając początek progenitorom, które z kolei wytwarzają terminalnie zróżnicowane linie dojrzałych komórek krwi poprzez kilka rund podziału komórkowego i dobrze zaaranżowane etapy różnicowania1. Co ważne, HSC wytwarzają swoją energię w procesie glikolizy beztlenowej. Natomiast bardziej zaangażowani i aktywni przodkowie układu krwiotwórczego przestawiają swój metabolizm w kierunku metabolizmu mitochondrialnego2,3,4. Uważa się, że ten odrębny stan metaboliczny chroni HSC przed uszkodzeniami komórek spowodowanymi przez reaktywne formy tlenu (ROS) wytwarzane przez aktywne mitochondria, utrzymując w ten sposób ich długoterminową funkcję in vivo5,6,7,8. Bezpośredni pomiar stanu metabolicznego HSC jest trudny i często ma niską przepustowość ze względu na ich ograniczoną liczbę. W tym miejscu opisujemy test oparty na cytometrii przepływowej do solidnego pomiaru potencjału błonowego mitochondriów (ΔΨm) przy użyciu fluorescencji estru metylowego tetrametylorodaminy (TMRM) i masy mitochondrialnej przy użyciu zielonego fluorescencyjnego barwnika mitochondrialnego (Mitotracker Green) w HSC. Wcześniej wykazaliśmy, że niskie ΔΨm jest prawdziwym funkcjonalnym markerem wysoce oczyszczonych HSCs9 i modulatorów metabolicznych zdolnych do obniżania ΔΨm wzmacnia funkcję HSCs9,10. W tym miejscu proponujemy wykorzystanie naszej metody profilowania mitochondriów HSC jako strategii identyfikacji nowych cząsteczek zdolnych do poprawy długoterminowego potencjału rekonstytucji krwi HSC.

Jako przykład, pokazujemy, że ten test wiarygodnie mierzy obniżenie HSC ΔΨm po ekspozycji na analog witaminy B3, rybozyd nikotynamidu (NR). W związku z tym w naszym niedawno opublikowanym badaniu wykazaliśmy, że NR silnie poprawia regenerację krwi po przeszczepie zarówno u myszy, jak i humanizowanych myszy poprzez bezpośrednią poprawę funkcji krwiotwórczych pni i progenitorów10. Zdolność takich modulatorów metabolicznych ma dużą wartość kliniczną, biorąc pod uwagę, że 25% śmiertelność jest związana z opóźnieniem powrotu krwi i odporności u pacjentów po przeszczepie11,12.

Ponadto, dostarczamy dowodów na to, że ta metodologia może być zastosowana do charakterystyki profilu metabolicznego i funkcji ludzkich limfocytów T. W ostatnich latach rozwój adoptywnej terapii komórkowej (ACT) z wykorzystaniem autologicznych limfocytów naciekających nowotwór (TIL) stał się najskuteczniejszym podejściem do niektórych typów zaawansowanych nowotworów o wyjątkowo niekorzystnym rokowaniu (np. czerniak z przerzutami, gdzie >50% pacjentów reaguje na leczenie, a do 24% pacjentów ma całkowitą regresję)13. Jednak TIL o wystarczającej aktywności przeciwnowotworowej są trudne do wygenerowania14. Rozległa proliferacja i stymulacja, której poddawane są TIL podczas ekspansji ex vivo, powoduje wyczerpanie i starzenie się limfocytów T, co dramatycznie upośledza odpowiedź przeciwnowotworową limfocytów T15. Co ważne, zdolność przeciwnowotworowa TIL jest ściśle związana z ich metabolizmem16,17, a podejścia mające na celu modulację metabolizmu poprzez hamowanie szlaku PI3K/Akt przyniosły zachęcające wyniki18,19. Z tego powodu porównujemy ΔΨm limfocytów T pochodzących z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) i TIL pochodzących od pacjentów i pokazujemy, że mniej zróżnicowane limfocyty T pochodzące z PBMC mają niższy ΔΨm i masę mitochondrialną w porównaniu z kończnie zróżnicowanymi TIL.

Przewidujemy, że ten test może być wykorzystany do identyfikacji nowych modulatorów metabolicznych, które poprawiają funkcję komórek HSC i T poprzez modulację ΔΨm.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty opisane w manuskrypcie są zgodne z wytycznymi naszej instytucji i zostały przeprowadzone zgodnie ze szwajcarskim prawem dla eksperymentów na zwierzętach (Autoryzacja: VD3194) oraz dla badań z udziałem próbek ludzkich (Protokół: 235/14; CER-VD 2017-00490)

1. Ekstrakcja hematopoetycznych komórek macierzystych

  1. Kup myszy C57BL6/J typu dzikiego i trzymaj je w pomieszczeniu dla zwierząt przez co najmniej tydzień, aby zmniejszyć stres związany z transportem.
  2. W dniu eksperymentu poddać mysz eutanazji za pomocą uduszenia CO2 .
  3. Spryskaj mysz 70% etanolem, aby wysterylizować futro i rozetnij mysz na brzuchu za pomocą standardowych narzędzi chirurgicznych, takich jak nożyczki preparacyjne i kleszcze, aby przeciąć kości udowe i piszczelowe od tylnych nóg.
  4. Usuń mięśnie przyczepione do kości udowej, piszczelowej i miednicy za pomocą miękkiego ręcznika papierowego i umieść oczyszczone kości w probówce o pojemności 50 ml zawierającej PBS z 1 mM EDTA (buforem) na lodzie.
  5. Spryskaj moździerz i tłuczek 70% etanolem i umieść je w kapturze do hodowli komórkowych. Sterylizuj UV przez 30 min. Po sterylizacji spłucz moździerz i tłuczek buforem, aby usunąć ślady etanolu.
  6. Umieść czyste kości z odrobiną buforu (~10 ml) w moździerzu i delikatnie je zmiażdż, aby wydostać szpik kostny w postaci zawiesiny. Teraz zbierz zawiesinę komórek i przepuść ją przez sitko o wielkości 70 μm do probówki o pojemności 50 ml, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki.
  7. Powtarzaj krok 1.6, aż cały szpik kostny zostanie usunięty, a resztki kości zmienią kolor na biały.
  8. Umieścić probówkę (probówki) o pojemności 50 ml zawierającą zawiesinę jednokomórkową szpiku kostnego na wirówce. Uruchomić wirówkę przy 300 x g na 10 minut w temperaturze 4 °C w celu osadzenia komórek.
  9. W międzyczasie przygotuj 10 ml 1x buforu do lizy RBC w autoklawowanej wodzie destylowanej. Przefiltrować roztwór przez filtr 0,22 μm.
  10. Pobrać probówkę z próbką z wirówki i zdekantować supernatant. Odpipetować 1x bufor do lizy RBC (tabela materiałów) na osad komórkowy. Usunąć osad i przygotować jednorodny roztwór, pipetując kilka razy w górę i w dół. Pozostaw probówkę w temperaturze pokojowej na 1–2 minuty, aby nastąpiła liza RBC. Zatrzymaj proces lizy, napełniając probówkę buforem.
  11. Umieścić probówkę na wirówce i wirować z prędkością 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Zebrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Ponownie zawiesić osad, dodając 10 ml buforu i przefiltrować roztwór do nowej probówki o pojemności 50 ml za pomocą sitka do komórek 70 μm, aby usunąć zanieczyszczenia spowodowane lizą RBC.
  12. Odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 500 μl buforu.
  13. Wyjąć podwielokrotność 100 μl i przechowywać w osobnej probówce o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl koktajlu przeciwciał zubożających linię biotyny z zestawu wzbogacającego progenitory (tabela materiałów) do pozostałych 450 μl zawiesiny komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez 15 minut.
  14. Dodać 15 ml buforu i odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 460 μl buforu. Pobrać podwielokrotność 10 μl i przechowywać w osobnej probówce o pojemności 1,5 ml.
  15. Dodać 50 μl kulek magnetycznych streptawidyny z zestawu do wzbogacania progenitorów (tabela materiałów) do pozostałych 450 μl zawiesiny komórek. Inkubować w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez 15 minut.
  16. Dodać 15 ml buforu i odwirować probówkę o stężeniu 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Pobrać probówkę z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 5 ml buforu i przenieść roztwór do probówki o pojemności 15 ml.
  17. Przenieść probówkę do automatycznego separatora komórek (tabela materiałów). Uruchom program mycia, aby przepłukać i zalać rurki separatora komórek. Umieścić próbkę i dwie probówki zbiorcze na uchwycie probówki. Wykonaj separację za pomocą programu "Zubożenie". Zbierz frakcje dodatnie i ujemne z automatycznego separatora komórek po zakończeniu cyklu.
    nuta: W przypadku braku automatycznego separatora komórek użytkownicy mogą korzystać z ręcznych kolumn magnetycznych i odpowiednich magnesów, zgodnie z instrukcją obsługi. Użytkownicy powinni pamiętać, że proces ręcznej separacji jest wolniejszy niż automatycznej. Ponadto kolumny ręczne są bardziej podatne na zatykanie. Dlatego użytkownikom zaleca się rozcieńczanie próbki i powolne ładowanie kolumny.
  18. Odrzuć frakcję dodatnią. Napełnij probówkę z frakcją ujemną buforem. Odwirować probówkę o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
  19. W międzyczasie przygotować mieszaninę przeciwciał w 1 ml roztworu do końcowej objętości, a jednokolorowe kontrole w 200 μl roztworu do końcowej objętości, jak opisano w Tabeli Materiałów i Tabeli 1.
    nuta: Jeśli TMRM i zielone fluorescencyjne barwienie mitochondriów mają być połączone z barwieniem markerem komórek macierzystych, należy zastąpić CD150-PE CD150-PEcy5, a czerwień Streptavidin-Tx Streptavidin-Pac Orange.
  20. Pobrać probówkę z próbką z wirówki i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w 1 ml mieszanki przeciwciał. Dodaj 10 μl komórek (z kroku 1.13) do każdej z jednokolorowych probówek kontrolnych (z wyjątkiem linii). Dodaj 10 μl komórek (z kroku 1.14) do jednokolorowej probówki z linią produkcyjną.
  21. Inkubować próbkę i jednokolorowe probówki kontrolne w temperaturze 4 °C na wytrząsarce przez 45 minut. Przykryć wiadro na lód pokrywką lub folią aluminiową.
  22. Napełnić wszystkie probówki buforem i odwirować przy 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić próbkę w 1 ml buforu, a jednobarwne kontrole w 200 μl buforu.
  23. Przenieś próbkę i jednokolorowe kontrolki do górnych probówek FACS o pojemności 5 ml.
  24. Weź probówki do maszyny sortującej i posortuj populację HSC (strategia bramkowania w Rysunek 1A) w probówkach o pojemności 1,5 ml zawierających 400 μl pożywki do namnażania komórek macierzystych.

2. Hodowla ex vivo hematopoetycznych komórek macierzystych

  1. Zebrać probówki zawierające posortowane komórki (patrz sekcja 1 dotycząca ekstrakcji komórek). Odwirować probówki o sile 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Delikatnie usunąć większość supernatantu bez usuwania osadu i pozostawić 50–80 μl na wierzchu osadu komórkowego. Minimalizuje to utratę komórek.
  2. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do ekspandowania komórek macierzystych do końcowej objętości w zależności od liczby warunków, które mają być badane (liczba na 100 μl na studzienkę/warunek hodowli).
  3. Przygotować 2x pożywkę hodowlaną zawierającą pożywkę do ekspandowania komórek macierzystych, czynnik komórek macierzystych (200 ng/ml), ligand FLT3 (4 ng/ml) i antybiotyki pen-strep (1%) (2x podłoże podstawowe; Tabela materiałów).
  4. Weź sterylną kulturę tkankową poddaną działaniu 96 U-dolnej płytki dołkowej (tabela materiałów) i zidentyfikuj studzienki, w których komórki będą hodowane (projekt płytki w Rysunek 1B).
    nuta: Użytkownikom zaleca się unikanie studni brzeżnych, ponieważ są one bardziej podatne na parowanie.
  5. Umieść 100 μl 2x podłoża podstawowego przygotowanego wcześniej w kroku 2.3 do tych studzienek. Do dobrze oznaczonej NR dodać 2 μl roztworu 100x NR (Tabela Materiałów). Uzupełniaj NR co 24 godziny < > nuta: Uzupełnianie zapasów jest specyficzne dla NR. Inne modulatory metaboliczne mogą, ale nie muszą, wymagać uzupełnienia.
  6. Wysiewać 100 μl komórek przygotowanych w kroku 2.2 na wierzchu studzienek zawierających 2x podłoże podstawowe. W tym eksperymencie liczba HSC wysianych na studzienkę wynosiła od 800 do 1000 komórek.
  7. Przygotuj pięć dodatkowych studzienek zawierających 2x podłoże podstawowe. Do każdego z nich dodać 100 000 całych komórek szpiku kostnego (z kroku 1.13) zawieszonych w 100 μl pożywki do ekspandowania komórek macierzystych, która ma być wykorzystana jako kontrola barwienia do analizy cytometrii przepływowej po hodowli.
    nuta: Jeśli użytkownicy chcą połączyć markery komórek macierzystych i markery mitochondrialne do analizy po hodowli, zaleca się dodatkowe sortowanie populacji progenitorów (komórki Ckit+ lub komórki LKSCD150-). Zasiej te posortowane progenitory w studzienkach kontrolnych barwienia w celu analizy cytometrii przepływowej po hodowli. Przygotuj jedną studzienkę na pojedynczy kolor plamy.
  8. Wlej 200 μl autoklawizowanej wody do wszystkich okolicznych studzienek, aby zmniejszyć parowanie ze studni zawierających komórki. Pozostawić płytkę w nienaruszonym stanie w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez cały okres hodowli (72 godziny). Wyjąć płytkę, aby uzupełnić NR co 24 godziny i umieścić ją z powrotem w inkubatorze.

3. Pomiar masy mitochondriów i potencjału błonowego

  1. Pod koniec okresu hodowli przygotuj 100-krotny roztwór TMRM (20 μM) i Mitotracker green (10 μM) (zielone barwienie fluorescencyjne) w pożywce do ekspandowania komórek macierzystych (tabela materiałów).
  2. Dodać 2 μl 100x roztworu TMRM i 2 μl 100x roztworu zielonej fluorescencji do każdej z dołków testowych. Dodaj 2 μl 100x TMRM do studzienki kontrolnej TMRM. Dodaj 2 μl 100x zielonej plamy fluorescencyjnej do studzienki kontrolnej Mitotracker. Umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 45 minut. Przykryj górną część talerza folią aluminiową.
    nuta: Dodatkowa kontrola z Verapamilem (inhibitorem pompy ABC) może być przygotowana, jeśli konieczne jest przetestowanie wypływu barwnika za pośrednictwem pompy ABC. W tym celu dodać 50 μM Werapamilu do jednej z studzienek testowych na 1 godzinę przed barwieniem na TMRM i barwienie zieloną fluorescencyjną.
  3. Wyjąć płytkę z inkubatora i odwirować ją przy sile 300 x g przez 5 minut. Odwrócić płytkę, aby usunąć supernatant. Dodać 200 μl standardowego buforu FACS (PBS-1 mM EDTA-P/S-2% FBS), odwirować płytkę przy 300 x g przez 5 min. Usunąć supernatant. Powtórz ten krok prania 3 razy. Użytkownicy muszą upewnić się, że płyta jest zawsze przykryta folią, aby zapewnić minimalną ekspozycję na bezpośrednie działanie światła.
    nuta: Jeśli użytkownicy muszą połączyć barwienie mitochondriów z barwieniem komórek macierzystych, próbka będzie musiała być inkubowana z mieszanką przeciwciał wszystkich markerów komórek macierzystych, a jednokolorowe kontrole będą musiały być barwione pojedynczymi przeciwciałami oddzielnie w temperaturze 4 °C przez 30–45 min.
    nuta: Na wszystkich etapach użytkownicy muszą przykryć płytę folią aluminiową. Użytkownicy muszą pamiętać, że ten dodatkowy etap barwienia i kolejne etapy prania mogą spowodować dodatkową utratę komórek.
  4. Ponownie zawiesić komórki w 200 μl buforu FACS i przenieść do probówek FACS.
  5. Uruchom próbki na cytometrze przepływowym (patrz Rysunek 1). Jednokolorowe probówki zawierające WBM obejmują: (1) Niebarwione; (2) DAPI; 3) TMRM (PE); (4) zielona plama fluorescencyjna (FITC); (5) Pełna plama (PE i FITC).
  6. Najpierw zdobądź jednokolorowe elementy sterujące, aby skonfigurować urządzenie. Użyj uruchomionego oprogramowania na maszynie, aby obliczyć odszkodowanie. Po zastosowaniu kompensacji należy pobrać próbkę HSC i zarejestrować jak najwięcej zdarzeń.
    nuta: W przypadku połączenia markerów komórek macierzystych i mitochondriów, użytkownicy muszą być szczególnie ostrożni przy kompensacji między TMRM (PE), CD150 (PE-Cy5) i Sca-1 (APC). Ponadto próbki należy uruchomić natychmiast po barwieniu.
  7. Wyeksportuj pliki FACS z cytometru i przeanalizuj dane w oprogramowaniu analitycznym (Tabela materiałów).
    1. Aby przeprowadzić analizę, otwórz plik w oprogramowaniu do analizy. Za pomocą bramkowania FSC-A i SSC-A zidentyfikuj populację komórek. Zidentyfikuj pojedyncze punkty w następnych bramkach przed wykreśleniem frakcji ujemnej DAPI (żywe komórki). W bramie komórki pod napięciem wykonaj wykres konturowy w kanale TMRM i zielonym fluorescencyjnym barwieniu, aby zmierzyć odpowiednio ΔΨm i masę (Rysunek 2A). Eksportuj średnią intensywność fluorescencji (MFI) tych dwóch kanałów w bramce komórki na żywo.
    2. Dolna bramka TMRM jest ustawiana na podstawie populacji pobocza w kanale TMRM. Jednokolorowa kontrolka TMRM może służyć do identyfikowania tej populacji pobocza w celu ustawienia bramy. Eksportuj proporcję żywych komórek w niskiej bramce TMRM w próbkach kontrolnych i testowych do wykreślenia.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W Rysunek 1 pokazujemy strategię bramkowania dla izolacji hematopoetycznych komórek macierzystych ze szpiku kostnego myszy oraz układ płytki dla ich hodowli ex vivo. Rysunek 1A pokazuje identyfikację frakcji limfocytów na wykresie SSC-A/FSC-A. Dublety usunięto w bramce singletowej, a następnie zidentyfikowano żywe komórki na podstawie braku sygnału DAPI. Zidentyfikowano populację LKS, zdefiniowaną przez linię Sca1 + cKit +....

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ścisła regulacja funkcji HSC jest ważna dla utrzymania stabilnej hematopoezy w ciągu życia organizmu. Podobnie jak różne inne typy komórek w organizmie, kluczowym składnikiem, który przyczynia się do regulacji funkcji HSC, jest metabolizm komórkowy. Poprzednie badania z naszego laboratorium9 i innych 2,3 sugerowały znaczenie mitochondriów w utrzymaniu odrębnego stanu metabolicznego w HSC. Ze względu na wyjątkowo niską liczbę HSC wyizolowanych z mysiego szpiku kos...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niektóre elementy tej pracy zostały złożone jako P1828EP00 zgłoszeniowe do Europejskiego Urzędu Patentowego.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy za wsparcie Centralnemu Ośrodku Cytometrii Przepływowej UNIL, szczególnie Dr. Romainowi Bedelowi. Praca ta została wsparta grantem fundacji Kristiana Gerharda Jebsena dla N.V i O.N.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Probówki FACS 5 mlFalcon352235Przygotowanie próbki
Płyta dolna 96-UCorning3799
Separator AutoMACS prohodowli komórkowych Miltenyi BiotecAutomatyczna separacja komórek
BD FACS AriaIIIBecton i DickinsonSortowanie komórek
BD IMag zestaw do wzbogacania krwiotwórczych komórek progenitorowych myszyBD558451Zubożenie linii
BD LSRIIMaszyna do akwizycji FACSBecton and Dickinson
BD-DIVAOprogramowanie do akwizycjiBecton and Dickinson
CD150 PEBiolegend115904Mieszanka do barwienia przeciwciał
CD150 PE-Cy5Biolegend115912Mieszanka do barwienia przeciwciał
CD48 PBBiolegend103418Mieszanka do barwienia przeciwciał
Wirówka- 5810REppendorfWirowanie
Ckit PeCy7 Biolegend105814Mieszanka do barwienia przeciwciał
Flow joFlowJo LLCOprogramowanie do analizy FACS
GraphPad-PrismGraphPadWykres danych na wykresach
Mitotracker GreenInvitrogenM7514Barwienie mitokondrium o zielonej fluorescencji do pomiaru masy mitochondrialnej; stężenie robocze = 100 nM; stężenie zapasów = 1 mM
Rybozyd nikotynamidu (NR)Specjalnie syntetyzowany w domuModulator metaboliczny; stężenie robocze = 500 &mikro; M; stężenie zapasów = 50 mM
PBSCHUVPrzygotowanie buforu; stężenie robocze = 1x; stężenie zapasu = 1x
Pen-Strep (P/S)Technologie życia15140122Hodowla ex vivo; stężenie robocze = 1x; stężenie zapasu = 1x
Bufor do lizy RBCBiolegend420301Liza Czerwone krwinki; stężenie robocze = 1x; stężenie zapasu = 10x
Rekombinowany mysi ligand Flt-3 (FLT3)RnD427-FL-005/CFHodowla ex vivo; stężenie robocze = 2 ng/mL; stężenie podstawowe = 10 &mikro; g/ml
Rekombinowany czynnik mysich komórek macierzystych (SCF)RnD455-MC-010/CFHodowla ex vivo; stężenie robocze = 100 ng/mL; stężenie podstawowe = 50 &mikro; g / ml
Sca1 APCThermo Fisher Scientific17-5981-82Mieszanka do barwienia przeciwciał
StemlineII Pożywka do ekspansji hematopoetycznych komórek macierzystychSIGMAS0192Hodowla ex vivo
Streptawidyna Pac pomarańczowaLife TechnologiesS32365Mieszanka do barwienia przeciwciał
Streptawidyna Tx czerwonaLife TechnologiesS872Mieszanka
do barwienia przeciwciałTMRMInvitrogenT668Barwienie potencjału błony mitochondrialnej; stężenie robocze = 200 nM; stężenie podstawowe = 10 mM
Ultra czysty EDTAInvitrogen15575-038Przygotowanie buforu; stężenie robocze = 0,5 M; stężenie wyjściowe = 1 mM
do 1000324

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Busch, K., et al. Fundamental properties of unperturbed haematopoiesis from stem cells in vivo. Nature. 518 (7540), 542-546 (2015).
  2. Simsek, T., et al. The distinct metabolic profile of hematopoietic stem cells reflects their location in a hypoxic niche. Cell Stem Cell. 7 (3), 380-390 (2010).
  3. Takubo, K., et al. Regulation of glycolysis by Pdk functions as a metabolic checkpoint for cell cycle quiescence in hematopoietic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 49-61 (2013).
  4. Yu, W. M., et al. Metabolic regulation by the mitochondrial phosphatase PTPMT1 is required for hematopoietic stem cell differentiation. Cell Stem Cell. 12 (1), 62-74 (2013).
  5. Chen, C., et al. TSC-mTOR maintains quiescence and function of hematopoietic stem cells by repressing mitochondrial biogenesis and reactive oxygen species. Journal of Experimental Medicine. 205 (10), 2397-2408 (2008).
  6. Ito, K., et al. Regulation of oxidative stress by ATM is required for self-renewal of haematopoietic stem cells. Nature. 431 (7011), 997-1002 (2004).
  7. Ito, K., et al. Reactive oxygen species act through p38 MAPK to limit the lifespan of hematopoietic stem cells. Nature Medicine. 12 (4), 446-451 (2006).
  8. Tothova, Z., et al. FoxOs are critical mediators of hematopoietic stem cell resistance to physiologic oxidative stress. Cell. 128 (2), 325-339 (2007).
  9. Vannini, N., et al. Specification of haematopoietic stem cell fate via modulation of mitochondrial activity. Nature Communications. 7, (2016).
  10. Vannini, N., et al. The NAD-Booster Nicotinamide Riboside Potently Stimulates Hematopoiesis through Increased Mitochondrial Clearance. Cell Stem Cell. 24 (3), 405(2019).
  11. Gratwohl, A., et al. Risk score for outcome after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a retrospective analysis. Cancer. 115 (20), 4715-4726 (2009).
  12. Gooley, T. A., et al. Reduced Mortality after Allogeneic Hematopoietic-Cell Transplantation. New England Journal of Medicine. 363 (22), 2091-2101 (2010).
  13. Rosenberg, S. A., et al. Durable complete responses in heavily pretreated patients with metastatic melanoma using T cell transfer immunotherapy. Clinical Cancer Research. 17 (13), 4550-4557 (2011).
  14. Aranda, F., et al. Trial Watch: Adoptive cell transfer for anticancer immunotherapy. Oncoimmunology. 3, 28344(2014).
  15. Wherry, E. J. T cell exhaustion. Nature Immunology. 12 (6), 492-499 (2011).
  16. Ho, P. C., et al. Phosphoenolpyruvate Is a Metabolic Checkpoint of Anti-tumor T Cell Responses. Cell. 162 (6), 1217-1228 (2015).
  17. Chang, C. H., et al. Metabolic Competition in the Tumor Microenvironment Is a Driver of Cancer Progression. Cell. 162 (6), 1229-1241 (2015).
  18. van der Waart, A. B., et al. Inhibition of Akt signaling promotes the generation of superior tumor-reactive T cells for adoptive immunotherapy. Blood. 124 (23), 3490-3500 (2014).
  19. Crompton, J. G., et al. Akt inhibition enhances expansion of potent tumor-specific lymphocytes with memory cell characteristics. Cancer Research. 75 (2), 296-305 (2015).
  20. de Almeida, M. J., Luchsinger, L. L., Corrigan, D. J., Williams, L. J., Snoeck, H. W. Dye-Independent Methods Reveal Elevated Mitochondrial Mass in Hematopoietic Stem Cells. Cell Stem Cell. 21 (6), 725-729 (2017).
  21. Abe, T., et al. Establishment of Conditional Reporter Mouse Lines at ROSA26 Locus For Live Cell Imaging. Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).
  22. Sukumar, M., et al. Mitochondrial Membrane Potential Identifies Cells with Enhanced Stemness for Cellular Therapy. Cell Metabolism. 23 (1), 63-76 (2016).
  23. Sukumar, M., et al. Inhibiting glycolytic metabolism enhances CD8+ T cell memory and antitumor function. Journal of Clinical Investigation. 123 (10), 4479-4488 (2013).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Potencja b ony mitochondrialnejizolacja szpiku kostnegonikotynamid rybosydbarwienie TMRMbarwienie MitoTrackeranaliza FACS

Powiązane artykuły