Artykuł metodologiczny

Przestrzenna analiza czasowa przepływu w terenie w mikrokrążeniu

5.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60493

⸱

18 listopada 2019

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biocomplexity Institute, Indiana University, 2Department of Intelligent Systems Engineering, Indiana University, 3Department of Physics, Indiana University, 4Scientific Designs, 5Department of Medicine, Indiana University, 6School of Public Health, Indiana University

W tym artykule

Podsumowanie

Aby określić ilościowo przepływ mikronaczyniowy na podstawie sekwencji obrazów przepływu kapilarnego o dużej prędkości, opracowaliśmy oprogramowanie STAFF (Spatial Temporal Analysis of Fieldwise Flow). Na całym polu obrazu i w czasie STAFF ocenia prędkości przepływu i generuje sekwencję oznaczonych kolorami map przestrzennych do wizualizacji i tabelarycznych danych wyjściowych do analiz ilościowych.

Streszczenie

Zmiany w prędkości i dystrybucji przepływu krwi są niezbędne do utrzymania perfuzji tkanek i narządów w odpowiedzi na różne potrzeby komórkowe. Ponadto pojawienie się wad mikrokrążenia może być głównym wskaźnikiem rozwoju wielu patologii. Postępy w obrazowaniu optycznym sprawiły, że mikroskopia przyżyciowa (IVM) stała się praktycznym podejściem, umożliwiającym obrazowanie na poziomie komórkowym i subkomórkowym u żywych zwierząt z dużą prędkością w miarę upływu czasu. Jednak pomimo znaczenia utrzymania odpowiedniej perfuzji tkanek, przestrzenna i czasowa zmienność przepływu kapilarnego jest rzadko udokumentowana. W podejściu standardowym do obrazowania w ograniczonym czasie wybiera się niewielką liczbę segmentów naczyń włosowatych. Aby kompleksowo określić ilościowo przepływ kapilarny w bezstronny sposób, opracowaliśmy Przestrzenną Analizę Czasową Przepływu Terenowego (STAFF), makro dla oprogramowania do analizy obrazów FIJI o otwartym kodzie źródłowym. Korzystając z szybkich sekwencji obrazów pełnych pól przepływu krwi w naczyniach włosowatych, STAFF tworzy obrazy przedstawiające ruch w czasie, zwane kymografami dla każdego przedziału czasu dla każdego segmentu naczyń krwionośnych. Na podstawie kymogramów STAFF oblicza prędkości na podstawie odległości, na jaką czerwone krwinki przemieszczają się w czasie, i wyprowadza dane dotyczące prędkości w postaci sekwencji kolorowych map przestrzennych do wizualizacji i tabelarycznych danych wyjściowych do analiz ilościowych. W przypadku zdrowych wątrob myszy analizy STAFF pozwoliły określić ilościowo głębokie różnice w prędkości przepływu między regionami okołocentralnymi i okołoportalnymi w obrębie zrazików. Jeszcze bardziej nieoczekiwane są różnice w prędkości przepływu obserwowane między sinusoidami, które znajdują się obok siebie, a fluktuacje obserwowane w poszczególnych segmentach naczyń w ciągu kilku sekund. STAFF to nowe, potężne narzędzie, które może dostarczyć nowych informacji, umożliwiając pomiar złożonej czasoprzestrzennej dynamiki przepływu kapilarnego.

Wprowadzenie

Mikrokrążenie odgrywa kluczową rolę w fizjologii, zapewniając skuteczną perfuzję tkanek w zmieniających się warunkach. Dysfunkcja mikrokrążenia jest związana z niezliczonymi schorzeniami, w tym długotrwałą chorobowością i śmiertelnością z przyczyn sercowo-naczyniowych, rozwojem demencji oraz chorobami zarówno wątroby, jak i nerek, a zatem jest kluczowym czynnikiem zainteresowania w szerokim zakresie badań biomedycznych1,2,3,4,5. Chociaż do oceny perfuzji tkanek zastosowano wiele technik, tylko mikroskopia przyżyteczna umożliwia zbieranie danych w rozdzielczości czasowej i przestrzennej niezbędnej do scharakteryzowania przepływu krwi na poziomie poszczególnych naczyń włosowatych.

Przepływ mikronaczyniowy może być wizualizowany w mikroskopii fluorescencyjnej albo przez ruch fluorescencyjnych mikrosfer, albo przez ruch czerwonych krwinek na tle nieprzepuszczalnych dla błony markerów fluorescencyjnych (np. znakowanego fluorescencyjnie dekstranu lub albuminy)6,7. Przepływ mikronaczyniowy można obrazować w powierzchownych warstwach komórek za pomocą mikroskopii szerokokątnej lub na głębokości za pomocą mikroskopii konfokalnej lub wielofotonowej. Jednak natężenie przepływu kapilarnego jest takie, że przejście czerwonych krwinek nie może być na ogół uchwycone z prędkością mniejszą niż 60 klatek/s. Ponieważ większość laserowych mikroskopów konfokalnych i wielofotonowych wymaga od 1 do 5 s na zeskanowanie pełnego pola obrazu, prędkość tę można osiągnąć tylko poprzez ograniczenie pola widzenia, czasami do pojedynczej linii skanowania8. Proces ograniczania pomiarów do wybranych segmentów naczyń włosowatych (1) może wprowadzić błąd selekcji oraz (2) uniemożliwia uchwycenie przestrzennej i czasowej niejednorodności w szybkości przepływu krwi w naczyniach włosowatych. Natomiast obrazy sieci kapilarnych mogą być zbierane z prędkościami przekraczającymi 100 kl./s za pomocą szerokokątnych mikroskopów cyfrowych wyposażonych w naukowe kamery z komplementarnym półprzewodnikiem tlenku metalu (sCMOS)9,10. Te niedrogie systemy, powszechne w typowych laboratoriach biomedycznych, umożliwiają obrazowanie przepływu mikronaczyniowego w całych sieciach dwuwymiarowych, w zasadzie w sposób ciągły. Problemem staje się zatem znalezienie podejścia analitycznego, które jest w stanie wyodrębnić znaczące dane ilościowe z ogromnych i złożonych zestawów danych obrazowych generowanych przez szybką mikroskopię wideo.

Aby umożliwić analizę danych o przepływie w pełnym polu, opracowaliśmy STAFF, nowatorskie oprogramowanie do analizy obrazów, które może w sposób ciągły mierzyć przepływ mikronaczyniowy w całych polach mikroskopowych serii obrazów zbieranych z dużą prędkością11. Podejście to jest kompatybilne z wieloma różnymi systemami eksperymentalnymi i modalnościami obrazowania, a oprogramowanie do analizy obrazów STAFF jest zaimplementowane jako zestaw narzędzi makr do implementacji ImageJ12 na FIDŻI. Podstawową zasadą zastosowaną tutaj do wizualizacji przepływu mikronaczyniowego jest to, że najpierw należy zapewnić pewien kontrast, aby móc zobrazować czerwone krwinki w naczyniach włosowatych. W naszych badaniach kontrast jest zapewniany przez dużą sondę fluorescencyjną, która jest wykluczana przez czerwone krwinki. Prędkość przepływu można następnie określić ilościowo na podstawie przemieszczenia czerwonych krwinek, które pojawiają się jako ujemne zabarwienie w fluorescencyjnie znakowanym osoczu na obrazach zebranych z dużą prędkością od żywego zwierzęcia8. Następnie używamy STAFF do tworzenia wykresów odległości wzdłuż każdego segmentu kapilary w wielu odstępach czasu zwanych kymografami, a następnie wykrywamy nachylenia obecne w kymografach13 i na podstawie tych nachyleń obliczamy natężenie przepływu mikronaczyniowego. Podejście to można zastosować do obrazów pobranych z dowolnego złoża kapilarnego, do którego można uzyskać dostęp w celu obrazowania. W tym miejscu opisujemy zastosowanie IVM i STAFF do badań przepływu krwi w wątrobie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone i przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu Indiana, a także przestrzegały wytycznych NRC dotyczących opieki i użytkowania zwierząt.

1. Przygotowanie chirurgiczne do mikroskopii przyżyciowej

UWAGA: To nie jest operacja przetrwania. Po rozpoczęciu sekcji 1 "Przygotowanie chirurgiczne do mikroskopii przyżyciowej" nie można wstrzymać pracy do czasu zakończenia sekcji 2 "Mikroskopia przyżyciowa".

  1. Aklimatyzuj 9-10 tygodniowe samce myszy C57BL/6 przez co najmniej 4 dni i pościć przez 16 godzin przed badaniami.
  2. Zważ zwierzę, uspokój 5% izofluranem i umieść na poduszce grzewczej, aby utrzymać temperaturę ciała. Stosować natężenie przepływu tlenu 1–2 l/min i utrzymywać sedację za pomocą 1-2% izofluranu. Sprawdź odruchy przez uszczypnięcie palca u nogi. Monitoruj temperaturę za pomocą termometru doodbytniczego. Monitoruj wizualnie tętno i oddech.
  3. Gdy znieczulenie jest stabilne, ogol obszar do umieszczenia kaniulacji szyjnej i obszar poniżej klatki piersiowej w celu odsłonięcia wątroby.
  4. W przypadku kaniulacji szyjnej wykonaj 1 cm lewe nacięcie brzuszne 1–2 cm poniżej szczęki myszy. Usuń cały tłuszcz i powięź otaczającą żyłę szyjną. Zwiąż przedni koniec szyi za pomocą sznurka do szwów 06, aby zapobiec krwawieniu.
    1. Zrób małe nacięcie w żyle szyjnej i wsuń kaniulę (30 G x 1/2 cala, igła), uchwyt igły i rurkę polietylenową (0,011 x 0,024 cala2 przymocowane do adaptera Luer i wypełnione 0,9% soli fizjologicznej) na około 1 cm i zabezpiecz na tylnym końcu szyi za pomocą sznurka do szwów 0-6.
  5. Za pomocą kaniuli szyjnej dostarczyć 70 kDa dekstranu fluoresceinowego (do dawki 30 mg/kg przez wstrzyknięcie 0,1 ml roztworu o stężeniu 9 mg/ml w soli fizjologicznej).
  6. Wystaw wątrobę do obrazowania, wykonując 4–6 cm nacięcie w poprzek tułowia, 1–2 cm poniżej środka klatki piersiowej.
  7. Umieść mokrą (nasączoną 0,9% solą fizjologiczną) gąbkę z gazy o wymiarach 2 x2 cale poniżej lewego bocznego płata wątroby. Umieść taśmę na obrzeżach szklanej szyby naczynia z dnem nakrywkowym o średnicy 40 mm i nałóż klej cyjanoakrylowy na taśmę. Przyciśnij szklaną płytkę do wątroby i za pomocą aplikatorów z bawełnianą końcówką wciśnij gazę w klej na taśmie, aby zminimalizować ruchy tkanek do mikroskopii.
  8. Przenieś zwierzę do etapu mikroskopu. Dodaj sterylną sól fizjologiczną o stężeniu 0,9% do naczynia z dnem nakrywkowym, aby wątroba była wilgotna przez cały czas sesji obrazowania. Utrzymuj temperaturę na poziomie 36–37 °C za pomocą poduszek grzewczych zamontowanych na stoliku, poduszki grzewczej umieszczonej nad zwierzęciem i grzejnika obiektywowego.

2. Mikroskopia przyżyciowa

  1. Wykonaj mikroskopię przyżyciową na odwróconym mikroskopie epifluorescencyjnym wyposażonym w kamerę wideo zdolną do szybkiego przechwytywania obrazu.
    nuta: Zastosowano tu ksenonową lampę łukową, filtry wzbudzenia specyficznego dla fluoresceiny (480–500 nm) i emisyjne (507–543 nm), obiektyw Plan Fluor 20x, obiektyw zanurzeniowy N.A. 0,75 oraz szybką kamerę sCMOS.
  2. Wybierz obszar zainteresowania do analizy kapilarnego przepływu krwi przy minimalnym oświetleniu.
  3. Ustaw czas naświetlania na tyle krótki, aby aparat był w stanie uzyskać 100 kl./s. Ustaw poziom oświetlenia, aby wyraźnie uwidocznić cienie czerwonych krwinek i topologię układu krwionośnego, jednocześnie unikając fototoksyczności i fotowybielania sondy fluorescencyjnej.
  4. Zbieraj obrazy z szybkością 100 kl./s. Ustaw rozdzielczość pikseli kamery w zakresie od ~0.65 do ~1.3 μm/piksel. Ustaw rozmiar klatki z zakresu od 512 x 512 do 1024 x 1024 pikseli. Ustawia głębię bitową w zakresie od 8 do 16 bitów. Korzystaj z najwyższej rozdzielczości, rozmiaru klatki i głębi bitowej, które nadal pozwalają na zbieranie obrazów z prędkością 100 kl./s w systemie.
  5. Zapisz plik(i) szeregów czasowych jako sekwencję plików TIF lub jako natywny format kamery/mikroskopu, jeśli Bio-Formats14 w FIJI może otworzyć pliki w formacie natywnym.
  6. Obrazowanie wielu obszarów w czasie. Utrzymuj mysz na stoliku mikroskopu do 2 godzin. Poddaj mysz eutanazji pod koniec obrazowania.
    nuta: Czas trwania szeregów czasowych będzie oparty na zrównoważeniu potrzeby obrazowania dla przedziału czasu, który obejmuje zmienność, nie wpływając jednocześnie na żywotność tkanki. Czas trwania szeregów czasowych może być również podyktowany względami dotyczącymi rozmiaru pliku; 1-minutowy szereg czasowy 16-bitowych obrazów o wymiarach 1024 x 1024 pikseli zebranych z szybkością 100 kl./s wygeneruje plik o rozmiarze 12 GB. Względy dotyczące rozmiaru pliku mogą również decydować o używanym rozmiarze klatki i głębi bitowej. W STAFF nie ma wyraźnych limitów rozmiaru.

3. Zdefiniuj sieć naczyniową za pomocą TrakEM2 na FIDŻI

UWAGA: Protokół może zostać wstrzymany po zapisaniu pracy w dowolnym momencie sekcji 3.

  1. Pobierz i zainstaluj FIJI z https://imagej.net/Fiji/Downloads.
    nuta: Wersja 1.51n Fidżi została użyta w tym projekcie i można ją pobrać z https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip. Należy pamiętać, że w systemie Windows FIJI powinien być zainstalowany w przestrzeni użytkownika, a nie w Program Files.
  2. Otwórz plik filmowy na FIDŻI za pomocą polecenia File > Open lub File > Import > Image sequence. Wybierz pojedynczy obraz ze stabilnych obrazów między oddechami, gdzie topologia sieci naczyniowej jest łatwa do zobaczenia. Wybierz Obraz > Duplikuj i zduplikuj wybrany pojedynczy obraz (nie stos) i zapisz obraz w nowym folderze. Nie dołączaj spacji w nazwach plików lub folderów.
  3. Skonfiguruj nowy pusty projekt TrakEM2, wybierając pozycję Plik > Nowy > TrakEM2 (pusty). Wybierz nowy folder zawierający pojedynczy obraz z filmu jako folder projektu. Otworzą się okna TrakEM2.
  4. Kliknij prawym przyciskiem myszy w głównym obszarze roboczym i wybierz Importuj > Importuj obraz. Przejdź do pojedynczego obrazu zapisanego w kroku 3.3 i wybierz go.
  5. Ponownie kliknij prawym przyciskiem myszy w głównym obszarze roboczym i wybierz opcję Wyświetl > Automatycznie zmień rozmiar płótna/zestawu warstw. Kliknij lewym przyciskiem myszy w głównym oknie roboczym. Obraz wypełni obszar roboczy.
  6. Aby wybrać obszary na obrazie, które zawierają sieć naczyniową, ustaw wybór listy obszarów w TrakEM2. W mniejszym oknie TrakEM2 (Szablon, Obiekty projektu, Warstwy) kliknij prawym przyciskiem myszy na "• cokolwiek". Wybierz pozycję Dodaj nową listę obszarów podrzędnych >
    7. .
  7. W mniejszym oknie TrakEM2 przeciągnij "Szablon > cokolwiek" do "Obiekty projektu > projekt". Następnie przeciągnij "Szablon > wszystko > • lista obszarów" do "Obiekty projektu > projekt > cokolwiek". W sekcji "Obiekty projektu > projekt > cokolwiek" pojawi się teraz • lista obszarów.
  8. W głównym oknie TrakEM2 w zakładce Przestrzeń Z został utworzony pasek oznaczony listą obszarów. Kliknij, aby go wybrać. W oknie głównym TrakEM2 wybierz również narzędzie Pędzel. Naciśnij Shift i obróć kółko myszy, aby wybrać odpowiedni rozmiar pędzla, np. mniejszy niż średnica naczynia krwionośnego. Aby zapisać konfigurację TrakEM2, naciśnij Control + S.
  9. Pomaluj sieć naczyniową za pomocą pędzla. Aby wymazać, przytrzymaj Alt podczas korzystania z narzędzia Pędzel. Nie uwzględniaj regionów, które nie są ostre. Oszczędzaj często, korzystając z Control + S.
  10. Po zakończeniu etykietowania sieci naczyniowej kliknij prawym przyciskiem myszy w głównym oknie TrakEM2 i wybierz Eksportuj > AreaLists jako etykiety (tif). W wyskakującym okienku wybierz Skaluj 100% i Eksportuj całą listę obszarów. Zamknij okna TrakEM2 i wybierz tak dla opcji Zapisz projekt.
  11. Zostanie otwarty obraz AreaLists, który może być wyświetlany jako pusty obraz. W głównym menu FIJI wybierz Obraz > Dostosuj > Jasność/Kontrast. W oknie B&C naciśnij przycisk auto, a AreaList stanie się widoczny. W menu głównym FIJI wybierz Image > Lookup Tables > Invert LUT. Zapisz ten obraz czarnych etykiet na białym tle i zamknij obraz.
  12. Otwórz plik etykiet na FIDŻI. Wybierz Wtyczki > Szkielet > Skeletonize. Zapisz szkieletowany obraz jako tif. Użyj pliku skeleton.tif jako jednego z plików wejściowych potrzebnych do uruchomienia analizy przepływu STAFF. Podczas zapisywania pliku nie należy używać spacji w nazwie pliku.
  13. W razie potrzeby ręcznie edytuj plik szkieletu, umieszczając odstęp (za pomocą narzędzia do malowania) w rysunku liniowym, na przykład w miejscach, w których gałęzie w układzie naczyniowym nie zostały uchwycone, ponieważ wychodzą poza płaszczyznę obrazu.

4. Przygotuj sekwencję filmu do analizy STAFF

  1. Otwórz plik filmowy w FIDŻI za pomocą opcji File > Open lub File > Import > Image sequence. Wybierz przedział czasu sekwencji obrazu do analizy przepływu (może to być od sekund do minut, od setek do dziesiątek tysięcy klatek), w którym pozycja tkanki pozostała stabilna w czasie, z wyjątkiem czasu oddychania.
  2. Wybierz opcję Obraz > Duplikuj i zduplikuj zaznaczoną część sekwencji, wpisując numery klatki początkowej i końcowej. Sprawdź kalibrację przestrzenną i czasową obrazu w obszarze Właściwości > obrazu i popraw w razie potrzeby. Zapisz plik obrazu jako TIF (lub jako nieskompresowany plik AVI). Ten movie.tif jest potrzebny jako plik wejściowy do uruchomienia analizy STAFF. Nie dodawaj spacji w nazwie pliku.

5. Zainstaluj makra STAFF na FIDŻI

UWAGA: (Ważne) Wiele folderów w podkatalogach folderów FIJI ma podobne nazwy plików, niektóre pisane wielkimi literami, inne nie. Upewnij się, że podczas instalacji STAFF wybrano właściwe foldery.

  1. Pobierz makra STAFF z https://github.com/icbm-iupui/STAFF.
  2. Aby zainstalować, najpierw otwórz folder FIJI.
    1. W systemie Windows znajdź folder, w którym jest zainstalowany FIJI w przestrzeni użytkownika, najczęściej na pulpicie. W systemie MacOS znajdź ikonę FIJI w folderze Aplikacje, kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz Otwórz.
  3. W folderze FIJI otwórz folder wtyczek. W folderze wtyczek otwórz folder Makra. Skopiuj plik STAFF.ijm do tego folderu Makra: Fiji\plugins\Macros\STAFF.ijm.
  4. W folderze FIJI otwórz folder wtyczek. Skopiuj STAFF_Dir.jar do tego folderu wtyczek: Fiji\plugins\STAFF_Dir.jar.
  5. W folderze FIJI otwórz folder makr. W tym folderze makr otwórz folder AutoRun. Skopiuj plik STAFF_Loader.ijm do tego folderu AutoRun: Fiji\macros\AutoRun\STAFF_Loader.ijm.
  6. Uruchom FIJI i sprawdź instalację makra. Aby zweryfikować instalację, wybierz opcję Wtyczki > Makra. Po prawidłowym zainstalowaniu menu rozwijane będzie zawierać: Open-Create Project, Analyze Skeleton, Edit Time Intervals, Analyze Flow i Create Spatial Map.
  7. Jeśli tych poleceń nie ma w menu Makra, wybierz Wtyczki > Makra > Zainstaluj, otwórz folder Fiji\plugins\Macros, wybierz plik STAFF.ijm, a następnie kliknij przycisk OK. Polecenia powinny teraz pojawić się w menu Wtyczki > Makra.

6. Kwantyfikacja przepływu naczyniowego za pomocą STAFF

  1. Utwórz nowy projekt.
    1. Wybierz pozycję Wtyczki > makra > Open-Create Project i postępuj zgodnie z instrukcjami, aby utworzyć lub zaktualizować plik konfiguracyjny.
    2. Z menu Otwórz tworzenie projektu przejdź do katalogu projektu, folderu plików wejściowych oraz plików wejściowych Movie.tif i Skeleton.tif i wybierz je. W razie potrzeby edytuj automatycznie wypełnione nazwy plików wyjściowych.
    3. Wartości wejściowe dla najkrótszej długości segmentu (20 μm), maksymalnej zmierzonej prędkości (2 000 μm/s) i odwzorowanej maksymalnej prędkości (1 000 μm/s).
      nuta: Iloczyn najkrótszej długości segmentu i klatek na sekundę daje maksymalną prędkość przepływu, którą teoretycznie można zmierzyć. Najwyższe prędkości przepływu kapilarnego podawane w literaturze wynoszą około 2 000 μm/s15. W wątrobie zaobserwowaliśmy, że prędkości przepływu kapilarnego na ogół wynosiły średnio około 300 μm/s i rzadko przekraczały 1000 μm/s.
    4. Wpisz wartości rozmiaru w pikselach i liczby klatek na sekundę dla sekwencji obrazów (z metadanych obrazu lub notatek eksperymentalnych). Te wartości wymagają wprowadzenia danych przez użytkownika. Zaznacz pole Korekcja migotania, jeśli obrazy mają okresowe migotanie tła.
    5. Wybierz parametry, aby uzyskać najlepszą wizualizację danych. Wybierz opcję maksymalna szybkość mapowania, aby uwzględnić około 95% danych, tak aby dane były mapowane w pełnym zakresie skali kolorów. STAFF odwzorowuje wartości odstające o dużej szybkości na szybki koniec skali kolorów.
  2. Przeanalizuj szkielet.
    1. Wybierz Wtyczki > Makra > Analizuj szkielet. Otworzy się plik skeleton.tif, a Menedżer obszaru zainteresowania (ROI) zostanie otwarty i uruchomiony.
      nuta: Narzędzie Analizuj szkielet klasyfikuje każdy piksel według liczby sąsiadów jako w punkcie końcowym, na skrzyżowaniu lub w segmencie. Dla każdego segmentu rejestrowany jest numer identyfikacyjny (numer identyfikacyjny), skalibrowana długość odgałęzienia oraz współrzędne przestrzenne końców odgałęzienia.
    2. Poczekaj, aż identyfikatory segmentów pojawią się w szkielecie, lista segmentów pojawi się w menedżerze ROI i pojawi się wyskakujące okienko wskazujące, że plik menedżera ROI dla szkieletu został zapisany. Kliknij przycisk OK.
    3. Sprawdź, czy między ruchami oddechowymi szkielet pozostaje nad miejscem, w którym czerwone krwinki przechodzą przez naczynia włosowate (np. nie krawędź i nie na zewnątrz naczynia włosowatego). Wyświetl segmenty oznaczone etykietami jako nakładkę na film, otwierając plik filmowy, a następnie przeciągając plik zip ROI na otwarty film. Odtwórz film z nałożonymi segmentami.
  3. Wybierz przedziały czasowe.
    1. Wybierz Wtyczki > Makra > wybierz Interwały czasowe. Poczekaj, aż makro wygeneruje kimograf z pojedynczego segmentu w całym czasie trwania filmu. Z tego kimografu użytkownik wybiera przedziały czasowe do analizy. W razie potrzeby użyj Control + +, aby zwiększyć rozmiar kimografu.
    2. Narzędzie do zaznaczania prostokątów jest aktywowane automatycznie. Narysuj prostokąt wokół każdego interwału czasu. Dobrym punktem wyjścia dla długości odstępu czasowego jest 1-2 sekundowy odstęp między oddechami, który jest widoczny jako poziome rozmyte obszary na kimografie.
    3. Kliknij T lub przycisk Dodaj w menedżerze ROI, aby zarejestrować wybrane przedziały czasu. Powtarzaj tę czynność w tylu odstępach czasu, ile chcesz. Dokonuj selekcji sekwencyjnie od góry (lub po lewej) do dołu (lub prawej) krawędzi kimografu.
    4. Oceń wybrane parametry (z projektu Open-Create), wybierając niewielką liczbę interwałów czasu (od 3 do 4) i kończąc analizę tylko dla tych interwałów, ponieważ analiza przepływu (następny krok) może zająć godziny w przypadku dużych zestawów danych.
    5. Po zakończeniu kliknij przycisk OK w oknie Utwórz zwrot z inwestycji dla każdego przedziału czasu. Wyskakujące okienko pojawia się, gdy wybrane interwały zostały zapisane w folderze projektu. Kliknij przycisk OK.
  4. Analizuj przepływ.
    1. Wybierz opcję Wtyczki > Makra > Analizuj przepływ, a otworzy się okno dialogowe Analizuj parametry przepływu, w którym zostaną wyświetlone wartości wprowadzone w kroku Otwórz projekt. W razie potrzeby edytuj, a następnie kliknij przycisk OK.
    2. Zostanie otwarte okno dialogowe Nazwy plików wyjściowych, w którym zostaną wyświetlone nazwy wprowadzone w kroku Otwórz projekt. W razie potrzeby edytuj, a następnie kliknij przycisk OK.
    3. Zostanie otwarte okno dialogowe z pytaniem, czy użytkownik jest gotowy do rozpoczęcia analizy. Kliknij OK, a rozpocznie się analiza. Poczekaj na otwarcie okna dialogowego z informacją o zakończeniu analizy przepływu.
      nuta: Wymagany czas zależy od szybkości procesora i rozmiaru zestawu danych.
    4. Upewnij się, że pliki wyników zostały zapisane jako pliki arkuszy kalkulacyjnych w formacie .csv w folderze projektu.
      nuta: Pliki wyjściowe obejmują: segment_velocities.csv zawiera wartości prędkości, które mają wartości dodatnie i ujemne wskazujące kierunek przepływu. Komórki reprezentujące segmenty o długości mniejszej niż minimalna zawiera tekst SHORT. Komórki z wartościami prędkości większymi niż maksymalna zmierzona prędkość zawierają tekst OUT (dla wartości odstających). kym_ang.csv zawiera kąty kimografu zmierzone przez wtyczkę Directionality w FIDŻI. good_fit.csv zawiera dobroczynne dopasowanie krzywej do rozkładu kątów mierzonych z każdego kimografu. Słaba jakość dopasowania (< 0,8) może wskazywać na ukryte punkty rozgałęzień w segmencie, zmianę prędkości w przedziale czasowym, migotanie lampy lub światła w pomieszczeniu.
    5. Sprawdź, czy segment_velocities.csv zawiera niewiele wartości OUT. Jeśli istnieje duża liczba wartości OUT, sprawdź, czy minimalna długość segmentu do analizy jest nie mniejsza niż 15–20 μm, a następnie ponownie uruchom polecenie Analizuj przepływ. Jeśli nowy segment_velocities.csv nadal zawiera dużą część wartości OUT, zaznacz pole korekcji migotania, a następnie uruchom ponownie Analizuj przepływ.
  5. Tworzenie map przestrzennych.
    1. Wybierz Wtyczki > Makra > Utwórz mapę przestrzenną, a otworzy się okno Parametry mapy przestrzennej, wyświetlające wartości wprowadzone w kroku Otwórz projekt . Edytuj w razie potrzeby lub, aby kontynuować, wybierz przycisk OK.
    2. Obserwuj, jak generowana jest sekwencja czasowa map przestrzennych prędkości przepływu z kolorem wskazującym prędkość przepływu. Dane wyjściowe mają postać stosu obrazów .tif z jednym obrazem dla każdego interwału czasu. Przewiń stos .tif, aby wyświetlić przestrzenną i czasową zmienność przepływu. Zapisz stos jako plik AVI (nieskompresowany dla maksymalnej przenośności) i udostępnij go jako film.

7. Analiza ilościowa z wykorzystaniem danych wyjściowych STAFF

  1. Otwórz plik segment_velocities.csv w arkuszu kalkulacyjnym lub programie do analizy statystycznej. Wartości te mają znak dodatni lub ujemny, który wskazuje kierunek przepływu względem punktów początkowych/końcowych tego segmentu (zapisany w pliku ROI segmentu).
  2. Utwórz nową stronę arkusza kalkulacyjnego zawierającą wartości bezwzględne wszystkich wartości prędkości. Wartości te służą do obliczania ogólnej średniej prędkości przepływu, średniej prędkości przepływu dla wszystkich segmentów naczyniowych w czasie, prędkości przepływu dla każdego segmentu naczyniowego w czasie oraz tworzenia histogramów rozkładów prędkości.
  3. Oblicz wartości wokół określonych regionów morfologicznych lub innych obszarów zainteresowania, najpierw znajdując określone odpowiednie segmenty w oznaczonym szkielecie, a następnie wykonując analizy na tych wybranych segmentach.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Analiza STAFF generuje kompletny spis prędkości mikronaczyniowych w całych polach widzenia mikroskopu w okresach czasu trwających od sekund do minut. Reprezentatywne wyniki przedstawiono na Rysunku 1, Rysunku 2, Rysunku 3 oraz Rysunku 4. Rysunek 1 pokazuje przykład serii czasowej sieci mikronaczyniowej w wątrobie myszy, generowanie obrazu szkieletowego służącego do zdefinio...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

W tym protokole składa się wiele krytycznych kroków. Po pierwsze, minimalizacja ruchu podczas obrazowania przyżyciowego wątroby jest niezbędna do generowania filmów, które można wykorzystać do analizy przepływu kapilarnego za pomocą STAFF. Ze względu na bliskość przepony występują krótkie okresy ruchu wywołanego oddychaniem, a zabezpieczona wątroba wraca do swojej początkowej pozycji po każdym oddechu. Zabezpieczenie chirurgicznie odsłoniętej wątroby o naczynie z dnem nakrywkowym za pomocą gazy, a następnie obrazowanie o...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy nie deklarują braku sprzecznych interesów.

Podziękowania

Badania przedstawione tutaj były finansowane przez National Institutes of Health (NIH U01 GM111243 i NIH NIDDK P30 DK079312). Badania mikroskopowe przyżyciowe przeprowadzono w Indiana Center for Biological Microscopy. Dziękujemy dr Małgorzacie Kamockiej za pomoc techniczną przy mikroskopii.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
#5 kleszczyFine Science Tools11251-20Dumont #5 Kleszcze Inox
C57BL/6 myszyJackson Labsmężczyzna 9-12 tygodni
KaniulaInstechBTPE-10Rurka polietylenowa 0,011 x 0,024 cala
Kamera CMOSHamamatsuC11440-42U304.0LT Scientific CMOS
Naczynie z dnem nakrywkowymMikroskopia elektronowa SciencesWillCo Szklane dno naczynia GWST5040
Nożyczki preparacyjneNarzędzia
Fidżi ImageJ Oprogramowaniehttps://fiji.sc/ ; https://downloads.imagej.net/fiji/Life-Line/fiji-win64-20170530.zip
Dekstran fluoresceinowyThermo Fisher, DvitrogenD1822Dekstran, Fluoresceina, 70 000 MW, Anionowy, Lizyna Fixable
Gąbka z gazyFisher22-415-5042x2 cale Dukal sterylne gąbki z gazy
Poduszka grzewczaReptithermRH-4między myszą a sceną
Poduszka grzewczaSunbeam000732-500-000Unad myszą
Odwrócony mikroskop epifluorescencyjnyNikonNikon TiE
Golarka elektryczna Isis GradentBraun AesculapGT420
IsofluoraneAbbott GmbHPZN4831850
Adapter króćca LuerFisher14-826-19EAdapter cewnika
MikronożyczkiCastro Viejo
Obiektyw mikroskopowyNikonPlan Fluor 20x, NA 0,75 zanurzenie w wodzie
IgłaFisher30 G x1/2"
Igła uchwytOlsen-Hegar
Grzejnik obiektywuBioScience ToolsMTC-HLS-025Regulator temperatury z podgrzewaczem
obiektywu Termometr doodbytniczyBraintree Scientific, INCTH-5AMonitorowanie temperatury ciała myszy
Makra personeluhttps://github.com/icbm-iupui/STAFF
Harvard Bioscience723288jedwabny szew, 6-0, szpula
do nauki do analizy obrazu Sznurek do szwów

Bibliografia

  1. Shen, J., et al. Subclinical Vascular Dysfunction Associated with Metabolic Syndrome in African Americans and Whites. The Journal of clinical Endocrinology and Metabolism. 100 (11), 4231-4239 (2015).
  2. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  3. Zafrani, L., Ince, C. Microcirculation in Acute and Chronic Kidney Diseases. American Journal of Kidney Diseases. 66 (6), 1083-1094 (2015).
  4. Nielsen, R. B., et al. Capillary dysfunction is associated with symptom severity and neurodegeneration in Alzheimer's disease. Alzheimer's & Dementia. 13 (10), 1143-1153 (2017).
  5. Houben, A. J. H. M., Martens, R. J. H., Stehouwer, C. D. A. Assessing Microvascular Function in Humans from a Chronic Disease Perspective. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (12), 3461-3472 (2017).
  6. Clemens, M., Zhang, J. Regulation of Sinusoidal Perfusion: In Vivo Methodology and Control by Endothelins. Seminars in Liver Disease. 19 (04), 383-396 (1999).
  7. Uhlmann, S., Uhlmann, D., Spiegel, H. U. Evaluation of hepatic microcirculation by in vivo microscopy. Journal of investigative surgery : the official journal of the Academy of Surgical Research. 12 (4), 179-193 (1999).
  8. Dunn, K. W., Sutton, T. A., Sandoval, R. M. Live-animal imaging of renal function by multiphoton microscopy. Current protocols in cytometry. , Chapter 12, Unit12.9 (2012).
  9. von Diezmann, A., Shechtman, Y., Moerner, W. E. Three-Dimensional Localization of Single Molecules for Super-Resolution Imaging and Single-Particle Tracking. Chemical Reviews. 117 (11), 7244-7275 (2017).
  10. Huang, Z. -L., et al. Localization-based super-resolution microscopy with an sCMOS camera. Optics Express. 19 (20), 19156(2011).
  11. Clendenon, S. G., et al. A simple automated method for continuous fieldwise measurement of microvascular hemodynamics. Microvascular Research. 123, 7-13 (2019).
  12. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  13. Liu, Z. -Q. Scale space approach to directional analysis of images. Applied Optics. 30 (11), 1369(1991).
  14. Linkert, M., et al. Metadata matters: access to image data in the real world. The Journal of cell biology. 189 (5), 777-782 (2010).
  15. Sherman, I. A., Pappas, S. C., Fisher, M. M. Hepatic microvascular changes associated with development of liver fibrosis and cirrhosis. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 258 (2), 460-465 (1990).
  16. Babbey, C. M., et al. Quantitative intravital microscopy of hepatic transport. IntraVital. 1 (1), 44-53 (2012).
  17. Dunn, K. W., Ryan, J. C. Using quantitative intravital multiphoton microscopy to dissect hepatic transport in rats. Methods. 128, 40-51 (2017).
  18. Ryan, J., et al. Intravital Multiphoton Microscopy with Fluorescent Bile Salts in Rats as an In Vivo Biomarker for Hepatobiliary Transport Inhibition. Drug metabolism and disposition: the biological fate of chemicals. 46 (5), 704-718 (2018).
  19. Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats. Journal of Visualized Experiments. (74), e50052(2013).
  20. Chhatbar, P. Y., Kara, P. Improved blood velocity measurements with a hybrid image filtering and iterative Radon transform algorithm. Frontiers in Neuroscience. 7, 106(2013).
  21. Drew, P. J., Blinder, P., Cauwenberghs, G., Shih, A. Y., Kleinfeld, D. Rapid determination of particle velocity from space-time images using the Radon transform. Journal of computational neuroscience. 29 (1-2), 5-11 (2010).
  22. Kleinfeld, D., Mitra, P. P., Helmchen, F., Denk, W. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
  23. Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. -L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. Journal of visualized experiments : JoVE. (101), e52303(2015).
  24. Hoshikawa, R., et al. Dynamic Flow Velocity Mapping from Fluorescent Dye Transit Times in the Brain Surface Microcirculation of Anesthetized Rats and Mice. Microcirculation. 23 (6), New York, N.Y. 416-425 (2016).
  25. Sironi, L., et al. In vivo flow mapping in complex vessel networks by single image correlation. Scientific reports. 4 (1), 7341(2014).
  26. Kamoun, W. S., et al. Simultaneous measurement of RBC velocity, flux, hematocrit and shear rate in vascular networks. Nature Methods. 7 (8), 655-660 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Przep yw mikronaczyniowymikroskopia witalnaprzep yw kapilarnyanaliza obrazu w programie FIJIprojekt TrakEM2Skeleton Eyesanaliza kymograficznamapowanie pr dko ci

Powiązane artykuły