Artykuł metodologiczny

Przygotowanie próbek biologicznych do specjacji w temperaturze kriogenicznej przy użyciu absorpcyjnej spektroskopii rentgenowskiej o wysokiej rozdzielczości

DOI:

10.3791/60849

⸱

27 maja 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1University Grenoble Alpes, INSERM UA7, Synchrotron Radiation for Biomedicine (STROBE), 2CNRS, UMR 5254, Université Pau & Pays Adour, E2S UPPA, Institut des Sciences Analytiques et de Physicochimie pour l'Environnement et les Matériaux, 3Institut Jacques Monod, UMR 7592 CNRS, Université Paris Diderot, 4OSUG, UMS 832 CNRS, Université Grenoble Alpes, 5FAME and FAME-UHD beamlines, ESRF, the European Synchrotron, 6ID16A beamline, ESRF, the European Synchrotron

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół przedstawia szczegółową procedurę przygotowania biologicznych próbek kriogenicznych do eksperymentów z synchrotronową spektroskopią absorpcyjną promieniowania rentgenowskiego. Opisujemy wszystkie kroki wymagane do optymalizacji przygotowania próbek i kriokonserwacji wraz z przykładami protokołu z komórkami nowotworowymi i fitoplanktonem. Metoda ta zapewnia uniwersalny standard krioprzygotowania próbek.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie pierwiastków za pomocą spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego (XAS) jest szczególnie interesujące podczas badania roli metali w systemach biologicznych. Przygotowanie próbek jest kluczową i często złożoną procedurą, szczególnie w przypadku próbek biologicznych. Chociaż techniki specjacji rentgenowskiej są szeroko stosowane, nie opublikowano jeszcze szczegółowego protokołu dla użytkowników tej techniki. Ponadto modyfikacja stanu chemicznego jest niepokojąca i zaleca się techniki kriogeniczne do analizy próbek biologicznych w ich prawie natywnym stanie uwodnionym, aby zapewnić maksymalne zachowanie integralności chemicznej komórek lub tkanek. W tym przypadku proponujemy protokół przygotowania komórkowego oparty na próbkach kriokonserwowanych. Wykazano to w badaniu spektroskopii absorpcji promieniowania rentgenowskiego o wysokiej rozdzielczości energetycznej wykrywanej fluorescencją selenu w komórkach rakowych oraz badaniu żelaza w fitoplanktonie. Protokół ten może być stosowany z innymi próbkami biologicznymi i innymi technikami rentgenowskimi, które mogą zostać uszkodzone przez napromieniowanie.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie komórkowych biotransformacji niezbędnych lub toksycznych pierwiastków wymaga technik specjacji o wysokiej czułości i powinno zminimalizować etapy przygotowania próbek, które często są podatne na modyfikację związków chemicznych.

Pierwiastki fizjologiczne, takie jak selen i żelazo, są szczególnie trudne do wyspecyfikowania ze względu na ich złożoną chemię, różne stabilności gatunków selenu lub żelaza oraz ich niskie stężenie w zakresie ppm (mg/kg) lub nawet poniżej ppm. W związku z tym badanie specjacji tych pierwiastków przez XAS może być niezwykle trudne. Synchrotron XAS, a w szczególności XAS (HERFD-XAS), który pozwala na bardzo niski stosunek sygnału do tła><, jest dostępny w źródłach synchrotronowych do specyfikacji wysoce rozcieńczonych pierwiastków w złożonych matrycach biologicznych2,3. Konwencjonalne pomiary fluorescencji-XAS mogą być wykonywane przy użyciu detektora półprzewodnikowego o wysokiej rozdzielczości (SSD) o szerokości pasma energii ~150–250 eV, na linii badawczej CRG-FAME w Europejskim Zakładzie Promieniowania Synchrotronowego (ESRF)4, natomiast pomiary HERFD-XAS wymagają spektrometru analizatora kryształów (CAS), o szerokości pasma energii ~1–3 eV, na linii badawczej CRG-FAME-UHD na ESRF2. Fotony fluorescencyjne są rozróżniane pod względem energii odpowiednio za pomocą procesów elektronicznych lub optycznych.

Przygotowanie próbki jest niezbędne do zachowania struktur i utrzymania integralności chemicznej składu, umożliwiając tym samym analizę zbliżoną do naturalnego stanu biologicznego5. Co więcej, analizy przeprowadzone w temperaturach kriogenicznych tak niskich jak 10 K przy użyciu chłodzenia kriogenicznego ciekłym helem (LN2) pozwalają na spowolnienie uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem i zachowanie specjacji pierwiastkowej dla XAS. Chociaż niektóre przeglądy technik XAS stosowanych do próbek biologicznych wskazują na konieczność przygotowania i analizy próbek w warunkach kriogenicznych (np. Sarret et al.6, Porcaro et al.7), żaden z nich nie opisuje jasno powiązanego szczegółowego protokołu. W niniejszej publikacji opisano metodę kriopreparacji komórek nowotworowych i mikroorganizmów planktonowych dla specjacji HERFD-XAS Se8 i Fe9 w temperaturze kriogenicznej.

Dobra praktyka dotycząca przygotowania próbek i środowiska podczas najnowocześniejszych pomiarów spektroskopii XAS wymaga 1) konfiguracji; 2) procedurę analizy, która w jak największym stopniu ogranicza skutki uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem; oraz 3) próbkę (lub odniesienie do związku modelowego) możliwie najbardziej jednorodną w odniesieniu do wielkości wiązki fotonów promieniowania rentgenowskiego. Pierwsza pozycja jest brana pod uwagę, wykonując akwizycję w niskiej temperaturze, przy użyciu kriostatu z ciekłym helem. Drugi element jest wykonywany poprzez wykonanie każdej akwizycji na świeżym obszarze próbki, przesuwając ją względem wiązki. Wreszcie, biorąc pod uwagę trzeci warunek, próbki (granulki) i odniesienia (proszki) są kondycjonowane w sprasowanych granulkach luzem w celu maksymalnego ograniczenia porowatości i niejednorodności oraz uniknięcia chropowatości w odniesieniu do wielkości wiązki na powierzchni próbki badanej promieniami rentgenowskimi. Wyjaśniamy, w jaki sposób protokół odnosi się do wszystkich tych punktów.

Użyliśmy ludzkiej linii komórkowej prostaty PC-3 (wysoki potencjał przerzutowy) i linii komórek jajnika OVCAR-3 (która stanowi do 70% wszystkich przypadków raka jajnika) do zbadania właściwości antyproliferacyjnych nanocząsteczek selenu (Se-NPs) w stosunku do komórek rakowych oraz okrzemki Phaeodactylum tricornutum jako gatunku modelowego do zbadania sekwestracji żelaza w fitoplanktonie.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie granulek ludzkich komórek rakowych PC-3 i OVCAR-3 do specjacji selenu

UWAGA: Poniższy protokół jest zaadaptowany z Weekley et al.10. Wszystkie etapy muszą być przeprowadzane pod okapem do hodowli komórkowych w warunkach i ograniczeniach poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2, z zachowaniem technik aseptycznych.

  1. Policz komórki za pomocą komory do liczenia komórek Malasseza. Wysiewaj 150 000–200 000 komórek na kolbę dla linii komórkowej PC-3 i 300 000 komórek dla linii komórkowej OVCAR-3.
  2. Komórki nasienne w kolbach T-75 (trzy kolby na warunek w celu uzyskania potrójnych porcji) w odpowiedniej pożywce do hodowli komórkowych (tabela 1) pod pokrywą z przepływem laminarnym.
  3. Pozostawić hodowle komórkowe do wzrostu w inkubatorze w temperaturze 37 °C i w wilgotnej atmosferze z 5% CO2 , aż osiągną 80% konfluencji. Zwykle linie komórkowe raka prostaty PC-3 podwajają się po 24 godzinach, podczas gdy linie komórkowe raka jajnika OVCAR-3 potrzebują 72 godzin. Kolby należy pozostawić w inkubatorze.
  4. W międzyczasie rozcieńczyć Se-NP stosowane do leczenia do końcowego stężenia odpowiadającego IC20 (stężenie hamujące w celu osiągnięcia 20% śmierci komórki), które zostało wstępnie określone w teście MTT (bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylotetrazolium) do oceny cytotoksyczności. Stężenia te są specyficzne dla każdego typu Se-NPs, ale także specyficzne dla badanej linii komórkowej.
    1. Umieścić roztwór podstawowy nanocząstek (2 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej [BSA] lub Se-NP pokrytych chitozanem) w ultradźwiękowej łaźni wodnej na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).
    2. Rozcieńczyć roztwór Se-NPs przez seryjne rozcieńczenia w kompletnej pożywce do hodowli komórkowych, aby osiągnąć stężenie robocze. Pomiędzy każdym rozcieńczeniem wirować przez 1 minutę.
  5. Przygotować dodatnią kontrolę selenu z rozcieńczoną solą selenu do leczenia.
    1. Przygotować wodny roztwór podstawowy seleninu sodu (1 mg/ml) w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Wymieszaj 1 mg seleninu sodu w proszku z 1 ml ultraczystej wody.
    2. Wirować roztwór podstawowy przez 1 minutę.
    3. Rozcieńczyć roztwór podstawowy seleninu sodu przez seryjne rozcieńczenia w kompletnej pożywce do hodowli komórkowej do osiągnięcia stężeń roboczych.
      UWAGA: Nie zapomnij odpipetować kilka razy przed każdym rozcieńczeniem w celu homogenizacji roztworu.
  6. Wystaw komórki rakowe na leczenie selenem.
    UWAGA: Ta część protokołu musi być powtórzona dla każdej badanej nanocząstki (NP). W tym przypadku NP są dwojakiego rodzaju, BSA i Se-NP pokryte chitozanem, plus kontrole. Roztwór seleninu sodu jest kontrolą pozytywną, a żadne działanie nie jest kontrolą negatywną.
    1. Otwórz trzy kolby T-75 zawierające komórki w okapie z przepływem laminarnym.
    2. Usuń pożywkę i delikatnie umyj komórki 2x 5 ml podgrzanego (37 °C) soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS).
    3. Delikatnie, na spodzie kolby, a nie bezpośrednio na warstwę komórek, dodać 15 ml roztworu do każdej kolby za pomocą automatycznej pipety wyposażonej w sterylne plastikowe pipety o pojemności 25 ml. Umieścić pokrywki na kolbach. Nie zamykaj szczelnie pokrywek.
      UWAGA: Jak opisano w krokach 1.3 i 1.4, roztwory do traktowania muszą być wcześniej ponownie zawieszone w celu homogenizacji.
    4. Pozostawić trzy kolby poziomo w inkubatorze w temperaturze 37 °C i w atmosferze nawilżonej 5% CO2 przez 24 godziny.
  7. Przygotowanie granulek komórkowych
    1. Delikatnie przemyć komórki 2x 5 ml podgrzanego PBS (37 °C) bezpośrednio w kolbach T75.
    2. Dodać 6 ml podgrzanej pożywki do hodowli komórkowych (37 °C) na warstwę komórek w kolbie T-75 za pomocą pipety wyposażonej w 10 ml sterylnych pipet plastikowych.
    3. Zbierz komórki, delikatnie skrobając je za pomocą skrobaka do komórek. Użyć jednego skrobaka do komórek na kolbę.
    4. Za pomocą pipety i pipety o pojemności 10 ml odessać płyn i wypłukać komórkę/pożywkę z powrotem na powierzchni kolby w celu zebrania wszystkich komórek. Powtórz ten krok kilka razy, aby dysocjować i zindywidualizować komórki. Zebrać pożywkę zawierającą komórki w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml.
    5. Wirować z prędkością 250 x g przez 5 minut przy temperaturze obrotowej. Odessać supernatant.
    6. Przepłucz komórki, umieszczając je ponownie w 5 ml PBS.
    7. Wirować z prędkością 250 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Odessać supernatant i powtórzyć kroki 1.6.5 i 1.6.6 2x, aby pozbyć się wszystkich pozostałych śladów zabiegu.
    8. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS i przenieść je do probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml. Na koniec odwiruj je w temperaturze 250 x g przez 5 minut w temperaturze suchej. Rysunek 1 przedstawia osad komórkowy otrzymany po odwirowaniu i odrzuceniu supernatantu.
    9. Delikatnie usunąć cały supernatant PBS za pomocą pipety o pojemności 200 μl.
      UWAGA: Uważaj, aby nie dotknąć i nie uszkodzić granulki ogniwa. Idealnie, pellet powinien mieć 2–3 mm wysokości lub grubość, o średnicy 3–6 mm. W przypadku linii komórkowej PC-3 do testu wymagane jest 9 x 106–10 x 106 komórek. Dla linii komórek OVCAR-3 wymagane jest 8 x 106–9 x 106 komórek (Rysunek 1). Niektóre komórki prawdopodobnie zostaną utracone podczas kolejnych etapów płukania bufora. Im wyższa liczba komórek, tym lepsza będzie granulka.
  8. Błyskawiczne zamrażanie granulek komórek
    1. Zanurz dolną część probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej osad w ciekłym azocie (LN2) do poziomu osadu komórkowego.
    2. W komorze rękawicowej całkowicie oczyszczonej atmosferą obojętną, taką jak gazowy azot, zebrać osad ogniwa, delikatnie stukając rurką o pojemności 1,5 ml w płaską powierzchnię bloku miedzianego chłodzonego LN2 (Rysunek 2). Osad jest następnie zbierany bez utraty komórek.
      UWAGA: Do obsługi LN2 należy używać sprzętu do krioochrony, fartucha laboratoryjnego, zamkniętych butów, rękawic kriogenicznych oraz osłony twarzy lub okularów ochronnych.
    3. W razie potrzeby można użyć chłodzonej igły LN2, aby pomóc w wyjęciu granulki.
      UWAGA: Powstała zamrożona osada komórkowa może ulec fragmentacji. Kroki te muszą być wykonane w ciągu kilku minut i zależą od zręczności i szybkości badacza.
    4. Wymiary zamrożonego osadu muszą pasować do uchwytu na próbkę kriostatu. Przy użyciu opisanego sprzętu, jeżeli osad kuwety ma wysokość większą niż 2 mm i nieco mniejszą niż otwór w uchwycie próbki używanym do XAS, próbka może być użyta bezpośrednio. Jeśli tak nie jest, lub jeśli pożądana jest płaska powierzchnia do analizy, należy przygotować luzem cylindryczny granul, nadal utrzymując granulat w stanie zamrożonym. Jeśli osad komórkowy jest rozdrobniony, następujące kroki można zastosować idealnie w komorze rękawicowej całkowicie oczyszczonej atmosferą obojętną.
  9. Przygotowanie zamrożonych luzem cylindrycznych granulek
    1. Zanurz wszystkie części ręcznej prasy hydraulicznej, które będą miały kontakt z próbką, w LN2 (Rysunek 3A; matryce do peletowania o średnicy 3 lub 5 mm, forma, tłok/ciągnięcie drutu).
    2. Przenieś szybko zamrożone fragmenty peletów do formy załadowanej odpowiednimi matrycami do peletów (Rysunek 3B).
    3. Szybkie granulowanie za pomocą prasy hydraulicznej. Użycie 1,5 tony na granulat o średnicy 5 mm lub 0,5 tony na pellet o średnicy 3 mm jest wystarczające (Rysunek 3C).
      UWAGA: Po każdym przygotowaniu granulatu za pomocą prasy hydraulicznej wszystkie materiały należy rozmrozić i odpowiednio wysuszyć przy użyciu gazowego azotu, aby uniknąć problemów z pozostałym szronem i wilgotnością.
    4. Szybko zbierz masowe granulki zamrożonych komórek i umieść je w odpowiedniej kriotubie do przechowywania.
    5. Przechowuj go z powrotem w zbiorniku LN2 w celu długotrwałego przechowywania.
    6. Przenieś i zamontuj kriogranulki do analizy. Osad przechowywany w krioprobówce chłodzonej LN2 jest przenoszony do wstępnie schłodzonego uchwytu na próbkę kriostatu o temperaturze 77 K w cieczy N2 (Rysunek 4, używany dla linii badawczej CRG-FAME-UHD). Ten krok należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, ale może to potrwać kilka minut. Następnie przenieść uchwyt próbki do kriostatu i utrzymywać go w temperaturze 10 K podczas całej analizy XAS.
      UWAGA: Kroki 1.9.3 i 1.9.6 są trudne, ponieważ należy je wykonać szybko, aby uniknąć tworzenia się szronu, który zablokuje tłok i formę. Alternatywą jest wykonanie tych czynności pod plastikowym namiotem całkowicie oczyszczonym azotem. Chłodna masa miedziana LN2 pozwala na utrzymanie granulatu w stanie zamrożonym.

2. Przygotowanie komórek planktonu do specjacji żelaza

UWAGA: Syntetyczna woda morska użyta do tego protokołu została przygotowana przez dodanie ultraczystych soli wodnych, kwasu morfolinopropanosulfonowego, azotanu amonu, azotanu sodu, metakrzemianu sodu pentahydratu, fosforanu sodu jednozasadowego, zapasu witamin, zapasu metali śladowych, zapasu antybiotyków i buforu HEPES o pH = 7,9. Stężenia każdego składnika są wskazane w Tabeli Materiałów. Szczegóły na temat kultury można znaleźć w Sutak et al.11

  1. Odwirować kulturę okrzemek P. tricornutum w probówce polipropylenowej o pojemności 50 ml o stężeniu 1 100 x g przez 6 minut i przenieść osad do kolby ze świeżą pożywką.
  2. Pozwól kulturze rosnąć w syntetycznej wodzie morskiej w komorze wzrostowej przez 24 godziny.
  3. Odwirować kulturę planktonu przez 6 minut przy 1 100 x g i przenieść osad do świeżej pożywki zawierającej Fe-cytrynian (1 μM w końcowej hodowli). Inkubować przez 72 godziny.
  4. Przygotuj komórki planktonu
    1. Odwirowywać komórki przez 3 minuty przy 1 100 x g i spłukać pożywką bez żelaza.
    2. Przenieś granulat do probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml, przemyj ultraczystą wodą i odwiruj 2x przez 3 minuty przy 1,100 x g. Usunąć supernatant.
    3. Zanurz dolną część probówki polipropylenowej o pojemności 1,5 ml zawierającej osad w LN2 zgodnie z opisem w kroku 1.8.
    4. Przenieś zamrożone komórki do zamrożonej formy LN2 i szybko wyciśnij za pomocą prasy do peletów XRF (Rysunek 3 i Rysunek 7), jak opisano w kroku 1.9.
    5. Wyjmij pelety i przechowuj je w zbiorniku LN2 do długotrwałego przechowywania.
    6. Postępuj zgodnie z krokiem 1.9.6 (patrz Rysunek 4 dla transferu do uchwytu na próbkę kriostatu).

3. Przygotowanie i pomiar związku referencyjnego

UWAGA: Związki referencyjne (stałe lub ciekłe) reprezentatywne dla gatunku i spodziewane do znalezienia w systemie biologicznym muszą być przygotowane i przeanalizowane przez XAS w celu porównania z eksperymentalnymi próbkami biologicznymi. Widma referencyjne można również znaleźć w bazach danych12,13,14 i mogą być używane pod warunkiem, że warunki pomiaru (np. rozdzielczość spektralna) były podobne do próbek eksperymentalnych.

  1. W przypadku roztworów wzorcowych w roztworze wodnym należy zważyć początkowe związki w postaci proszku lub cieczy w warunkach beztlenowych lub w atmosferze obojętnej. Przygotuj odniesienia wrażliwe na redoks w atmosferze obojętnej (tj. w beztlenowej komorze rękawicowej lub na linii Schlenka, patrz Rysunek 5 i Rysunek 6), aby uniknąć reakcji oksydo-redukcyjnej i zachować integralność chemiczną związku, który może być wysoce reaktywny i niestabilny w otaczającym powietrzu). W tym przypadku wszystkie referencje selenu zostały przygotowane przy użyciu linii Schlenka i odgazowanej wody ultraczystej (Rysunek 6). Ciekły jabłczan FeIII i ferrytynę przygotowano w powietrzu atmosferycznym.
  2. Wymieszać z odpowiednim roztworem w celu osiągnięcia 1% wag. końcowego stężenia badanego pierwiastka (tj. selenu lub żelaza) do zbierania w trybie fluorescencji.
    UWAGA: Woda ultraczysta jest najczęściej stosowanym roztworem do przygotowania referencji XAS. Dodatek glicerolu (15%-20%) jest wymagany w przypadku cieczy mierzonych przy użyciu standardowej fluorescencji XAS, aby zapobiec artefaktom powstającym w wyniku dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego przez kryształki lodu i zachować jakość sygnału XAS zebranego za pomocą detektora półprzewodnikowego. Jednak w przypadku HERFD-XAS glicerol nie jest obowiązkowy. Używając spektrometru analizatora kryształów zamiast detektora półprzewodnikowego, energia jest wybierana z niezwykle wysoką rozdzielczością, a dyfrakcja indukowana przez kryształki lodu nie wpływa na zbieranie danych badanego pierwiastka1.
  3. Przygotowany roztwór należy zachować i przechowywać w szczelnie zamkniętym balonie Schlenka (Rysunek 5) lub w probówce polipropylenowej o pojemności 1,5 ml do czasu pomiaru w tych samych warunkach, co próbki.
  4. W celu uzyskania solidnych odniesień, należy zważyć proszki modelowych związków selenu lub żelaza w powietrzu otoczenia lub w schowku rękawicowym, jeśli gatunki te są wrażliwe na redoks. W tym przypadku stałe wzorce FeII (octan FeII i wiwianit) przygotowano w gazowej komorze rękawicowejN2, podczas gdy FeIII (Fe(OH)3 i FeIII-fosforan) przygotowano w powietrzu otoczenia.
  5. Zważyć proszek azotku boru o wysokiej czystości i wymieszać z proszkami związków modelowych w celu osiągnięcia 1% wagowego stężenia końcowego badanego pierwiastka (Rysunek 7A).
  6. Zmielić na drobny proszek za pomocą moździerza przez co najmniej 15 minut.
  7. Umieść mieszaninę proszku w formierce, aby przygotować granulki za pomocą prasy hydraulicznej ( Rysunek 7B, podobny do Rysunek 3A dla próbki granulki).
  8. Zamknij formę za pomocą tłoka ( Rysunek 7C, podobny do Rysunek 3B dla próbki granulki).
  9. Naciśnij, aby uzyskać masowy granulat (Rysunek 7D, podobny do Rysunek 3C dla próbki granulki).
  10. Przygotowane granulki należy przechowywać w schowku na rękawiczki do czasu, aż zostaną przeanalizowane w takich samych warunkach jak próbki.
    UWAGA: Granulat luzem czasami przykleja się do tłoków, w zależności od zawartości proszku, na przykład. Usunięcie go delikatnie bez złamania go może być trudne. W takim przypadku należy zastosować następującą procedurę z użyciem krążków poliimidowych (np. Kaptonu).
  11. Umieść kroplę etanolu po każdej stronie tłoków, które będą miały kontakt z proszkiem (Rysunek 8A).
  12. Przygotuj dwa krążki poliimidowe o średnicy nieco mniejszej niż tłoki. Grubość poliimidu musi wynosić 10–25 μm (cieńszy będzie trudny do manipulowania, grubszy pochłonie zbyt dużo fotonów promieniowania rentgenowskiego podczas analizy).
  13. Umieść tarcze na tłokach. Będą się trzymać przez działanie kapilarne (Rysunek 8B).
  14. Zamontuj formę z tłokiem, dodaj proszek i włóż drugi tłok (Rysunek 8C).
  15. Naciśnij (patrz krok 3.11) i usuń sprasowany granulat luzem z tłoków.
    UWAGA: Stałe wzorce można zamontować na uchwycie na próbki specyficznym dla kriostatu, podobnie jak próbki (patrz krok 1.8.6). Wzorce cieczy można zamontować na uchwycie na próbki specyficznym dla kriostatu. Zobacz Rysunek 9A dla uchwytu na próbki kriostatu CRG-FAME. Tę samą procedurę można zastosować przy użyciu uchwytu na próbki CRG-FAME-UHD, pokazanego na Rysunek 4D, przy użyciu następującej procedury.
  16. Mocowanie cieczy referencyjnej na uchwycie próbki kriostatu.
    1. Ustaw taśmę poliimidową (np. Kapton) (o grubości 25 μm) w celu uszczelnienia jednej strony otworu w uchwycie próbki na RT (Rysunek 9B).
    2. Za pomocą strzykawki powoli napełnij ubytek roztworem, aż dotrze do góry. Unikaj bąbelków. Zbiornik musi być napełniony (Rysunek 9C, po lewej).
    3. Uszczelnij drugą stronę wnęki taśmą (Rysunek 9C, po prawej).
    4. Zanurz szczelnie zamknięty uchwyt próbki w LN2 (Rysunek 9D, T0–T3).
    5. Reakcja termiczna indukuje bulgotanie LN2. Poczekaj, aż bulgotanie ustanie, sygnalizując koniec reakcji (Rysunek 9D, T3–T5).
    6. Przenieś uchwyt próbki w temperaturze 77 K do kriostatu linii badawczej przed rozpoczęciem zbierania danych (Rysunek 9D, T6) lub przechowywaniem w LN2 Dewar.
      UWAGA: Zamrożony roztwór jest dobrze rozprowadzony w jamie i tworzy jednolitą i jednorodną osadkę (Rysunek 9D, T7).

4. HERFD-XAS: procedura pomiarowa

  1. Zoptymalizuj wszystkie kryształy z CAS w warunkach Bragga w odniesieniu do energii linii fluorescencji będącej przedmiotem zainteresowania. Procedurę tę można wykonać przy użyciu skoncentrowanego związku referencyjnego.
  2. Skalibrować energię padającej wiązki monochromatycznej za pomocą punktu odniesienia, dla którego znane jest położenie energetyczne krawędzi absorpcyjnej (zazwyczaj jest to czysta folia metaliczna). Odniesienie to można umieścić w drugim kroku po próbce, w trybie podwójnej transmisji, aby móc sprawdzić kalibrację dla każdego uzyskanego widma i ostatecznie wyrównać je po obróbce.
  3. Umieścić próbkę w kriosacie ciekłym helem dla próbek biologicznych, postępując zgodnie z odpowiednią procedurą opisaną w kroku 1.9.6.
  4. Zamknij eksperymentalną klatkę zgodnie z zasadami bezpieczeństwa synchrotronu.
  5. Wykonaj akwizycję XAS w zakresie energii, który pokrywa wybraną krawędź absorpcji.
  6. Po każdej akwizycji spektralnej należy przesunąć próbkę o co najmniej dwukrotność wielkości wiązki w kierunku ruchu przed rozpoczęciem nowej akwizycji.
    UWAGA: W tym przypadku pomiary przeprowadzono przy użyciu kryształów Ge(440) w celu wybrania linii Fe Ka1 oraz przy użyciu kryształów Ge(844) w celu wybrania linii Se Ka1. Rozmiar wiązki w próbce wynosił 200 x 100 μm² (wys. x szer. pełnej szerokości, maksymalnie połowa połówki). Ruch próbki pomiędzy każdą akwizycją wynosił 500 μm w obu kierunkach, w celu zbadania jednorodności strukturalnej i analizy nowego obszaru wolnego od wcześniejszych możliwych uszkodzeń radiacyjnych za każdym razem. Poszczególne widma są porównywane i łączone, jeśli nakładają się na siebie w szumie. Pomiar zostaje przerwany dla danej próbki, gdy jakość połączonego widma jest prawidłowa. Następnie analiza danych może być wykonana za pomocą dowolnego oprogramowania dedykowanego do analizy XAS, szczególnie tych, które pozwalają na liniowe dopasowanie kombinacji znormalizowanych widm, na przykład Athena i Artemis (grupa oprogramowania Demeter)15, SixPack16, lub Viper17. Pełne i szczegółowe wyjaśnienia analizy XAS wykraczają poza zakres tego protokołu i można je znaleźć w najnowszych artykułach18,19, niektóre z nich bardziej szczegółowo poświęcone próbkom biologicznym20. Widma referencyjne Selenium XANES są już zgromadzone w bazie danych widm SSHADE21.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Głównym celem tych preparatów było zbadanie interakcji między nanocząstkami selenu (Se-NPs) a komórkami rakowymi oraz wiązaniem i sekwestracją żelaza w fitoplanktonie.

Widma HERFD-XANES selenu w stanie początkowym (BSA Se-NPs) oraz w komórkach inkubowanych w pożywce (BSA Se-NPs po 24 h inkubacji) są pokazane w Rysunek 10. Wyniki wykazały, że selen w początkowych Se-NP był obecny zarówno w postaci Se(0), jak i selenitopodobnych, podczas gdy po interakcjach z komór...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół ten został wykorzystany do badania formy chemicznej selenu i żelaza w próbkach biologicznych za pomocą spektroskopii absorpcyjnej promieniowania rentgenowskiego. Koncentruje się na krioprzygotowaniu i przechowywaniu próbek biologicznych i związków referencyjnych, a także na pomiarach HERFD-XAS.

Krioprzygotowanie i przechowywanie
Kriopreparacja granulek próbek biologicznych luzem pozwala na zachowanie integralności chemicznej gatunków obecnych w próbkach. Ma to za...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie pozostają w konflikcie interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni za wkład finansowy w rozwój linii badawczej przez CEMHTI (Orlean, Francja, ANR-13-BS08-0012-01) i Labex OSUG@2020 (Grenoble, Francja, ANR-10-LABX-0056). Projekt FAME-UHD jest wspierany finansowo przez francuską firmę EquipEx (EcoX, ANR-10-EQPX-27-01), konsorcjum CEA-CNRS CRG oraz instytut INSU CNRS. Jesteśmy wdzięczni za wszystkie wkłady wniesione podczas eksperymentów, a szczególnie wszystkim osobom pracującym przy BM30B i BM16. Autorzy dziękują Europejskiemu Ośrodkowi Promieniowania Synchrotronowego za zapewnienie czasu wiązki promieniowania synchrotronowego. Dziękujemy również projektowi PHYTOMET ANR za wsparcie finansowe (ANR-16-CE01-0008) oraz projektowi SEDMAC za wsparcie finansowe (INCA-Plan cancer-ASC16019CS).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Azotan amonuSigma-AldrichA3795NH4NO3, 2,66 mg/L miliQ wody
Komora beztlenowaCoy Laboratory, USAwyposażone w monitor beztlenowy (CAM-12)
Zapas antybiotykuSigma-AldrichA0166 dla ampicyliny, S9137 dla siarczanu streptomycyny1 ml/L wody miliQ (ampicylina sodowa i siarczan streptomycyny, 100 mg/ml)
Azotek boru w proszkuSigma-Aldrich255475
KomoraNeubauer lub Malassez
Skrobak
Sól fizjologiczna buforowana fosforanami Dulbecco (DPBS)GIBCO14190-094Bez wapnia, magnezu, czerwieni fenolowej
Probówki Eppendorfa0,5 ml i 1,5 ml
Falcon15 ml i 50 ml
cytrynian żelaza Fe/cytrynian = 1/20Sigma-AldrichF3388wodny roztwór FeCl3 50 mM i Na-cytrynianu 1M pH 6,5
Surowica bydlęcapłodu GIBCOA31604-02Performance Plus, certyfikowany format One Shot, pochodzenie z USA
KolbySigma-AldrichZ707503TPP 150 cm2 powierzchnia
Komora wzrostowaSanyoSanyo MLR-352przy 20 ° C i w 12:12 jasnym (3,000 luksów) ciemnym
reżimie Bufor HEPESSigma-AldrichH40341 g/L miliQ wody HEPES
Wysokiej jakości surowica, OVCAR-3ATCC, Rockville, MDHTB-161Temperatura przechowywania: temperatura par ciekłego azotu
Inkubator Inkubatorprzy 37° C, nawilżona atmosfera z 5% CO2
Roztwór insuliny z trzustki bydlęcejSigma-AldrichI051610 mg / ml insuliny w 25 mM HEPES, pH 8,2, Bioodczynnik, sterylnie filtrowany, odpowiedni do hodowli komórkowych
Ręczna prasa hydraulicznaSpecac, USA
Okrzemki morskie Phaeodactylum tricornutumKolekcja kultur RoscoffRCC69http://roscoff-culture-collection.org/rcc-strain-details/69
Kwas morpholinepropanosulfonowySigma-AldrichM3183MOPS, 250 mg/L miliQ wody (pH 7,3)
Mikroskop
PC-3ECCAC, Salisbury, Wielka Brytania90112714Temperatura przechowywania: temperatura pary ciekłego azotu
Penicylina-StreptomycynaSigma-AldrichP4333Stabilizowany roztworem, z 10 000 jednostek penicyliny i 10 mg streptomycyny/ml, sterylnie filtrowany, BioReagent, odpowiedni do hodowli komórkowych
Pipeta-chłopiec25 mL, 10 ml i 5 ml sterylne pipety plastikowe Produkty hodowli
planktonu, podłoże Mf: Sole morskieSigma-AldrichS988340g/L miliQ wody. Skład: Cl- 19,29 g, Na+ 10,78 g, SO42- 2,66 g, Mg2+ 1,32 g, K+ 420 mg, Ca2+ 400 mg, CO32- /HCO3- 200 mg, Sr2+ 8,8 mg, BO2- 5,6 mg, Br- 56 mg, I- 0,24 mg, Li+ 0,3 mg, F- 1 mg
Pęseta plastikowaOxford InstrumentAGT 5230
RPMI MEDIUM 1640 (modyfikacja ATCC)GIBCOA10491-01Roztwór zawierający 4,5 g/l D-glukozy, 1,5 g/l wodorowęglanu sodu, 110 mg/l (1 mM) pirogronianu sodu, 2,388 g/l (10 mM) buforu HEPES i 300 mg/l L-glutaminy do użytku badawczego
Nanocząstki selenu (Se-NPs), powlekane BSA, 2 mg/mlNANOCS Company, USASe50-BS-1BSA stabilizowany roztwór Se-NPs. Średni rozmiar około 30 nm. Przechowywany w 4° C w ciemności, chroniony przed światłem.
Nanocząstki selenu (Se-NPs), powlekane chitozanem, 2 mg/mlNANOCS Company, USA11. Se50-CS-1Stabilizowany chitozanem roztwór Se-NPs. Średni rozmiar około 30 nm. Przechowywany w 4° C w ciemności, chroniony przed światłem.
Metakrzemian sodu pentahydratSigma-Aldrich71746Na2SiO3,5H2O, 22,8 mg/L wody miliQ
Azotan soduSigma-AldrichS5022NaNO3, 75 mg/L wody miliQ
Fosforan sodu jednozasadowySigma-AldrichS5011NaH2PO4, 15 mg/L wody miliQ
kolby
Kapturdo hodowli tkankowych
Zapas metali śladowychSigma-AldrichM5005, Z1001, M1651, C2911, 450243, 451193, 2298571 ml/L wody miliQ (MnCl2,4H2O 200 mg/L, ZnSO4,7H2O 40 mg/L, Na2MoO4,2H2O 20mg/L, CoCl2,6H2O 14 mg/L, Na3VO4.nH2O 10 mg/L, NiCl2 10 mg/L, H2SeO3 10 mg/L)
Roztwór błękitu trypanowego (0,4%)GIBCO15250061
Trypsin-EDTA (0,05%), czerwień fenolowaGIBCO25300-054
Zapas witaminSigma-AldrichT1270 dla tiaminy, B4639 dla biotyny, V6629 dla B121 ml/L wody miliQ (tiamina HCl 20 mg/L, biotyna 1 mg/L, B12 1 mg/L)
Kąpiel wodna 37° Z
zliczania komórek do komórekoptycznyT-75

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Llorens, I., et al. High energy resolution five-crystal spectrometer for high quality fluorescence and absorption measurements on an x-ray absorption spectroscopy beamline. Review of Scientific Instruments. 83 (6), 063104(2012).
  2. Proux, O., et al. High Energy Resolution Fluorescence Detected X-ray Absorption Spectroscopy: a new powerful structural tool in environmental biogeochemistry sciences. Journal of Environmental Quality. 46 (6), 1146-1157 (2017).
  3. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  4. Proux, O., et al. FAME: a new beamline for X-ray absorption investigations of very-diluted systems of environmental, material and biological interests. Physica Scripta. 115, 970-973 (2005).
  5. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19 (6), 875-886 (2012).
  6. Sarret, G., et al. Use of Synchrotron-Based techniques to Elucidate Metal Uptake and Metabolism in Plants. Advanced in Agronomy. 119, 1-82 (2013).
  7. Porcaro, F., Roudeau, S., Carmona, A., Ortega, R. Advances in element speciation analysis of biomedical samples using synchrotron-based techniques. Trends Analytical Chemistry. 104, 22-41 (2018).
  8. Bissardon, C., et al. Role of selenium nanoparticles to dampen the metastatic potential of aggressive cancer cells. 9th bioMedical Applications of Synchrotron Radiation, Beijing, China. , Available from: https://indico.ihep.ac.cn/event/7794/contribution/7 (2018).
  9. Isaure, M. P. Metals in microorganisms: new insights from nano-scale imaging and X-ray absorption spectroscopy. 102nd Canadian Chemistry Conference and Exhibition Environmental Chemistry. Quebec, Canada. , Available from: http://www.ccce2019.ca/environmental-chemistry (2019).
  10. Weekley, C. M., et al. Speciation of Seleno-amino Acids by Human Cancer Cells: X-ray Absorption and Fluorescence Methods. Biochemistry. 50 (10), 1641-1650 (2011).
  11. Sutak, R., et al. A comparative study of iron uptake mechanisms in marine microalgae: Iron binding at the cell surface is a critical step. Plant Physiology. 160, 2271-2284 (2012).
  12. Asakura, K., Abe, H., Kimura, M. The challenge of constructing an international XAFS database. Journal of Synchrotron Radiation. 25 (4), 967-971 (2018).
  13. Schmitt, B., et al. SSHADE: "Solid Spectroscopy Hosting Architecture of Databases and Expertise" and its databases. OSUG Data Center. Service/Database Infrastructure. , Available from: https://www.sshade.eu/ (2018).
  14. Bissardon, C., et al. Sub-ppm high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy of selenium in articular cartilage. Analyst. 144 (11), 3488-3493 (2019).
  15. Ravel, B., Newville, M. ATHENA, ARTEMIS, HEPHAESTUS: data analysis for X-ray absorption spectroscopy using IFEFFIT. Journal of Synchrotron Radiation. 12 (4), 537-541 (2005).
  16. Webb, S. M. SIXpack: a graphical user interface for XAS analysis using IFEFFIT. Physica Scripta. 115, 1011(2005).
  17. Klementiev, K. V. VIPER for Windows. Journal of Physics D: Applied Physics. 34 (2), 209-217 (2001).
  18. Newville, M. Fundamental of XAFS. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 33-74 (2014).
  19. Henderson, G. S., de Groot, F. M. F., Moulton, B. J. A. X-ray Absorption Near-Edge Structure (XANES) Spectroscopy. Reviews in Mineralogy & Geochemistry. 78, 75-138 (2014).
  20. Ortega, R., Carmona, A., Llorens, I., Solari, P. L. X-ray absorption spectroscopy of biological samples. A tutorial. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 27, 2054-2065 (2012).
  21. Bissardon, C., Bohic, S., Proux, O. Se K edge XAS HERFD of selenium with various oxidation states at 10K. SSHADE/FAME. , Available from: https://doi.org/10.26302/SSHADE/EXPERIMENT_CB_20190408_001 (2019).
  22. George, G. N., et al. X-ray-induced photo-chemistry and X-ray absorption spectroscopy of biological samples. Journal of Synchrotron Radiation. 19, 875-886 (2012).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biological Sample PreparationHigh Resolution XASSelenium SpeciationIron AnalysisCell Pellet PreparationLiquid Nitrogen StorageHelium CryostatSynchrotron Safety

Powiązane artykuły