Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych

7.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/60955

⸱

6 sierpnia 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Faculty of Biological Sciences, Tarbiat Modares University, 2Center for Therapeutic Innovation and Department of Psychiatry & Behavioral Sciences, University of Miami Miller School of Medicine, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Miami Miller School of Medicine, 4Persian BayanGene Research and Training Center

W tym artykule

Podsumowanie

Prezentowany protokół opisuje metodę badania wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności związków małocząsteczkowych.

Streszczenie

Test wzrostu neurytu i ocena neurotoksyczności to dwa główne badania, które można przeprowadzić przy użyciu przedstawionej tutaj metody. Protokół ten zapewnia wiarygodną analizę morfologii neuronów wraz z ilościowymi pomiarami modyfikacji długości neurytów oraz lokalizacji i obfitości białek synaptycznych po leczeniu związkami małocząsteczkowymi. Oprócz zastosowania przedstawionej metody w badaniach wzrostu neurytów, można przeprowadzić ocenę neurotoksyczności w celu oceny, rozróżnienia i uszeregowania komercyjnych związków chemicznych na podstawie ich potencjalnego wpływu na neurotoksyczność rozwojową.

Mimo że linie komórkowe są obecnie szeroko stosowane w badaniach przesiewowych w neurobiologii, często różnią się genetycznie i fenotypowo od swojego tkankowego pochodzenia. Z drugiej strony komórki pierwotne utrzymują ważne markery i funkcje obserwowane in vivo. W związku z tym, ze względu na potencjał translacyjny i znaczenie fizjologiczne, które komórki te mogą oferować test wzrostu neurytów i ocenę neurotoksyczności, można znacznie skorzystać z zastosowania ludzkich nerwowych komórek progenitorowych (hNPC) jako podstawowego modelu komórek ludzkich.

Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do badania zdolności związków do wywoływania rozrostu neurytów i neurotoksyczności poprzez wykorzystanie ludzkich neuronów pochodzących z komórek progenitorowych, modelu komórkowego ściśle reprezentującego ludzką biologię."

Wprowadzenie

Wzrost neurytu to proces fundamentalny dla tworzenia sieci neuronalnej i regeneracji nerwów1,2. Po urazie wyrost neurytów odgrywa kluczową rolę w regeneracji układu nerwowego. Przerost neurytowy jest również ważnym elementem sygnalizacji zewnątrzkomórkowej w indukowaniu aktywności regeneracyjnej neuronów w celu poprawy wyników w przypadku zaburzeń neurodegeneracyjnych i uszkodzeń neuronów3,4,5,6.

Zachowując swój potencjał różnicowania w wytwarzaniu różnych linii nerwowych, ludzkie neuronalne komórki progenitorowe (hNPC) mogą stanowić modelowy system do badań funkcji i rozwoju ośrodkowego układu nerwowego (OUN)7,8,9. Wysoki potencjał translacyjny i fizjologiczne znaczenie hNPC jako pierwotnego modelu komórki ludzkiej dają znaczną przewagę w badaniach przesiewowych związanych z odkrywaniem leków związanych z przerostem neurytów. Jednak utrzymanie i skalowanie podstawowych modeli komórek dla testów o wysokiej przepustowości może być czasochłonne i pracochłonne10,11,12,13.

Oprócz zastosowania przedstawionej metody w badaniach nad wzrostem neurytów, ocena neurotoksyczności jest kolejnym zastosowaniem wykorzystującym neurony pochodzące z hNPC. Istnieją tysiące komercyjnych związków chemicznych, które albo nie są badane, albo mają słabo poznany potencjał neurotoksyczności. W związku z tym istnieje duże zapotrzebowanie na bardziej wiarygodne i skuteczne eksperymenty przesiewowe w celu oceny, rozróżnienia i uszeregowania związków na podstawie ich potencjału do wywoływania neurotoksyczności rozwojowej14. Wzrost częstości występowania i częstości występowania zaburzeń neurologicznych wraz z obfitością nieprzebadanych związków w środowisku wymaga opracowania bardziej wiarygodnych i wydajnych eksperymentów w celu identyfikacji niebezpiecznych związków środowiskowych, które mogą powodować neurotoksyczność15.

Przedstawiona tutaj metoda może być wykorzystana do badania zdolności związków do wywoływania wzrostu neurytów i neurotoksyczności poprzez wykorzystanie ludzkich neuronów pochodzących z neuronów progenitorowych, modelu komórkowego ściśle reprezentującego ludzką biologię.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

Oświadczenie etyczne: Próbki płodu zostały dostarczone z Laboratorium Badań nad Wadami Wrodzonymi na Uniwersytecie Waszyngtońskim w Seattle dzięki programowi dystrybucji tkanek wspieranemu przez Narodowy Instytut Zdrowia (NIH). Laboratorium Badań nad Wadami Wrodzonymi uzyskało odpowiednią pisemną świadomą zgodę rodziców, a pobieranie tkanek było monitorowane przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu Waszyngtońskiego. Wszystkie prace zostały wykonane za zgodą Biura Badań nad Ludźmi na Uniwersytecie w Miami8.

1. Izolacja i hodowla ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych (hNPC)

  1. Umieść tkankę mózgową na szalce Petriego o średnicy 100 mm i ostrożnie usuń opony mózgowe za pomocą kleszczy.
  2. Przenieś tkankę mózgową do stożkowej rurki o pojemności 50 ml i umyj ją dwukrotnie 20 ml PBS, delikatnie odwracając probówkę.
  3. Inkubować tkankę mózgową w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, zanurzając tkankę w roztworze dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) i DNazie I (10 U/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
  4. Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów) do rurki zawierającej tkankę mózgową i mechanicznie zdysocjować neurosfery, rozcierając 20 do 30 razy przez końcówkę pipety o pojemności 1000 μl, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
  5. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć skupiska komórek.
  6. Wysiewać zawiesinę jednokomórkową w wentylowanej kolbie T-25 zaopatrzonej w 5-10 ml pożywki do hodowli komórek nerwowych uzupełnionej składnikami wyszczególnionymi w tabeli 1.
    1. Wysterylizuj roztwór heparyny przez filtrację przez filtr 0,2 μm. Suplement B-27 bez witaminy A jest suplementem bez surowicy do hodowli progenitorów nerwowych i komórek macierzystych, bez wywoływania różnicowania.
      UWAGA: Ludzkie nerwowe komórki progenitorowe (hNPC) są izolowane z ludzkiego mózgu płodu pobranego od abortowanego płodu. Po 7–10 dniach hodowli nerwowe komórki macierzyste (NSC) tworzą swobodnie unoszące się kolonie neurosfery, podczas gdy inne typy komórek pozostają w zawieszeniu jako pojedyncze komórki lub przyczepiają się do dna kolby. Izolowane hNPC mogą być hodowane jako neurosfery w zawieszeniu przez kilka miesięcy8,16,17.
kwotaskładnik
100 μLEGF (20 ng/ml)
100 μLFGF (10 ng/ml)
2 mlB-27, minus witamina A (50X)
1 mlL-alanylo-L-glutamina (100X) (patrz tabela materiałów)
4 μlHeparyna (2 μg/ml)
96,8 mlPożywka do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów)

Tabela 1. Składniki potrzebne do wytworzenia 100 ml pożywki hodowlanej

2. Przekazywanie hNPC

  1. Zebrać pożywkę zawierającą pływające kulki, duże i małe neurosfery, i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
    UWAGA: Z nieznanych przyczyn czas rozszczepienia neurosfer jest zmienny od 7 dni do 30 dni. Jednak ogólnie rzecz biorąc, neurosfery muszą być pasażowane, gdy osiągną średnicę większą niż 700-900 μm. Dzieje się tak, gdy środek neurosfery zaczyna ciemnieć, co jest uważane za oznakę wysokiego tempa śmierci komórki18.
  2. Wirować neurosfery przez odwirowanie przy 300-400 x g przez 3 minuty.
  3. Ostrożnie odessać supernatant, a następnie zanurzyć kulki w 500 μl odczynnika do dysocjacji rozmrożonych komórek (patrz tabela materiałów).
    1. Przygotować porcje odczynnika do dysocjacji komórek, dodając 500 μl na 1,5 ml mikroprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby uniknąć utraty aktywności enzymatycznej, należy rozmrozić odczynnik do dysocjacji komórek, trzymając go w temperaturze pokojowej lub ogrzewając przez 5 minut w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C.
  4. W zależności od gęstości i wielkości kulek, zanurzone kule inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-15 minut.
  5. Dodaj 5-10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do neurosfer zawierających 50 ml stożkowej probówki i odwiruj przy 300-400 x g przez 5 minut, aby osadzać neurosfery.
  6. Odessać supernatant i delikatnie pipetować w górę i w dół, za pomocą pipety 1000 μl, w 2 ml pożywki hodowlanej, aż wszystkie neurosfery znajdą się w zawiesinie pojedynczej komórki.
    UWAGA: Dysocjacja stanie się widoczna gołym okiem. Przed dysocjacją neurosfery mają postać sfer. Po zanurzeniu w odczynniku dysocjacyjnym i pipetowaniu w górę iw dół, staną się pojedynczymi komórkami.
    1. Policz komórki i połóż pojedyncze komórki, od 2 do 3 milionów komórek na kolbę T-25 w 10 ml pożywki hodowlanej.
  7. Karm komórki co 3 dni, wymieniając połowę pożywki hodowlanej.
    1. Uspokój neurosfery, pochylając kolbę tak, aby znajdowała się w dolnym rogu. Trzymać kolbę w tej pozycji przez około 1-2 minuty, aż neurosfery opadną. Następnie delikatnie odessać połowę pożywki, wkładając pipetę serologiczną do pożywki powyżej osadzonych neurosfer. Zdysocjowane komórki mogą agregować się, tworząc kule po 2 do 3 dniach w hodowli19.

3. Zamrażanie hNPC

  1. Przygotować pożywkę do zamrażania komórek, dodając DMSO do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 10% (v/v) lub użyć dostępnej w handlu pożywki do krioprezerwacji dla wrażliwych typów komórek (patrz tabela materiałów).
  2. Posortuj duże kule, przenosząc pożywkę do stożkowej rurki o pojemności 50 ml i pozwalając kulkom osiąść grawitacyjnie. Następnie wyjmij i przenieś duże neurosfery do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu pasażowania za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 lub 1000 μl.
    UWAGA: Neurosfery o średnicy większej niż 900 μm są uważane za duże, a te o średnicy mniejszej niż 500 μm są uważane za małe.
  3. Pozostałe neurosfery odwirować przez odwirowanie w stężeniu 300-400 x g przez 3 min. Ostrożnie usunąć supernatant.
  4. Ponownie zawiesić do 100 kulek w 1 ml odczynnika do kriokonserwacji i przenieść go do krioprobówki.
  5. Przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania komórek (patrz Tabela materiałów) i następnego dnia przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
    UWAGA: Zaleca się zamrażanie małych i średnich neurosfer (o średnicy mniejszej niż 900 μm) i unikanie zamrażania dużych neurosfer (o średnicy większej niż 900 μm) lub pojedynczych komórek. Aby zmniejszyć uszkodzenia komórek podczas rozmrażania próbki, utrzymuj gęstość komórek, umieszczając rozmrożone neurosfery w małej kolbie T25.

4. Różnicowanie i traktowanie hNPC

UWAGA: Aby wywołać różnicowanie, neurosfery są rozdzielane na pojedyncze komórki, liczone i następnie wysiewane na powlekanych płytkach przez 5 dni. Następnie zróżnicowane komórki są traktowane przez 24 godziny związkami testowymi przed barwieniem immunologicznym i kwantyfikacją fluorescencji.

  1. powłoka
    1. Dodać 200 μl poli-L-lizyny (PLL) na studzienkę 4-dołkowych szkiełek szklanych (140 μl na studzienkę 8-dołkowych szkiełek
      2. podstawowych).
    2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT).
    3. Umyj 3x PBS.
    4. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (przez około 30 minut).
    5. Dodać 150 μl lamininy (50 μg/ml) na studzienkę 4-dołkowych szkiełek szklanych (120 μl na studzienkę 8-dołkowych szkiełek
      6. podstawowych).
    6. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    7. Umyć 3x PBS.
      UWAGA: Powlekane szkiełka komorowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
  2. Posiewanie ogniw
    1. Policz i ułóż 80 000 neurosfer jednokomórkowych (neurosfer w zawiesinie pojedynczej komórki) na studzienkę 4-dołkowych szkiełek komorowych (70 000 komórek na studzienkę 8-dołkowego szkiełka komórkowego).
    2. Dodać 500 μl pożywki różnicującej na studzienkę szkiełka 4-dołkowego (250 μl pożywki na studzienkę szkiełka 8-dołkowego).
      1. Aby najpierw wytworzyć pożywkę różnicującą, dodaj następujące składniki z tabeli 2 do sterylnego, jednorazowego pojemnika, aby uzyskać pożywkę indukującą neurony (NIM).
      2. Dodać następujące składniki z tabeli 3 do 48,5 ml NIM wytworzonego w poprzednim kroku, aby uzyskać pożywkę różnicującą.
    3. Inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C.
    4. Po 5 dniach poddać komórki działaniu przez 24 godziny, zastępując połowę pożywki w każdym dołku świeżą pożywką zmieszaną z pożądanym stężeniem badanych związków, łącznie z odpowiednimi kontrolami.
kwotaskładnik
49 mlDMEM/F-12
0,5 mlSuplement N2 (100X)
0,5 mlAminokwasy endogenne MEM (100X)
2 μlHeparyna (2 μg/ml) (stężenie podstawowe wynosi 50 mg/ml)

Tabela 2. Składniki potrzebne do wytworzenia 50 ml NIM

kwotaskładnik
1 mlB-27 (50X)
500 μLAntybiotyk-Antybiotyk (100X)
5 μL Kwas retinowy (0,1 μM)
50 μLGDNF (10 μg/ml)
50 μLBDNF (10 μg/ml)
5 μLKwas askorbinowy (0,2 μg/ml) (stężenie w magazynie wynosi 2 mg/ml) UWAGA: Zaleca się przygotowanie świeże.
48,5 mlNIM (NIM)

Tabela 3. Składniki niezbędne do wytworzenia 50 ml pożywki różnicującej

5. Immunocytochemia (ICC)

UWAGA: Komórki są utrwalane 4% formaldehydem. Następnie przeprowadza się przepuszczalność i blokowanie w celu poprawy penetracji i zapobieżenia niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał. Komórki są następnie inkubowane z pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc. Następnie komórki są inkubowane z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami drugorzędowymi. Na koniec, po użyciu DAPI do barwienia jądra, montowane są szkiełka komorowe.

  1. Utrwalenie
    1. Delikatnie zassać pożywkę w każdym dołku.
    2. Dodać 500 μl 4% formaldehydu na studzienkę 4-dołkowych szkiełek komorowych (250 μl na studzienkę 8-dołkowych szkiełek komorowych).
    3. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
    4. Delikatnie przemyć 2x z 500 μL PBS.
      UWAGA: Po utrwaleniu, pozostawiając 1 ml PBS w każdym dołku, szkiełka hodowlane można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
  2. Przenikanie i blokowanie komórek
    1. Dodać następujące składniki z Tabeli 4 do sterylnego, jednorazowego pojemnika, aby utworzyć bufor przeciwciał (Ab).
    2. Wymieszaj następujące składniki z tabeli 5 z buforem Ab wykonanym w poprzednim kroku, aby uzyskać roztwór przepuszczalny i blokujący komórkę.
    3. Dodać 500 μl na studzienkę 4-dołkowych szkiełek komorowych i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze RT.
      UWAGA: Bufor Ab może być przechowywany w temperaturze 4 °C.
kwotaskładnik
1,75 gramaNaCl (150 mM)
1,2 gramaTrisBase (50 mM)
2 gramówBSA 1%
3,6 grL-lizyna (100 mM)
8 gramówAzydek sodu (4%)
200 mlwoda destylowana. UWAGA: Początkowo rozpuść wymagane składniki w 150 ml wody, a następnie dostosuj do 200 ml.

Tabela 4. Składniki niezbędne do wytworzenia 200 ml buforu przeciwciał

kwotaskładnik
600 μL20% Kozia surowica
6 μL0,2% Tryton-X100
2394 μLBufor przeciwciał. UWAGA: Początkowo rozpuść wymagane składniki w 2 ml buforu Ab, a następnie dostosuj do pH 7,4. Następnie dodaj więcej buforu Ab, aby dostosować się do końcowej objętości 3 ml i wysterylizować filtr.

Tabela 5. Składniki niezbędne do wytworzenia 3 ml roztworu do przepuszczalności i blokowania komórek

  1. Barwienia
    1. Przemyć 2x 500 μL PBS.
    2. Dodać rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe, anty-β-tubulinę III (1:200) i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C (200 μl na studzienkę szkiełka 4-dołkowego). Rozcieńczyć pierwszorzędowe przeciwciało w PBS.
    3. Umyj 2x PBS.
    4. Dodać rozcieńczone w PBS, znakowane fluorescencyjnie przeciwciało drugorzędowe Alexa Fluor 488 (1:500) i inkubować przez 2 godziny w temperaturze pokojowej w miejscu chronionym przed światłem (250 μl na studzienkę szkiełek 4-dołkowych)
    5. Umyj 2x PBS.
    6. Dodać rozcieńczoną w PBS DAPI (stężenie 300 nM) i inkubować przez 5 minut w temperaturze RT w miejscu chronionym przed światłem (300 μl na studzienkę z 4-dołkowych szkiełek podstawowych).
    7. Umyj 3x PBS.
    8. Zamontuj prowadnice studzienki zgodnie z poniższymi instrukcjami.
      1. Rozebrać suwak komory, łamiąc zaczepy zrywalne i zdejmując uszczelkę oraz podstawę.
      2. Dodać jedną kroplę roztworu montażowego (patrz Tabela materiałów) na studzienkę 4-dołkowych szkiełek komorowych. Następnie użyj szkiełka zakrywającego, aby zakryć cały slajd.
      3. Za pomocą pęsety i pod kątem przyłóż jedną stronę szkiełka nakrywkowego do szkiełka, stykając się z zewnętrzną krawędzią kropli cieczy.
      4. Ostrożnie przechylić szkiełko nakrywkowe na roztwór montażowy podczas opuszczania go na miejsce. Unikaj tworzenia się bąbelków. Weź końcówkę do pipety i dociśnij ją do szkiełka nakrywkowego. Bąbelki przesuną się na bok.
        UWAGA: Tworzenie się pęcherzyków jest czasami nieuniknione. Jeśli tak się stanie, wyobraź sobie wokół nich, o ile jest ich kilka.
      5. Postępuj zgodnie ze wskazówkami producenta dotyczącymi czasu utwardzania. Unikaj stosowania nieutwardzalnych roztworów montażowych ze względu na trudności w obsłudze podczas obrazowania. W przeciwnym razie wymagane jest użycie odpowiedniego uszczelniacza do szkiełek nakrywkowych na krawędziach, aby zapobiec przesuwaniu się szkiełka nakrywkowego podczas obrazowania.
      6. Aby uszczelnić szkiełko nakrywkowe, użyj lakieru do paznokci i wykonaj małą linię na krawędzi szkiełka nakrywkowego. Pozostaw lakier do paznokci do wyschnięcia na około 2 minuty.

6. Akwizycja obrazu, wzrost neurytów i kwantyfikacja intensywności fluorescencji

UWAGA: Po barwieniu użyj mikroskopu konfokalnego z obiektywem 20x i rozmiarem obrazu 1024 x 1024 pikseli, aby uzyskać obrazy leczonych komórek. Wykonaj zdjęcie z co najmniej dwóch pól na kontrpróbę biologiczną w każdym stanie. Następnie użyj oprogramowania do analizy obrazu Fidżi (ImageJ 1.51u) do ilościowego określenia długości neurytu. Krótko mówiąc, zmierz długość najdłuższego neurytu dla każdego neuronu, a po uśrednieniu wartości na leczenie użyj testu t studenta dla grup niezależnych, aby porównać średnie między grupami eksperymentalnymi a grupą kontrolną.

UWAGA: Dostępnych jest kilka komercyjnych (Imaris, Volocity, Amira) i open source (ImajeJ, CellProfiler, Vaa3D, BioImageXD, Icy, KNIME) programów do przetwarzania obrazów. Spośród tych programów, ImageJ stał się narzędziem z wyboru do biologicznej analizy obrazu20,21. Portal ImageJ w https://imagej.net/Introduction jest użytecznym źródłem informacji zawierającym dokładny opis podstawowych i wbudowanych funkcji ImageJ, w tym przetwarzania obrazu, kolokalizacji, dekonwolucji, rejestracji, segmentacji, śledzenia i wizualizacji.

  1. Pomiar rozrostu neuronów za pomocą oprogramowania do analizy obrazu Fidżi
    1. Jak pokazano w Rysunek 1, otwórz obraz, przeciągając go i upuszczając na oprogramowanie Fidżi lub wybierając Plik | Otwarty.
    2. Wybierz pozycję Analizuj | Narzędzia | Menedżer ROI, a następnie kliknij prawym przyciskiem myszy 5. ikonę na pasku narzędzi Prosty i przełącz się na linię odręczną. Opcjonalnie kliknij dwukrotnie tę samą ikonę, aby zmienić szerokość linii na 10, a następnie prześledź najdłuższy neuryt, zaczynając w pobliżu ciała komórki i rozciągając się do czubka neurytu.
    3. Naciśnij Ctrl + T, a następnie F, aby dodać pomiar do Menedżera ROI i podświetlić zmierzony neuron. Zaznacz wszystkie liczby w ROI, kliknij Zmierz, wybierz wszystkie obliczone długości i skopiuj/wklej do arkusza kalkulacyjnego.
  2. Pomiar intensywności fluorescencji znakowanych komórek za pomocą oprogramowania do analizy obrazu Fidżi
    1. Jak pokazano w Rysunek 2, po otwarciu obrazu kliknij na 4ikonę na pasku narzędzi Zaznaczanie odręczne. Narysuj kształt komórki.
    2. Wybierz pozycję Analizuj | Ustaw Measurements (Pomiary) i wybierz następujące wartości: Area, Integrated density (Gęstość zintegrowana), Mean grey value (Średnia wartość szarości) | Analizowanie | Zmierz (otworzy się wyskakujące okienko ze stosem wartości).
    3. Wybierz region obok komórki jako tło (rozmiar nie jest ważny), a następnie wybierz pozycję Analizuj | Miara. Zaznacz wszystkie zmierzone dane i skopiuj/wklej do arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Gęstość zintegrowana (IntDen) to pozycja używana do określania intensywności fluorescencji. W tym badaniu mierzy się intensywność fluorescencyjną cząsteczki docelowej, aby najpierw przeanalizować jej rozmieszczenie w komórce, a następnie określić ilościowo obfitość cząsteczki docelowej pod różnymi zabiegami. W związku z tym skuteczność leczenia będzie mierzona i porównywana z kontrolą.

7. Ocena neurotoksyczności

UWAGA: Cytotoksyczność badanych związków jest oceniana na płytkach 384-dołkowych (patrz Tabela Materiałów) za pomocą testu żywotności komórek luminescencyjnych (patrz Tabela materiałów). hNPC są przygotowywane według tej samej metody, z wyjątkiem niewielkich modyfikacji, opisanych w sekcji "Różnicowanie i traktowanie hNPC". Następnie mierzy się sygnał luminescencyjny generowany przez test żywotności komórek luminescencyjnych za pomocą czytnika mikropłytek. Sygnał luminescencyjny jest proporcjonalny do stężenia komórkowego ATP, które samo w sobie jest wprost proporcjonalne do liczby żywotnych komórek obecnych w każdym dołku.

  1. powłoka
    1. Dodać 30 μl poli-L-lizyny (PLL) na dołek płytki 384-dołkowej.
    2. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
    3. Umyj 2x PBS.
    4. Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (przez około 30 minut).
    5. Dodać 30 μl lamininy (50 μg/ml) na dołek płytki 384-dołkowej.
    6. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
    7. Umyj 2x z PBS.
      UWAGA: Powlekane płytki 384-dołkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
  2. Posiewanie ogniw
    1. Policz i umieść 20 000 neurosfer jednokomórkowych na dołku 384-dołkowej płytki w 25 μl pożywki różnicowej.
    2. Inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C.
    3. Po 5 dniach poddać komórki działaniu przez 24 godziny za pomocą badanych związków przygotowanych w stężeniu 6-krotnie większym niż końcowe pożądane stężenie w objętości 5 μl (aby uzyskać końcową objętość 30 μl na studzienkę).
  3. Test żywotności komórek
    1. Dodać 30 μl odczynnika do oznaczania żywotności komórek luminescencyjnych na dołek płytki 384-dołkowej.
      UWAGA: Dodać objętość odczynnika do oznaczania żywotności komórek luminescencyjnych równą objętości obecnej w każdym dołku. Rozmrozić odczynnik do oznaczania żywotności komórek luminescencyjnych i zrównoważyć z RT przed użyciem.
    2. Wstrząsać na talerzu przez 2 minuty (w celu wymieszania i wywołania lizy komórek).
    3. Odwirować mieszaninę przez odwirowanie w temperaturze 300-400 x g przez 30 s.
    4. Inkubować 384-dołkową płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w miejscu chronionym przed światłem (w celu ustabilizowania sygnału luminescencyjnego).
    5. Rejestruj luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek.
      UWAGA: Do oznaczania żywotności należy użyć odpowiednich środków kontrolnych, w tym Velcade (o końcowym stężeniu 10 μM) jako dodatnim i HBSS zawierającym DMSO (o stężeniu końcowym 0,1% lub 0,2%) jako kontroli ujemnej.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Protokół przedstawiony w manuskrypcie został pomyślnie zastosowany w dwóch niedawno opublikowanych pracach22,23. Rysunek 3 demonstruje wykorzystanie neuronów pochodzących z hNPCs do zbadania wpływu inhibitorów HDAC jako związków epigenetycznych na wydłużanie neurytów, co służy jako marker wzrostu neurytów i późniejszej zdolności neurogennej związków małocząsteczkowych.

Ponadto, na Rysu...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Protokół ten jest jedną z niewielu opublikowanych prac opisujących test długości neurytu po leczeniu związkami testowymi. Ponadto opisujemy, jak używać hNPC do testu wzrostu neurytów i oceny neurotoksyczności. Wykorzystując ten test wzrostu neurytów i ocenę neurotoksyczności neuronów pochodzących z hNPC, wykazano potencjał neurogenny kategorii epigenetycznych związków małocząsteczkowych, inhibitorów HDAC, w indukowaniu wzrostu neurytów22. Ponadto, w innym artykule przedstawionym przez Sartora i ws...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Wszyscy autorzy wskazują na brak potencjalnego konfliktu interesów.

Podziękowania

To badanie zostało sfinansowane z grantu badawczego NIMAD (940714) przyznanego MAF.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Szkiełka komorowe 4-dołkoweSigmaPEZGS0816
Alexa Fluor 488InvitrogenA-11001
Alexa Fluor 594InvitrogenR37117
Antybiotykowo-PrzeciwgrzybiczeGibco15240062
Anti-Β-Tubulin IIIThermoMA1-118X
B27Thermo
B27 - bez witaminy AThermo12587010
BDNFPeproTech450-02
BSASigmaA8531
CellTiter-GloPromegaG7572
CoolCellCorning432000Pojemniki do zamrażania komórek zapewniające znormalizowaną kontrolowaną szybkość -1° C/minutę zamrażania komórek w -80° C zamrażarka
CryoStor CS10StemCell Technologies7930Pożywka do kriokonserwacji zawierająca 10% DMSO
DAPIThermoD1306
DMEM/F12Gibco11320033
DMSOSigma34869-100ML
EGFGibcoPHG0311
FGFGibcoPHG6015
FormaldehydThermoFB002
GDNFPeproTech450-10
GlutamaxGibco35050061Suplement L-alanylo-L-glutaminy
Kozia surowicaThermo50062Z
HeparynaCalbiochem375095
LamininSigmaL2020-1MG
Kwas L-askorbinowySigmaA92902-25G
L-lizynaSigmaL5501
MEM aminokwasy endogenneGibco11140050
mFreSRStemCell Technologies5854Pożywka do kriokonserwacji bez surowicy przeznaczona do kriokonserwacji ludzkich embrionalnych i indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych
N2Gibco17502048
NaClSigma71376
Neurobasal MediumGibco21103049
Nunc 384-well Polistyren Białe mikropłytkiThermo164610
PBSThermo10010-049
Poli-L-lizynaSigmaP5899-5MG
ProLong Gold Antifade MountantThermoP10144
Kwas retinowySigmaR2625
Azydek soduSigmaS2002
StemPro AccutaseGibcoA1110501Odczynnik do dysocjacji komórek zawierający enzymy proteolityczne i kolagenolityczne
SynaptophysinThermoMA5-14532
Tris BaseSigma10708976001
Triton X-100SigmaPłyta X100-100ML
17504001

Bibliografia

  1. Sherman, S. P., Bang, A. G. High-throughput screen for compounds that modulate neurite growth of human induced pluripotent stem cell-derived neurons. Disease Models & Mechanisms. 11 (2), (2018).
  2. Al-Ali, H., Beckerman, S. R., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. In vitro models of axon regeneration. Experimental Neurology. 287, 423-434 (2017).
  3. Kudo, T., et al. Induction of neurite outgrowth in PC12 cells treated with temperature-controlled repeated thermal stimulation. PloS One. 10 (4), 0124024(2015).
  4. Higgins, S., Lee, J. S., Ha, L., Lim, J. Y. Inducing neurite outgrowth by mechanical cell stretch. BioResearch Open Access. 2 (3), 212-216 (2013).
  5. Muramatsu, R., Ueno, M., Yamashita, T. Intrinsic regenerative mechanisms of central nervous system neurons. Bioscience Trends. 3 (5), (2009).
  6. Read, D. E., Herbert, K. R., Gorman, A. M. Heat shock enhances NGF-induced neurite elongation which is not mediated by Hsp25 in PC12 cells. Brain Research. 1221, 14-23 (2008).
  7. Finan, G. M., et al. Bioactive Compound Screen for Pharmacological Enhancers of Apolipoprotein E in Primary Human Astrocytes. Cell Chemical Biology. 23 (12), 1526-1538 (2016).
  8. Magistri, M., et al. A comparative transcriptomic analysis of astrocytes differentiation from human neural progenitor cells. European Journal of Neuroscience. 44 (10), 2858-2870 (2016).
  9. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Research. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  10. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Neurobehavioural effects of developmental toxicity. The Lancet Neurology. 13 (3), 330-338 (2014).
  11. Finkbeiner, S., Frumkin, M., Kassner, P. D. Cell-based screening: extracting meaning from complex data. Neuron. 86 (1), 160-174 (2015).
  12. An, W. F., Tolliday, N. Cell-based assays for high-throughput screening. Molecular Biotechnology. 45 (2), 180-186 (2010).
  13. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & Therapeutics. 134 (1), 82-106 (2012).
  14. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507(2011).
  15. Ryan, K. R., et al. Neurite outgrowth in human induced pluripotent stem cell-derived neurons as a high-throughput screen for developmental neurotoxicity or neurotoxicity. Neurotoxicology. 53, 271-281 (2016).
  16. Magistri, M., Velmeshev, D., Makhmutova, M., Faghihi, M. A. Transcriptomics profiling of Alzheimer's disease reveal neurovascular defects, altered amyloid-β homeostasis, and deregulated expression of long noncoding RNAs. Journal of Alzheimer's Disease. 48 (3), 647-665 (2015).
  17. Darbinyan, A., Kaminski, R., White, M. K., Darbinian, N., Khalili, K. Isolation and propagation of primary human and rodent embryonic neural progenitor cells and cortical neurons. Neuronal Cell Culture. , 45-54 (2013).
  18. Gil-Perotín, S., et al. Adult neural stem cells from the subventricular zone: a review of the neurosphere assay. The Anatomical Record. 296 (9), 1435-1452 (2013).
  19. Ebert, A. D., McMillan, E. L., Svendsen, C. N. Isolating, expanding, and infecting human and rodent fetal neural progenitor cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 6 (1), 2(2008).
  20. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676(2012).
  21. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43 (1), 25-30 (2007).
  22. Bagheri, A., et al. HDAC Inhibitors Induce BDNF Expression and Promote Neurite Outgrowth in Human Neural Progenitor Cells-Derived Neurons. International Journal of Molecular Sciences. 20 (5), 1109(2019).
  23. Sartor, G. C., et al. Enhancement of BDNF expression and memory by HDAC inhibition requires BET bromodomain reader proteins. Journal of Neuroscience. 39 (4), 612-626 (2019).
  24. Conde, C., Cáceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nature Reviews Neuroscience. 10 (5), 319(2009).
  25. Schmitz, S. K., et al. Automated analysis of neuronal morphology, synapse number and synaptic recruitment. Journal of Neuroscience Methods. 195 (2), 185-193 (2011).
  26. Grandjean, P., Landrigan, P. J. Developmental neurotoxicity of industrial chemicals. The Lancet. 368 (9553), 2167-2178 (2006).
  27. Dragunow, M. The adult human brain in preclinical drug development. Nature reviews Drug Discovery. 7 (8), 659(2008).
  28. Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: the promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
  29. Pan, C., Kumar, C., Bohl, S., Klingmueller, U., Mann, M. Comparative proteomic phenotyping of cell lines and primary cells to assess preservation of cell type-specific functions. Molecular & Cellular Proteomics. 8 (3), 443-450 (2009).
  30. Alge, C. S., Hauck, S. M., Priglinger, S. G., Kampik, A., Ueffing, M. Differential protein profiling of primary versus immortalized human RPE cells identifies expression patterns associated with cytoskeletal remodeling and cell survival. Journal of Proteome Research. 5 (4), 862-878 (2006).
  31. Yeo, Y., et al. Human Embryonic Stem Cell-Derived Neural Lineages as In Vitro Models for Screening the Neuroprotective Properties of Lignosus rhinocerus (Cooke) Ryvarden. BioMed Research International. 2019, (2019).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Przeglądaj więcej artykułów

Ludzkie komórki progenitorowe neuronówanaliza morfologii neuronówlokalizacja białek synaptycznychtest żywotności komórekpomiar intensywności fluorescencjiprotokół powlekania płytekmetoda przesiewowa związkówinkubacja w pośrodku różnicującym
Test wzrostu neurytów i ocena neurotoksyczności z ludzkimi neuronami pochodzącymi z neuronów progenitorowych
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.