Artykuł metodologiczny

Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

6.3K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61027

⸱

9 maja 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh, 2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh, 3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

W tym artykule

Informacja o sprostowaniu

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Podsumowanie

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

Interakcja między białkami wiążącymi RNA (RBP) a ich substratami RNA wykazuje płynność i złożoność. W ciągu swojego życia pojedynczy RNA może być związany przez wiele różnych RBP, które będą regulować jego produkcję, stabilność, aktywność i degradację. W związku z tym zrobiono wiele, aby zrozumieć dynamikę, która istnieje między tymi dwoma typami cząsteczek. Szczególnie ważny przełom nastąpił wraz z pojawieniem się "cross-l inking and immunoprecipitation" (CLIP). Technika ta pozwoliła na rygorystyczne badanie, które RNA są związane przez określony RBP. Krótko mówiąc, interesujące białko jest sieciowane promieniami UV z jego substratami RNA in vivo, oczyszczane w bardzo rygorystycznych warunkach, a następnie RNA kowalencyjnie usieciowane z białkiem są przekształcane w biblioteki cDNA i sekwencjonowane. Od momentu powstania opracowano wiele technik pochodnych, aby CLIP był podatny na poszczególne kierunki nauki. Jednak sieciowanie za pomocą światła ultrafioletowego jest notorycznie nieefektywne. Powoduje to wydłużenie czasu ekspozycji, które uniemożliwia czasowe badanie interakcji RBP-RNA. Aby przezwyciężyć ten problem, niedawno zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy znacznie ulepszone urządzenia do naświetlania promieniowaniem UV i zbierania komórek. Korzystając z tych nowych narzędzi, opracowaliśmy protokół czasowo-rozdzielczych analiz interakcji RBP-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (χCRAC). Niedawno wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania roli drożdżowych RBP w adaptacji stresu pokarmowego. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy przegląd metody χCRAC i przedstawia najnowsze wyniki uzyskane za pomocą Nrd1 RBP.

Wprowadzenie

RNA często polegają na RBP, aby pełnić swoją funkcję, co doprowadziło do dużego zainteresowania zrozumieniem dynamiki między tymi cząsteczkami. Wiele RBP zidentyfikowano w wielu różnych organizmach. Jednak badanie interakcji RBP-RNA in vivo zawsze było niezwykle trudne. Duży przełom w badaniu takich interakcji nastąpił wraz z pojawieniem się CLIP1. Metoda ta wykorzystuje promieniowanie ultrafioletowe (UV, 254 nm) do indukowania wiązań kowalencyjnych między RBP a ich bezpośrednio związanymi RNA (tj. sieciowanie na zerową odległość). Następnie RBP będący przedmiotem zainteresowania jest oczyszczany immunologicznie w rygorystycznych warunkach, aby zapewnić, że identyfikowane są tylko RNA walencyjnie usieciowane z białkami. Związane RNA są następnie częściowo trawione przez RNazy, a następnie przekształcane w biblioteki cDNA w celu sekwencjonowania. Wysoka rygorystyczność oczyszczania jest ważna, ponieważ znacznie zwiększa specyficzność odzyskiwania białek i RNA, która jest również dodatkowo wzmacniana przez oczyszczanie SDS-PAGE z usieciowanego kompleksu rybonukleoproteiny (RNP). CLIP i pokrewne metody zapewniają również wgląd w rozdzielczość nukleotydów w miejscu wiązania białka, ponieważ podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania aminokwasy, które usieciowały RNA, często przerywają odwrotną transkryptazę lub powodują, że enzym wprowadza mutacje w tym miejscu1,2,3.

Od momentu wprowadzenia, oryginalny protokół CLIP stworzył niezwykłą różnorodność metodologii pochodnych. Szczególnie ważnym przełomem było opracowanie HITS-CLIP (lub CLIP-seq), które łączy sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości z podejściem CLIP3. Od tego czasu zostało to przyjęte we wszystkich metodologiach opartych na CLIP. W ramach projektu iCLIP wprowadzono ulepszenia w technikach przycinania i ligacji adaptorowej za pośrednictwem RNazy, które ułatwiają dokładniejsze mapowanie miejsc wiązania RBP4. W ramach projektu PAR-CLIP połączono znakowanie 4tio-urydyny/uracylu z sieciowaniem w odległości 365 nm, co umożliwiło mapowanie miejsc sieciowania poprzez analizę podstawień T-C5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP i uvCLAP wprowadziły warunki denaturacji i etapy oczyszczania o podwójnym powinowactwie, które jeszcze bardziej zmniejszają wiązanie tła z żywicą powinowactwa i dodatkowo zwiększają swoistość wychwytywania białek2,6,7,8,9. Ponadto w ramach projektów CRAC, uvCLAP i dCLIP wprowadzono znakowanie RBP będącego przedmiotem zainteresowania znacznikiem powinowactwa, eliminując w ten sposób potrzebę generowania specyficznych przeciwciał.

Dokonano również kilku optymalizacji w celu przyspieszenia metodologii CLIP. Oryginalny protokół CLIP wykorzystywał znakowanie radioaktywne wychwyconych RNA w celu wizualizacji kompleksów RBP-RNA po SDS-PAGE. Jednak stosowanie promieniotwórczości może być problematyczne dla laboratoriów, które nie są przystosowane do takiej pracy. irCLIP zawiera adapter sprzężony z fluoroforem, który ułatwia wizualizację poprzez obrazowanie w podczerwieni10, a sCLIP wykorzystuje biotynylację wychwyconych RNA w celu ich wizualizacji za pomocą sprzężonej ze streptawidyną HRP11. Co więcej, eCLIP całkowicie rezygnuje z znakowania RNA; Zamiast tego białko jest wycinane wyłącznie na podstawie znanego rozmiaru12. Oczyszczanie oparte na streptawidynie zostało również wykorzystane do przyspieszenia procesu przygotowania biblioteki w FAST-iCLIP, gdzie biotynylowany adapter 3' jest ligowany na RNA i używany do umożliwienia oczyszczania po odwrotnej transkrypcji i cyrkularyzacji13. Dodatkowe ulepszenia protokołu iCLIP również znacznie zwiększyły złożoność bibliotek4.

Na koniec, CLIP został zmodyfikowany, aby umożliwić przechwytywanie RBP z różnych podprzedziałów komórkowych14,15, do wizualizacji nowo transkrybowanych RNA za pomocą pulsacyjnej indukcji fotoaktywowanych rybonukleozydów5,16,17, aby wychwycić metylowane RNAs18,19,20, do badania interakcji RNA-RNA21,22, oraz do mapowania 3' ends23,24.

Pomimo ogromnego wkładu technik opartych na CLIP w naszym zrozumieniu interakcji między RBP i RNA, zostało to ograniczone przez nieefektywność sieciowania UV. Chociaż komórki hodowlane hodowane w monowarstwie są na ogół stosunkowo łatwe do sieciowania, jest to znacznie trudniejsze w tkankach lub komórkach w roztworze. Tkanki mogą wymagać wielu rund ekspozycji na promieniowanie UV, aby przeniknąć do wymaganych warstw komórkowych, podczas gdy komórki drobnoustrojów są często hodowane w bogatych pożywkach, które zawierają aromatyczne związki pochłaniające promieniowanie UV25. Rzeczywiście, czasy naświetlania promieniami UV do 30 minut zostały wykorzystane do wygenerowania wystarczającego usieciowania między RBP a związanymi z nimi RNA dla takich próbek26,27,28. Ta przedłużona ekspozycja na promieniowanie UV wywołuje reakcje stresowe w komórce, takie jak uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem UV, które mogą zanieczyścić dane końcowe w niektórych zastosowaniach.

Większość badań CLIP skupia się na generowaniu pojedynczych "migawek" specyficznych interakcji białko-RNA w komórce. Jednak interakcje białko-RNA są z natury dynamiczne, szczególnie gdy komórki podlegają zmianom w swoim środowisku. Może to obejmować nagłe zmniejszenie dostępności niezbędnych składników odżywczych lub gwałtowne zmiany temperatury. W związku z tym, aby w pełni zrozumieć rolę RBP podczas stresu, najlepiej jest przeprowadzić analizy czasowo-rozdzielcze, ponieważ mogą one uchwycić pełne spektrum celów RBP podczas stresu i określić, na jakim etapie reakcji na stres wybrany RBP jest aktywny. W szczególności badania na drożdżach wykazały, że pierwsze kilka minut adaptacji jest absolutnie kluczowe dla przetrwania, a okres półtrwania RNA u bakterii może wahać się od minut do sekund29,30,31,32,33. Dlatego najlepiej byłoby, gdyby takie analizy czasowo-rozdzielcze były wykonywane w wysokiej rozdzielczości czasowej. Jednak długi czas sieciowania sprawia, że badanie reakcji adaptacyjnych na wczesnym etapie jest szczególnie trudne.

Aby przezwyciężyć te problemy, niedawno opracowaliśmy ulepszoną metodę, która jest w stanie sieciować i zbierać komórki w minutowych skalach czasowych. Nasza metoda χCRAC pozwala na ilościowy pomiar dynamicznych zmian w oddziaływaniach RBP-RNA w nieobserwowanej wcześniej rozdzielczości. Kluczowe znaczenie dla tej metody miało opracowanie nowatorskiego urządzenia do naświetlania promieniami UV32, które około 10-krotnie skraca wymagany czas sieciowania drożdży i bakterii w roztworze, skutecznie zamrażając interakcje RBP-RNA. Ponadto, w celu szybkiego zebrania komórek po naświetlaniu promieniami UV, opracowaliśmy urządzenie do filtracji próżniowej, które może zbierać gwałtownie rosnące drożdże w kulturze o pojemności 0,5 l w około 30 s32. Te innowacje technologiczne pozwalają na badanie dynamiki RBP-RNA w rozdzielczości minutowej. Dodatkowo wprowadziliśmy również kilka optymalizacji do oryginalnego protokołu CRAC2 w celu zwiększenia jego praktyczności.

Korzystając z χCRAC, niedawno badaliśmy cel drożdżowego jądrowego RBP, Nab3, w odpowiedzi na niedobór glukozy. U Saccharomyces cerevisiae Nab3 może tworzyć kompleks z Nrd1, RBP i helikazą RNA Sen1, tworząc kompleks NNS. Wiązanie NNS z polimerazą RNA i powstającym transkryptem może wywołać terminację transkrypcji34. Kompleks ten jest głównie zaangażowany w usuwanie tajemniczych niekodujących transkryptów RNA, ale wykazano również, że reguluje ekspresję genów kodujących białka. Badanie wykazało zróżnicowane ukierunkowanie Nab3 na transkrypty niekodujące i kodujące już po minucie stresu32. Wykazaliśmy, że kotranskrypcyjna terminacja przez Nab3 powoduje bardzo przejściową, pulsacyjną ekspresję genów retrotranspozonów, która byłaby trudna do wykrycia przy użyciu tradycyjnych podejść opartych na CLIP. Dodatkowo, krótkie czasy naświetlania promieniami UV w naszym sieciowniku UV również znacznie zwiększyły odzysk krótkożyciowych niekodujących RNAs32. χCRAC będzie prawdopodobnie kluczowym narzędziem w wyjaśnianiu nie tylko, w jaki sposób RBP kształtują reakcję na stres w bezpośrednich skalach czasowych, ale także ich zmieniających się ról w całym cyklu życia odpowiedzi. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy przegląd wszystkich etapów protokołu χCRAC. W celach ilustracyjnych metoda ta została wykorzystana do zbadania drożdżowego białka Nrd1, które bierze udział w terminacji transkrypcji i rozpadzie RNA35,36, oraz jego docelowego RNA w odpowiedzi na deprywację glukozy w wielu punktach czasowych. Na koniec wykazaliśmy również, że nasze urządzenie do naświetlania promieniami UV może szybko sieciować RBP z RNA w komórkach HeLa, umożliwiając również wykonywanie analiz czasowo-rozdzielczych o wysokiej rozdzielczości w komórkach przylegających.

Protokół

TN150
50 mM Tris pH 7,8
150 mM NaCl
0,1% NP-40
1X inhibitor proteazy
TN1000
50 mM Tris pH 7,8
1 mln NaCl
0,1% NP-40
NP-PNK
50 mM Tris-HCl pH 7,8
10 mM MgCl2
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
5 x PNK
250 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM MgCl2
50 mM beta-merkaptoetanolu
WB I
50 mM Tris-HCl pH 7,8
300 mM NaCl
10 mM imidazol
6M guanidyna-HCl
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
Balans bieli II
50 mM Tris-HCl pH 7,8
50 mM NaCl
10 mM imidazol
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
Bufor elucyjny
50 mM Tris pH 7,8
50 mM NaCl
250 mM imidazol
0,1% NP-40
5 mM beta-merkaptoetanol
Bufor proteazy K
50 mM Tris
0,1% NP-40
5 mM β-merkaptoetanolu
1% SDS
5 mM EDTA
50 mM NaCl2
Bufor do lizy ssaków
50 mM Tris-HCl pH 8
100 mM NaCl
0,5% v/v Triton X-100
0,25% w/v Na-deoksycholanu
0,1% w/v SDS
5 mM EDTA
1 mM naziemna telewizja cyfrowa (dodana na świeżo)
1X inhibitor proteazy
powiedział:

Tabela 1: wymagane dla χCRAC i ich składu.

1. Sieciowanie UV i produkcja lizatu

  1. Mikroorganizmy w roztworze
    1. Zaszczepić 3,5 l pożądanej pożywki drożdżami z nocnej kultury do wyjściowego OD600 0,05. Rosnąć w temperaturze 30 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 180 obr./min.
    2. Podczas wzrostu przygotuj inne niezbędne materiały.
      1. Przygotuj pojemnik z ciekłym azotem.
      2. Przygotować 3 l podłoża wywołującego stres i ogrzać do temperatury 30 °C w łaźni wodnej.
      3. Ustaw aparaturę filtrującą, włącz środek sieciujący (Rysunek 2A) i oznacz stożkowe probówki o pojemności 50 ml, po jednej dla każdego punktu czasowego.
    3. Gdy komórki osiągną pożądaną średnicę zewnętrzną600, wlej 500 ml komórek bezpośrednio do środka sieciującego i naświetl UV 250 mJ promieniowania UV o długości fali 254 nm. Zobacz Rysunek 2A i Rysunek 3A, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat korzystania z crosslinkera.
      UWAGA: Energia promieniowania UV musi być starannie zoptymalizowana dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
    4. Po usieciowaniu przefiltruj komórki za pomocą jednego z urządzeń do filtracji próżniowej (Rysunek 2B,C). Zwinąć membranę z przefiltrowanymi komórkami, umieścić w stożkowej probówce t = 0 (czas zero) o pojemności 50 ml i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
    5. Przefiltruj pozostałe komórki przez sześć różnych filtrów. Zebrane komórki należy zawiesić w 3 litrach uprzednio podgrzanej pożywki wywołującej stres, wrzucając błony do pożywki i energicznie mieszając z paskiem przez 50 sekund. Po upływie 50 s przygotować się do pobrania t = 1 próbki.
    6. Po 1 minucie usieciować 500 ml komórek i zebrać przez filtrację, jak w krokach 1.1.3–1.1.4. Powtórz po 2, 4, 8, 14 i 20 minutach lub w różnych punktach czasowych w razie potrzeby.
    7. Przechowywać stożkowe probówki zawierające komórki w temperaturze -80 °C. Ustawić sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C na noc.
    8. Następnego dnia weź każdą stożkową probówkę zawierającą usieciowaną próbkę i ponownie zawieś komórki w 25 ml zimnego PBS, energicznie wstrząsając.
    9. Przenieść zawiesiny komórek do nowych stożkowych probówek i wirować z prędkością 4 600 x g, 5 minut w temperaturze 4 °C.
    10. Odlej PBS, szybko ponownie odwiruj, aby zebrać resztki PBS, a następnie zdekantuj pozostały płyn za pomocą pipety.
    11. Oblicz wagę granulki w tubie, porównując ją z pustą tubą.
    12. Dodaj dwie objętości osadów lodowatego TN150, 60 μl DNazy 1 i 10 μl inhibitora RNazy. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
      1. Na przykład na 400 mg komórek dodaj 800 μl lodowatego TN150.
      2. Dodanie DNazy nie jest niezbędne dla większości rozpuszczalnych białek, ale jest bardzo ważne podczas badania białek związanych z chromatyną, takich jak polimeraza RNA. Dodatkowo zmniejsza lepkość lizatów bakteryjnych. Bardzo ważne jest, aby użyć dokładnie dwóch objętości granulek buforu do lizy, w przeciwnym razie wydajność lizy może się zmniejszyć.
    13. Dodać trzy objętości granulek (w ml) kulek cyrkonu do zawiesiny komórek. W przypadku drożdży użyj kulek o średnicy 0,5 mm, a w przypadku bakterii użyj 0,1 mm.
      1. Na przykład w przypadku 400 mg komórek odmierz 1,2 ml kulek cyrkonu w probówce o pojemności 1,5 ml i dodaj je do komórek zawieszonych w buforze do lizy.
    14. Wiruj zawiesiny komórkowe przez 1 minutę, a następnie umieść na lodzie na 1 minutę. Powtórz w sumie 5x.
    15. Dodaj dwie objętości granulek buforu TN150 i energicznie wiruj, aby wymieszać.
    16. Odwirować zawiesinę w stożkowej probówce o masie 4 600 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
      1. Po odwirowaniu należy pobrać próbkę supernatantu o objętości 50 μl do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania ekspresji białek w całej komórce.
    17. Przenieść supernatanty do probówek o pojemności 1,5 ml i wirować lizat przez 20 minut w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C, w mikrofugach.
      1. Alternatywnie, jeśli używasz probówek o pojemności 5 ml, odwiruj przy 13 000 x g przez 20 minut.
      2. Po odwirowaniu należy pobrać próbkę supernatantu o objętości 50 μl do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania rozpuszczalnej ekspresji białka.
    18. Przejdź do wychwytywania RBP (sekcja 2).
  2. Hodowane komórki adherentne
    1. Zasiej wystarczającą ilość przylegających komórek na szalce Petriego na 24 godziny przed sieciowaniem UV, aby następnego dnia mogły osiągnąć 80% zbieżności. Uprawiać przez noc w żądanym podłożu w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO2,
      UWAGA: W przypadku stosowania kwarcowych szalek Petriego korzystne jest promowanie adhezji komórek poprzez traktowanie naczyń poli-D-lizyną (70 000–140 000 wag.) i płodową surowicą cielęcą (FCS) na 2,5 godziny przed siewem. Dodaj tyle poli-D-lizyny, aby pokryć całą powierzchnię wzrostu i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Następnie kwarcową szalkę Petriego należy dokładnie spłukać wodą i suszyć w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2 godziny lub do całkowitego wyschnięcia. Następnie dodaj tyle FCS, aby całkowicie pokryć powierzchnię wzrostu i umieść w inkubatorze na co najmniej 30 minut. FCS powinien zostać całkowicie usunięty przed wysiewem komórek.
    2. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, usuń pożywkę i przemyj 15 ml lodowatego PBS. Następnie całkowicie usuń cały pozostały płyn i natychmiast przejdź do następnego kroku.
    3. Przenieś szalkę Petriego na tackę na przylegające komórki (Rysunek 3B) i naświetlaj promieniowaniem UV 300 mJ o długości fali 254 nm UV. Zobacz Rysunek 2A i Rysunek 3B, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat korzystania z crosslinkera.
      UWAGA: Energia promieniowania UV musi być starannie zoptymalizowana dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
    4. Natychmiast po usieciowaniu umieść szalkę Petriego na lodzie i dodaj 10 ml lodowatego PBS. Zebrać komórki, zeskrobując je i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Osad przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
    5. Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Ponownie osadzać komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
    6. Wyjmij PBS i zatrzaskowo zamroź granulki komórek na suchym lodzie. Przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
    7. Powtórz kroki 1.2.3–1.2.6 dla każdego punktu czasowego.
    8. Ponownie zawiesić granulki komórek w 1 ml buforu do lizy i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie dodaj 1 ml buforu do lizy, co daje w sumie 2 ml.
    9. Dodać 5 μl inhibitora RNazy ssaków.
    10. Sonikuj 5x przez 10 s na lodzie przy 10 amperach. Odczekaj 30 s między rundami sonikacji.
    11. Obliczyć stężenie białka w każdej próbce i znormalizować do najniższego stężenia.
    12. Przenieś 1,98 ml lizatu do probówki o pojemności 2 ml.
    13. Dodać 10 μl DNazy I i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut z wytrząsaniem przy 1 200 obr./min.
    14. Odwirować lizat przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
      1. Po odwirowaniu należy pobrać 50 μl próbki supernatantu do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania rozpuszczalnej ekspresji białka.
    15. Przejdź do wychwytywania RBP (sekcja 2).

2. Przechwytywanie RBP

  1. Przemyć magnetyczne kulki anty-FLAG (75 μl gnojowicy na próbkę) lub agarozy IgG (500 μl gnojowicy na próbkę) 3x za pomocą 5 ml TN150. Zawiesić w końcowej objętości 700 μl TN150 i dodać 100 μl umytych kulek do siedmiu stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
    1. Przechowywać na lodzie do czasu, aż będzie to wymagane.
  2. Po sklarowaniu lizatów dodać supernatant do probówki zawierającej kulki anty-FLAG/IgG.
  3. Nutian w temperaturze 4 °C przez 2 h.
    UWAGA: Niektóre protokoły opisują nocne inkubacje z kulkami, ale nie jest to zalecane, ponieważ długi czas inkubacji może znacznie zmniejszyć odzyskiwanie usieciowanych RNA.

3. Mycie koralików i dekoltu TEV

  1. Zbierz koraliki i usuń lizat.
    1. Pobrać 50 μl próbki supernatantu do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania niewychwyconego białka.
  2. Ponownie zawiesić kulki w lodowatym TN1000 i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Prać przez 10 min, w temperaturze 4 °C, z nutacją. Powtórz w sumie trzy prania.
    1. Jeśli używasz kulek agarozy IgG, przemyj 5 ml TN1000. Jeśli używasz koralików anty-FLAG, użyj 2 ml.
  3. Następnie umyj koraliki 3x za pomocą TN150, o tej samej objętości co powyżej.
  4. Po trzecim praniu ponownie zawieś kulki w 600 μl TN150.
  5. Dodaj 30 U domowej roboty proteazy GST-TEV do zawiesiny koralików i obracaj przez 2 godziny w temperaturze RT.
    UWAGA: Rekombinowana proteaza GST-TEV jest obecnie również dostępna na rynku, ale nie została przetestowana przy użyciu tego protokołu.
    1. Podczas trawienia przygotuj się do kolejnych kroków, ustawiając kolumny po trzy probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki (tj. dla siedmiu próbek powinny mieć trzy rzędy po siedem kolumn).
    2. Do ostatniego rzędu probówek dodać 0,4 g chlorowodorku guanidu, 27 μl 5M chlorku sodu i 3 μl 2,5 M imidazolu (pH = 8). Należy pamiętać, że pH imidazolu musi wynosić 8. Ma to kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności RNA.
    3. Dodatkowo umyć wymaganą objętość kulek niklowych w WB I 3x. Użyć 100 μl gnojowicy na próbkę. Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić kulki w tej samej pierwotnej objętości WB I i przechowywać na lodzie.
  6. Po zakończeniu trawienia TEV zebrać supernatant za pomocą stojaka magnetycznego do kulek anty-FLAG lub odwirowania do kulek IgG i przenieść do pierwszego rzędu wcześniej ustawionych probówek.
    1. Pobrać 50 μl próbki eluatu TEV do analizy Western blot.
  7. Ustawić inkubator z termoblokiem na 37 °C. Do drugiego rzędu probówek dodać 1 μl koktajlu RNazy (rozcieńczenie 1:50).
  8. Pobrać 550 μl eluatu TEV z pierwszego rzędu probówek i dodać do drugiego rzędu (zawierającego koktajl RNazy). Energicznie pipetować, aby zapewnić mieszanie.
  9. Po wykonaniu tej czynności dla pierwszej próbki natychmiast umieść rurkę w termobloku i uruchom timer. Przejdź do kolejnych próbek, tak aby każda z nich była rozłożona w czasie.
  10. Inkubować dokładnie przez 5 minut. Po zakończeniu wyjąć pierwszą próbkę z termobloku i przenieść roztwór do trzeciego rzędu probówek (zawierających proszek chlorowodorku guanidu).
    UWAGA: 5-minutowa inkubacja z rozcieńczeniem koktajlu RNazy w stosunku 1:50 jest zwykle odpowiednia dla większości białek, ale ten krok będzie musiał być starannie zoptymalizowany z różnymi czasami inkubacji lub stężeniami dla każdego białka, aby upewnić się, że usieciowane RNA mają odpowiednią wielkość (30-100 nt).
  11. Natychmiast wirować przez kilka sekund z pełną prędkością, aby rozpuścić proszek guanidu, a następnie przejść do następnej próbki.
  12. Po przeniesieniu wszystkich próbek do proszku guanidu, ponownie przeprowadź wirowanie, aby upewnić się, że cały proszek jest całkowicie rozpuszczony.
  13. Dodać 100 μl umytych kulek niklowych i obracać przez noc w temperaturze 4 °C. Inkubację tę można skrócić do 2 godzin.

4. Leczenie fosfatazą alkaliczną na koralikach

  1. Ustawić termoblok na 37 °C.
  2. Umieścić wirową kolumnę oczyszczającą w probówce o pojemności 2 ml, po jednej na każdą próbkę. Przenieść kulki niklu do kolumn i pozwolić supernatantowi spłynąć. Następnie upewnij się, że wszystkie kulki niklu zostały usunięte z probówki o pojemności 1.5 ml, spłukując WB I i nakładając na kolumnę.
  3. Ustaw probówki o pojemności 2 ml, po sześć na próbkę (jedna do zbierania każdego prania). Utrzymuj zewnętrzną część kolumn w suchości, aby utrzymać przepływ. Umyj kulki 3x 500 μL WB I, a następnie 3x 500 μL NP-PNK.
  4. Zamknij pokrywę kolumny wirującej i krótko zakręć koralikami, aby usunąć nadmiar bufora.
  5. Umieścić korek na kolumnie, umieścić kolumny w probówkach o pojemności 1,5 ml i dodać 60 μl mieszaniny reakcyjnej widocznej w tabeli 2.
Rozdział
składnik1x7,5-krotnie
5 x bufor PNK1290
Fosfataza alkaliczna4Rozdział 30
Inhibitor RNazycyfra arabska15
H2O42 Rozdział 42Rozdział 315
Ostatni tom60 μL450 μL

Tabela 2: Mieszanina reakcji fosfatazy alkalicznej.

  1. Inkubować koraliki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
  2. Przemyć kulki 1x 500 μl WB I w celu inaktywacji fosfatazy alkalicznej, a następnie 3x 500 μl buforu NP-PNK. Upewnij się, że dokładnie przepłukałeś wnętrze kolumny buforem NP-PNK, aby usunąć wszelkie ślady guanidu.

5. Ligacja na koraliku łącznika App-PE do końca 3' RNA

  1. Odwirować pozostały bufor i dodać 60 μl mieszaniny określonej w tabeli 3 (zob. tabela 4 dla sekwencji App-PE) do kolumn. Inkubować reakcję przez 6 godzin w temperaturze 25 °C.
Rozdział pkt. Rozdział pkt. TGL
składnik1x7,5-krotnie
5 x bufor PNK1290
Adapter App-PE (100 μM)0,6Rozdział 4.5
Ligaza RNA T4 2 obcięta K227Q322,5
Inhibitor RNazy1,5Godzina 11.25
50% PEG 80001290
H2O30,9231,75
Ostatni tom60 μL450 μL

Tabela 3: Mieszanina reakcji ligacji łącznika App-PE.

powiedział:
Nazwa oligonukleotyduSekwencja (5'-3')
L5AainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrUrCrCrUrUrNrNrNrUrArArGrCrN-OH
L5AbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrUrUrCrCrArUrUrNrNrArUrUrArGrCrN-OH
L5AcinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrCrUrUrNrNrNrGrCrCrGrCrArGrN-OH
L5Ad (Reklama L5)invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrUrUrCrUrCrRNrNrCrGrGrCrGrUrUrArGrN-OH
L5BainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrGrArUrUrUrUrNrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5BBinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrGrArUrCrUrUrRNrNrGrUrGrArGrN-OH
L5BC (Prowincja L5BC)invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrNrCrArGrN-OH
L5Bd powiedział:invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrUrUrCrUrUrNrNrUrUrCrUrUrArGrN-OH
L5CainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrGrArUrUrUrNrNrCrUrRNrCrNr-OH
L5CbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrCrUrRrNrNrUrGrGrArGrCrN-OH
L5CcinvddT-ACACrGrArCrGrGrUrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrNrArCrUrUrCrArGrCrN-OH
L5CdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrNrNrGrArCrCrUrArGrN-OH
L5DainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrCrUrRNrNrCrGrGrGrArUrN-OH
L5DbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrArUrCrUrRNrNrGrCrArCrUrArN-OH
L5Dc (Prąd Całkowity)invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrGrArUrUrUrRrNrNrUrArGrGrCrN-OH
L5DdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrUrUrNrNrNrArUrCrArCrArGrN-OH
L5EainvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrCrRrNrCrArCrUrGrUrN-OH
L5EbinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrCrUrUrRNrNrGrUrGrArCrArN-OH
L5EcinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrCrUrUrNrNrNrUrGrUrCrArCrN-OH
L5EdinvddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrNrArCrArGrGrN-OH
App_PEApp-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

Tabela 4: Sekwencje adapterów DNA i RNA wymagane do ligacji na końcach 5' i 3' przechwyconych RNA. Zostały one oczyszczone za pomocą HPLC wolnej od RNaz.

  1. Kulki płuczące przemywać 1x 500 μL WB I i 3x 500 μL buforu NP-PNK. Umieść kolumnę w nowej rurce i odkręć pozostały bufor
    2. .

6. Fosforylacja na koralikach końców 5' RNA

  1. Dodać 80 μl mieszaniny określonej w tabeli 5 do kolumn. Inkubować reakcję przez 40 minut w temperaturze 37 °C.
    UWAGA: Próbki będą teraz wysoce radioaktywne. W związku z tym wszystkie późniejsze prace powinny być wykonywane za osłoną ochronną, a odpady należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami BHP.
szt. pkt. pkt.
składnik1x7,5-krotnie
5 x bufor PNK16120
32P-ɣATP (10 μCi/μL)322,5
T4 PNK322,5
H2ORozdział 58Z numerem 435
Ostatni tom80 μL600 μL

Tabela 5: Mieszanina reakcji fosforylacji.

  1. Dodać 1 μl 100 mM ATP i pozostawić reakcję na kolejne 20 minut. Zapewni to, że prawie wszystkie końce 5' będą zawierały fosforany, aby ułatwić ligację łącznika 5'.
  2. Ustaw probówki o pojemności 2 ml, po pięć na próbkę.
  3. Kulki płuczące przemywać 1x 500 μL WB I i 3x 500 μL buforu NP-PNK. Należy pamiętać, że te uwolnienia będą bardzo radioaktywne i dlatego należy je odpowiednio zutylizować.
  4. Przenieś kolumnę do ostatniej rurki i odkręć pozostały bufor.

7. Podwiązanie na koraliku łącznika 5'

UWAGA: Łączniki 5' zawierają kod kreskowy RNA, który jest używany do identyfikacji każdej próbki po sekwencjonowaniu. Dlatego absolutnie ważne jest, aby zanotować, który łącznik jest używany dla której próbki.

  1. Dodać 78 μl mieszaniny opisanej w tabeli 6 do kolumn. Dodać 2 μl adaptera 5' (100 μM; patrz tabela 4) do każdej probówki i inkubować przez noc w temperaturze 18 °C.
szt. Rozdział .
składnik1x7,5-krotnie
5 x bufor PNK16120
ATP (10 mM)860
Inhibitor RNazycyfra arabska15
Ligaza RNA T44Rozdział 30
H2ORozdział 48360 pkt
Ostatni tom78 μL585 μL

Tabela 6: 5' mieszanina reakcji ligacji łącznika.

  1. Następnego dnia przemyj kulki 1x 500 μl WB I i 3x 500 μl WB II i przenieś kolumny do nowej probówki o pojemności 2 ml.

8. Elucja, SDS-PAGE i ekstrakcja RNA

  1. Ustawić wirówkę na 4 °C. Przygotować dwa rzędy probówek o pojemności 1,5 ml na próbkę do elucji.
  2. Szybko odkręć pustą objętość kolumn za pomocą kulek niklowych. Umieścić kolumny w pierwszym rzędzie probówek elucyjnych i dodać 200 μl buforu elucyjnego. Odczekaj 2 minuty, a następnie przepchnij bufor przez kolumnę szybkim obróceniem.
  3. Przenieś kolumny do drugiego rzędu rur i powtórz krok 8.2. Każda próbka będzie teraz miała łącznie 400 μl eluatu, podzielonych na dwie probówki o pojemności 1,5 ml.
    1. Weź wszystkie eluaty i przenieś je razem do probówki o pojemności 5 ml. Dodać 2 μl 20 mg/ml glikogenu. Tak więc, jeśli użyjemy siedmiu próbek, w probówce o pojemności 5 ml będzie teraz 2,8 ml zbiorczego eluatu.
  4. Dodać 100 μl kwasu trichlorooctowego (TCA) na próbkę [np. 700 μl TCA na 7 próbek (2,8 ml zbiorczego eluatu)] do probówki o pojemności 5 ml i dobrze wirować przez 30 s.
  5. Inkubować na lodzie przez 20 minut.
  6. Wirować przez 30 minut w temperaturze 17 000 x g, 4 °C, w wirówce stołowej.
  7. Ostrożnie usunąć supernatant z rurki stożkowej, sprawdzając pipetę za pomocą licznika Geigera, aby upewnić się, że osad nie został przypadkowo usunięty. Jeśli tak, umieść supernatant z powrotem w probówce i odwiruj przez kolejne 10 minut.
    UWAGA: Supernatant może być nadal wysoce radioaktywny. Upewnij się, że używasz odpowiedniego ekranowania.
  8. Całkowicie zawiesić osad w 2 ml lodowatego acetonu.
  9. Wirować przez 15 minut w temperaturze 17 000 x g, 4 °C.
  10. Usuń jak najwięcej acetonu za pomocą pipety P1000. Następnie krótko zakręć probówką, aby zebrać małe kropelki acetonu, a następnie usuń za pomocą pipety P10. Suszyć przez 2 minuty w dygestorium.
    UWAGA: Supernatant acetonu może być nadal radioaktywny. Upewnij się, że używasz odpowiedniego ekranowania.
  11. Zawiesić próbkę w 30 μl 1x buforu ładującego białko. Aby upewnić się, że osad jest prawidłowo zawieszony, należy sprawdzić, czy zdecydowana większość radioaktywności jest teraz obecna w buforze ładującym i nie pozostała w probówce o pojemności 1,5 ml, usuwając roztwór z pipety P200 i mierząc aktywność pozostałą w probówce 1,5 ml za pomocą licznika Geigera.
  12. Podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 °C. Załadować prefabrykowany żel Bis-Tris o średnicy 1 mm i 4–12% i pracować przez 1,5 godziny przy napięciu 125 V w buforze MOPS.
  13. Po zakończeniu działania żelu otwórz kasetę z żelem. Żel powinien być zatrzymany na dolnej płycie. Wyrzuć górę.
  14. Owiń żel folią spożywczą, a następnie przymocuj go taśmą do wnętrza światłoszczelnej kasety. Upewnij się, że kaseta ma amplifier ekran poprawiający sygnał.
  15. Naświetlić film autoradiograficzny żelem i przechowywać kasetę w temperaturze -80 °C podczas naświetlania. Czas ekspozycji będzie się różnił w zależności od białek o różnej skuteczności sieciowania.
    1. Podczas umieszczania filmu musi istnieć sposób na ponowne wyrównanie go do kasety, aby w kolejnym kroku wyciąć interesujące nas pasmo. Aby to zapewnić, użyj fluorescencyjnej linijki, a także upewnij się, że żel znajduje się w rogu kasety, która jest następnie pokryta folią również umieszczoną w najwyższym rogu.
      UWAGA: Z reguły eluaty w buforze ładowania, które dają odczyt co najmniej ~250 cps, gdy są wyświetlane na liczniku Geigera, dają wystarczający sygnał na ekspozycję trwającą 3 godziny. W przeciwnym razie przeprowadzana jest nocna ekspozycja.
  16. Wywołaj film. Odetnij folię spożywczą pokrywającą żel, ale nie przesuwaj żelu. W przeciwnym razie obraz zostanie przesunięty w stosunku do gel.
    UWAGA: Żel będzie prawdopodobnie wysoce radioaktywny. Upewnij się, że używasz odpowiedniej osłony podczas wycinania plastra żelu.
  17. Umieść folię na żelu i wytnij interesującą Cię opaskę. Włóż plasterek żelu do probówki o pojemności 2 ml.
  18. Rozbij plasterek żelu za pomocą końcówki pipety P1000 i dodaj 600 μl buforu proteinazy K oraz 200 μg proteinazy K (w tym protokole używa się 10 μl roztworu proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 55 °C, energicznie wstrząsając.
  19. Następnie odetnij koniec końcówki P1000 czystym skalpelem i przenieś kawałki supernatantu i żelu do kolumny wirowej umieszczonej w probówce o pojemności 2 ml.
  20. Obracać kolumnę przez 1 minutę przy 17 000 x g w temperaturze pokojowej. Zebrać przepływ, który zawiera radioaktywne, izolowane RNA.
  21. Przeprowadzić ekstrakcję fenol:chloroform.
    1. Dodać 50 μl 3 M octanu sodu o pH = 5,2 i 500 μl fenolu:chloroform i dobrze odwirować. Wiruj przez 5 minut przy 17 000 x g. Usuń górną warstwę wody i umieść w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 500 μl chloroformu i energicznie wirować przez 10–15 s. Wirować przez 5 minut w temperaturze 17 000 x g w temperaturze pokojowej. Usuń warstwę wodną i umieść w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodaj 1 μl 20 mg/ml glikogenu i 1 ml lodowatego 96% etanolu. Wytrącać przez 30 minut w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
    4. Wirować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, 17 000 x g. Usunąć sklarowany osad, dodać 500 μl 70% etanolu i wirować przez 5 minut, w temperaturze 4 °C przy 17 000 x g. Usuń cały etanol, wykonaj szybkie wirowanie, aby zebrać pozostałości i usuń nadmiar za pomocą pipety P10.
    5. Suszyć pellet przez ~3 minuty w dygestorium. Zawiesić w 20 μl wody uzdatnionej DEPC.
  22. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C przez noc lub natychmiast przejść do etapu odwrotnej transkrypcji.

9. Odwrotna transkrypcja

  1. Dodać 2 μl 10 μM oligo RT (PE_reverse; patrz tabela 7) i 4 μl 5 mM dNTP do 20 μl RNA.
Nazwa oligonukleotyduSekwencja (5'-3')
P5 do przoduAATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC1CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCTCT
Zobacz materiał BC3CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCGATGCTGCTGCTCCCCGATCT
Zobacz materiał BC4CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC5CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTGACTCGTGCTGCTCCCCGATCT
Zobacz materiał BC7CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTGTGCTGCTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC8CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTGTGCTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC9CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGGTGACTGGAGTGTGCTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC10CAAGCAGAAGACGGCATGAGATATCACGGTGACTGGAGTGCTGCTGCTCGTGCTCTCTCTCT
PE_reverseCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

Tabela 7: Startery PCR (w tym sekwencje kodów kreskowych) i starter odwrotnej transkrypcji.

  1. Przenieść do nagrzanego termobloku w temperaturze 85 °C na 3 minuty, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut. Zebrać zawartość probówki przez krótkie odwirowanie, a następnie dodać 8 μl 5x buforu odwrotnej transkryptazy, 2 μl 100 mM DTT i 2 μl inhibitora RNazy.
  2. Inkubować mieszaninę w temperaturze 50 °C przez 3 minuty, a następnie dodać 2 μl odwrotnej transkryptazy i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.
  3. Dezaktywować odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 15 minut.
  4. Przenieść probówki do nagrzanego termobloku w temperaturze 37 °C i pozostawić na 3 minuty w celu aklimatyzacji.
  5. Dodać 2 μl RNazy H i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
  6. Wyizoluj cDNA za pomocą kulek SPRI.
    1. Dodać dwie objętości po 84 μl kulek. Inkubować przez 15 minut. Połóż koraliki na stojaku magnetycznym i pozostaw na 1 minutę, aby zebrać koraliki.
    2. Usunąć i usunąć supernatant oraz dodać 200 μl 70% etanolu. Nie wyjmuj koralików z stojaka magnetycznego. Inkubuj kulki z etanolem przez 30 sekund.
    3. Usuń etanol i powtórz etap mycia. Usuń cały pozostały etanol za pomocą końcówki P10.
    4. Umieść koraliki w dygestorium na 2 minuty, aby je wysuszyć. Wyjmij koraliki ze stojaka, umieść je ponownie w 12 μl wody, a następnie umieść koraliki z powrotem na stojaku. Usunąć 11 μl supernatantu.
  7. Zamrozić cDNA w temperaturze -20 °C lub natychmiast przejść do etapu PCR.

10. Reakcja qPCR

  1. Przed ostatecznym PCR w celu amplifikacji cDNA przeprowadza się ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) w celu określenia optymalnej liczby cykli amplifikacji cDNA, aby zapobiec nadmiernej amplifikacji biblioteki.
  2. Ustawić reakcję qPCR na lodzie zgodnie z tabelą 8. Patrz Tabela 7 dla wszystkich starterów.
składnik1x
2x mastermix reakcji qPCR5
Starter 0,1 μM P5 (do przodu)0,8
Starter 0,1 μM BC (odwrócony)0,8
cDNA (lub woda jako kontrola ujemna)1
H2O2.4
Ostatni tom10 μL

Tabela 8: mieszanina reakcyjna qPCR.

  1. W celu prawidłowego określenia ilościowego cykli potrzebnych do amplifikacji należy użyć trzech kontrprób technicznych dla cDNA i trzech ujemnych (tj. wody) kontroli.
  2. Uszczelnij płytki optycznie przezroczystą folią i uruchom qPCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
  3. Przeanalizuj próbki za pomocą bezwzględnej metody kwantyfikacji, aby określić liczbę cykli (n), w których osiągane jest kolano wykładniczego wzrostu (patrz Rysunek 4C dla przykładu). Ta liczba cykli jest następnie wykorzystywana do ostatecznej amplifikacji reszty cDNA.

11. Reakcja PCR i ekstrakcja żelu

  1. Ustawić reakcję PCR na lodzie zgodnie z tabelą 9. Patrz Tabela 7 dla wszystkich podkładów.
    UWAGA: Używane jest tylko 5 μL biblioteki cDNA.
pkt.
składnik1x
10 x bufor polimerazy z korektą5
Podkład 10 μM P5 (do przodu)1
Starter 10 μM BC (rewers)1
5 mM dNTPRozdział 2.5
Korekta odczytu enzymu polimerazy1
Zawartość cDNA5
H2O34,5
Ostatni tom50 μL

Tabela 9: Mieszanina reakcyjna PCR.

  1. Uruchom PCR w następujący sposób: 95 °C przez 2 minuty; n cykli 98 °C przez 20 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 5 minut. Liczbę (n) cykli amplifikacji biblioteki χCRAC określa się za pomocą qPCR opisanego w sekcji 10.
  2. Dodać 1 μl egzonukleazy I i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
  3. Oczyść amplifikowane cDNA za pomocą kulek SPRI, jak opisano powyżej, używając dwóch objętości kulek (tj. 100 μL). Eluować w 11 μl.
  4. Dodaj 3 μl 6-krotnego barwnika ładującego i pracuj na prefabrykowanym 6% żelu TBE przy 100 V przez 1 godzinę w 1x buforze TBE. Użyj drabiny odpowiedniej do ilościowego oznaczania krótkich fragmentów DNA.
  5. Po zakończeniu wyjmij żel z kasety i umieść go w odpowiednim, szczelnym pojemniku z wystarczającą ilością 1x TBE, aby pokryć żel (np. ~50 ml). Dodaj odpowiednią ilość bezpiecznego barwnika SYBR (np. na 50 ml użyj 5 μl barwnika 10 000x)
  6. Pozostawić żel do zabarwienia poprzez delikatne mieszanie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź 1x TBE zawierający SYBR i zastąp czystym 1x TBE. Myj żel przez 10 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
  7. Odcedź 1x TBE i umieść żel w przezroczystym folderze. Przytnij folder do odpowiedniego rozmiaru.
  8. Zobrazuj żel za pomocą odpowiedniego środka, takiego jak luminowizator. Wyciąć fragmenty DNA od ~175 pz do ~400 pz. Umieść plasterek żelu w tubce o pojemności 1,5 ml.
  9. Dokładnie rozbić plasterek żelu za pomocą końcówki P1000 i dodać 400 μlH2O. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 1 godzinę w termobloku.
  10. Zamrażać próbkę na suchym lodzie przez 10 minut, a następnie umieścić z powrotem w termobloku w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez 1 godzinę.
  11. Utwórz jednostkę filtrującą, biorąc kolumnę filtrującą i wkładając do niej dwa filtry z mikrofibry szklanej. Umieść urządzenie w probówce o pojemności 1.5 ml.
  12. Odetnij koniec końcówki P1000 czystym skalpelem i wchłoń rozbitą zawiesinę żelu TBE, a następnie dozuj do jednostki filtrującej utworzonej w kroku 11.12. Wiruj z prędkością 17 000 x g przez 30 s.
  13. Dodać 1 μl glikogenu do supernatantu wraz z 40 μl octanu sodu o pH = 5,2 i 1 ml 96% etanolu. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 30 min.
  14. Wirować przez 30 minut w temperaturze 17 000 x g, 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć 500 μl 70% etanolu.
  15. Wirować przez 5 minut, całkowicie usunąć etanol, a następnie suszyć granulki w dygestorium przez 3 minuty.
  16. Zawiesić w 10 μlH2Oi zmierzyć stężenie DNA.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność metody χCRAC, przeprowadzono eksperyment z analizą przebiegu czasowego z użyciem szczepów drożdży eksponujących białko Nrd1 z etykietą HTP. Szczegółowy schemat przedstawiający zasadę działania tej metody znajduje się na Rysunku 1. Podobnie jak Nab3, białko Nrd1 bierze udział w jądrowej degradacji różnorodnych transkryptów RNA37. Wcześniejsze prace zespołu Corden sugerowały, że wiązanie Nrd1 z jego celami RNA zmienia się znacząco, gdy komórki są poddane głodzeniu glukozowemu28,38. W związku z tym komórki rosnące wykładniczo w medium zawierającym glukozę (SD-TRP) przeniesiono do tego samego medium bez glukozy (S-TRP) w określonych odstępach czasu, aby monitorować dynamiczne zmiany w oddziaływaniach Nrd1-RNA. Próbki pobrano i poddano sieciowaniu w komorze Vari-X-linker (Rysunek 3A) przed przeniesieniem, a następnie po 1, 2, 4, 8, 14 i 20 min. Medium stosowane do wzrostu komórek było celowo pozbawione tryptofanu, aby ograniczyć absorpcję promieniowania UV przez ten aminokwas aromatyczny. Należy pamiętać, że najlepiej stosować syntetyczne medium sterylizowane przez filtrację, ponieważ autoklawowanie medium może prowadzić do karmelizacji cukrów, co następnie obniża wydajność sieciowania.

Rysunek 4A przedstawia reprezentatywny autoradiogram z eksperymentu χCRAC. Należy zauważyć, że w tym przykładzie próbki nie zostały połączone. Zamiast tego każda z nich została poddana osobnej elektroforezie w żelu. Jest to zalecane podczas wstępnych testów eksperymentalnych, aby wykazać, że białko skutecznie sieciuje się z RNA we wszystkich badanych punktach czasowych. Szczególnie intensywny sygnał zaobserwowano przy spodziewanej masie cząsteczkowej RBP, co odpowiada białku związanemu z bardzo krótkimi, znakowanymi promieniotwórczo cząsteczkami RNA, które nie nadają się do sekwencjonowania. Dlatego wyizolowano rozmyty sygnał powyżej tego prążka, który reprezentuje białko sieciowane z dłuższymi fragmentami RNA. Fragment wycięto z obszaru tuż powyżej prążka białka, obejmując dodatkowo około 30 kDa. Rysunek 4B przedstawia autoradiogram po wycięciu, na którym białko sieciowane z krótkimi RNA pozostało w żelu, a wcześniej rozmyty sygnał został usunięty.

Po odwrotnej transkrypcji bibliotekę cDNA należy powielić za pomocą PCR. Należy jednak unikać nadmiernej amplifikacji biblioteki, ponieważ może to wprowadzić błąd w postaci preferencyjnego powielania niektórych sekwencji przez polimerazę oraz generować artefakty PCR. Nadmiernie powielone biblioteki zawierają również dużą liczbę sekwencji duplikowanych, co prowadzi do marnowania odczytów w sekwenatorze. Aby obliczyć optymalną liczbę cykli PCR dla amplifikacji końcowej biblioteki, alikwot cDNA powielono metodą qPCR z użyciem oligonukleotydów P5 i BC. Jako liczbę cykli PCR wybrano pierwszy cykl, w którym biblioteka osiągnęła szczyt fluorescencji. Rycina 4C przedstawia przykład qPCR z typowej biblioteki cDNA, w której szczytowa liczba cykli wyniosła 16. Wartość ta została następnie zastosowana w końcowej reakcji PCR dla χCRAC. W celu przetworzenia danych z sekwencjonowania wykorzystano oprogramowanie opracowane wcześniej w naszym laboratorium (pyCRAC) oraz odpowiadający mu rurociąg analityczny do analizy kinetycznych danych CRAC (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Te narzędzia programistyczne typu open source umożliwiają demultipleksowanie i przycinanie danych, usuwanie duplikatów PCR, identyfikację statystycznie istotnych pików, grupowanie odczytów w sekwencje ciągłe oraz identyfikację motywów wiązania39. Dalsze szczegóły dotyczące działania tych narzędzi znajdują się na ich odpowiednich stronach internetowych.

Rozpoczęliśmy również opracowywanie protokołu χCRAC dla komórek ssaków. Większość linii komórkowych ssaków hodowana jest w monowarstwie, a taca w naszym urządzeniu do sieciowania z workiem przepuszczającym promienie UV nie nadaje się do eksperymentów z komórkami adherentnymi. Aby rozwiązać ten problem, opracowaliśmy platformę, która umożliwia naświetlanie UV 1–2 szalek Petriego (o średnicy 150 mm i głębokości 25 mm) z komórkami adherentnymi (Rycina 3B). W ramach pierwszego testu wydajność sieciowania dla komórek ssaków zmierzono poprzez sieciowanie i wychwytywanie stabilnie znakowanego białka GFP-RBM7 przy użyciu przeciwciał anty-GFP i tradycyjnej puryfikacji opartej na metodzie CLIP. Jak pokazano na Rycynie 5A, urządzenie do sieciowania pozwoliło na odzyskanie kompleksów białko-RNA z komórek ssaków hodowanych w monowarstwie przy użyciu promieniowania UV o długości 254 nm z wydajnością porównywalną do powszechnie stosowanego urządzenia do naświetlania UV. Jednak standardowe plastikowe naczynia do hodowli komórkowej, zwykle używane w eksperymentach z sieciowaniem UV, są nieprzepuszczalne dla promieniowania UV o długości 254 nm. W związku z tym, w naszym urządzeniu komórki otrzymywałyby naświetlanie tylko z górnego rzędu lamp UV. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy przepuszczalną dla UV kwarcową szalkę Petriego do hodowli komórek i sieciowania. Zastosowanie kwarcowych naczyń hodowlanych wykazało skuteczne odzyskiwanie kompleksów białko-RNA już przy 2 s naświetlania UV (Rycina 5B). W połączeniu z metodami wychwytywania RBP dla komórek ssaków, takimi jak technologie CLIP, te krótkie czasy sieciowania są odpowiednie do badań kinetycznych w celu odzyskania spatiotemporalnych profili wiązania RNA przez RBP w odpowiedzi na stresy genotoksyczne lub szybką deplecję czynników białkowych, a także równolegle z synchronizacją transkrypcyjną lub cyklu komórkowego.

Rycina 6 przedstawia kilka przykładów danych Nrd1 przetworzonych za pomocą potoku χCRAC. Rycina ta została przygotowana przy użyciu plików bedgraph wygenerowanych przez potok oraz pakietu python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), który zaprojektowaliśmy w celu uproszczenia tworzenia obrazów z przeglądarki genomu w jakości publikacyjnej. Szare prostokąty reprezentują regiony genomowe, w których ekspresowane są niekodujące RNA, takie jak kryptyczne niestabilne transkrypty (CUTs), stabilne niecharakteryzowane transkrypty (SUTs)40 oraz niestabilne transkrypty wrażliwe na Xrn1 (XUTs)41. Dane na Rycini 6 pokazują, że Nrd1 wiąże się z wieloma z tych niekodujących transkryptów RNA, co jest zgodne z tezą, że białko to uczestniczy w degradacji tej klasy transkryptów42. Rycina 6A przedstawia region o długości ~15 kb na chromosomie IV. Odnotowano tutaj znaczący wzrost wiązania Nrd1 do transkryptów kodujących wysokowydajne transportery glukozy HXT6 i HXT7, z których oba ulegają nadekspresji podczas głodzenia glukozowego. Prawdopodobnie terminacja transkrypcji przez kompleks NNS może wpływać na kinetykę indukcji tych genów podczas głodzenia glukozowego. Rycina 6B pokazuje przykład sieciowania Nrd1 z transkryptem Imd3, o którym wiadomo, że jest regulowany przez Nab343. W tym przypadku dane wykazały znaczną redukcję wiązania podczas głodzenia glukozowego. Wcześniejsze prace wykazały zmniejszone wiązanie Nab3 do transkryptu Tye7 podczas głodzenia glukozowego44. Zgodnie z tą obserwacją dane χCRAC sugerują, że wiązanie Nrd1 zmniejszyło się podczas głodzenia glukozowego, a sieciowanie Nrd1 z Tye7 było najniższe po 8 min stresu (Rycina 4C). Wydaje się jednak, że efekt ten był jedynie przejściowy, ponieważ po 14 min głodzenia glukozowego wiązanie Nrd1 powróciło do poziomów wyjściowych.

Schemat sieciowania białko-RNA z etapami naświetlania UV, oczyszczania, Nu-PAGE i sekwencjonowania.
Rycina 1: Schematyczny przebieg protokołu χCRAC. Oznakowane szczepy hodowano do osiągnięcia pożądanej gęstości. RBP oznacza białko wiążące RNA. Następnie pobrano próbkę referencyjną i poddano ją sieciowaniu światłem UV o długości 254 nm. Pozostałe komórki zebrano poprzez filtrację, a następnie szybko przeniesiono do medium indukującego stres. W opisanym tutaj eksperymencie χCRAC próbki pobierano i sieciowano 1, 2, 4, 8, 14 i 20 min po przeniesieniu (1). Następnie oczyszczono interesujące RBP za pomocą wysokostringentnego dwuetapowego oczyszczania powinowactwa (2). Dalej, wychwycone sieciowane RNA poddano częściowemu trawieniu RNazami, znakowaniu radioaktywnym na końcu 5’ i ligacji adapterów (3). Adaptery 5’ zawierały unikalne sekwencje kodów kreskowych „in-read”, aby poszczególne próbki można było oddzielić bioinformatycznie po sekwencjonowaniu. Kompleksy RBP-RNA zostały następnie eluowane, połączone i wspólnie wytrącone (4), rozdzielone za pomocą SDS-PAGE i zwizualizowane poprzez autoradiografię (5). Następnie z żelu wycięto pojedynczy pasek zawierający sygnał radioaktywny tuż nad głównym prążkiem, zaznaczony czerwoną przerywaną ramką na obrazie autoradiograficznym (5). Paski żelu potraktowano proteazą K, a następnie wyekstrahowano RNA (6), przekształcono w cDNA i namnożono za pomocą PCR (7). Etap PCR wprowadził dodatkowe kody kreskowe (żółty blok wprowadzony przez oligo P7), dzięki czemu wiele bibliotek można było zmultipleksować w jednej ścieżce. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat układu naświetlania UV z systemem pompowym, filtrami zmiennymi i kontrolą przepływu do przetwarzania komórek.
Rycina 2: Sieciowanie i filtracja próżniowa. (A) Układ sieciujący. Zawiesinę komórkową wlewa się do lejka znajdującego się w prawym górnym rogu urządzenia (zob. również Rycina 3A dla zbliżenia), a następnie utrzymuje się ją w przezroczystym dla UV worku umieszczonym w środkowej tacy. Worek jest flankowany przez dwie przesłony, które pozostają zamknięte do momentu wydania przez użytkownika polecenia rozpoczęcia etapu naświetlania. Komórki są naświetlane światłem UV z tac znajdujących się zarówno powyżej, jak i poniżej. Urządzenie jest wyposażone w lampy UV o długości fali 254 nm i 365 nm, przy czym ta druga jest stosowana w eksperymentach PAR-CLIP. Obsługa urządzenia odbywa się za pomocą panelu dotykowego w prawym górnym rogu, który umożliwia kontrolę dawki UV lub czasu ekspozycji. (B) Po sieciowaniu komórki są odprowadzane z lewej strony urządzenia. Zawiesiny komórkowe są odzyskiwane za pomocą próżni i odprowadzane do kolby szklanej, z której mogą zostać następnie przelane do urządzenia do filtracji próżniowej w celu zbioru. (C) Urządzenia do filtracji próżniowej. Są one otwierane i zamykane za pomocą klipsa, pomiędzy który wkłada się filtr. W przypadku bardzo krótkich serii czasowych równolegle użyto czterech urządzeń filtrujących, aby nie tracić czasu na wymianę filtrów. (D) Po filtracji nadsącz pożywki był odprowadzany do kolb w celu późniejszej utylizacji. Poniżej urządzeń do filtracji próżniowej zainstalowano zawory, aby utrzymać próżnię w układzie po wyjęciu filtra. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Konfiguracja komory UV do naświetlania próbek; obejmuje wlot, tackę do hodowli oraz tackę na szalki Petriego do eksperymentów.
Rycina 3: Sieciowanie komórek w zawiesinie w porównaniu do komórek adherentnych. (A) Urządzenie do sieciowania z komorą Vari-X-linker dla komórek w zawiesinie. Hodowlę komórkową wlewa się do wlotu próbki (lejka) znajdującego się w prawym górnym rogu tacki. (B) Tacka, w której można umieścić plastikowe lub kwarcowe szalki Petriego do sieciowania komórek adherentnych lub małych objętości komórek w zawiesinie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Analiza autoradiograficzna i qPCR; wyniki elektroforezy; ilościowe oznaczenie DNA; dane chromatogramu.
Rysunek 4: Przygotowanie biblioteki. (A) Przykład autoradiogramu z eksperymentu Nrd1-HTP χCRAC. Silny, skoncentrowany sygnał reprezentuje białko sieciowane z bardzo krótkimi RNA, natomiast smuga powyżej reprezentuje białko sieciowane z RNA o długości wystarczającej do sekwencjonowania. (B) Smugę wycięto, co pokazano na autoradiogramie wykonanym po wycięciu fragmentu żelu. (C) Reprezentatywny wynik qPCR z biblioteki cDNA χCRAC. W tym przykładzie maksymalną amplifikację cDNA osiągnięto w 16 cyklach. Zatem do końcowej amplifikacji wykorzystano 16 cykli. Słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe trzech technicznych powtórzeń qPCR. (D) Przykład obrazu fosforowego biblioteki cDNA na żelu TBE 6%. (E) Analiza długości i jakości cDNA za pomocą kapilarnej elektroforezy na chipie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Elektroforeza żelowa i kwantyfikacja RBM7-GFP po ekspozycji na UV o różnej intensywności i czasie.
Rysunek 5: Eksperyment iCLIP z wysoką aktywnością RNazy w celu przetestowania sieciowania w komórkach ssaków. Przedstawiono autoradiogramy z eksperymentów iCLIP GFP-RBM7, w których badano wydajność odzyskiwania RNP przy różnych energiach sieciowania. Immunoprecypitacje przeprowadzono z użyciem przeciwciał anty-GFP sprzężonych z kulkami magnetycznymi na sieciowanych komórkach stabilnie eksprimujących GFP-RBM7. Immunoprecypitaty inkubowano z wysokimi stężeniami RNazy I w celu przycięcia związanych RNA do krótkich, jednolitych długości. RNP wizualizowano poprzez znakowanie 32P i SDS-PAGE; migrują one jako wyraźny prążek, blisko poziomu migracji białka niesieciowanego. Kwantyfikacja przedstawia wyniki analiz densytometrycznych sygnału znakowanego promieniotwórczo RBM7-RNA znormalizowanego do sygnału western blot anty-GFP. (A) Kinetyka czasu sieciowania powszechnie stosowanego sieciowacza UVP w porównaniu z naszym sieciowaczem (Vari-X-linker; VxL). (B) Kinetyka czasu sieciowania naszego sieciowacza na naczyniach hodowlanych kwarcowych (lewo) i plastikowych (prawo). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Analiza ekspresji genów na chromosomach IV, XII, XV; wykresy RNA-seq pokazują czasowe rozkłady odczytów.
Rycina 6: Przykładowe wykresy z przeglądarki genomu pokazujące zdolność metody χCRAC do wykazania różnicowego i czasowego wiązania Nrd1 z jego celami. Każda ramka przedstawia wykresy dla poszczególnych regionów genomowych. Strzałki wskazują nić, na której zakodowane są geny (strzałka skierowana w lewo = nić minus; strzałka skierowana w prawo = nić plus). Punkty czasowe (min) są oznaczone jako t0, t1, t2 itd. na osiach y każdego wykresu pomocniczego. Podano rzymskie cyfry oznaczające chromosomy oraz współrzędne. (A) Po pozbawieniu glukozy Nrd1 wiąże dwa wysokopowinowate transportery glukozy, HXT6 i HXT7, które oba wykazują zwiększoną ekspresję w tych warunkach. (B) Zaobserwowano wiązanie Nrd1 z Imd3, który jest już zwalidowanym celem Nab344, przy czym intensywność wiązania maleje po głodzeniu glukozowym. (C) Wiązanie Tye7 przez Nrd1 ma charakter dynamiczny i przejściowy, zmniejszając się po głodzeniu glukozowym do minimum po 8 min stresu. Następnie jednak wiązanie powraca do poziomów podstawowych po 14 min. Odczyty zostały znormalizowane do „liczby odczytów na milion” (RPM; oś y). Szare pola oznaczają regiony kodujące niekodujące RNA. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Dyskusja

Metoda χCRAC, w połączeniu z nowymi urządzeniami do sieciowania i pobierania komórek, ma ogromny potencjał, ponieważ ma zastosowanie do szerokiego zakresu organizmów modelowych, a zatem powinna być przedmiotem ogólnego zainteresowania w dziedzinie RNA. Istnieje wiele obszarów, w których χCRAC może być wykorzystany. Na przykład metoda ta może być wykorzystana do pomiaru hierarchicznego składania białek w duże kompleksy makromolekularne, takie jak spliceosom i rybosom, co często wiąże się z dynamicznymi interakcjami między białkami a cząsteczkami RNA. Obecnie rutynowo używamy go również do monitorowania interakcji między czynnikami rozpadu RNA a ich substratami, gdy komórki są poddawane różnego rodzaju stresom. Dzięki temu możemy określić, na jakim etapie odpowiedzi adaptacyjnej czynniki te są najbardziej aktywne, z jakimi substratami się wiążą i jak dynamiczne są te interakcje. Takie dane powinny umożliwić naukowcom określenie względnego wkładu każdego czynnika w adaptację do zmian środowiskowych.

χCRAC wykorzystuje znaczniki oczyszczania o podwójnym powinowactwie (HTF lub HTP) do oczyszczania białka w bardzo rygorystycznych i denaturujących warunkach. Gwarantuje to, że oczyszczone RNA jest wysoce wzbogacone o RNA, które były kowalencyjnie usieciowane z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Jednak poleganie na tagach powinowactwa ma wady. Na przykład znacznik może zakłócać funkcję białka, co może powodować zniekształcony odczyt interaktomii wiążącego RNA. Ponadto w przypadku niektórych organizmów modelowych wykorzystanie znaczników może nie zawsze być możliwe, ponieważ narzędzia genetyczne do integracji fragmentów DNA z genomem lub przekształcania plazmidów ekspresyjnych nie są jeszcze dostępne. Jednak łatwo jest zmienić niektóre części protokołu χCRAC, aby był kompatybilny z protokołami opartymi na CLIP, które opierają się na przeciwciałach do oczyszczania RBP. Rzeczywiście, to badanie wykazało, że możliwe jest połączenie oczyszczania opartego na iCLIP z naszym środkiem sieciującym. Obecnie jesteśmy w trakcie opracowywania protokołów CLIP w celu zbadania czasowego związku ludzkich białek wiążących RNA z powstającymi transkryptami RNA.

Podczas wykonywania χCRAC na nowym białku należy zoptymalizować ekspozycję na promieniowanie UV, aby wywołać maksymalne sieciowanie. Jest to ważne, ponieważ wysoka ekspozycja na promieniowanie UV może zmniejszyć odzysk RNA na etapie oczyszczania. Komórki wykazujące ekspresję rekombinowanego RBP poddano działaniu różnych dawek UV, 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 i 1 J/cm2. RNP zostały następnie przechwycone, a RNA zostały rozdrobnione i znakowane radioizotopem. Następnie RNP zostały rozwiązane za pomocą SDS-PAGE i wykonano autoradiogram w celu wywnioskowania, która ekspozycja dała najbardziej intensywny sygnał (tj. maksymalne sieciowanie).

Po zoptymalizowaniu warunków eksperymentalnych zaleca się przeprowadzenie kilku eksperymentów kontrolnych podczas wykonywania χCRAC. Po pierwsze, naświetlana promieniami UV, nieoznakowana próbka może być użyta do monitorowania wiązania tła z kulkami oczyszczającymi. Po drugie, przy zastosowaniu χCRAC podczas eksperymentu przesunięciowego, drugi szereg czasowy, w którym komórki są przesuwane z powrotem do pierwotnego podłoża, umożliwia zbadanie, czy sama filtracja komórek indukuje zmiany w poziomach RNA lub interakcje białko-RNA.

Jak wspomniano we Wprowadzeniu, liczne ostatnio opublikowane artykuły sugerują szereg optymalizacji protokołu CLIP. Obejmuje to zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie adapterów do wykrywania kompleksu białko-RNA poprzez skanowanie w podczerwieni10, a także optymalizacje różnych etapów oczyszczania kwasów nukleinowych i wyboru rozmiaru, które wykazano w celu zwiększenia złożoności powstałych bibliotek12,45. Obecnie wdrażamy niektóre z tych ulepszeń, aby jeszcze bardziej udoskonalić protokół χCRAC. Przedstawiony tutaj protokół zawiera już szereg ulepszeń w stosunku do oryginalnych protokołów CRAC i χCRAC, które zwiększają złożoność danych. Na przykład wcześniej, po rozpuszczeniu usieciowanych, radioaktywnych kompleksów białko-RNA na żelach SDS-PAGE, przeniesiono je do membrany nitrocelulozowej, a usieciowany RNA wyizolowano z plamy. Jednak przenoszenie RNP i późniejsza ekstrakcja RNA może być bardzo nieefektywna, szczególnie w przypadku dużych RBP, takich jak podjednostki polimerazy RNA. Może to spowodować znaczne zmniejszenie odzysku usieciowanego RNA. W obecnym protokole usieciowany RNA jest ekstrahowany bezpośrednio z plastrów żelu SDS-PAGE, jak pokazano na rysunku 1. Zwiększyło to odzyskiwanie usieciowanych RNA. Dodatkowo, po amplifikacji cDNA metodą PCR, produkt został pierwotnie rozdzielony na 3%, niskotopliwych żelach agarozowych, a następnie z żelu wyekstrahowano produkty PCR o gęstości 175–300 pz. Jednak żele te mogą być łatwo przeciążone, co skutkuje bardzo słabą separacją DNA. Zastąpienie żeli agarozowych prefabrykowanymi żelami TBE zaowocowało bardziej spójną separacją wielkości i lepszym odzyskiwaniem produktów PCR.

Oświadczenia

A. Langford i W. Worboys są powiązani z firmą handlową UVO3. Nie odgrywali oni żadnej roli w projektowaniu badań, gromadzeniu i interpretacji danych ani w podejmowaniu decyzji o przesłaniu pracy do publikacji.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez granty od Wellcome Trust (091549 dla S.G i 109093/Z/15/A dla S.M.), Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) oraz Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 to S.G.), Europejskiej Organizacji Biologii Molekularnej w ramach długoterminowego stypendium podoktorskiego (ALTF 1070-2017 do R.A.C.), oraz Niezależny Fundusz Badawczy Danii (T.H.J).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
1,4-ditioreitolMerck10708984001Składnik buforowy w lizie komórek ssaków
1,5 ml probówkiEppendorf0030 120.086Probówka do reakcji
ogólnej 2 mlEppendorf0030 123.344Do przechowywania kolumn i zbierania odpadów
32P-yATPPerkin ElmerNEG502Z-250Do znakowania radioizotopem końca 5' RNA
4-12% Bis-Tris żelInvitrogenNP0321BOXSDS-PAGE
żel 4X bufor ładującyNovexNP0008Koncentrat barwnika ładującego białko
50 pz drabinkaNew England BiolabsN3236Drabinka referencyjna do wycinania obszaru zainteresowania z amplifikowanej biblioteki cDNA
50% PEGNEBB100045Do podwiązania łącznika L5
6% żel TBEInvitrogenEC6265BOXDo separacji i oczyszczania biblioteki cDNA
AcetonACROS Organics423245000Mycie białek wytrąconych TCA
Koraliki anty-FLAGSigma AldrichM8823-1MLDo oczyszczania RBP znakowanych flagą
ATP (100 mM)Thermo Fisher ScientificR0441Do ligacji łącznika L5 na końcu 5' wychwyconych RNA
Beta-merkaptoetanolSigma AldrichM3148-100MLSkładnik buforowy
Biomax MS ekran intensyfikującySigma AldrichZ363162-1EADo intensyfikacji sygnału autoradiogramu
ChloroformThermo Fisher Scientific1010219Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA
cOmplete koktajl inhibitorów proteazy bez EDTARoche11873580001Do hamowania proteaz komórkowych po lizie
Kompletna mieszanka suplementów -TRPFormediumDCS0149Do przygotowania syntetycznego zdefiniowanego podłoża
Costar Spin-X 0,22 µ Filtry mSigma AldrichCLS8160Do izolowania wyciętych cDNA po ekstrakcji żelem
DNaza RQ1PromegaM6101Do trawienia DNA po lizie
komórek dNTP (10 mM)Sigma Aldrich4638956001Do odwrotnej transkrypcji i PCR
EtanolThermo Fisher Scientific10041814Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA i DNA wytrącanie
Kwas etylenodiaminotetraoctowyInvitrogenAM9261Do buforu proteazy K
Egzonukleaza INew England BiolabsM0293Do degradacji starterów po PCR
Filtry z mikrowłókna szklanegoWhatman1823-010Do izolowania wyciętych cDNA po ekstrakcji żelem
GlukozaFormediumGLU03Do przygotowania zawierającego glukozę, syntetycznego zdefiniowanego podłoża
glikogenu (20 mg/ml)Roche10901393001Wytrącanie białek, RNA i DNA
GST-TEVProtokółkonstrukcji i oczyszczania jest dostępny na żądanie
Hydrochlorodek guaniduThermo Fisher Scientific10071503Wymagany do warunków denaturacji pulldown i buforu
Kulki IgGGE Healthcare17-0969-01Do oczyszczania białek RBP znakowanych A
ImidazolSigma AldrichI2399-100GDo elucji wychwyconych białek z kulek niklowych
Alkohol izoamylowyThermo Fisher ScientificA393-500Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA
Luna Universal One-Step RT-qPCRNEBE3005SDo qPCR cDNA w celu obliczenia wymaganej liczby cykli PCR
Chlorek magnezuFluka Analytical63020-1LDo bufora PNK
Filtry membranoweMilliporeAAWP09000 na drożdże lub HAWP09000 na bakterieDo filtracji próżniowej komórek
Kolumny mikrobiospinoweBiorad732-6204Do zbierania eluatu po ekstrakcji żelu
Kulki Ni-NTAQiagen30210Do wtórnego wychwytywania białek
NP-40Sigma AldrichI8896-100MLSkładnik buforowy
PolimerazaPfu PromegaM7741Do amplifikacji biblioteki cDNA
PhenolSigma AldrichP4682-400MLDo ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA
Pierce Kolumny wiroweThermo Fisher Scientific69725Do nakolumnowych reakcji enzymatycznych
Proteaza KRoche 3115887001Do degradacji RBP po ekstrakcji żelem
Kwarcowa szalka PetriegoUVO3N/ADo sieciowania przylegających komórek. Dostępne od https://www.vari-x-link.com za 400 GBP
Filmy radiograficzneAmersham28906843Do wizualizacji autoradiograficznej
Koraliki RNAClean XPBeckmannA63987Koraliki SPRI do oczyszczania RNA i cDNA
RNaza H NewEngland BiolabsM0297Do degradacji RNA po odwrotnej transkrypcji
RNase-ItAgilent400720Do trawienia RNA
rRNasinPromegaN2511Do hamowania wszelkich zanieczyszczających RNaz podczas reakcji enzymatycznej
Octan soduSigma AldrichS2889-1KGDo ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA i wytrąceniu DNA
Chlorek soduThermo Fisher Scientific7647-14-5Składnik buforowy
Deoksycholan soduSigma AldrichD6750-100GSkładnik buforowy w lizie komórek ssaków
Dodecylosiarczan soduSigma AldrichL3771-1KGDo buforu proteazy K
SUPERase-InInvitrogenAM2694Do hamowania komórkowych RNaz po lizie
SuperScript IVThermo Fisher Scientific18090010Do odwrotnej transkrypcji
T4 PNKNew England BiolabsM0201Do znakowania radioizotopem końca 5' RNA
Ligazy T4 RNA 1New England BiolabsM0204Do ligacji adaptera L5 na końcu RNA 5'
Ligaza RNazy T4 2, obcięta K222QNEBM0351SDo ligacji łącznika App_PE na końcu 3' wychwyconego RNA
Bufor TBE (10X)Invitrogen15581-028Do uruchamiania żeli TBE
Proteaza TEVDomowej robotyDo elucji wychwyconych białek po wychwycie LGR
Termoczuła fosfataza alkalicznaPromegaM9910Do defosforylacji 5' i 3' RNA
Kwas trichlorooctowy (100%)Sigma AldrichT0699-100MLDo wytrącania kompleksów RBP-RNA
Chlorowodorek TrisInvitrogen15504-020Składnik buforowy
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100MLSkładnik buforowy w lizie komórek ssaków
Vari FilterUVO3N/AUrządzenie do próżniowego zbierania komórek. Dostępne od https://www.vari-x-link.com dla 100 GBP
Vari-X-LinkerUVO3N/ACross-linker do ogniw sieciujących. Dostępne od https://www.vari-x-link.com za 16 000 GBP
Drożdżowa baza azotowaFormediumCYN0410Do przygotowania syntetycznego zdefiniowanego podłoża
Kulki cyrkonoweThistle11079105Z dla drożdży lub 11079101Z dla bakteriiDo lizy komórek poprzez ubijanie kulek
domowej myjącego

Bibliografia

  1. Ule, J., et al. CLIP identifies Nova-regulated RNA networks in the brain. Science. 302 (5648), 1212-1215 (2003).
  2. Granneman, S., Kudla, G., Petfalski, E., Tollervey, D. Identification of protein binding sites on U3 snoRNA and pre-rRNA by UV cross-linking and high-throughput analysis of cDNAs. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (24), 9613-9618 (2009).
  3. Licatalosi, D. D., et al. HITS-CLIP yields genome-wide insights into brain alternative RNA processing. Nature. 456 (7221), 464-469 (2008).
  4. König, J., et al. iCLIP reveals the function of hnRNP particles in splicing at individual nucleotide resolution. Nature Structural & Molecular Biology. 17 (7), 909-915 (2010).
  5. Hafner, M., et al. Transcriptome-wide Identification of RNA-Binding Protein and MicroRNA Target Sites by PAR-CLIP. Cell. 141 (1), 129-141 (2010).
  6. Aktaş, T., et al. DHX9 suppresses RNA processing defects originating from the Alu invasion of the human genome. Nature. 544 (7648), 115-119 (2017).
  7. Huppertz, I., et al. iCLIP: Protein–RNA interactions at nucleotide resolution. Methods. 65 (3), 274-287 (2014).
  8. Li, X., et al. Comprehensive in vivo RNA-binding site analyses reveal a role of Prp8 in spliceosomal assembly. Nucleic Acids Research. 41 (6), 3805-3818 (2013).
  9. Rosenberg, M., et al. Denaturing CLIP, dCLIP, Pipeline Identifies Discrete RNA Footprints on Chromatin-Associated Proteins and Reveals that CBX7 Targets 3′ UTRs to Regulate mRNA Expression. Cell Systems. 5 (4), 368-385 (2017).
  10. Zarnegar, B. J., et al. irCLIP platform for efficient characterization of protein–RNA interactions. Nature Methods. 13 (6), 489-492 (2016).
  11. Kargapolova, Y., Levin, M., Lackner, K., Danckwardt, S. sCLIP—an integrated platform to study RNA–protein interactomes in biomedical research: identification of CSTF2tau in alternative processing of small nuclear RNAs. Nucleic Acids Research. 45 (10), 6074-6086 (2017).
  12. Van Nostrand, E. L., et al. Robust transcriptome-wide discovery of RNA-binding protein binding sites with enhanced CLIP (eCLIP). Nature Methods. 13 (6), 508-514 (2016).
  13. Flynn, R. A., et al. Dissecting noncoding and pathogen RNA–protein interactomes. RNA. 21 (1), 135-143 (2015).
  14. Brugiolo, M., Botti, V., Liu, N., Müller-McNicoll, M., Neugebauer, K. M. Fractionation iCLIP detects persistent SR protein binding to conserved, retained introns in chromatin, nucleoplasm and cytoplasm. Nucleic Acids Research. 45 (18), 10452-10465 (2017).
  15. Sanford, J. R., et al. Identification of Nuclear and Cytoplasmic mRNA Targets for the Shuttling Protein SF2/ASF. PLOS ONE. 3 (10), e3369(2008).
  16. Garzia, A., Meyer, C., Morozov, P., Sajek, M., Tuschl, T. Optimization of PAR-CLIP for transcriptome-wide identification of binding sites of RNA-binding proteins. Methods. 118-119, 24-40 (2017).
  17. Windhager, L., et al. Ultrashort and progressive 4sU-tagging reveals key characteristics of RNA processing at nucleotide resolution. Genome Research. 22 (10), 2031-2042 (2012).
  18. Chen, K., et al. High-Resolution N6-Methyladenosine (m6A) Map Using Photo-Crosslinking-Assisted m6A Sequencing. Angewandte Chemie International Edition. 54 (5), 1587-1590 (2015).
  19. Ke, S., et al. A majority of m6A residues are in the last exons, allowing the potential for 3′ UTR regulation. Genes & Development. 29 (19), 2037-2053 (2015).
  20. Linder, B., et al. Single-nucleotide-resolution mapping of m6A and m6Am throughout the transcriptome. Nature Methods. 12 (8), 767-772 (2015).
  21. Kudla, G., Granneman, S., Hahn, D., Beggs, J. D., Tollervey, D. Cross-linking, ligation, and sequencing of hybrids reveals RNA–RNA interactions in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (24), 10010-10015 (2011).
  22. Sugimoto, Y., et al. hiCLIP reveals the in vivo atlas of mRNA secondary structures recognized by Staufen 1. Nature. 519 (7544), 491-494 (2015).
  23. Hwang, H. W., et al. cTag-PAPERCLIP Reveals Alternative Polyadenylation Promotes Cell-Type Specific Protein Diversity and Shifts Araf Isoforms with Microglia Activation. Neuron. 95 (6), 1334-1349 (2017).
  24. Hwang, H. W., et al. PAPERCLIP Identifies MicroRNA Targets and a Role of CstF64/64tau in Promoting Non-canonical poly(A) Site Usage. Cell Reports. 15 (2), 423-435 (2016).
  25. Lee, F. C. Y., Ule, J. Advances in CLIP Technologies for Studies of Protein-RNA Interactions. Molecular Cell. 69 (3), 354-369 (2018).
  26. Beckmann, B. M. RNA interactome capture in yeast. Methods. 118-119, 82-92 (2017).
  27. Granneman, S., Petfalski, E., Tollervey, D. A cluster of ribosome synthesis factors regulate pre-rRNA folding and 5.8S rRNA maturation by the Rat1 exonuclease. The EMBO Journal. 30 (19), 4006-4019 (2011).
  28. Schaughency, P., Merran, J., Corden, J. L. Genome-Wide Mapping of Yeast RNA Polymerase II Termination. PLOS Genetics. 10 (10), e1004632(2014).
  29. Bernstein, J. A., Khodursky, A. B., Lin, P. H., Lin-Chao, S., Cohen, S. N. Global analysis of mRNA decay and abundance in Escherichia coli at single-gene resolution using two-color fluorescent DNA microarrays. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (15), 9697-9702 (2002).
  30. Kresnowati, M. T. A. P., et al. When transcriptome meets metabolome: fast cellular responses of yeast to sudden relief of glucose limitation. Molecular Systems Biology. 2, 49(2006).
  31. Marguerat, S., Lawler, K., Brazma, A., Bähler, J. Contributions of transcription and mRNA decay to gene expression dynamics of fission yeast in response to oxidative stress. RNA Biology. 11 (6), 702-714 (2014).
  32. van Nues, R., et al. Kinetic CRAC uncovers a role for Nab3 in determining gene expression profiles during stress. Nature Communications. 8 (1), 12(2017).
  33. Selinger, D. W., Saxena, R. M., Cheung, K. J., Church, G. M., Rosenow, C. Global RNA Half-Life Analysis in Escherichia coli Reveals Positional Patterns of Transcript Degradation. Genome Research. 13 (2), 216-223 (2003).
  34. Tudek, A., Candelli, T., Libri, D. Non-coding transcription by RNA polymerase II in yeast: Hasard or nécessité? Biochimie. 117, 28-36 (2015).
  35. Lingaraju, M., et al. The MTR4 helicase recruits nuclear adaptors of the human RNA exosome using distinct arch-interacting motifs. Nature Communications. 10 (1), 1-11 (2019).
  36. Lubas, M., et al. Interaction Profiling Identifies the Human Nuclear Exosome Targeting Complex. Molecular Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  37. Conrad, N. K., et al. A yeast heterogeneous nuclear ribonucleoprotein complex associated with RNA polymerase II. Genetics. 154 (2), 557-571 (2000).
  38. Darby, M. M., Serebreni, L., Pan, X., Boeke, J. D., Corden, J. L. The Saccharomyces cerevisiae Nrd1-Nab3 Transcription Termination Pathway Acts in Opposition to Ras Signaling and Mediates Response to Nutrient Depletion. Molecular and Cellular Biology. 32 (10), 1762-1775 (2012).
  39. Webb, S., Hector, R. D., Kudla, G., Granneman, S. PAR-CLIP data indicate that Nrd1-Nab3-dependent transcription termination regulates expression of hundreds of protein coding genes in yeast. Genome Biology. 15 (1), R8(2014).
  40. Jensen, T. H., Jacquier, A., Libri, D. Dealing with Pervasive Transcription. Molecular Cell. 52 (4), 473-484 (2013).
  41. van Dijk, E. L., et al. XUTs are a class of Xrn1-sensitive antisense regulatory non-coding RNA in yeast. Nature. 475 (7354), 114-117 (2011).
  42. Thiebaut, M., et al. Futile Cycle of Transcription Initiation and Termination Modulates the Response to Nucleotide Shortage in S. cerevisiae. Molecular Cell. 31 (5), 671-682 (2008).
  43. Merran, J., Corden, J. L. Yeast RNA-Binding Protein Nab3 Regulates Genes Involved in Nitrogen Metabolism. Molecular and Cellular Biology. 37 (18), e00154-e00117 (2017).
  44. Bresson, S., Tuck, A., Staneva, D., Tollervey, D. Nuclear RNA Decay Pathways Aid Rapid Remodeling of Gene Expression in Yeast. Molecular Cell. 65 (5), 787-800 (2017).
  45. Buchbender, A., et al. Improved library preparation with the new iCLIP2 protocol. Methods. , (2019).

Przedruki i uprawnienia

Sprostowanie


Formal Correction: Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC
Posted by JoVE Editors on 2/17/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using χCRAC. The Authors section was updated from:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

to:

Stuart W. McKellar1
Ivayla Ivanova1
Robert W. van Nues2
Ross A. Cordiner3
Mehak Chauhan1
Niki Christopoulou1
Will Worboys4
Andrew Langford4
Torben Heick Jensen3
Sander Granneman1
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

Tagi

Kinetyczne CRACsieciowanie UVbiałka wiążące RNAkomórki drożdżyRBP Nrd1głodzenie glukozoweanaliza autoradiograficznabiblioteka cDNAelektroforeza żelowa
Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.