Monitorowanie dynamiki interakcji białko-RNA in vivo w wysokiej rozdzielczości czasowej przy użyciu χCRAC

Podsumowanie

Kinetyczne sieciowanie i analiza cDNA to metoda, która pozwala badać dynamikę interakcji białko-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej. Tutaj protokół jest szczegółowo opisany, w tym wzrost komórek drożdży, sieciowanie UV, zbieranie, oczyszczanie białek i etapy przygotowania biblioteki sekwencjonowania nowej generacji.

Streszczenie

Interakcja między białkami wiążącymi RNA (RBP) a ich substratami RNA wykazuje płynność i złożoność. W ciągu swojego życia pojedynczy RNA może być związany przez wiele różnych RBP, które będą regulować jego produkcję, stabilność, aktywność i degradację. W związku z tym zrobiono wiele, aby zrozumieć dynamikę, która istnieje między tymi dwoma typami cząsteczek. Szczególnie ważny przełom nastąpił wraz z pojawieniem się "cross-l inking and immunoprecipitation" (CLIP). Technika ta pozwoliła na rygorystyczne badanie, które RNA są związane przez określony RBP. Krótko mówiąc, interesujące białko jest sieciowane promieniami UV z jego substratami RNA in vivo, oczyszczane w bardzo rygorystycznych warunkach, a następnie RNA kowalencyjnie usieciowane z białkiem są przekształcane w biblioteki cDNA i sekwencjonowane. Od momentu powstania opracowano wiele technik pochodnych, aby CLIP był podatny na poszczególne kierunki nauki. Jednak sieciowanie za pomocą światła ultrafioletowego jest notorycznie nieefektywne. Powoduje to wydłużenie czasu ekspozycji, które uniemożliwia czasowe badanie interakcji RBP-RNA. Aby przezwyciężyć ten problem, niedawno zaprojektowaliśmy i zbudowaliśmy znacznie ulepszone urządzenia do naświetlania promieniowaniem UV i zbierania komórek. Korzystając z tych nowych narzędzi, opracowaliśmy protokół czasowo-rozdzielczych analiz interakcji RBP-RNA w żywych komórkach w wysokiej rozdzielczości czasowej: Kinetic CRoss-linking and Analysis of cDNAs (χCRAC). Niedawno wykorzystaliśmy tę technikę do zbadania roli drożdżowych RBP w adaptacji stresu pokarmowego. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy przegląd metody χCRAC i przedstawia najnowsze wyniki uzyskane za pomocą Nrd1 RBP.

Wprowadzenie

RNA często polegają na RBP, aby pełnić swoją funkcję, co doprowadziło do dużego zainteresowania zrozumieniem dynamiki między tymi cząsteczkami. Wiele RBP zidentyfikowano w wielu różnych organizmach. Jednak badanie interakcji RBP-RNA in vivo zawsze było niezwykle trudne. Duży przełom w badaniu takich interakcji nastąpił wraz z pojawieniem się CLIP¹. Metoda ta wykorzystuje promieniowanie ultrafioletowe (UV, 254 nm) do indukowania wiązań kowalencyjnych między RBP a ich bezpośrednio związanymi RNA (tj. sieciowanie na zerową odległość). Następnie RBP będący przedmiotem zainteresowania jest oczyszczany immunologicznie w rygorystycznych warunkach, aby zapewnić, że identyfikowane są tylko RNA walencyjnie usieciowane z białkami. Związane RNA są następnie częściowo trawione przez RNazy, a następnie przekształcane w biblioteki cDNA w celu sekwencjonowania. Wysoka rygorystyczność oczyszczania jest ważna, ponieważ znacznie zwiększa specyficzność odzyskiwania białek i RNA, która jest również dodatkowo wzmacniana przez oczyszczanie SDS-PAGE z usieciowanego kompleksu rybonukleoproteiny (RNP). CLIP i pokrewne metody zapewniają również wgląd w rozdzielczość nukleotydów w miejscu wiązania białka, ponieważ podczas przygotowywania biblioteki sekwencjonowania aminokwasy, które usieciowały RNA, często przerywają odwrotną transkryptazę lub powodują, że enzym wprowadza mutacje w tym miejscu^1,2,3.

Od momentu wprowadzenia, oryginalny protokół CLIP stworzył niezwykłą różnorodność metodologii pochodnych. Szczególnie ważnym przełomem było opracowanie HITS-CLIP (lub CLIP-seq), które łączy sekwencjonowanie o wysokiej przepustowości z podejściem CLIP³. Od tego czasu zostało to przyjęte we wszystkich metodologiach opartych na CLIP. W ramach projektu iCLIP wprowadzono ulepszenia w technikach przycinania i ligacji adaptorowej za pośrednictwem RNazy, które ułatwiają dokładniejsze mapowanie miejsc wiązania RBP⁴. W ramach projektu PAR-CLIP połączono znakowanie 4tio-urydyny/uracylu z sieciowaniem w odległości 365 nm, co umożliwiło mapowanie miejsc sieciowania poprzez analizę podstawień T-C⁵. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP i uvCLAP wprowadziły warunki denaturacji i etapy oczyszczania o podwójnym powinowactwie, które jeszcze bardziej zmniejszają wiązanie tła z żywicą powinowactwa i dodatkowo zwiększają swoistość wychwytywania białek^2,6,7,8,9. Ponadto w ramach projektów CRAC, uvCLAP i dCLIP wprowadzono znakowanie RBP będącego przedmiotem zainteresowania znacznikiem powinowactwa, eliminując w ten sposób potrzebę generowania specyficznych przeciwciał.

Dokonano również kilku optymalizacji w celu przyspieszenia metodologii CLIP. Oryginalny protokół CLIP wykorzystywał znakowanie radioaktywne wychwyconych RNA w celu wizualizacji kompleksów RBP-RNA po SDS-PAGE. Jednak stosowanie promieniotwórczości może być problematyczne dla laboratoriów, które nie są przystosowane do takiej pracy. irCLIP zawiera adapter sprzężony z fluoroforem, który ułatwia wizualizację poprzez obrazowanie w podczerwieni¹⁰, a sCLIP wykorzystuje biotynylację wychwyconych RNA w celu ich wizualizacji za pomocą sprzężonej ze streptawidyną HRP¹¹. Co więcej, eCLIP całkowicie rezygnuje z znakowania RNA; Zamiast tego białko jest wycinane wyłącznie na podstawie znanego rozmiaru¹². Oczyszczanie oparte na streptawidynie zostało również wykorzystane do przyspieszenia procesu przygotowania biblioteki w FAST-iCLIP, gdzie biotynylowany adapter 3' jest ligowany na RNA i używany do umożliwienia oczyszczania po odwrotnej transkrypcji i cyrkularyzacji¹³. Dodatkowe ulepszenia protokołu iCLIP również znacznie zwiększyły złożoność bibliotek⁴.

Na koniec, CLIP został zmodyfikowany, aby umożliwić przechwytywanie RBP z różnych podprzedziałów komórkowych^14,15, do wizualizacji nowo transkrybowanych RNA za pomocą pulsacyjnej indukcji fotoaktywowanych rybonukleozydów^5,16,17, aby wychwycić metylowane RNAs^{18,19,20, do badania interakcji RNA-RNA21,22}, oraz do mapowania 3' ends^23,24.

Pomimo ogromnego wkładu technik opartych na CLIP w naszym zrozumieniu interakcji między RBP i RNA, zostało to ograniczone przez nieefektywność sieciowania UV. Chociaż komórki hodowlane hodowane w monowarstwie są na ogół stosunkowo łatwe do sieciowania, jest to znacznie trudniejsze w tkankach lub komórkach w roztworze. Tkanki mogą wymagać wielu rund ekspozycji na promieniowanie UV, aby przeniknąć do wymaganych warstw komórkowych, podczas gdy komórki drobnoustrojów są często hodowane w bogatych pożywkach, które zawierają aromatyczne związki pochłaniające promieniowanie UV²⁵. Rzeczywiście, czasy naświetlania promieniami UV do 30 minut zostały wykorzystane do wygenerowania wystarczającego usieciowania między RBP a związanymi z nimi RNA dla takich próbek^26,27,28. Ta przedłużona ekspozycja na promieniowanie UV wywołuje reakcje stresowe w komórce, takie jak uszkodzenia DNA wywołane promieniowaniem UV, które mogą zanieczyścić dane końcowe w niektórych zastosowaniach.

Większość badań CLIP skupia się na generowaniu pojedynczych "migawek" specyficznych interakcji białko-RNA w komórce. Jednak interakcje białko-RNA są z natury dynamiczne, szczególnie gdy komórki podlegają zmianom w swoim środowisku. Może to obejmować nagłe zmniejszenie dostępności niezbędnych składników odżywczych lub gwałtowne zmiany temperatury. W związku z tym, aby w pełni zrozumieć rolę RBP podczas stresu, najlepiej jest przeprowadzić analizy czasowo-rozdzielcze, ponieważ mogą one uchwycić pełne spektrum celów RBP podczas stresu i określić, na jakim etapie reakcji na stres wybrany RBP jest aktywny. W szczególności badania na drożdżach wykazały, że pierwsze kilka minut adaptacji jest absolutnie kluczowe dla przetrwania, a okres półtrwania RNA u bakterii może wahać się od minut do sekund^{29,30,31,32,33}. Dlatego najlepiej byłoby, gdyby takie analizy czasowo-rozdzielcze były wykonywane w wysokiej rozdzielczości czasowej. Jednak długi czas sieciowania sprawia, że badanie reakcji adaptacyjnych na wczesnym etapie jest szczególnie trudne.

Aby przezwyciężyć te problemy, niedawno opracowaliśmy ulepszoną metodę, która jest w stanie sieciować i zbierać komórki w minutowych skalach czasowych. Nasza metoda χCRAC pozwala na ilościowy pomiar dynamicznych zmian w oddziaływaniach RBP-RNA w nieobserwowanej wcześniej rozdzielczości. Kluczowe znaczenie dla tej metody miało opracowanie nowatorskiego urządzenia do naświetlania promieniami UV³², które około 10-krotnie skraca wymagany czas sieciowania drożdży i bakterii w roztworze, skutecznie zamrażając interakcje RBP-RNA. Ponadto, w celu szybkiego zebrania komórek po naświetlaniu promieniami UV, opracowaliśmy urządzenie do filtracji próżniowej, które może zbierać gwałtownie rosnące drożdże w kulturze o pojemności 0,5 l w około 30 s³². Te innowacje technologiczne pozwalają na badanie dynamiki RBP-RNA w rozdzielczości minutowej. Dodatkowo wprowadziliśmy również kilka optymalizacji do oryginalnego protokołu CRAC² w celu zwiększenia jego praktyczności.

Korzystając z χCRAC, niedawno badaliśmy cel drożdżowego jądrowego RBP, Nab3, w odpowiedzi na niedobór glukozy. U Saccharomyces cerevisiae Nab3 może tworzyć kompleks z Nrd1, RBP i helikazą RNA Sen1, tworząc kompleks NNS. Wiązanie NNS z polimerazą RNA i powstającym transkryptem może wywołać terminację transkrypcji³⁴. Kompleks ten jest głównie zaangażowany w usuwanie tajemniczych niekodujących transkryptów RNA, ale wykazano również, że reguluje ekspresję genów kodujących białka. Badanie wykazało zróżnicowane ukierunkowanie Nab3 na transkrypty niekodujące i kodujące już po minucie stresu³². Wykazaliśmy, że kotranskrypcyjna terminacja przez Nab3 powoduje bardzo przejściową, pulsacyjną ekspresję genów retrotranspozonów, która byłaby trudna do wykrycia przy użyciu tradycyjnych podejść opartych na CLIP. Dodatkowo, krótkie czasy naświetlania promieniami UV w naszym sieciowniku UV również znacznie zwiększyły odzysk krótkożyciowych niekodujących RNAs³². χCRAC będzie prawdopodobnie kluczowym narzędziem w wyjaśnianiu nie tylko, w jaki sposób RBP kształtują reakcję na stres w bezpośrednich skalach czasowych, ale także ich zmieniających się ról w całym cyklu życia odpowiedzi. Niniejszy manuskrypt zawiera szczegółowy przegląd wszystkich etapów protokołu χCRAC. W celach ilustracyjnych metoda ta została wykorzystana do zbadania drożdżowego białka Nrd1, które bierze udział w terminacji transkrypcji i rozpadzie RNA^35,36, oraz jego docelowego RNA w odpowiedzi na deprywację glukozy w wielu punktach czasowych. Na koniec wykazaliśmy również, że nasze urządzenie do naświetlania promieniami UV może szybko sieciować RBP z RNA w komórkach HeLa, umożliwiając również wykonywanie analiz czasowo-rozdzielczych o wysokiej rozdzielczości w komórkach przylegających.

Protokół

TN150

50 mM Tris pH 7,8

150 mM NaCl

0,1% NP-40

1X inhibitor proteazy

TN1000

50 mM Tris pH 7,8

1 mln NaCl

0,1% NP-40

NP-PNK

50 mM Tris-HCl pH 7,8

10 mM MgCl2

0,1% NP-40

5 mM beta-merkaptoetanol

5 x PNK

250 mM Tris-HCl pH 7,8

50 mM MgCl2

50 mM beta-merkaptoetanolu

WB I

50 mM Tris-HCl pH 7,8

300 mM NaCl

10 mM imidazol

6M guanidyna-HCl

0,1% NP-40

5 mM beta-merkaptoetanol

Balans bieli II

50 mM Tris-HCl pH 7,8

50 mM NaCl

10 mM imidazol

0,1% NP-40

5 mM beta-merkaptoetanol

Bufor elucyjny

50 mM Tris pH 7,8

50 mM NaCl

250 mM imidazol

0,1% NP-40

5 mM beta-merkaptoetanol

Bufor proteazy K

50 mM Tris

0,1% NP-40

5 mM β-merkaptoetanolu

1% SDS

5 mM EDTA

50 mM NaCl2

Bufor do lizy ssaków

50 mM Tris-HCl pH 8

100 mM NaCl

0,5% v/v Triton X-100

0,25% w/v Na-deoksycholanu

0,1% w/v SDS

5 mM EDTA

1 mM naziemna telewizja cyfrowa (dodana na świeżo)

1X inhibitor proteazy

powiedział:

Tabela 1: wymagane dla χCRAC i ich składu.

1. Sieciowanie UV i produkcja lizatu

1. Mikroorganizmy w roztworze
   1. Zaszczepić 3,5 l pożądanej pożywki drożdżami z nocnej kultury do wyjściowego OD₆₀₀ 0,05. Rosnąć w temperaturze 30 °C z ciągłym wytrząsaniem przy 180 obr./min.
   2. Podczas wzrostu przygotuj inne niezbędne materiały.
      1. Przygotuj pojemnik z ciekłym azotem.
      2. Przygotować 3 l podłoża wywołującego stres i ogrzać do temperatury 30 °C w łaźni wodnej.
      3. Ustaw aparaturę filtrującą, włącz środek sieciujący (Rysunek 2A) i oznacz stożkowe probówki o pojemności 50 ml, po jednej dla każdego punktu czasowego.
   3. Gdy komórki osiągną pożądaną średnicę zewnętrzną₆₀₀, wlej 500 ml komórek bezpośrednio do środka sieciującego i naświetl UV 250 mJ promieniowania UV o długości fali 254 nm. Zobacz Rysunek 2A i Rysunek 3A, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat korzystania z crosslinkera.
      UWAGA: Energia promieniowania UV musi być starannie zoptymalizowana dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
   4. Po usieciowaniu przefiltruj komórki za pomocą jednego z urządzeń do filtracji próżniowej (Rysunek 2B,C). Zwinąć membranę z przefiltrowanymi komórkami, umieścić w stożkowej probówce t = 0 (czas zero) o pojemności 50 ml i błyskawicznie zamrozić w ciekłym azocie.
   5. Przefiltruj pozostałe komórki przez sześć różnych filtrów. Zebrane komórki należy zawiesić w 3 litrach uprzednio podgrzanej pożywki wywołującej stres, wrzucając błony do pożywki i energicznie mieszając z paskiem przez 50 sekund. Po upływie 50 s przygotować się do pobrania t = 1 próbki.
   6. Po 1 minucie usieciować 500 ml komórek i zebrać przez filtrację, jak w krokach 1.1.3–1.1.4. Powtórz po 2, 4, 8, 14 i 20 minutach lub w różnych punktach czasowych w razie potrzeby.
   7. Przechowywać stożkowe probówki zawierające komórki w temperaturze -80 °C. Ustawić sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS) w temperaturze 4 °C na noc.
   8. Następnego dnia weź każdą stożkową probówkę zawierającą usieciowaną próbkę i ponownie zawieś komórki w 25 ml zimnego PBS, energicznie wstrząsając.
   9. Przenieść zawiesiny komórek do nowych stożkowych probówek i wirować z prędkością 4 600 x g, 5 minut w temperaturze 4 °C.
   10. Odlej PBS, szybko ponownie odwiruj, aby zebrać resztki PBS, a następnie zdekantuj pozostały płyn za pomocą pipety.
   11. Oblicz wagę granulki w tubie, porównując ją z pustą tubą.
   12. Dodaj dwie objętości osadów lodowatego TN150, 60 μl DNazy 1 i 10 μl inhibitora RNazy. Inkubować na lodzie przez 30 minut.
       1. Na przykład na 400 mg komórek dodaj 800 μl lodowatego TN150.
       2. Dodanie DNazy nie jest niezbędne dla większości rozpuszczalnych białek, ale jest bardzo ważne podczas badania białek związanych z chromatyną, takich jak polimeraza RNA. Dodatkowo zmniejsza lepkość lizatów bakteryjnych. Bardzo ważne jest, aby użyć dokładnie dwóch objętości granulek buforu do lizy, w przeciwnym razie wydajność lizy może się zmniejszyć.
   13. Dodać trzy objętości granulek (w ml) kulek cyrkonu do zawiesiny komórek. W przypadku drożdży użyj kulek o średnicy 0,5 mm, a w przypadku bakterii użyj 0,1 mm.
       1. Na przykład w przypadku 400 mg komórek odmierz 1,2 ml kulek cyrkonu w probówce o pojemności 1,5 ml i dodaj je do komórek zawieszonych w buforze do lizy.
   14. Wiruj zawiesiny komórkowe przez 1 minutę, a następnie umieść na lodzie na 1 minutę. Powtórz w sumie 5x.
   15. Dodaj dwie objętości granulek buforu TN150 i energicznie wiruj, aby wymieszać.
   16. Odwirować zawiesinę w stożkowej probówce o masie 4 600 g przez 20 minut w temperaturze 4 °C w wirówce stołowej.
       1. Po odwirowaniu należy pobrać próbkę supernatantu o objętości 50 μl do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania ekspresji białek w całej komórce.
   17. Przenieść supernatanty do probówek o pojemności 1,5 ml i wirować lizat przez 20 minut w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C, w mikrofugach.
       1. Alternatywnie, jeśli używasz probówek o pojemności 5 ml, odwiruj przy 13 000 x g przez 20 minut.
       2. Po odwirowaniu należy pobrać próbkę supernatantu o objętości 50 μl do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania rozpuszczalnej ekspresji białka.
   18. Przejdź do wychwytywania RBP (sekcja 2).
2. Hodowane komórki adherentne
   1. Zasiej wystarczającą ilość przylegających komórek na szalce Petriego na 24 godziny przed sieciowaniem UV, aby następnego dnia mogły osiągnąć 80% zbieżności. Uprawiać przez noc w żądanym podłożu w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO₂,
      UWAGA: W przypadku stosowania kwarcowych szalek Petriego korzystne jest promowanie adhezji komórek poprzez traktowanie naczyń poli-D-lizyną (70 000–140 000 wag.) i płodową surowicą cielęcą (FCS) na 2,5 godziny przed siewem. Dodaj tyle poli-D-lizyny, aby pokryć całą powierzchnię wzrostu i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 5 minut. Następnie kwarcową szalkę Petriego należy dokładnie spłukać wodą i suszyć w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2 godziny lub do całkowitego wyschnięcia. Następnie dodaj tyle FCS, aby całkowicie pokryć powierzchnię wzrostu i umieść w inkubatorze na co najmniej 30 minut. FCS powinien zostać całkowicie usunięty przed wysiewem komórek.
   2. Gdy komórki osiągną 80% zbieżności, usuń pożywkę i przemyj 15 ml lodowatego PBS. Następnie całkowicie usuń cały pozostały płyn i natychmiast przejdź do następnego kroku.
   3. Przenieś szalkę Petriego na tackę na przylegające komórki (Rysunek 3B) i naświetlaj promieniowaniem UV 300 mJ o długości fali 254 nm UV. Zobacz Rysunek 2A i Rysunek 3B, aby uzyskać szczegółowe informacje na temat korzystania z crosslinkera.
      UWAGA: Energia promieniowania UV musi być starannie zoptymalizowana dla każdego białka będącego przedmiotem zainteresowania. Zobacz Dyskusję, aby uzyskać więcej informacji.
   4. Natychmiast po usieciowaniu umieść szalkę Petriego na lodzie i dodaj 10 ml lodowatego PBS. Zebrać komórki, zeskrobując je i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Osad przez odwirowanie w temperaturze 300 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C.
   5. Usunąć PBS i ponownie zawiesić osad komórkowy w 1 ml lodowatego PBS i przenieść do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Ponownie osadzać komórki przez odwirowywanie przez 5 minut przy 300 x g w temperaturze 4 °C.
   6. Wyjmij PBS i zatrzaskowo zamroź granulki komórek na suchym lodzie. Przechowywać granulki komórek w temperaturze -80 °C do momentu, gdy będą potrzebne.
   7. Powtórz kroki 1.2.3–1.2.6 dla każdego punktu czasowego.
   8. Ponownie zawiesić granulki komórek w 1 ml buforu do lizy i przenieść do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Następnie dodaj 1 ml buforu do lizy, co daje w sumie 2 ml.
   9. Dodać 5 μl inhibitora RNazy ssaków.
   10. Sonikuj 5x przez 10 s na lodzie przy 10 amperach. Odczekaj 30 s między rundami sonikacji.
   11. Obliczyć stężenie białka w każdej próbce i znormalizować do najniższego stężenia.
   12. Przenieś 1,98 ml lizatu do probówki o pojemności 2 ml.
   13. Dodać 10 μl DNazy I i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut z wytrząsaniem przy 1 200 obr./min.
   14. Odwirować lizat przy 16 000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C.
       1. Po odwirowaniu należy pobrać 50 μl próbki supernatantu do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania rozpuszczalnej ekspresji białka.
   15. Przejdź do wychwytywania RBP (sekcja 2).

2. Przechwytywanie RBP

1. Przemyć magnetyczne kulki anty-FLAG (75 μl gnojowicy na próbkę) lub agarozy IgG (500 μl gnojowicy na próbkę) 3x za pomocą 5 ml TN150. Zawiesić w końcowej objętości 700 μl TN150 i dodać 100 μl umytych kulek do siedmiu stożkowych probówek o pojemności 15 ml.
   1. Przechowywać na lodzie do czasu, aż będzie to wymagane.
2. Po sklarowaniu lizatów dodać supernatant do probówki zawierającej kulki anty-FLAG/IgG.
3. Nutian w temperaturze 4 °C przez 2 h.
   UWAGA: Niektóre protokoły opisują nocne inkubacje z kulkami, ale nie jest to zalecane, ponieważ długi czas inkubacji może znacznie zmniejszyć odzyskiwanie usieciowanych RNA.

3. Mycie koralików i dekoltu TEV

1. Zbierz koraliki i usuń lizat.
   1. Pobrać 50 μl próbki supernatantu do przyszłej analizy Western blot w celu zbadania niewychwyconego białka.
2. Ponownie zawiesić kulki w lodowatym TN1000 i przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml. Prać przez 10 min, w temperaturze 4 °C, z nutacją. Powtórz w sumie trzy prania.
   1. Jeśli używasz kulek agarozy IgG, przemyj 5 ml TN1000. Jeśli używasz koralików anty-FLAG, użyj 2 ml.
3. Następnie umyj koraliki 3x za pomocą TN150, o tej samej objętości co powyżej.
4. Po trzecim praniu ponownie zawieś kulki w 600 μl TN150.
5. Dodaj 30 U domowej roboty proteazy GST-TEV do zawiesiny koralików i obracaj przez 2 godziny w temperaturze RT.
   UWAGA: Rekombinowana proteaza GST-TEV jest obecnie również dostępna na rynku, ale nie została przetestowana przy użyciu tego protokołu.
   1. Podczas trawienia przygotuj się do kolejnych kroków, ustawiając kolumny po trzy probówki o pojemności 1,5 ml dla każdej próbki (tj. dla siedmiu próbek powinny mieć trzy rzędy po siedem kolumn).
   2. Do ostatniego rzędu probówek dodać 0,4 g chlorowodorku guanidu, 27 μl 5M chlorku sodu i 3 μl 2,5 M imidazolu (pH = 8). Należy pamiętać, że pH imidazolu musi wynosić 8. Ma to kluczowe znaczenie dla utrzymania integralności RNA.
   3. Dodatkowo umyć wymaganą objętość kulek niklowych w WB I 3x. Użyć 100 μl gnojowicy na próbkę. Po ostatnim umyciu ponownie zawiesić kulki w tej samej pierwotnej objętości WB I i przechowywać na lodzie.
6. Po zakończeniu trawienia TEV zebrać supernatant za pomocą stojaka magnetycznego do kulek anty-FLAG lub odwirowania do kulek IgG i przenieść do pierwszego rzędu wcześniej ustawionych probówek.
   1. Pobrać 50 μl próbki eluatu TEV do analizy Western blot.
7. Ustawić inkubator z termoblokiem na 37 °C. Do drugiego rzędu probówek dodać 1 μl koktajlu RNazy (rozcieńczenie 1:50).
8. Pobrać 550 μl eluatu TEV z pierwszego rzędu probówek i dodać do drugiego rzędu (zawierającego koktajl RNazy). Energicznie pipetować, aby zapewnić mieszanie.
9. Po wykonaniu tej czynności dla pierwszej próbki natychmiast umieść rurkę w termobloku i uruchom timer. Przejdź do kolejnych próbek, tak aby każda z nich była rozłożona w czasie.
10. Inkubować dokładnie przez 5 minut. Po zakończeniu wyjąć pierwszą próbkę z termobloku i przenieść roztwór do trzeciego rzędu probówek (zawierających proszek chlorowodorku guanidu).
    UWAGA: 5-minutowa inkubacja z rozcieńczeniem koktajlu RNazy w stosunku 1:50 jest zwykle odpowiednia dla większości białek, ale ten krok będzie musiał być starannie zoptymalizowany z różnymi czasami inkubacji lub stężeniami dla każdego białka, aby upewnić się, że usieciowane RNA mają odpowiednią wielkość (30-100 nt).
11. Natychmiast wirować przez kilka sekund z pełną prędkością, aby rozpuścić proszek guanidu, a następnie przejść do następnej próbki.
12. Po przeniesieniu wszystkich próbek do proszku guanidu, ponownie przeprowadź wirowanie, aby upewnić się, że cały proszek jest całkowicie rozpuszczony.
13. Dodać 100 μl umytych kulek niklowych i obracać przez noc w temperaturze 4 °C. Inkubację tę można skrócić do 2 godzin.

4. Leczenie fosfatazą alkaliczną na koralikach

1. Ustawić termoblok na 37 °C.
2. Umieścić wirową kolumnę oczyszczającą w probówce o pojemności 2 ml, po jednej na każdą próbkę. Przenieść kulki niklu do kolumn i pozwolić supernatantowi spłynąć. Następnie upewnij się, że wszystkie kulki niklu zostały usunięte z probówki o pojemności 1.5 ml, spłukując WB I i nakładając na kolumnę.
3. Ustaw probówki o pojemności 2 ml, po sześć na próbkę (jedna do zbierania każdego prania). Utrzymuj zewnętrzną część kolumn w suchości, aby utrzymać przepływ. Umyj kulki 3x 500 μL WB I, a następnie 3x 500 μL NP-PNK.
4. Zamknij pokrywę kolumny wirującej i krótko zakręć koralikami, aby usunąć nadmiar bufora.
5. Umieścić korek na kolumnie, umieścić kolumny w probówkach o pojemności 1,5 ml i dodać 60 μl mieszaniny reakcyjnej widocznej w tabeli 2.

Rozdział

składnik	1x	7,5-krotnie
5 x bufor PNK	12	90
Fosfataza alkaliczna	4	Rozdział 30
Inhibitor RNazy	cyfra arabska	15
H2O	42 Rozdział 42	Rozdział 315
Ostatni tom	60 μL	450 μL

Tabela 2: Mieszanina reakcji fosfatazy alkalicznej.

6. Inkubować koraliki przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.
7. Przemyć kulki 1x 500 μl WB I w celu inaktywacji fosfatazy alkalicznej, a następnie 3x 500 μl buforu NP-PNK. Upewnij się, że dokładnie przepłukałeś wnętrze kolumny buforem NP-PNK, aby usunąć wszelkie ślady guanidu.

5. Ligacja na koraliku łącznika App-PE do końca 3' RNA

1. Odwirować pozostały bufor i dodać 60 μl mieszaniny określonej w tabeli 3 (zob. tabela 4 dla sekwencji App-PE) do kolumn. Inkubować reakcję przez 6 godzin w temperaturze 25 °C.

Rozdział pkt. Rozdział pkt. TGL

składnik	1x	7,5-krotnie
5 x bufor PNK	12	90
Adapter App-PE (100 μM)	0,6	Rozdział 4.5
Ligaza RNA T4 2 obcięta K227Q	3	22,5
Inhibitor RNazy	1,5	Godzina 11.25
50% PEG 8000	12	90
H2O	30,9	231,75
Ostatni tom	60 μL	450 μL

Tabela 3: Mieszanina reakcji ligacji łącznika App-PE.

powiedział:

Nazwa oligonukleotydu	Sekwencja (5'-3')
L5Aa	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrUrCrCrUrUrNrNrNrUrArArGrCrN-OH
L5Ab	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrUrUrCrCrArUrUrNrNrArUrUrArGrCrN-OH
L5Ac	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrCrUrUrNrNrNrGrCrCrGrCrArGrN-OH
L5Ad (Reklama L5)	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrUrUrCrUrCrRNrNrCrGrGrCrGrUrUrArGrN-OH
L5Ba	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrGrArUrUrUrUrNrNrNrArGrArGrCrN-OH
L5BB	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrGrArUrCrUrUrRNrNrGrUrGrArGrN-OH
L5BC (Prowincja L5BC)	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrNrCrArGrN-OH
L5Bd powiedział:	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrUrUrCrUrUrNrNrUrUrCrUrUrArGrN-OH
L5Ca	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrGrArUrUrUrNrNrCrUrRNrCrNr-OH
L5Cb	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrCrUrRrNrNrUrGrGrArGrCrN-OH
L5Cc	invddT-ACACrGrArCrGrGrUrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrNrArCrUrUrCrArGrCrN-OH
L5Cd	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrNrNrGrArCrCrUrArGrN-OH
L5Da	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrCrUrRNrNrCrGrGrGrArUrN-OH
L5Db	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrCrCrArUrCrUrRNrNrGrCrArCrUrArN-OH
L5Dc (Prąd Całkowity)	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrGrArUrUrUrRrNrNrUrArGrGrCrN-OH
L5Dd	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrUrUrNrNrNrArUrCrArCrArGrN-OH
L5Ea	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrCrRrNrCrArCrUrGrUrN-OH
L5Eb	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrCrUrUrRNrNrGrUrGrArCrArN-OH
L5Ec	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrCrArUrCrUrUrNrNrNrUrGrUrCrArCrN-OH
L5Ed	invddT-ACACrGrArCrGrCrUrUrUrCrCrCrArUrUrUrNrNrNrArCrArGrGrN-OH
App_PE	App-NAGATCGGAAGAGCACACGTCTG-ddC

Tabela 4: Sekwencje adapterów DNA i RNA wymagane do ligacji na końcach 5' i 3' przechwyconych RNA. Zostały one oczyszczone za pomocą HPLC wolnej od RNaz.

2. Kulki płuczące przemywać 1x 500 μL WB I i 3x 500 μL buforu NP-PNK. Umieść kolumnę w nowej rurce i odkręć pozostały bufor
.

6. Fosforylacja na koralikach końców 5' RNA

1. Dodać 80 μl mieszaniny określonej w tabeli 5 do kolumn. Inkubować reakcję przez 40 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Próbki będą teraz wysoce radioaktywne. W związku z tym wszystkie późniejsze prace powinny być wykonywane za osłoną ochronną, a odpady należy utylizować zgodnie z lokalnymi przepisami BHP.

szt. pkt. pkt.

składnik	1x	7,5-krotnie
5 x bufor PNK	16	120
32P-ɣATP (10 μCi/μL)	3	22,5
T4 PNK	3	22,5
H2O	Rozdział 58	Z numerem 435
Ostatni tom	80 μL	600 μL

Tabela 5: Mieszanina reakcji fosforylacji.

2. Dodać 1 μl 100 mM ATP i pozostawić reakcję na kolejne 20 minut. Zapewni to, że prawie wszystkie końce 5' będą zawierały fosforany, aby ułatwić ligację łącznika 5'.
3. Ustaw probówki o pojemności 2 ml, po pięć na próbkę.
4. Kulki płuczące przemywać 1x 500 μL WB I i 3x 500 μL buforu NP-PNK. Należy pamiętać, że te uwolnienia będą bardzo radioaktywne i dlatego należy je odpowiednio zutylizować.
5. Przenieś kolumnę do ostatniej rurki i odkręć pozostały bufor.

7. Podwiązanie na koraliku łącznika 5'

UWAGA: Łączniki 5' zawierają kod kreskowy RNA, który jest używany do identyfikacji każdej próbki po sekwencjonowaniu. Dlatego absolutnie ważne jest, aby zanotować, który łącznik jest używany dla której próbki.

1. Dodać 78 μl mieszaniny opisanej w tabeli 6 do kolumn. Dodać 2 μl adaptera 5' (100 μM; patrz tabela 4) do każdej probówki i inkubować przez noc w temperaturze 18 °C.

szt. Rozdział .

składnik	1x	7,5-krotnie
5 x bufor PNK	16	120
ATP (10 mM)	8	60
Inhibitor RNazy	cyfra arabska	15
Ligaza RNA T4	4	Rozdział 30
H2O	Rozdział 48	360 pkt
Ostatni tom	78 μL	585 μL

Tabela 6: 5' mieszanina reakcji ligacji łącznika.

2. Następnego dnia przemyj kulki 1x 500 μl WB I i 3x 500 μl WB II i przenieś kolumny do nowej probówki o pojemności 2 ml.

8. Elucja, SDS-PAGE i ekstrakcja RNA

1. Ustawić wirówkę na 4 °C. Przygotować dwa rzędy probówek o pojemności 1,5 ml na próbkę do elucji.
2. Szybko odkręć pustą objętość kolumn za pomocą kulek niklowych. Umieścić kolumny w pierwszym rzędzie probówek elucyjnych i dodać 200 μl buforu elucyjnego. Odczekaj 2 minuty, a następnie przepchnij bufor przez kolumnę szybkim obróceniem.
3. Przenieś kolumny do drugiego rzędu rur i powtórz krok 8.2. Każda próbka będzie teraz miała łącznie 400 μl eluatu, podzielonych na dwie probówki o pojemności 1,5 ml.
   1. Weź wszystkie eluaty i przenieś je razem do probówki o pojemności 5 ml. Dodać 2 μl 20 mg/ml glikogenu. Tak więc, jeśli użyjemy siedmiu próbek, w probówce o pojemności 5 ml będzie teraz 2,8 ml zbiorczego eluatu.
4. Dodać 100 μl kwasu trichlorooctowego (TCA) na próbkę [np. 700 μl TCA na 7 próbek (2,8 ml zbiorczego eluatu)] do probówki o pojemności 5 ml i dobrze wirować przez 30 s.
5. Inkubować na lodzie przez 20 minut.
6. Wirować przez 30 minut w temperaturze 17 000 x g, 4 °C, w wirówce stołowej.
7. Ostrożnie usunąć supernatant z rurki stożkowej, sprawdzając pipetę za pomocą licznika Geigera, aby upewnić się, że osad nie został przypadkowo usunięty. Jeśli tak, umieść supernatant z powrotem w probówce i odwiruj przez kolejne 10 minut.
   UWAGA: Supernatant może być nadal wysoce radioaktywny. Upewnij się, że używasz odpowiedniego ekranowania.
8. Całkowicie zawiesić osad w 2 ml lodowatego acetonu.
9. Wirować przez 15 minut w temperaturze 17 000 x g, 4 °C.
10. Usuń jak najwięcej acetonu za pomocą pipety P1000. Następnie krótko zakręć probówką, aby zebrać małe kropelki acetonu, a następnie usuń za pomocą pipety P10. Suszyć przez 2 minuty w dygestorium.
    UWAGA: Supernatant acetonu może być nadal radioaktywny. Upewnij się, że używasz odpowiedniego ekranowania.
11. Zawiesić próbkę w 30 μl 1x buforu ładującego białko. Aby upewnić się, że osad jest prawidłowo zawieszony, należy sprawdzić, czy zdecydowana większość radioaktywności jest teraz obecna w buforze ładującym i nie pozostała w probówce o pojemności 1,5 ml, usuwając roztwór z pipety P200 i mierząc aktywność pozostałą w probówce 1,5 ml za pomocą licznika Geigera.
12. Podgrzewać próbkę przez 10 minut w temperaturze 65 °C. Załadować prefabrykowany żel Bis-Tris o średnicy 1 mm i 4–12% i pracować przez 1,5 godziny przy napięciu 125 V w buforze MOPS.
13. Po zakończeniu działania żelu otwórz kasetę z żelem. Żel powinien być zatrzymany na dolnej płycie. Wyrzuć górę.
14. Owiń żel folią spożywczą, a następnie przymocuj go taśmą do wnętrza światłoszczelnej kasety. Upewnij się, że kaseta ma amplifier ekran poprawiający sygnał.
15. Naświetlić film autoradiograficzny żelem i przechowywać kasetę w temperaturze -80 °C podczas naświetlania. Czas ekspozycji będzie się różnił w zależności od białek o różnej skuteczności sieciowania.
    1. Podczas umieszczania filmu musi istnieć sposób na ponowne wyrównanie go do kasety, aby w kolejnym kroku wyciąć interesujące nas pasmo. Aby to zapewnić, użyj fluorescencyjnej linijki, a także upewnij się, że żel znajduje się w rogu kasety, która jest następnie pokryta folią również umieszczoną w najwyższym rogu.
       UWAGA: Z reguły eluaty w buforze ładowania, które dają odczyt co najmniej ~250 cps, gdy są wyświetlane na liczniku Geigera, dają wystarczający sygnał na ekspozycję trwającą 3 godziny. W przeciwnym razie przeprowadzana jest nocna ekspozycja.
16. Wywołaj film. Odetnij folię spożywczą pokrywającą żel, ale nie przesuwaj żelu. W przeciwnym razie obraz zostanie przesunięty w stosunku do gel.
    UWAGA: Żel będzie prawdopodobnie wysoce radioaktywny. Upewnij się, że używasz odpowiedniej osłony podczas wycinania plastra żelu.
17. Umieść folię na żelu i wytnij interesującą Cię opaskę. Włóż plasterek żelu do probówki o pojemności 2 ml.
18. Rozbij plasterek żelu za pomocą końcówki pipety P1000 i dodaj 600 μl buforu proteinazy K oraz 200 μg proteinazy K (w tym protokole używa się 10 μl roztworu proteinazy K o stężeniu 20 mg/mL). Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 55 °C, energicznie wstrząsając.
19. Następnie odetnij koniec końcówki P1000 czystym skalpelem i przenieś kawałki supernatantu i żelu do kolumny wirowej umieszczonej w probówce o pojemności 2 ml.
20. Obracać kolumnę przez 1 minutę przy 17 000 x g w temperaturze pokojowej. Zebrać przepływ, który zawiera radioaktywne, izolowane RNA.
21. Przeprowadzić ekstrakcję fenol:chloroform.
    1. Dodać 50 μl 3 M octanu sodu o pH = 5,2 i 500 μl fenolu:chloroform i dobrze odwirować. Wiruj przez 5 minut przy 17 000 x g. Usuń górną warstwę wody i umieść w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
    2. Dodać 500 μl chloroformu i energicznie wirować przez 10–15 s. Wirować przez 5 minut w temperaturze 17 000 x g w temperaturze pokojowej. Usuń warstwę wodną i umieść w nowej probówce o pojemności 1,5 ml.
    3. Dodaj 1 μl 20 mg/ml glikogenu i 1 ml lodowatego 96% etanolu. Wytrącać przez 30 minut w temperaturze -80 °C lub przez noc w temperaturze -20 °C.
    4. Wirować przez 30 minut w temperaturze 4 °C, 17 000 x g. Usunąć sklarowany osad, dodać 500 μl 70% etanolu i wirować przez 5 minut, w temperaturze 4 °C przy 17 000 x g. Usuń cały etanol, wykonaj szybkie wirowanie, aby zebrać pozostałości i usuń nadmiar za pomocą pipety P10.
    5. Suszyć pellet przez ~3 minuty w dygestorium. Zawiesić w 20 μl wody uzdatnionej DEPC.
22. Przechowywać RNA w temperaturze -80 °C przez noc lub natychmiast przejść do etapu odwrotnej transkrypcji.

9. Odwrotna transkrypcja

1. Dodać 2 μl 10 μM oligo RT (PE_reverse; patrz tabela 7) i 4 μl 5 mM dNTP do 20 μl RNA.

Nazwa oligonukleotydu	Sekwencja (5'-3')
P5 do przodu	AATGATACGGCGACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC1	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGATGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGCTCTTCCGATCTCT
Zobacz materiał BC3	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCGATGCTGCTGCTCCCCGATCT
Zobacz materiał BC4	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC5	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTGACTCGTGCTGCTCCCCGATCT
Zobacz materiał BC7	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGATCGTGACTGGAGTGTGCTGCTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC8	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGCTTGTGACTGGAGTGTGCTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC9	CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCAGGTGACTGGAGTGTGCTGCTCTTCCGATCT
Zobacz materiał BC10	CAAGCAGAAGACGGCATGAGATATCACGGTGACTGGAGTGCTGCTGCTCGTGCTCTCTCTCT
PE_reverse	CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT

Tabela 7: Startery PCR (w tym sekwencje kodów kreskowych) i starter odwrotnej transkrypcji.

2. Przenieść do nagrzanego termobloku w temperaturze 85 °C na 3 minuty, a następnie schłodzić na lodzie przez 5 minut. Zebrać zawartość probówki przez krótkie odwirowanie, a następnie dodać 8 μl 5x buforu odwrotnej transkryptazy, 2 μl 100 mM DTT i 2 μl inhibitora RNazy.
3. Inkubować mieszaninę w temperaturze 50 °C przez 3 minuty, a następnie dodać 2 μl odwrotnej transkryptazy i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 50 °C.
4. Dezaktywować odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 65 °C przez 15 minut.
5. Przenieść probówki do nagrzanego termobloku w temperaturze 37 °C i pozostawić na 3 minuty w celu aklimatyzacji.
6. Dodać 2 μl RNazy H i inkubować przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
7. Wyizoluj cDNA za pomocą kulek SPRI.
   1. Dodać dwie objętości po 84 μl kulek. Inkubować przez 15 minut. Połóż koraliki na stojaku magnetycznym i pozostaw na 1 minutę, aby zebrać koraliki.
   2. Usunąć i usunąć supernatant oraz dodać 200 μl 70% etanolu. Nie wyjmuj koralików z stojaka magnetycznego. Inkubuj kulki z etanolem przez 30 sekund.
   3. Usuń etanol i powtórz etap mycia. Usuń cały pozostały etanol za pomocą końcówki P10.
   4. Umieść koraliki w dygestorium na 2 minuty, aby je wysuszyć. Wyjmij koraliki ze stojaka, umieść je ponownie w 12 μl wody, a następnie umieść koraliki z powrotem na stojaku. Usunąć 11 μl supernatantu.
8. Zamrozić cDNA w temperaturze -20 °C lub natychmiast przejść do etapu PCR.

10. Reakcja qPCR

1. Przed ostatecznym PCR w celu amplifikacji cDNA przeprowadza się ilościową reakcję łańcuchową polimerazy (qPCR) w celu określenia optymalnej liczby cykli amplifikacji cDNA, aby zapobiec nadmiernej amplifikacji biblioteki.
2. Ustawić reakcję qPCR na lodzie zgodnie z tabelą 8. Patrz Tabela 7 dla wszystkich starterów.

składnik	1x
2x mastermix reakcji qPCR	5
Starter 0,1 μM P5 (do przodu)	0,8
Starter 0,1 μM BC (odwrócony)	0,8
cDNA (lub woda jako kontrola ujemna)	1
H2O	2.4
Ostatni tom	10 μL

Tabela 8: mieszanina reakcyjna qPCR.

3. W celu prawidłowego określenia ilościowego cykli potrzebnych do amplifikacji należy użyć trzech kontrprób technicznych dla cDNA i trzech ujemnych (tj. wody) kontroli.
4. Uszczelnij płytki optycznie przezroczystą folią i uruchom qPCR zgodnie z instrukcjami producenta zestawu.
5. Przeanalizuj próbki za pomocą bezwzględnej metody kwantyfikacji, aby określić liczbę cykli (n), w których osiągane jest kolano wykładniczego wzrostu (patrz Rysunek 4C dla przykładu). Ta liczba cykli jest następnie wykorzystywana do ostatecznej amplifikacji reszty cDNA.

11. Reakcja PCR i ekstrakcja żelu

1. Ustawić reakcję PCR na lodzie zgodnie z tabelą 9. Patrz Tabela 7 dla wszystkich podkładów.
   UWAGA: Używane jest tylko 5 μL biblioteki cDNA.

pkt.

składnik	1x
10 x bufor polimerazy z korektą	5
Podkład 10 μM P5 (do przodu)	1
Starter 10 μM BC (rewers)	1
5 mM dNTP	Rozdział 2.5
Korekta odczytu enzymu polimerazy	1
Zawartość cDNA	5
H2O	34,5
Ostatni tom	50 μL

Tabela 9: Mieszanina reakcyjna PCR.

2. Uruchom PCR w następujący sposób: 95 °C przez 2 minuty; n cykli 98 °C przez 20 s, 52 °C przez 30 s i 72 °C przez 1 minutę i 72 °C przez 5 minut. Liczbę (n) cykli amplifikacji biblioteki χCRAC określa się za pomocą qPCR opisanego w sekcji 10.
3. Dodać 1 μl egzonukleazy I i inkubować w temperaturze 37 °C przez 60 minut.
4. Oczyść amplifikowane cDNA za pomocą kulek SPRI, jak opisano powyżej, używając dwóch objętości kulek (tj. 100 μL). Eluować w 11 μl.
5. Dodaj 3 μl 6-krotnego barwnika ładującego i pracuj na prefabrykowanym 6% żelu TBE przy 100 V przez 1 godzinę w 1x buforze TBE. Użyj drabiny odpowiedniej do ilościowego oznaczania krótkich fragmentów DNA.
6. Po zakończeniu wyjmij żel z kasety i umieść go w odpowiednim, szczelnym pojemniku z wystarczającą ilością 1x TBE, aby pokryć żel (np. ~50 ml). Dodaj odpowiednią ilość bezpiecznego barwnika SYBR (np. na 50 ml użyj 5 μl barwnika 10 000x)
7. Pozostawić żel do zabarwienia poprzez delikatne mieszanie przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Odcedź 1x TBE zawierający SYBR i zastąp czystym 1x TBE. Myj żel przez 10 minut, delikatnie wstrząsając w temperaturze pokojowej.
8. Odcedź 1x TBE i umieść żel w przezroczystym folderze. Przytnij folder do odpowiedniego rozmiaru.
9. Zobrazuj żel za pomocą odpowiedniego środka, takiego jak luminowizator. Wyciąć fragmenty DNA od ~175 pz do ~400 pz. Umieść plasterek żelu w tubce o pojemności 1,5 ml.
10. Dokładnie rozbić plasterek żelu za pomocą końcówki P1000 i dodać 400 μl_H2O. Inkubować w temperaturze 37 °C, wytrząsając przez 1 godzinę w termobloku.
11. Zamrażać próbkę na suchym lodzie przez 10 minut, a następnie umieścić z powrotem w termobloku w temperaturze 37 °C, wstrząsając przez 1 godzinę.
12. Utwórz jednostkę filtrującą, biorąc kolumnę filtrującą i wkładając do niej dwa filtry z mikrofibry szklanej. Umieść urządzenie w probówce o pojemności 1.5 ml.
13. Odetnij koniec końcówki P1000 czystym skalpelem i wchłoń rozbitą zawiesinę żelu TBE, a następnie dozuj do jednostki filtrującej utworzonej w kroku 11.12. Wiruj z prędkością 17 000 x g przez 30 s.
14. Dodać 1 μl glikogenu do supernatantu wraz z 40 μl octanu sodu o pH = 5,2 i 1 ml 96% etanolu. Inkubować w temperaturze -80 °C przez 30 min.
15. Wirować przez 30 minut w temperaturze 17 000 x g, 4 °C. Odrzucić supernatant i przemyć 500 μl 70% etanolu.
16. Wirować przez 5 minut, całkowicie usunąć etanol, a następnie suszyć granulki w dygestorium przez 3 minuty.
17. Zawiesić w 10 μl_H2Oi zmierzyć stężenie DNA.

Wyniki

Aby zademonstrować skuteczność metody χCRAC, przeprowadzono eksperyment z udziałem szczepów drożdży wykazujących ekspresję białka Nrd1 znakowanego przez HTP. Szczegółowy schemat opisujący, jak działa ta metoda, znajduje się w Rysunek 1. Podobnie jak Nab3, Nrd1 bierze udział w rozpadzie jądrowego RNA różnych transkryptów RNA³⁷. Wcześniejsze prace z laboratorium Corden sugerowały, że wiązanie Nrd1 z jego celami RNA zmienia się znacząco, gdy komórki są poddawane głodowi glukozy^28,38. W związku z tym komórki rosnące wykładniczo w pożywce zawierającej glukozę (SD-TRP) zostały przesunięte na to samo podłoże bez glukozy (S-TRP) w ciągu czasu, aby monitorować dynamiczne zmiany w interakcjach Nrd1-RNA. Próbki pobrano i usieciowano w komorze Vari-X-linker (Rysunek 3A) przed zmianą, a następnie po 1, 2, 4, 8, 14 i 20 minutach. Pożywka używana do wzrostu komórek była celowo uboga w tryptofan, aby zmniejszyć absorpcję promieniowania UV przez ten aromatyczny aminokwas. Należy pamiętać, że najlepiej jest używać pożywki syntetycznej, która jest sterylizowana filtracyjnie, ponieważ autoklawowanie pożywki może prowadzić do karmelizacji cukrów. To z kolei zmniejsza wydajność sieciowania.

Rysunek 4A przedstawia reprezentatywny autoradiogram z eksperymentu χCRAC. Należy zauważyć, że w tym przykładzie próbki nie zostały połączone razem. Zamiast tego każdy z nich był uruchamiany indywidualnie na żelu. Jest to zalecane do wstępnych testów eksperymentalnych, aby wykazać, że białko skutecznie łączy się krzyżowo z RNA we wszystkich badanych punktach czasowych. Szczególnie intensywny sygnał zaobserwowano przy oczekiwanej masie cząsteczkowej RBP, reprezentującej białko związane z bardzo krótkimi, znakowanymi radioaktywnie RNA, które nie nadają się do sekwencjonowania. W związku z tym wyizolowano sygnał rozmazowy powyżej tego pasma, który jest białkiem usieciowanym z dłuższymi fragmentami RNA. Fragment został wycięty tuż nad pasmem białka plus około 30 kDa. Rysunek 4B pokazuje autoradiogram po wycięciu, z białkiem usieciowanym do krótkich RNA pozostawionych w żelu i wcześniej rozmazanym sygnałem teraz wyciętym.

Po odwrotnej transkrypcji, biblioteka cDNA musi zostać amplifikowana za pomocą PCR. Należy jednak unikać nadmiernej amplifikacji biblioteki, ponieważ może to wprowadzić stronniczość w kierunku sekwencji preferencyjnie amplifikowanych przez polimerazę i generować artefakty PCR. Nadmiernie wzmocnione biblioteki zawierają również dużą liczbę zduplikowanych sekwencji, które są marnotrawione podczas odczytywania sekwencera. W celu obliczenia idealnej liczby cykli PCR do amplifikacji biblioteki końcowej, podwielokrotność cDNA amplifikowano za pomocą qPCR przy użyciu oligonukleotydów P5 i BC. Pierwszy cykl, w którym biblioteka osiągnęła szczyt fluorescencji, został wybrany jako liczba cykli PCR. Rysunek 4C przedstawia przykład qPCR z typowej biblioteki cDNA, który dał szczytową liczbę cykli wynoszącą 16. Wartość ta została następnie wykorzystana do końcowego pcr χCRAC. W celu przetworzenia zsekwencjonowanych danych wykorzystaliśmy oprogramowanie opracowane wcześniej w naszym laboratorium (pyCRAC) i odpowiedni potok do analizy danych kinetycznych CRAC (Nues i in., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Te narzędzia programowe typu open source umożliwiają demultipleksowanie i przycinanie danych, usuwanie duplikatów PCR, identyfikację statystycznie istotnych pików, odczyty klastrów w ciągłe sekwencje i identyfikowanie motywów wiązania³⁹. Więcej informacji na temat działania tych narzędzi można znaleźć na ich stronach internetowych.

Zaczęliśmy również opracowywać protokół χCRAC dla komórek ssaków. Większość linii komórkowych ssaków jest hodowana jako monowarstwa, a taca w naszym sieciowniku z torbą przepuszczającą promieniowanie UV nie nadaje się do eksperymentów z przylegającymi komórkami. Aby przezwyciężyć ten problem, opracowaliśmy etap, w którym użytkownicy mogą naświetlać promieniami UV 1–2 szalki Petriego (o średnicy 150 mm i głębokości 25 mm) za pomocą przylegających komórek (Rysunek 3B). W pierwszym teście zmierzono skuteczność środka sieciującego dla komórek ssaków poprzez sieciowanie i wychwytywanie stabilnie znakowanego GFP-RBM7 przy użyciu przeciwciał anty-GFP i tradycyjnego oczyszczania opartego na CLIP. Jak pokazano w Rysunek 5A, sieciownik był w stanie odzyskać kompleksy białko-RNA z komórek ssaków hodowanych jako monowarstwa przy użyciu promieniowania UV o długości fali 254 nm z wydajnością porównywalną do powszechnie stosowanego urządzenia do naświetlania UV. Jednak standardowe tworzywa sztuczne do hodowli komórkowych zwykle używane do eksperymentów z sieciowaniem UV są nieprzepuszczalne dla promieniowania UV 254 nm. Dlatego w naszym sieciowniku ogniwa otrzymywałyby promieniowanie tylko z górnego banku lamp UV. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy przepuszczalną dla promieniowania UV kwarcową szalkę Petriego do wzrostu komórek i sieciowania. Użycie kultur kwarcowych wykazało solidny odzysk kompleksów białko-RNA przy zaledwie 2 s naświetlania promieniowaniem UV (Rysunek 5B). W połączeniu z metodami wychwytywania RBP dla komórek ssaków, takimi jak technologie CLIP, te krótkie czasy sieciowania są podatne na przebieg czasowy w celu odzyskania czasoprzestrzennych profili wiążących RNA RBP w odpowiedzi na stres genotoksyczny lub szybkie wyczerpanie czynników białkowych, lub równolegle z synchronizacją transkrypcji lub cyklu komórkowego.

Rysunek 6 pokazuje kilka przykładów danych Nrd1 przetwarzanych przez potok χCRAC. Rysunek ten został przygotowany przy użyciu plików bedgraph wygenerowanych przez potok i pakietu GenomeBrowser Pythona (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), który zaprojektowaliśmy, aby uprościć tworzenie obrazów danych w przeglądarce genomu o jakości publikacji. Szare prostokąty reprezentują regiony genomowe, które wyrażają niekodujące RNA, takie jak tajemniczy niestabilny transkrypt (CUT), stabilne niescharakteryzowane transkrypty (SUT)⁴⁰ i niestabilne transkrypty wrażliwe na Xrn1 (XUTs)⁴¹. Dane w Rysunek 6 pokazują, że Nrd1 wiąże się z wieloma z tych niekodujących transkryptów RNA, co jest zgodne z ideą, że białko to jest zaangażowane w degradację tej klasy transkryptów⁴². Rysunek 6A pokazuje region ~15 kb na chromosomie IV. W tym przypadku nastąpił znaczny wzrost wiązania Nrd1 z transkryptami kodującymi transportery glukozy o wysokim powinowactwie HXT6 i HXT7, z których oba są regulowane w górę podczas głodu glukozy. Jest prawdopodobne, że przerwanie transkrypcji przez kompleks NNS może wpływać na kinetykę indukcji tych genów podczas głodu glukozy. Rysunek 6B pokazuje przykład sieciowania Nrd1 do transkryptu Imd3, o którym wiadomo, że jest regulowany przez Nab3⁴³. W tym przypadku dane wykazały znaczące zmniejszenie wiązania przy głodzie glukozy. Poprzednie prace wykazały zmniejszone wiązanie Nab3 z transkryptem Tye7 podczas głodu glukozy⁴⁴. Zgodnie z tą obserwacją, dane χCRAC sugerują, że wiązanie Nrd1 zmniejszyło się podczas głodu glukozy, a sieciowanie Nrd1 z Tye7 było najniższe po 8 minutach stresu (Figura 4C). Wydaje się jednak, że efekt ten był tylko przejściowy, ponieważ po 14 minutach głodu glukozy wiązanie Nrd1 wróciło do poziomów wyjściowych.

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie protokołu χCRAC. Oznaczone szczepy były uprawiane aż do pożądanej gęstości. RBP wskazuje na białko wiążące RNA. Następnie pobrano próbkę referencyjną i usieciowano ją światłem UV o długości fali 254 nm. Pozostałe komórki zebrano przez filtrację, a następnie szybko przeniesiono do pożywki wywołującej stres. W opisanym tutaj eksperymencie χCRAC próbki pobrano i usieciowano 1, 2, 4, 8, 14 i 20 minut po zmianie (1). Interesujący RBP został następnie oczyszczony przy użyciu bardzo rygorystycznego dwuetapowego oczyszczania powinowactwa (2). Następnie przechwycone usieciowane RNA zostały częściowo strawione RNazami, znakowane radioaktywnie na końcu 5', a adaptery zostały na nich podwiązane (3). Adaptery 5' zawierały unikalne sekwencje kodów kreskowych "w odczycie", dzięki czemu poszczególne próbki można było bioinformatyczną separacją po sekwencjonowaniu. Kompleksy RBP-RNA zostały następnie eluowane, połączone i wytrącone razem (4), rozwiązane przez SDS-PAGE i uwidocznione za pomocą autoradiografii (5). Następnie, pojedynczy plasterek żelu zawierający sygnał radioaktywny tuż nad głównym pasmem, zilustrowany przerywaną czerwoną ramką na obrazie autoradiograficznym, został wycięty z żelu (5). Wycinki żelu potraktowano proteazą K, a następnie wyekstrahowano RNA (6), przekształcono w cDNA i amplifikowano za pomocą PCR (7). Etap PCR wprowadził dodatkowe kody kreskowe (żółty blok wprowadzony przez oligo P7), dzięki czemu wiele bibliotek można było zmultipleksować na jednym torze. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Sieciowanie i filtracja próżniowa. (A) Środek sieciujący. Zawiesinę komórek wlewa się do lejka znajdującego się w prawym górnym rogu maszyny (zobacz również Rysunek 3A dla zbliżenia) i trzymany w przezroczystej dla UV torbie umieszczonej na środkowej tacy. Torba ta jest otoczona dwiema przesłonami, które pozostają zamknięte, dopóki użytkownik nie poinstruuje maszyny, aby rozpoczęła etap napromieniania. Komórki są naświetlane światłem UV z tacek zarówno powyżej, jak i poniżej. Maszyna jest dostarczana z lampami UV o długości fali 254 i 365 nm, przy czym ta ostatnia ma zastosowanie do eksperymentów PAR-CLIP. Maszyna jest obsługiwana za pomocą panelu dotykowego znajdującego się w prawym górnym rogu, który pozwala kontrolować dawkę UV lub czas ekspozycji. (B) Po usieciowaniu ogniwa są opróżniane z lewej strony maszyny. Zawiesiny komórek są odzyskiwane za pomocą próżni i odprowadzane do szklanej kolby, skąd można je następnie wlać do urządzenia do filtracji próżniowej w celu zbioru. (C) Urządzenia do filtracji próżniowej. Są one otwierane i zamykane za pomocą klipsa, a między nim wkładany jest filtr. Cztery urządzenia filtracyjne były używane równolegle przez bardzo krótkie szeregi czasowe, aby nie tracić czasu w wyniku wymiany filtrów. (D) Po przefiltrowaniu supernatant pożywki został odsączony do kolb w celu późniejszego usunięcia. Zawory zostały zainstalowane poniżej urządzeń do filtracji próżniowej, aby utrzymać podciśnienie w systemie po wyjęciu filtra. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Sieciowanie komórek zawieszonych i przylegających. (A) Środek sieciujący z komorą Vari-X-linker do komórek zawiesinowych. Kulturę komórkową wlewa się do wlotu próbki (lejka) znajdującego się w prawym górnym rogu tacy. (B) Taca, która może pomieścić plastikowe lub kwarcowe szalki Petriego do sieciowania przylegających komórek lub małych objętości komórek zawiesinowych. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Przygotowanie biblioteki. (A) Przykład autoradiogramu z eksperymentu Nrd1-HTP χCRAC. Silny, skoncentrowany sygnał reprezentuje białko usieciowane z bardzo krótkimi RNA, podczas gdy powyższy rozmaz reprezentuje białko usieciowane z RNA o długości wystarczającej do sekwencjonowania. (B) Wymaz został wycięty, jak pokazano na autoradiogramie wykonanym po wycięciu żelu. (C) Reprezentatywny qPCR z biblioteki cDNA χCRAC. W tym przykładzie maksymalna amplifikacja cDNA została osiągnięta po 16 cyklach. W ten sposób do końcowego wzmocnienia użyto 16 cykli. Słupek błędu reprezentuje odchylenie standardowe trzech technicznych powtórzeń qPCR. (D) Przykład obrazu fosforowego z biblioteki cDNA na 6% żelu TBE. (E) analiza długości i jakości cDNA z elektroforezy kapilarnej opartej na chipie. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 5: Test wysokiej RNazy w eksperymencie iCLIP w celu przetestowania sieciowania w komórkach ssaków. Pokazano autoradiogramy z eksperymentów GFP-RBM7 iCLIP, w których testowano skuteczność odzyskiwania RNP przy różnych energiach sieciowania. Immunoprecypitacje przeprowadzono przy użyciu przeciwciał anty-GFP sprzężonych z kulkami magnetycznymi na usieciowanych komórkach, które stabilnie wykazywały ekspresję GFP-RBM7. Immunoprecypaty inkubowano z wysokimi stężeniami RNazy I w celu przycięcia powiązanych RNA do krótkich, jednolitych długości. RNP wizualizowano za pomocą znakowania ³²P i SDS-PAGE i migrują jako zdefiniowane pasmo, zbliżone do migracji białka nieusieciowanego. Kwantyfikacja wskazuje na wyniki analiz densytometrycznych znakowanego radioaktywnie sygnału RBM7-RNA znormalizowanego do sygnału western blot anty-GFP. (A) Przebieg czasowy sieciowania powszechnie stosowanego sieciownika UVP w porównaniu z naszym sieciownikiem (Vari-X-linker; VxL). (B) Sieciowanie przebiegu czasowego naszego sieciownika na kulturach kwarcowych (po lewej) i plastikowych (po prawej). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Przykładowe wykresy przeglądarki genomu pokazujące moc χCRAC do pokazania różnicowego, czasowego wiązania Nrd1 z jego celami. Każde pole zawiera wykresy dla poszczególnych regionów genomu. Strzałki wskazują, na której nici są zakodowane geny (strzałka skierowana w lewo = nić ujemna; strzałka skierowana w prawo = nić plus). Punkty czasowe (min) są oznaczone symbolami t0, t1, t2 itd. na osiach y każdego podpowierzchni. Pokazane są cyfry rzymskie wskazujące chromosomy i współrzędne. (A) Po deprywacji glukozy, Nrd1 wiąże dwa transportery glukozy o wysokim powinowactwie, HXT6 i HXT7, które są regulowane w górę w tym stanie. (B) Zaobserwowano, że Nrd1 wiąże się z Imd3, już zatwierdzonym celem Nab3⁴⁴, ze zmniejszającą się intensywnością po głodzie glukozy. (C) Wiązanie Nrd1 Tye7 wykazuje dynamiczny i przejściowy charakter, zmniejszając się po głodzie glukozy do minimum po 8 minutach stresu. Jednak wiązanie powraca do poziomu podstawowego po 14 minutach. Odczyty zostały znormalizowane do "odczytów na milion" (RPM; oś y). Szare pola wskazują regiony kodujące niekodujące RNA. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Metoda χCRAC, w połączeniu z nowymi urządzeniami do sieciowania i pobierania komórek, ma ogromny potencjał, ponieważ ma zastosowanie do szerokiego zakresu organizmów modelowych, a zatem powinna być przedmiotem ogólnego zainteresowania w dziedzinie RNA. Istnieje wiele obszarów, w których χCRAC może być wykorzystany. Na przykład metoda ta może być wykorzystana do pomiaru hierarchicznego składania białek w duże kompleksy makromolekularne, takie jak spliceosom i rybosom, co często wiąże się z dynamicznymi interakcjami między białkami a cząsteczkami RNA. Obecnie rutynowo używamy go również do monitorowania interakcji między czynnikami rozpadu RNA a ich substratami, gdy komórki są poddawane różnego rodzaju stresom. Dzięki temu możemy określić, na jakim etapie odpowiedzi adaptacyjnej czynniki te są najbardziej aktywne, z jakimi substratami się wiążą i jak dynamiczne są te interakcje. Takie dane powinny umożliwić naukowcom określenie względnego wkładu każdego czynnika w adaptację do zmian środowiskowych.

χCRAC wykorzystuje znaczniki oczyszczania o podwójnym powinowactwie (HTF lub HTP) do oczyszczania białka w bardzo rygorystycznych i denaturujących warunkach. Gwarantuje to, że oczyszczone RNA jest wysoce wzbogacone o RNA, które były kowalencyjnie usieciowane z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Jednak poleganie na tagach powinowactwa ma wady. Na przykład znacznik może zakłócać funkcję białka, co może powodować zniekształcony odczyt interaktomii wiążącego RNA. Ponadto w przypadku niektórych organizmów modelowych wykorzystanie znaczników może nie zawsze być możliwe, ponieważ narzędzia genetyczne do integracji fragmentów DNA z genomem lub przekształcania plazmidów ekspresyjnych nie są jeszcze dostępne. Jednak łatwo jest zmienić niektóre części protokołu χCRAC, aby był kompatybilny z protokołami opartymi na CLIP, które opierają się na przeciwciałach do oczyszczania RBP. Rzeczywiście, to badanie wykazało, że możliwe jest połączenie oczyszczania opartego na iCLIP z naszym środkiem sieciującym. Obecnie jesteśmy w trakcie opracowywania protokołów CLIP w celu zbadania czasowego związku ludzkich białek wiążących RNA z powstającymi transkryptami RNA.

Podczas wykonywania χCRAC na nowym białku należy zoptymalizować ekspozycję na promieniowanie UV, aby wywołać maksymalne sieciowanie. Jest to ważne, ponieważ wysoka ekspozycja na promieniowanie UV może zmniejszyć odzysk RNA na etapie oczyszczania. Komórki wykazujące ekspresję rekombinowanego RBP poddano działaniu różnych dawek UV, 100 mJ/^cm2, 250 mJ/^cm2, 500 mJ/^cm2 i 1 J/^cm2. RNP zostały następnie przechwycone, a RNA zostały rozdrobnione i znakowane radioizotopem. Następnie RNP zostały rozwiązane za pomocą SDS-PAGE i wykonano autoradiogram w celu wywnioskowania, która ekspozycja dała najbardziej intensywny sygnał (tj. maksymalne sieciowanie).

Po zoptymalizowaniu warunków eksperymentalnych zaleca się przeprowadzenie kilku eksperymentów kontrolnych podczas wykonywania χCRAC. Po pierwsze, naświetlana promieniami UV, nieoznakowana próbka może być użyta do monitorowania wiązania tła z kulkami oczyszczającymi. Po drugie, przy zastosowaniu χCRAC podczas eksperymentu przesunięciowego, drugi szereg czasowy, w którym komórki są przesuwane z powrotem do pierwotnego podłoża, umożliwia zbadanie, czy sama filtracja komórek indukuje zmiany w poziomach RNA lub interakcje białko-RNA.

Jak wspomniano we Wprowadzeniu, liczne ostatnio opublikowane artykuły sugerują szereg optymalizacji protokołu CLIP. Obejmuje to zastosowanie znakowanych fluorescencyjnie adapterów do wykrywania kompleksu białko-RNA poprzez skanowanie w podczerwieni¹⁰, a także optymalizacje różnych etapów oczyszczania kwasów nukleinowych i wyboru rozmiaru, które wykazano w celu zwiększenia złożoności powstałych bibliotek^12,45. Obecnie wdrażamy niektóre z tych ulepszeń, aby jeszcze bardziej udoskonalić protokół χCRAC. Przedstawiony tutaj protokół zawiera już szereg ulepszeń w stosunku do oryginalnych protokołów CRAC i χCRAC, które zwiększają złożoność danych. Na przykład wcześniej, po rozpuszczeniu usieciowanych, radioaktywnych kompleksów białko-RNA na żelach SDS-PAGE, przeniesiono je do membrany nitrocelulozowej, a usieciowany RNA wyizolowano z plamy. Jednak przenoszenie RNP i późniejsza ekstrakcja RNA może być bardzo nieefektywna, szczególnie w przypadku dużych RBP, takich jak podjednostki polimerazy RNA. Może to spowodować znaczne zmniejszenie odzysku usieciowanego RNA. W obecnym protokole usieciowany RNA jest ekstrahowany bezpośrednio z plastrów żelu SDS-PAGE, jak pokazano na rysunku 1. Zwiększyło to odzyskiwanie usieciowanych RNA. Dodatkowo, po amplifikacji cDNA metodą PCR, produkt został pierwotnie rozdzielony na 3%, niskotopliwych żelach agarozowych, a następnie z żelu wyekstrahowano produkty PCR o gęstości 175–300 pz. Jednak żele te mogą być łatwo przeciążone, co skutkuje bardzo słabą separacją DNA. Zastąpienie żeli agarozowych prefabrykowanymi żelami TBE zaowocowało bardziej spójną separacją wielkości i lepszym odzyskiwaniem produktów PCR.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1,4-ditioreitol	Merck	10708984001	Składnik buforowy w lizie komórek ssaków
1,5 ml probówki	Eppendorf	0030 120.086	Probówka do reakcji
ogólnej 2 ml	Eppendorf	0030 123.344	Do przechowywania kolumn i zbierania odpadów
32P-yATP	Perkin Elmer	NEG502Z-250	Do znakowania radioizotopem końca 5' RNA
4-12% Bis-Tris żel	Invitrogen	NP0321BOX	SDS-PAGE
żel 4X bufor ładujący	Novex	NP0008	Koncentrat barwnika ładującego białko
50 pz drabinka	New England Biolabs	N3236	Drabinka referencyjna do wycinania obszaru zainteresowania z amplifikowanej biblioteki cDNA
50% PEG	NEB	B100045	Do podwiązania łącznika L5
6% żel TBE	Invitrogen	EC6265BOX	Do separacji i oczyszczania biblioteki cDNA
Aceton	ACROS Organics	423245000	Mycie białek wytrąconych TCA
Koraliki anty-FLAG	Sigma Aldrich	M8823-1ML	Do oczyszczania RBP znakowanych flagą
ATP (100 mM)	Thermo Fisher Scientific	R0441	Do ligacji łącznika L5 na końcu 5' wychwyconych RNA
Beta-merkaptoetanol	Sigma Aldrich	M3148-100ML	Składnik buforowy
Biomax MS ekran intensyfikujący	Sigma Aldrich	Z363162-1EA	Do intensyfikacji sygnału autoradiogramu
Chloroform	Thermo Fisher Scientific	1010219	Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA
cOmplete koktajl inhibitorów proteazy bez EDTA	Roche	11873580001	Do hamowania proteaz komórkowych po lizie
Kompletna mieszanka suplementów -TRP	Formedium	DCS0149	Do przygotowania syntetycznego zdefiniowanego podłoża
Costar Spin-X 0,22 µ Filtry m	Sigma Aldrich	CLS8160	Do izolowania wyciętych cDNA po ekstrakcji żelem
DNaza RQ1	Promega	M6101	Do trawienia DNA po lizie
komórek dNTP (10 mM)	Sigma Aldrich	4638956001	Do odwrotnej transkrypcji i PCR
Etanol	Thermo Fisher Scientific	10041814	Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA i DNA wytrącanie
Kwas etylenodiaminotetraoctowy	Invitrogen	AM9261	Do buforu proteazy K
Egzonukleaza I	New England Biolabs	M0293	Do degradacji starterów po PCR
Filtry z mikrowłókna szklanego	Whatman	1823-010	Do izolowania wyciętych cDNA po ekstrakcji żelem
Glukoza	Formedium	GLU03	Do przygotowania zawierającego glukozę, syntetycznego zdefiniowanego podłoża
glikogenu (20 mg/ml)	Roche	10901393001	Wytrącanie białek, RNA i DNA
GST-TEV	Protokół		konstrukcji i oczyszczania jest dostępny na żądanie
Hydrochlorodek guanidu	Thermo Fisher Scientific	10071503	Wymagany do warunków denaturacji pulldown i buforu
Kulki IgG	GE Healthcare	17-0969-01	Do oczyszczania białek RBP znakowanych A
Imidazol	Sigma Aldrich	I2399-100G	Do elucji wychwyconych białek z kulek niklowych
Alkohol izoamylowy	Thermo Fisher Scientific	A393-500	Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA
Luna Universal One-Step RT-qPCR	NEB	E3005S	Do qPCR cDNA w celu obliczenia wymaganej liczby cykli PCR
Chlorek magnezu	Fluka Analytical	63020-1L	Do bufora PNK
Filtry membranowe	Millipore	AAWP09000 na drożdże lub HAWP09000 na bakterie	Do filtracji próżniowej komórek
Kolumny mikrobiospinowe	Biorad	732-6204	Do zbierania eluatu po ekstrakcji żelu
Kulki Ni-NTA	Qiagen	30210	Do wtórnego wychwytywania białek
NP-40	Sigma Aldrich	I8896-100ML	Składnik buforowy
Polimeraza	Pfu Promega	M7741	Do amplifikacji biblioteki cDNA
Phenol	Sigma Aldrich	P4682-400ML	Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA
Pierce Kolumny wirowe	Thermo Fisher Scientific	69725	Do nakolumnowych reakcji enzymatycznych
Proteaza K		Roche 3115887001	Do degradacji RBP po ekstrakcji żelem
Kwarcowa szalka Petriego	UVO3	N/A	Do sieciowania przylegających komórek. Dostępne od https://www.vari-x-link.com za 400 GBP
Filmy radiograficzne	Amersham	28906843	Do wizualizacji autoradiograficznej
Koraliki RNAClean XP	Beckmann	A63987	Koraliki SPRI do oczyszczania RNA i cDNA
RNaza H New	England Biolabs	M0297	Do degradacji RNA po odwrotnej transkrypcji
RNase-It	Agilent	400720	Do trawienia RNA
rRNasin	Promega	N2511	Do hamowania wszelkich zanieczyszczających RNaz podczas reakcji enzymatycznej
Octan sodu	Sigma Aldrich	S2889-1KG	Do ekstrakcji fenolowo-chloroformowej po oczyszczeniu RNA i wytrąceniu DNA
Chlorek sodu	Thermo Fisher Scientific	7647-14-5	Składnik buforowy
Deoksycholan sodu	Sigma Aldrich	D6750-100G	Składnik buforowy w lizie komórek ssaków
Dodecylosiarczan sodu	Sigma Aldrich	L3771-1KG	Do buforu proteazy K
SUPERase-In	Invitrogen	AM2694	Do hamowania komórkowych RNaz po lizie
SuperScript IV	Thermo Fisher Scientific	18090010	Do odwrotnej transkrypcji
T4 PNK	New England Biolabs	M0201	Do znakowania radioizotopem końca 5' RNA
Ligazy T4 RNA 1	New England Biolabs	M0204	Do ligacji adaptera L5 na końcu RNA 5'
Ligaza RNazy T4 2, obcięta K222Q	NEB	M0351S	Do ligacji łącznika App_PE na końcu 3' wychwyconego RNA
Bufor TBE (10X)	Invitrogen	15581-028	Do uruchamiania żeli TBE
Proteaza TEV	Domowej roboty		Do elucji wychwyconych białek po wychwycie LGR
Termoczuła fosfataza alkaliczna	Promega	M9910	Do defosforylacji 5' i 3' RNA
Kwas trichlorooctowy (100%)	Sigma Aldrich	T0699-100ML	Do wytrącania kompleksów RBP-RNA
Chlorowodorek Tris	Invitrogen	15504-020	Składnik buforowy
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100ML	Składnik buforowy w lizie komórek ssaków
Vari Filter	UVO3	N/A	Urządzenie do próżniowego zbierania komórek. Dostępne od https://www.vari-x-link.com dla 100 GBP
Vari-X-Linker	UVO3	N/A	Cross-linker do ogniw sieciujących. Dostępne od https://www.vari-x-link.com za 16 000 GBP
Drożdżowa baza azotowa	Formedium	CYN0410	Do przygotowania syntetycznego zdefiniowanego podłoża
Kulki cyrkonowe	Thistle	11079105Z dla drożdży lub 11079101Z dla bakterii	Do lizy komórek poprzez ubijanie kulek