Method Article

Stabilność i struktura głównego kompleksu zgodności tkankowej nietoperzy klasy I z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną

DOI:

10.3791/61462

⸱

March 10th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Laboratory Medicine and Life Sciences, Wenzhou Medical University, 2NHC Key Laboratory of Biosafety, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention, 3Faculty of Health Sciences, University of Macau, 4CAS Key Laboratory of Pathogenic Microbiology and Immunology, Institute of Microbiology, Chinese Academy of Sciences, 5Savaid Medical School, University of Chinese Academy of Sciences

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokół opisuje eksperymentalne metody uzyskiwania stabilnego głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) klasy I poprzez potencjalne β podstawienia 2-mikroglobuliny (β2m) od różnych gatunków. Przeprowadzono porównanie strukturalne MHC I stabilizowanego β homologicznym i heterologicznym 2 m.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) odgrywa kluczową rolę w prezentacji peptydu antygenowego i odpowiedziach immunologicznych limfocytów T na choroby zakaźne i rozwój nowotworu. Hybrydowy MHC I skompleksowany z heterologicznym β podstawieniem 2-mikroglobuliny (β2m) z różnych gatunków można ustabilizować in vitro. Jest to realny sposób badania MHC I ssaków, gdy β homologiczny2m nie jest dostępny. Tymczasem wskazuje się, że β ssaków substytucja2m nie wpływa istotnie na prezentację peptydów. Istnieje jednak ograniczone podsumowanie dotyczące metodologii i technologii hybrydowego MHC I skompleksowanego z heterologicznąβ 2-mikroglobuliną (β2m). W artykule przedstawiono metody oceny możliwości substytucji heterologicznej β2m w badaniu MHC I. Metody te obejmują przygotowanie konstrukcji wyrażeń; oczyszczanie ciał inkluzyjnych i ponowne składanie kompleksu MHC; oznaczanie termostabilności białek; przesiewanie kryształów i oznaczanie struktury. Badanie to dostarcza zaleceń dotyczących zrozumienia funkcji i struktury MHC I, a także ma znaczenie dla oceny odpowiedzi limfocytów T podczas immunoterapii chorób zakaźnych i nowotworów.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Główny kompleks zgodności tkankowej (MHC) występuje u wszystkich kręgowców i jest zestawem genów, które determinują odporność komórkową na zakaźne patogeny. MHC klasy I przedstawia endogenne peptydy, takie jak składniki wirusowe wytwarzane po zakażeniu wirusem, do receptorów limfocytów T (TCR) na powierzchni limfocytów T CD8 + w celu pośredniczenia w odporności komórkowej i uczestniczenia w regulacji immunologicznej1. Badanie strukturalne wiązania MHC I z peptydami dostarcza informacji na temat motywów wiązania peptydów i cech prezentacji przez cząsteczki MHC I, co odgrywa istotną rolę w ocenie odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8 + i opracowywaniu szczepionek.

Od czasu pierwszej krystalizacji i strukturalnego określenia molekularnego MHC I przez Bjorkmana i wsp.2, analiza struktury krystalicznej cząsteczek MHC I znacznie przyczyniła się do lepszego zrozumienia sposobu wiązania peptydów z cząsteczkami MHC I i pomaga zrozumieć oddziaływanie lekkich łańcuchów z ciężkimi łańcuchami i peptydami. Seria badań uzupełniających wykazała, że chociaż geny kodujące łańcuch lekki nie są związane z MHC, łańcuch lekki jest kluczowym białkiem do składania cząsteczek MHC I3,4. Oddziałuje z trzema domenami cząsteczek MHC klasy I na wielu powierzchniach. Gdy łańcuch lekki jest nieobecny, cząsteczki MHC klasy I nie mogą być prawidłowo wyrażane na powierzchni komórek prezentujących antygen i nie mogą wchodzić w interakcje z TCR w celu wywierania swoich funkcji immunologicznych.

MHC I składa się z ciężkiego łańcucha (łańcuch H) i lekkiego łańcucha (tj.β 2-mikroglobuliny (β2m)), i jest składany poprzez wiązanie z odpowiednim peptydem5. Zewnątrzkomórkowy segment łańcucha H składa się z domen α1, α2 i α36. Domeny α1 i α2 tworzą rowek wiążący peptydy (PBG). Łańcuch βo długości 2m działa jako podjednostka strukturalna kompleksu montażowego w MHC I, stabilizując konformację kompleksu, i jest molekularnym opiekunem dla składania łańcucha MHC I H7,8,9. Seria badań wykazała, że MHC I H łańcuchy od różnych ssaków, takich jak nietoperze (Chiroptera) (Ptal-N*01:: 01)10, makak rezus (naczelne) (Mamu-B*17)11 (Mamu-A*01)12 (Mamu-A*02)13, mysz (Rodentia) (H-2Kd)14,15, pies (Carnivora) (DLA-88*50801)16, bydło (Artiodactyla) (BoLA-A11)17 i końskie (Perissodactyla) (Eqca-N*00602 i Eqca-N*00601)18 mogą łączyć się z heterologicznymi β2m (Tabela 1). Te hybrydowe cząsteczki są często wykorzystywane w badaniach strukturalnych i funkcjonalnych. Jednak metodologia badania funkcjonalnego i strukturalnego hybrydowego MHC I o β heterologicznym2m nie została jeszcze podsumowana. Tymczasem podstawa strukturalna wymiany β2m między różnymi taksonami pozostaje niejasna.

Tutaj podsumowano procedurę wyrażania MHC I, ponownego fałdowania, krystalizacji, zbierania danych o kryształach i określania struktury. Ponadto analizowane są potencjalne podstawienia β2m od różnych gatunków poprzez porównanie konformacji strukturalnej MHC I stabilizowanej przez homologiczne i heterologiczne β2m. Metody te będą pomocne w dalszych badaniach strukturalnych MHC I i ocenie odpowiedzi immunologicznej limfocytów T CD8 + w nowotworach i chorobach zakaźnych.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie konstrukcji wyrażeń

  1. Pobierz sekwencje genów MHC klasy I (w tym geny przewidywane) od nietoperzy z bazy danych NCBI.
  2. Pobierz sekwencje łańcuchów ciężkich MHC I ssaków wyższych z bazy danych polimorfizmu immunologicznego (IPD) (www.ebi.ac.uk/ipd/mhc) i bazy danych UniProt (www.uniprot.org).
  3. Aby uzyskać rozpuszczalne kompleksy MHC, należy zmutaginizować sekwencje w celu usunięcia regionów cytozolowych i transbłonowych.
  4. Sklonuj geny kodujące ektodomeny nietoperza Ptal-N*01:01 (GenBank no. KT98792919) (pozostałości 1–277) i nietoperzβ 2m (nr GenBank. XP_006920478.1) (reszty 1–98) odpowiednio na wektory pET-28a (Novagen, Pekin, Chiny).
  5. Wstawienie zoptymalizowanych (dla Escherichia coli) sekwencji wstawiono między miejsca NcoI i EcoR1 zmodyfikowanego wektora pET-28a.
  6. Skonstruuj ludzkie plazmidy o ekspresjiβ2 m, jak opisano wcześniej20.

2. Synteza peptydów

  1. Przewidywanie peptydów
    1. Jak opisano wcześniej10, aby przebadać peptydy, które mogą wiązać się z Ptal-N*01:01, przewiduj potencjalne peptydy za pomocą ciał białkowych wirusa hendra (HeV) związanego z nietoperzami. Aby uzyskać peptydy o wysokim powinowactwie na podstawie modelu strukturalnego z serwera online, serwer NetMHCpan 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/)21 i Rosetta FlexPepDock22 przewidziały potencjalne wiązanie w wybranej frakcji peptydowej. Ponadto można również korzystać z innego oprogramowania i baz danych, w tym BIMAS, bazy danych epitopów immunologicznych (IEDB), NetCTL 1.2 i SYFPEITHI, z których wszystkie integrują przewidywanie powinowactwa wiązania peptyd-MHC klasy I, transportera związanego z wydajnością transportu przetwarzania antygenu (TAP), proteasomalnego C-końcowego rozszczepienia i czasu połowicznego dysocjacji cząsteczek peptydu-HLA klasy I w ich odczytach.
    2. Aby przewidzieć peptydy o wysokim poziomie wiązania, należy użyć zarówno serwera NetMHCpan, jak i serwera Rosetta FlexPepDock.
      UWAGA: Niestety, żadne z opracowanych prognoz nie zgadzało się z danymi eksperymentalnymi. Może to wskazywać, że obecne prognozy dotyczące peptydów wiążących MHC nie były odpowiednie dla ssaków innych niż ludzie i myszy, takich jak nietoperze, które mogą mieć inny sposób wiązania peptydów. Dlatego musimy połączyć różne oprogramowanie prognostyczne i wyniki eksperymentalne do kompleksowej analizy, aby uzyskać peptydy o wysokim powinowactwie.
  2. Przygotowanie i konserwacja peptydów
    1. Zamiast generować niestandardowe peptydy, korzystaj z wyspecjalizowanych dostawców usług. Kupuj wszystkie peptydy komercyjnie, korzystając z narzędzi do przewidywania peptydów, które mają wyższy wynik wiązania. Czystość peptydów określono na >95% za pomocą HPLC i spektrometrii mas.
    2. Wszystkie zakupione peptydy należy przechowywać w postaci liofilizowanego proszku w temperaturze -80 °C i przed użyciem rozpuścić w dimetylosulfotlenku (DMSO).

3. Oczyszczanie ciał inkluzyjnych

  1. Transformacja E. coli
    1. Przekształć 10 ng plazmidu zawierającego łańcuch MHC I Ptal-N * 01:01 H nietoperza lub β człowieka o długości2m lub nietoperza β2m w 100 μl BL21(DE3) E. coli. Kąp się w lodzie przez 30 min.
    2. Szok termiczny w temperaturze 42 °C przez 90 s, a następnie kąpiel w lodzie przez 2 min.
    3. Dodać 800 μl bulionu lizogenicznego (LB: ekstrakt drożdżowy, trypton i NaCl; patrz tabela materiałów) do kroku 3.1.2 i wstrząsać z prędkością 200 obrotów na minutę (obr./min) na platformie bujającej w temperaturze 37 °C przez 20 min.
    4. Nanieść 100 μl zawiesiny bakteryjnej na płytkę zawierającą odpowiednią oporność na antybiotyki (ampicylina: 100 ng/ml), która jest taka sama jak w poprzednich konstruktach.
  2. Zaszczepianie kultur
    1. Wybierz pojedynczy, niedawno przekształcony klon bakteryjny do 3 ml LB z pożywką antybiotykową (ampicylina: 100 ng/ml) i hodowlą w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min na platformie kołyszącej, aby aktywować bakterie. Kultury można zaszczepiać późno w nocy, aby były gotowe do indukcji następnego ranka.
    2. Na jedną noc wcześniej przenieść 500 μl aktywowanego materiału bakteryjnego do 50 ml LB z pożywką antybiotykową (ampicylina: 100 ng/ml) i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Dla wygody podczas przygotowywania następnego inokulatu, zamrozić pozostały aktywowany materiał bakteryjny w 1 ml podwielokrotności (500 μl kultury z 500 μl 40% glicerolu) w temperaturze -80 °C do czasu, gdy potrzebne będzie następne przygotowanie.
    3. Aby wytworzyć duże ilości białka rekombinowanego, należy przenieść preparat bakteryjny do 2 l LB z pożywką antybiotykową (ampicylina: 100 ng/ml) w stosunku 1:100, inkubować w temperaturze 37 °C, wstrząsając z prędkością 200 obr./min. Hodowlę aż do osiągnięcia absorbancji 0,6 przy długości fali 600 nm. Dodać 1 mM izopropylo-1-tio-β-D-galaktopyranozydu (IPTG) (zmieniać stężenie IPTG dla różnych MHC, głównie między 0,1 mM-1 mM) do kolby w celu indukcji ekspresji białka.
  3. Zbieraj bakterie
    1. Przenieść bakterie do butelek wirowych i odwirować przy 5000 x g przez 20 minut w temperaturze 4 °C. Od tej pory wszystkie czynności powinny być wykonywane w temperaturze 4 °C.
    2. Zawiesić bakterie w 60 ml soli fizjologicznej buforu fosforanowego (PBS) i uwolnić wyrażone rekombinowane białko za pomocą ultradźwiękowego zakłócacza komórek.
      UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, program, który ustawiamy na tym urządzeniu, to ultradźwiękowy 6S, interwał 12S, 300 W, 99 razy).
  4. Oczyszczanie organów inkluzyjnych
    1. Odwirować sonikowaną zawiesinę bakteryjną o sile 12 000 x g przez 30 min. Wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w odpowiedniej objętości buforu płuczącego (0,5% Triton-100, 50 mM Tris pH 8,0, 300 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Powtórz ten proces jeszcze raz.
    2. Wirować przy 12 000 x g przez 10–20 minut. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić ciała inkluzyjne w buforze do resuspensji (50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 10 mM DTT). Pobrać próbkę o objętości 20 μl (ciała inkluzyjne w buforze do sporządzania zawiesiny) dla SDS-PAGE w celu zbadania czystości ciał inkluzyjnych.
    3. Odwirować pozostały preparat w sile 12 000 x g przez 10–20 minut. Wyrzucić supernatant. Zważyć osad zawierający inkluzje i dodać bufor do rozpuszczania (6 M Gua-HCl, 10% gliceryny, 50 mM Tris pH 8,0, 100 mM NaCl, 10 mM EDTA) do końcowego stężenia 30 mg/ml. Mieszać powoli za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C, aż do rozpuszczenia inkluzji w buforze do rozpuszczania.
    4. Wirować 12 000 x g przez 10–20 minut. Wyrzuć osady.Przechowywać inkluzje w temperaturze -20 °C lub -80 °C.
      UWAGA: Przed przystąpieniem do oczyszczania ciał inkluzyjnych należy potwierdzić, że indukcja i ekspresja rekombinowanego białka zakończyły się sukcesem. Pobrać próbki z każdej hodowli (pobrane przed i po indukcji IPTG) na żelu białkowym; 15% SDS-PAGE (sds-PAGE skoncentrowana guma:H2O, 30% akrylamid, 1 M Tris-HCl pH 6,8, 10% SDS, 10% APS i TEMED; Żel separacyjny SDS-PAGE:H2O, 30% akrylamid, 1,5 M Tris-HCl pH 8,8, 10% SDS, 10% APS i TEMED; patrz Tabela materiałów ) dla β2m, 10% SDS-PAGE dla łańcucha H.

4. Ponowne składanie kompleksu MHC

UWAGA: Efektywność ponownie złożonych ciał inkluzyjnych wpłynie na wydajność uzyskanego białka. Składanie konkuruje z polimeryzacją, dlatego ogólnie przyjmuje się, że ponowne fałdowanie przy niskich stężeniach białka jest najbardziej skuteczną metodą. W niniejszej pracy stężenie ciał inkluzyjnych wynosi 30 mg/ml.

  1. Przygotuj bufor do ponownego składania.
    1. Zmieniaj skład buforu do ponownego fałdowania w zależności od białka. Na przykład pH, siła jonowa, warunki redoks i obecność ligandów będą miały wpływ na wyniki ponownego fałdowania. Najczęściej stosuje się na bazie Tris lub HEPES o neutralnym pH o stężeniu NaCl 50-500 mM, ale zależy to również od białka docelowego. Poniżej znajduje się formuła buforu ponownego składania używana w tym artykule.
    2. Przygotować bufor do składania ze 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 400 mM L-argininy, 2 mM EDTA-2Na.
    3. Schłodzić bufor do temperatury 4 °C w kolbie o pojemności 250–300 ml, a następnie dodać 5 mM zredukowanego glutationu (GSH) i 0,5 mM utlenionego glutationu (GSSG). Mieszać powoli za pomocą mieszadła magnetycznego w temperaturze 4 °C przez kolejne 10–20 minut przed dodaniem ciał inkluzyjnych i peptydów.
  2. Wtryskiwanie i rozcieńczanie łańcucha MHC H i β2m
    UWAGA: Temperatura, w której odbywa się ponowne składanie, może się różnić, chociaż generalnie, aby zminimalizować agregację, najlepiej jest 4 °C. Używamy rozcieńczenia do ponownego złożenia białek.
    1. Za pomocą igły ze strzykawki o pojemności 1 ml wstrzyknąć 1 ml ciał inkluzyjnych hβ2m lub ciał inkluzyjnych bβ2m odpowiednio do dwóch do ponownego składania (każdy o pojemności 1 litra). Wstrzykiwać w pobliżu energicznie obracającego się pręta mieszającego, aby uzyskać szybkie i skuteczne rozcieńczenie. β2m składa się stosunkowo łatwo i pozostaje stabilny nawet w przypadku braku prowadnika H.
    2. Po rozpuszczeniu β2m w roztworze do ponownego fałdowania, należy rozpuścić peptydy (5 mg/ml) w DMSO i szybko wstrzyknąć 200 μl do roztworu do ponownego fałdowania. Mieszaj powoli przez 10–20 minut przed dodaniem łańcucha H.
    3. Wstrzyknąć łańcuch H zgodnie z tą samą procedurą opisaną powyżej dla β2m. Łańcuch H jest bardzo niestabilny; Dlatego kolejność wstrzykiwania jest dość ważna. Wstrzyknąć 3 ml ciał inkluzyjnych łańcucha H do dwóch różnych do ponownego składania (każdy o pojemności 1 litra) odpowiednio o wartości hβ2m lub bβ2m. Kolejne wstrzykiwanie małych porcji zamiast jednorazowego stosowania całej ilości białka zwiększa wydajność ponownie sfałdowanego MHC. Ponowne składanie należy odczekać, aż będzie trwało w temperaturze 4 °C przez 8–10 godzin.
  3. Stężenie ponownie sfałdowanego białka
    1. Stosować ultrafiltrację w komorze ciśnieniowej z membraną MMCO o mocy 10 kDa w celu zagęszczenia białek fałdowych. Ta metoda jest wygodna i może być połączona z wymianą bufora. Dodać bufor wymienny (20 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl pH 8,0) do komory i stężyć do końcowej objętości 30–50 ml.
    2. Przenieść roztwór do ponownego składania do probówki wirówkowej, wirować z prędkością 12 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C w celu usunięcia osadów.
    3. Ostrożnie przenieść supernatant i zagęścić go dalej do końcowej objętości ~1 ml.
    4. Wirować przy 12 000x g przez 10–20 minut. Przenieść supernatant do sterylnej probówki i oczyścić białka za pomocą kolumny wykluczającej wielkość 10/300 GL.
    5. Pobrać próbki w momencie piku i przeanalizować je za pomocą SDS–PAGE (15% żel poliakrylamidowy).
    6. Zebrać pik kompleksu MHC i stężyć do końcowego stężenia 15 mg/ml.
    7. Rozcieńczyć kompleks do 7,5 mg/ml i 15 mg/ml w celu krystalizacji.

5. Krystalizacja, gromadzenie i przetwarzanie danych

  1. Przeprowadzić krystalizację skompleksowanego MHC i peptydu przy użyciu techniki dyfuzji parowej w pozycji siedzącej.
  2. Przesiewaj kompleksy Ptal-N*01:01/peptide za pomocą dostępnych na rynku zestawów kryształowych (np. Zestaw Crystal Screen I/II, zestaw Index Screen, zestaw PEGIon I/II i zestaw PEGRx).
  3. Uszczelnić otrzymany roztwór i zrównoważyć ze 100 μl roztworu w zbiorniku w temperaturze 4 lub 18 °C.
  4. Obserwuj wzrost kryształów w kulturze przez 3 dni, 1 tydzień, 2 tygodnie, 1 miesiąc, 3 miesiące i 6 miesięcy. Użyj mikroskopu, aby sprawdzić, czy każda kropla w kryształowej płytce zawiera kryształy.
    UWAGA: Kryształy Ptal-N*01:01/HeV1(bβ2m) zaobserwowano w 0,2 M NaCl, 0,1 M Bis-Tris (pH 5,5) i 25% (w/v) glikolu polietylenowym 3,350 w stężeniu 7,5 mg/mL. Kryształy Ptal-N*01:01/HeV1(hβ2m) obserwowano w 0,1 M HEPES, pH 7,0, 2% w/v glikolu polietylenowego 3,350 w stężeniu 7,5 mg/mL.
  5. W celu ochrony kriogenicznej przenieś kryształy do roztworu magazynującego zawierającego 20% glicerolu, a następnie szybko schładzaj w strumieniu gazowego azotu o temperaturze 100 K.
  6. Zbierz dane dyfrakcji rentgenowskiej z linii badawczej BL19U w ośrodku promieniowania synchrotronowego w Szanghaju (Szanghaj, Chiny).

6. Wyznaczanie i analiza struktury

  1. Dzięki danym strukturalnym o wysokiej rozdzielczości, przetwarzaj i skaluj siłę kolekcji za pomocą programu Denzo i pakietu oprogramowania HKL2000 (https://hkl-xray.com/)23.
  2. Po wybraniu lepszego modelu początkowego w Banku Danych o Białkach (PDB), określ struktury za pomocą wymiany molekularnej za pomocą programu Phaser MR w CCP424 (http://www.ccp4.ac.uk/). Wykorzystanym modelem była struktura koordynowana z kodem Banku Danych o Białkach (PDB) 5F1I.
  3. Użyj udoskonalonego modelu rentgenowskiego do wstępnego udoskonalenia spoiny. Użyj trybów samego uszlachetniania Phenix i stawów odpowiednio dla samego promieniowania rentgenowskiego oraz wspólnego udoskonalania neutronów i promieniowania rentgenowskiego.
  4. Po każdej rundzie udoskonalania ręcznie sprawdź model z mapami dodatniej gęstości jądrowej Fo − Fc i 2Fo − Fc w klasie Coot25 (https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/). Ułatwia to prawidłowe rozmieszczenie wód i niektórych atomów D. Wszystkie figury budowli zostały stworzone przez firmę PyMOL (http://www.pymol.org/).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Poprzednia praca informowała, że peptyd HeV1 (DFANTFLP) pochodzący z HeV został zaprezentowany przez Ptal-N*01:0110,19. Tutaj, zdolność wiązania tego peptydu z Ptal-N*01:01 z homologicznym nietoperzem β2m (bβ2

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Budowa hybrydowego kompleksu białkowego poprzez heterologiczną substytucję z różnych taksonów jest powszechną strategią badań funkcjonalnych i strukturalnych, gdy kompleks homologiczny nie jest dostępny, na przykład w MHC I i jego ligandach. Podsumowanie dotyczące metodologii i technologii jest jednak ograniczone. W artykule przeanalizowano strukturę nietoperza MHC I, Ptal-N*01:01, stabilizowaną przez bβ2m lub hβ2m. Stwierdzono, że kluczowe aminokwasy β2m wiążące się z Ptal-N*01:01 są zac...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie mają nic do zadeklarowania.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To badanie było wspierane przez otwarty fundusz państwowego kluczowego laboratorium Biotechnologii Farmaceutycznej, Nan-jing University, Chiny (Grant no. KF-GN-201905), Chińska Narodowa Fundacja Nauk Przyrodniczych (granty 81971501). William J. Liu jest wspierany przez Excellent Young Scientist Program NSFC (81822040) oraz Beijing New-star Plan of Science and Technology (Z181100006218080).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Membrana 10 kDa MMCOMerck miliporePLGC07610
30% akryloamiduLABLEADA3291-500ml * 5
5 razy; Białko SDS ŁadowanieNovoproteinPM099-01A
AMICON ULTRA-15 15ML-10 KDa cutoffMerck milliporeUFC901096
AmpicillinInalco1758-9314
APSSigmaA3678-100G
BL21(DE3) szczepTIANGENCB105-02
DMSOMP219605580Nosić odpowiednie rękawice i ochronę oczu/twarzy. W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza.
RękawiceSolarbioD1070należy nosić i obsługiwać w wentylowanej kuchni. W przypadku kontaktu z oczami natychmiast przemyć dużą ilością wody i zasięgnąć porady lekarza.
EDTA-2NaKeyGEN BioTECHKGT515500
GlicerynaHUSHI10010618
GSHAmresco0399-250G
GSSGAmresco0524-100G
Chlorowodorek guanidynyAmrescoE424-5KG
hβ 2mnasze laboratoriumZhang, S. i wsp. Strukturalne podstawy prezentacji alleli krzyżowych przez HLA-A*0301 i HLA-A*1101 ujawnione przez dwa kompleksy peptydowe pochodzące z HIV. Mol Immunol. 49 (1-2), 395-401, (2011).
IPTGInalco1758-1400
Chlorowodorek L-argininyAmresco0877-5KG
NaClSolarbioS8210
Marker białkowyFermentas26614
SDSBoao Rui JingA112130
Superdex Increase 200 10/300 GLGE Healthcare28990944
RękawiceThermo17919należy nosić i obsługiwać w wentylowanej kuchni.
Tris-HClAmresco0497-5KG
Triton X-100BiolinijkaRH30056-100mL
TryptoneOxoidLP0042
Ekstrakt drożdżowyOxoidLP0021
i gogle DTT i gogle TEMED

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vyas, J. M., Van der Veen, A. G., Ploegh, H. L. The known unknowns of antigen processing and presentation. Nature Reviews Immunology. 8 (8), 607-618 (2008).
  2. Bjorkman, P. J., et al. Structure of the human class I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 329 (6139), 506-512 (1987).
  3. Seong, R. H., Clayberger, C. A., Krensky, A. M., Parnes, J. R. Rescue of Daudi cell HLA expression by transfection of the mouse beta 2-microglobulin gene. Journal of Experimental Medicine. 167 (2), 288-299 (1988).
  4. Zijlstra, M., et al. Beta 2-microglobulin deficient mice lack CD4-8+ cytolytic T cells. Nature. 344 (6268), 742-746 (1990).
  5. Gao, G. F., et al. Crystal structure of the complex between human CD8alpha(alpha) and HLA-A2. Nature. 387 (6633), 630-634 (1997).
  6. Bjorkman, P. J., Parham, P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules. Annual Review of Biochemistry. 59, 253-288 (1990).
  7. Achour, A., et al. Structural basis of the differential stability and receptor specificity of H-2Db in complex with murine versus human beta 2-microglobulin. Journal of Molecular Biology. 356 (2), 382-396 (2006).
  8. Kubota, K. Association of serum beta 2-microglobulin with H-2 class I heavy chains on the surface of mouse cells in culture. Journal of Immunology. 133 (6), 3203-3210 (1984).
  9. Bernabeu, C., van de Rijn, M., Lerch, P. G., Terhorst, C. P. Beta 2-microglobulin from serum associates with MHC class I antigens on the surface of cultured cells. Nature. 308 (5960), 642-645 (1984).
  10. Lu, D., et al. Peptide presentation by bat MHC class I provides new insight into the antiviral immunity of bats. PLoS Biology. 17 (9), 3000436(2019).
  11. Wu, Y., et al. Structural basis of diverse peptide accommodation by the rhesus macaque MHC class I molecule Mamu-B*17: insights into immune protection from simian immunodeficiency virus. Journal of Immunology. 187 (12), 6382-6392 (2011).
  12. Chu, F., et al. First glimpse of the peptide presentation by rhesus macaque MHC class I: crystal structures of Mamu-A*01 complexed with two immunogenic SIV epitopes and insights into CTL escape. Journal of Immunology. 178 (2), 944-952 (2007).
  13. Liu, J., et al. Diverse peptide presentation of rhesus macaque major histocompatibility complex class I Mamu-A*02 revealed by two peptide complex structures and insights into immune escape of simian immunodeficiency virus. Journal of Virology. 85 (14), 7372-7383 (2011).
  14. Liu, W. J., et al. Protective T cell responses featured by concordant recognition of Middle East respiratory syndrome coronavirus-derived CD8+ T cell epitopes and host MHC. Journal of Immunology. 198 (2), 873-882 (2017).
  15. Mitaksov, V., Fremont, D. H. Structural definition of the H-2Kd peptide-binding motif. Journal of Biological Chemistry. 281 (15), 10618-10625 (2006).
  16. Xiao, J., et al. Diversified anchoring features the peptide presentation of DLA-88*50801: first structural insight into domestic dog MHC class I. Journal of Immunology. 197 (6), 2306-2315 (2016).
  17. Li, X., et al. Two distinct conformations of a rinderpest virus epitope presented by bovine major histocompatibility complex class I N*01801: a host strategy to present featured peptides. Journal of Virology. 85 (12), 6038-6048 (2011).
  18. Yao, S., et al. Structural illumination of equine MHC class I molecules highlights unconventional epitope presentation manner that is evolved in equine leukocyte antigen alleles. Journal of Immunology. 196 (4), 1943-1954 (2016).
  19. Wynne, J. W., et al. Characterization of the antigen processing machinery and endogenous peptide presentation of a bat MHC class I molecule. Journal of Immunology. 196 (11), 4468-4476 (2016).
  20. Zhang, S., et al. Structural basis of cross-allele presentation by HLA-A*0301 and HLA-A*1101 revealed by two HIV-derived peptide complexes. Molecular Immunology. 49 (1-2), 395-401 (2011).
  21. Hoof, I., et al. NetMHCpan, a method for MHC class I binding prediction beyond humans. Immunogenetics. 61 (1), 1-13 (2009).
  22. Raveh, B., London, N., Zimmerman, L., Schueler-Furman, O. Rosetta FlexPepDock ab-initio: simultaneous folding, docking and refinement of peptides onto their receptors. PLoS One. 6 (4), 18934(2011).
  23. Otwinowski, Z., Minor, W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode. Methods in Enzymology. 276, 307-326 (1997).
  24. Brunger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54, Pt 5 905-921 (1998).
  25. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66, Pt 4 486-501 (2010).
  26. Glithero, A., et al. Crystal structures of two H-2Db/glycopeptide complexes suggest a molecular basis for CTL cross-reactivity. Immunity. 10 (1), 63-74 (1999).
  27. Tungatt, K., et al. Induction of influenza-specific local CD8 T-cells in the respiratory tract after aerosol delivery of vaccine antigen or virus in the Babraham inbred pig. PLoS Pathogens. 14 (5), 1007017(2018).
  28. McCoy, W. H. t, Wang, X., Yokoyama, W. M., Hansen, T. H., Fremont, D. H. Structural mechanism of ER retrieval of MHC class I by cowpox. PLoS Biology. 10 (11), 1001432(2012).
  29. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274 (5284), 94-96 (1996).
  30. Zhao, M., et al. Heterosubtypic protections against human-infecting avian influenza viruses correlate to biased cross-T-cell responses. mBio. 9 (4), (2018).
  31. Zhao, L., Cao, Y. J. Engineered T cell therapy for cancer in the clinic. Search Results. 10, 2250(2019).
  32. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D. G. The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Research. 25 (24), 4876-4882 (1997).
  33. Gouet, P., Robert, X., Courcelle, E. ESPript/ENDscript: Extracting and rendering sequence and 3D information from atomic structures of proteins. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3320-3323 (2003).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

MHC Class IBeta 2 MicroglobulinProtein RefoldingInclusion Body PurificationCrystallization TechniqueX ray DiffractionPeptide BindingThermostability AssessmentExpression ConstructsSize Exclusion Chromatography

Related Articles