Deriwatyzacja kryształów białek za pomocą I3C za pomocą losowego przesiewania macierzy mikronasion

Podsumowanie

W artykule przedstawiono metodę generowania kryształów białek pochodzonych z I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) za pomocą mikrozasiewania do generowania nowych warunków krystalizacji w rzadkich przesiewach matrycowych. Tacy można ustawić za pomocą robotów do dyspensowania płynów lub ręcznie.

Streszczenie

Wyjaśnienie struktury białek za pomocą krystalografii rentgenowskiej wymaga zarówno wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych, jak i obliczeniowego rozwiązania problemu fazy dyfrakcyjnej. Nowatorskie struktury, które nie mają odpowiedniego modelu homologowego, często są derywowane z ciężkimi atomami, aby dostarczyć eksperymentalnych informacji fazowych. Przedstawiony protokół efektywnie generuje derywantyzowane kryształy białkowe poprzez połączenie losowego mikrozasiewania matrycowego przesiewania z deriwatyzacją za pomocą cząsteczki ciężkiego atomu I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy kwas). Poprzez włączenie I3C do sieci krystalicznej, problem fazy dyfrakcyjnej można efektywnie rozwiązać za pomocą fazowania z anomalną dyspersją (SAD) o pojedynczej długości fali. Równoboczne ułożenie trójkąta atomów jodu w I3C pozwala na szybkie potwierdzenie poprawnej anomalnej podstruktury. Protokół ten będzie przydatny dla biologów strukturalnych, którzy rozwiązują struktury makrocząsteczkowe przy użyciu technik krystalograficznych, z zainteresowaniem eksperymentalnym fazowaniem.

Wprowadzenie

W dziedzinie biologii strukturalnej krystalografia rentgenowska jest uważana za złoty standard techniki określania struktur o rozdzielczości atomowej makrocząsteczek. Był szeroko wykorzystywany do zrozumienia molekularnych podstaw chorób, kierowania racjonalnym projektowaniem leków oraz wyjaśniania mechanizmu katalitycznego enzymów ^1,2. Chociaż dane strukturalne dostarczają ogromnej wiedzy, proces ekspresji i oczyszczania białek, krystalizacji oraz określania struktury może być niezwykle żmudny. Często napotyka się wiele wąskich gardeł, które utrudniają postęp tych projektów, co należy rozwiązać, aby efektywnie usprawnić proces określania struktury krystalicznej.

Po rekombinowanej ekspresji i oczyszczeniu należy zidentyfikować wstępne warunki sprzyjające krystalizacji, co często jest żmudnym i czasochłonnym aspektem krystalografii rentgenowskiej. Opracowano komercyjne przesiewanie matryc rzadkich, które konsolidują znane i opublikowane warunki, aby złagodzić to wąskie gardło ^3,4. Jednak często zdarza się, że te początkowe przesiewanie uzyska niewiele trafień mimo użycia bardzo czystych i skoncentrowanych próbek białek. Obserwowanie przezroczystych kropli wskazuje, że białko może nie osiągać poziomów przesycenia wymaganych do nukleacji kryształu. Aby sprzyjać nukleacji i wzrostowi kryształów, można dodać nasiona powstałe z istniejących kryształów, co pozwala na zwiększenie próbkowania przestrzeni krystalizacyjnej. Ireton i Stoddard jako pierwsi wprowadzili metodę przesiewania matrycy mikronasion^{nr 5}. Słabej jakości kryształy były rozdrabniane, aby uzyskać materiał nasienny, a następnie systematycznie dodawano do warunków krystalizacji zawierających różne sole, aby uzyskać nowe kryształy o jakości dyfrakcyjnej, które inaczej by się nie uformowały. Technika ta została dodatkowo udoskonalona przez D'Arcy'ego i in., którzy opracowali losowe przesiewanie matrycy mikronasion (rMMS), w którym nasiona wprowadzano do sparowego przesiewania matrycy krystalizacyjnej ^6,7. Poprawiło to jakość kryształów i zwiększyło średnio liczbę trafień krystalizacyjnych o razy 7.

Po pomyślnym wytworzeniu kryształów i uzyskaniu wzoru dyfrakcyjnego promieniowania rentgenowskiego napotyka się kolejne wąskie gardło w postaci rozwiązania "problemu fazowego". Podczas procesu akwizycji danych rejestrowana jest intensywność dyfrakcji (proporcjonalna do kwadratu amplitudy), ale informacje o fazie są tracone, co prowadzi do problemu fazowego, który zatrzymuje natychmiastowe określenie struktury⁸. Jeśli docelowe białko dzieli wysoką tożsamość sekwencji z białkiem o wcześniej określonej strukturze, zastępowanie molekularne może być użyte do oszacowania informacji fazowej 9,10,11,12. Chociaż ta metoda jest szybka i niedroga, struktury modeli mogą nie być dostępne lub odpowiednie. Skuteczność metody molekularnej wymiany opartej na modelach homologicznych znacznie spada, gdy tożsamość sekwencji spada poniżej 35%¹³. W przypadku braku odpowiedniego modelu homologicznego można testować metody ab initio, takie jak ARCIMBOLDO^14,15 i AMPLE¹⁶. Metody te wykorzystują modele lub fragmenty przewidywane obliczeniowo jako punkty wyjścia do zastępowania cząsteczki. AMPLE, który wykorzystuje przewidywane modele wabików jako punkt wyjścia, ma trudności z rozwiązywaniem struktur dużych (>100 reszt) białek oraz białek zawierających głównie β-arkusze. ARCIMBOLDO, który próbuje dopasować małe fragmenty do większej struktury, jest ograniczony do danych o wysokiej rozdzielczości (≤2 Å) oraz dzięki zdolności algorytmów do rozszerzania fragmentów w pełną strukturę.

Jeśli metody zastępowania cząsteczek zawiodą, należy zastosować bezpośrednie metody, takie jak izomorficzne zastąpienie^17,18 oraz rozpraszanie anomalne na jednej długości fali (SAD¹⁹) lub wielu (MAD²⁰). Często dzieje się to w przypadku naprawdę nowych struktur, gdzie kryształ musi być utworzony lub pochodzony z ciężkim atomem. Można to osiągnąć poprzez namoczenie lub współkrystalizację z ciężkim związkiem atomowym, modyfikację chemiczną (np. włączenie 5-bromuracylu do RNA) lub znakowaną ekspresję białek (np. włączenie aminokwasów selenometioniny lub selenocysteiny do struktury pierwotnej)^21,22. Dodatkowo komplikuje to proces krystalizacji i wymaga dodatkowego przesiewania oraz optymalizacji.

Nowa klasa związków fazowych, w tym I3C (5-amino-2,4,6-kwas trijodoizoftalowy) i B3C (5-amino-2,4,6-kwas tribromoizoftalowy), oferuje ekscytujące przewagi w porównaniu z istniejącymi związkami fazowymi ^23,24,25. Zarówno I3C, jak i B3C posiadają aromatyczny rusztowanie pierścieniowe z naprzemiennym układem anomalnych rozpraszań niezbędnych do bezpośrednich metod fazowania oraz amino- lub karboksylanowych grup funkcyjnych, które oddziałują specyficznie z białkiem i zapewniają specyficzność miejsc wiązania. Następujące równoboczne trójkątne ułożenie grup metali ciężkich umożliwia uproszczoną walidację podstruktury fazowej. W chwili pisania tego tekstu w Protein Data Bank (PDB) znajduje się 26 struktur związanych z I3C, z czego 20 rozwiązano przy użyciu fazowania SAD²⁶.

Protokół ten zwiększa skuteczność pipeline'u określania struktury poprzez połączenie metod deriwatyzacji metali ciężkich i filtrowania rMMS, aby jednocześnie zwiększyć liczbę trafień krystalizacyjnych i uprościć proces derytacjonacji kryształów. Wykazaliśmy, że metoda ta była niezwykle skuteczna z lizozymem białka kurczaka oraz domeną nowego białka lizyny z bakteriofagu P68²⁷. Opisano rozwiązanie strukturalne wykorzystujące wysoce zautomatyzowany pipeline określania struktury Auto-Rickshaw, specjalnie dostosowane do złoża fazowego I3C. Istnieją inne zautomatyzowane potoki, które można wykorzystać, takie jak AutoSol²⁸, ELVES²⁹ i CRANK2³⁰. Niew pełni zautomatyzowane pakiety, takie jak SHELXC/D/E, mogą być również używane^{w numerach} 31,32,33. Metoda ta jest szczególnie korzystna dla badaczy badających białka pozbawione homologicznych modeli w PDB, ponieważ znacząco zmniejsza liczbę etapów przesiewowych i optymalizacji. Warunkiem wstępnym tej metody są kryształy białka lub krystaliczny wytrąg docelowego białka, uzyskany w poprzednich próbach krystalizacji.

Protokół

1. Planowanie eksperymentalne i rozważania

1. Używaj już istniejących kryształów interesującego białka, najlepiej generowanych przez dyfuzję parową. Dla uogólnionego protokołu dyfuzji parowej zobacz Benvenuti i Mangani³⁴. Inne metody krystalizacji, takie jak mikropartia pod olejem czy dyfuzja na swobodnym interfejsie, wymagają pobrania kryształów przed rozdrabnieniem w celu uzyskania mikronasion.
2. Przy przygotowywaniu materiału nasiennego używaj najwyższej jakości kryształów, które można poświęcić. Najwyższej jakości kryształ można ocenić wizualnie na podstawie morfologii lub wybrać najlepszy kryształ dyfrakcyjny, jeśli takie dane są dostępne. Bardzo prawdopodobne jest, że po optymalizacji poprzez zasiewanie uzyskuje się jeszcze lepszą jakość kryształów. W przypadku, gdy kryształów nie ma dostępnych, można użyć osadów krystalicznych, takich jak sferulity i igły.
3. Zidentyfikuj kryształki soli. Kryształy soli mogą rosnąć w ekranach krystalizacyjnych i mogą wyglądać jak kryształy białka. Stosowanie kryształów soli w rMMS nie przyniesie korzyści i zmarnuje cenną próbkę, dlatego ważne jest, aby wyeliminować fałszywe alarmy z solą.
   1. Kryształki soli są głośne, gdy zostaną zmiażdżone. Kryształy muszą zostać rozdrobnione, aby wytworzyć zapas nasienny, dlatego ta strategia jest szczególnie istotna. Jeśli podczas rozgniatania kryształów słychać dźwięk pęknięcia, kryształ prawdopodobnie stanowi sól.
   2. Jeśli białko zawiera reszty tryptofanu i tyrozyny, należy użyć mikroskopii fluorescencyjnej ultrafioletowej, aby zidentyfikować kryształy białka fluorescencyjne w tych warunkach oświetleniowych.
   3. Użyj barwnika Izit (błękit metylenowy) do barwienia kryształów białka, aby odróżnić je do kryształów soli, które pozostają stosunkowo nieprzebarwione. Jednak ta procedura jest bardziej destrukcyjna i zalecana tylko wtedy, gdy ktoś posiada kryształy na zapas z replik tej samej kropli.
      UWAGA: Chociaż wspomniane testy mogą dać obiecujące wyniki, kryształy soli mogą być nadal mylone z kryształami białkowymi. W takim przypadku eksperymenty dyfrakcyjne pozwalają jednoznacznie rozróżnić kryształ białka od soli.

2. Przygotowanie zapasów litowych I3C

1. Odmierz 120 mg I3C (5-amino-2,4,6-trijodoizoftalowy) do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 mL.
2. Rozpuszczać I3C w 200 μL 2 M wodorotlenku litu. Roztwór można delikatnie podgrzać za pomocą bloku grzewczego w temperaturze 40-60 °C, aby sprzyjać rozpuszczaniu. Powstały roztwór litu I3C powinien być brązowy i mieć stężenie 1 M.
   UWAGA: Wodorotlenek litu jest żrący. Należy nosić okulary ochronne, rękawiczki i fartuch laboratoryjny.
3. Zmierz pH roztworu. W razie potrzeby dodaj niewielkie ilości 1 M kwasu solnego lub 2 M wodorotlenku litu, aby dostosować pH do przedziału od 7 do 8. Dodaj miliQ wody, aby uzyskać ostateczną objętość roztworu do 400 μL. Stężenie roztworu I3C wynosi 0,5 M.
   UWAGA: Krok 2.3 jest opcjonalny. pH roztworu powinno mieścić się w zakresie pH 7-8 przed jakąkolwiek korektą pH. Ten krok powinien być wykonany, jeśli interesujące białko jest silnie dotknięte pH. Protokół można zatrzymać tutaj. Lit I3C można przechowywać w ciemności w temperaturze 4 °C przez co najmniej dwa tygodnie do^{35 lat}.

3. Dodanie I3C do zapasów białka

1. Metoda 1
   1. Dodaj stockowy lit I3C do aliquoty 150 μL docelowego białka. Ostateczne stężenie litu I3C powinno wynosić od 5 do 40 mM.
2. Metoda 2 (łagodniejsza metoda)
   1. Przygotuj bufor rozcieńczający białko, który odpowiada buforowi docelowego białka. Do tego buforu rozcieńczania dodaj fabryczny lit I3C, aby uzyskać stężenie litu I3C w zakresie 10-80 mM.
   2. Rozcieńcz białko w stosunku 1:1 buforem rozcieńczającym białko, aby uzyskać końcowe stężenie litu I3C w zakresie 5-40 mM.
      UWAGA: Niektóre białka wytrącają się przy kontakcie z wysokim stężeniem litu I3C w metodzie 1, podczas gdy inne białka mogą je tolerować. Metoda 2 zmniejsza prawdopodobieństwo opadów. Jednak ta metoda zmniejsza stężenie białka o połowę. Dla białek, które nie mają ustalonego protokołu krystalizacji, zaleca się zazwyczaj stężenie białka 10 mg/mL do wstępnego przesiewu krystalizacyjnego. Zaleca się początkowy stosunek molowy I3C do białka 8. Stężenie białka i molowy stosunek I3C do białka można zoptymalizować po wstępnym przesiewaniu.

4. Tworzenie materiału nasiennego

1. Zrób zaokrągloną sondę do rozgniatania kryształów.
   1. Na niebieskim płomieniu palnik Bunsena podgrzej pipetę Pasteura w jego środku. Za pomocą pęsety pociągnij koniec pipety Pasteura, aby wyciągnąć ją na cienką średnicę mniejszą niż 0,3 mm.
   2. Gdy środek jest wystarczająco cienki, trzymaj ten segment w płomieniu, aby oddzielić pipetę w tym miejscu, i okrąż koniec pipety, aby wykończyć szklaną sondę.
      UWAGA: Kruszarki do kryształów zaokrąglonych sond są sprzedawane przez zewnętrznych sprzedawców. Są to alternatywy dla tworzenia zaokrąglonych sond.
2. Umieść pięć rurek mikrowirówek o pojemności 1,5 mL na lodzie.
3. Pod mikroskopem świetlnym zbadaj tacę krystalizacyjną pod kątem odpowiednich warunków do wytwarzania mikrokryształów. Idealnie wybiera się duże kryształy o dobrej morfologii. Jednak technika ta działa także na kryształy o słabej morfologii, igły, płytki, mikrokryształy i sferulity.
4. Otwórz dobrze tackę krystalizacyjną. Dla tacek krystalizacyjnych na 96 dołków zamkniętych plastikiem, użyj skalpela, aby przeciąć plastik uszczelniający odwiert. Do zawieszania tacek na spadki uszczelnione smarem pokrywkę można zdjąć pęsetą i odwrócić na równą powierzchnię.
5. Przelej 70 μL roztworu rezerwuarowego do rurki mikrowirówki i schłodzi na lodzie. Do pozostałych rurek mikrowirówek dodaj 90 μL roztworu rezerwuarowego i wróć do lodu do schładzenia.
   UWAGA: Jeśli złoże nie ma wystarczającej objętości lub go nie istnieje (w przypadku mikropartii pod ropą), należy utworzyć rezerwuar krystalizacyjny poprzez mieszanie odpowiednich odczynników.
6. Porusz kryształ w kropli za pomocą sondy kryształowej, aby dokładnie go zmiażdżyć. Kryształ musi być całkowicie rozdrobniony, co można monitorować pod mikroskopem.
7. Usuń cały płyn z kropli i przelej go do rurki mikrowirówki z roztworem rezerwuarowym. Wymieszaj i następnie pobierz 2 μL mieszanki z rurki mikrowirówki i dodaj ją z powrotem do studni. Przepłucz studnię roztworem i przelej go do rurki mikrowirówki. Powtórz ten etap płukania jeszcze raz. Od tego momentu trzymaj rurkę mikrowirówki zimną, aby zapobiec topieniu mikronasion w mieszance.
8. Wykonaj wir w rurze z maksymalną prędkością 4 °C przez 3 minuty, regularnie zatrzymując się, aby schłodzić ją na lodzie i zapobiec przegrzaniu.
   UWAGA: Niektóre protokoły mikrozasiewania dodają do rurki mikrowirówki koralik nasionowy z politetrafluoroetylenu, aby ułatwić kruszenie kryształów ^7,36. Stosowaliśmy tę technikę bez użycia kulki nasiennej z powodzeniem, ale nie widzimy problemu z użyciem kulki nasion do rozdrabniania kryształów.
9. Wykonaj seryjne rozcieńczenie nasion w stosunku 1:10, przenosząc kolejno 10 μL między chłodzone roztwory złożowe.
10. Przechowywać nasiona, które nie będą używane od razu, w temperaturze -80 °C.

5. Ustawienie ekranu rMMS

1. Ustawianie płyty przesiewowej na 96 dołków za pomocą robota do dozowania płynów. W przypadku braku robota może być również użyta pipeta wielokanałowa.
   1. Przelej 75 μL z bloku głębokiego odwiertu do tacy krystalizacyjnej z 96 dołkami. Dodaj 1 μL do kropli krystalizacyjnej i 74 μL do złoża.
   2. Przenieś 1 μL białka uzupełnionego litem I3C, przygotowanego w kroku 2, do kropli krystalizacyjnej.
   3. Przelej 0,1 μL materiału nasiennego do kropli krystalizacyjnej.
   4. Uszczelnij płytkę przezroczystą taśmą uszczelniającą i inkubuj ją w stałej temperaturze, aby umożliwić wzrost kryształów.
2. Ustawianie wiszących sitów
   1. Nasmaruj krawędzie wiszących otworów kroplowych (wiszące tacy krystalizacyjne można znaleźć w formatach 24- i 48-dołkowy).
   2. Przelej 500 μL roztworu krystalizacyjnego do złoża.
   3. W pobliżu środka szkiełka szklanego umieść kroplę białka o pojemności 1 μL z dodatkiem litu I3C, przygotowaną w kroku 2.
   4. Dodaj 1 μL roztworu krystalizacyjnego do kropli.
   5. Przelej 0,1 μL materiału nasiennego do kropli krystalizacyjnej.
   6. Odwróć osłonę i dobrze uszczelnij krystalizację, wciskając osłonę w smar.
   7. Inkubuj płytkę w stałej temperaturze, aby umożliwić wzrost kryształów.
      UWAGA: W przypadku nowych i nieprzetestowanych materiałów nasion zaleca się stosowanie najbardziej skoncentrowanych nasion, aby zmaksymalizować szanse na krystalizację. Można ustawić kolejne warunki przy zmniejszonym stężeniu nasion, aby zoptymalizować liczbę kryształów.
3. Regularnie sprawdzaj tacki kryształowe pod mikroskopem pod kątem wzrostu kryształów. Jeśli kryształy są odpowiedniej jakości, mogą być pozyskiwane do zbierania danych. Kryształy mogą być również wykorzystywane do generowania nowych zapasów nasion oraz nowych ekranów rMMS, umożliwiających iteracyjny optymalizację.

6. Zbieranie danych

1. Zbieraj kryształy za pomocą krioloopów, krioprotecturz kryształy i szybko schładzaj je w ciekłym azocie. Dodatkowe informacje o kryształach chłodzenia błyskowego można znaleźć w Teng³⁷ oraz Garman and Mitchell³⁸.
   1. Podczas etapu krioprotekcji, jeśli kryształ przejdzie przez nowy roztwór wodnisty, I3C może zostać utracony z kryształu z powodu przenikania do roztworu krioprotekcyjnego. Stosuj lit I3C w roztworze krioprotekcji w stężeniu odpowiadającym warunkom krystalizacji, aby złagodzić ten problem.
   2. Kryształy hodowane przy użyciu tego protokołu zostały pomyślnie kriochronione za pomocą olejowego krioprotektantu Parabar 10312 (Hampton Research).
      UWAGA: Protokół można tu wstrzymać, podczas gdy kryształy są przechowywane w ciekłym azocie.
      UWAGA: Ciekły azot może powodować oparzenia zimna. Ciekły azot może również powodować uduszenie, jeśli jest stosowany w zamkniętych pomieszczeniach.
2. Zamontuj kryształ na goniometrze źródła rentgenowskiego i zbieraj dane dyfrakcyjne, stosując specyficzny protokół źródłowy dla źródła promieniowania rentgenowskiego.
3. Technika ta opiera się na anomalnym sygnale z atomów jodu w I3C. Dlatego wybierz energię promieniowania rentgenowskiego, aby zmaksymalizować ten sygnał.
   1. Ustaw źródła rentgenowskie synchrotronowe z regulowanymi energiami jak najniżej. Dla wielu linii wiązek makromolekularnej krystalografii najniższa konfigurowalna energia wynosi 8000 do 8500 eV.
   2. Obrotowe anodowe źródła rentgenowskie nie mogą być strojone. Powszechnie stosowane źródła anodowe z miedzią mają krawędź Kα przy 8046 eV, co zapewnia dobry anomalny sygnał dla jodu (f" = 6,9 e). Źródła anodowe zawierające chrom mają krawędź Kα przy 5415 eV, co zapewnia silny anomalii dla jodu (f" = 12,6 e).
4. Uszkodzenia spowodowane promieniowaniem są istotnym problemem podczas zbierania danych, ponieważ mogą pogorszyć anomalny sygnał³⁹. Wybierz czas naświetlania i tłumienie wiązki, aby osiągnąć najlepszą dyfrakcję przy minimalizacji dawki promieniowania.
   UWAGA: W podobnym związku fazowym, gdzie atomy jodu zastąpiono atomami bromu, wykazano, że uszkodzenia promieniowania powodują radiolizę wiązania bromowego węgla oraz zmniejszenie obsadzenia atomów bromu²⁴.
   1. Stosuj odwrotną wiązkę zbierania danych SAD jako strategię zbierania. Dane są zbierane w klinach, a przeciwległe kliny zbierane jeden po drugim. Pozwala to na zebranie par Friedla przy równoważnej dawce, co skutkuje lepszym pomiarem sygnału anomalnego mniej podatnego na uszkodzenia promieniowanie. Na przykład strategia ośmiu klinów do zbierania 360° polegałaby na zbieraniu danych w kolejności: klin 1 (0°-45°), klin 2 (180°-225°), klin 3 (46°-90°), klin 4 (225°-270°), klin 5 (90°-135°), klin 6 (270°-315°), klin 7 (135°-180°) i klin 8 (315°-360°).
      UWAGA: Ciągła rotacja jest alternatywną strategią zbierania danych w stosunku do odwrotnego zbierania danych wiązki. Najnowsze porównanie strategii zbierania można znaleźć w Garcie-Bonte & Katona⁴⁰.

7. Rozwiązanie w zakresie przetwarzania i struktury danych

1. Wykonaj redukcję danych na danych dyfrakcyjnych za pomocą XDS⁴¹, aby zmaksymalizować sygnał anomalny. Parametry wejściowe redukcji danych są specyficzne dla danego zbioru danych i mogą wymagać metod prób i błędów. Oto kilka rekomendacji na początek.
   1. Ustaw prawo FRIEDELA=FAŁSZYWE. Wykonaj CORRECT dwukrotnie, ustawiając STRICT_ABSORPTION_CORRECT = TRUE i STRICT_ABSORPTION_CORRECT = FALSE. Jeden przebieg może mieć wyższy sygnał anomalny niż drugi. Porównaj sygnały anomalne między przebiegami, używając dyscyplin 'Anomal Corr' i 'SigAno' na wyjściu. To stanowi wskaźnik jakości danych.
   2. Uruchom SHELXC na XDS_ASCII. Plik HKL dla dokładniejszego wskazywania sygnału anomalnego. Dyscyplina 'Ranom' daje wskazanie sygnału anomalnego o różnych rozdzielczościach.
2. Uruchom POINTLESS⁴² i^{AIMLESS 43} , aby skalować dane. W AIMLESS ustaw parametr ANOMALOUS ON. Jeśli używasz interfejsu GUI, wybierz opcję Oddzielne pary anomalne dla odrzucenia odstających i scalania statystyk. Może być konieczne testowanie różnych odcięć rozdzielczości, aby zmaksymalizować sygnał anomalii.
3. Rozwiąż strukturę białka za pomocą automatycznego pipeline określania struktury kryształowej Auto-Rickshaw⁴⁴. Auto-Rickshaw spróbuje rozwiązać problem fazowy i automatycznie zbudować strukturę krystaliczną białka za pomocą oprogramowania do modelowania i rafinacji białek.
   1. Dla białek bez szablonu modelu homologicznego uruchom protokół SAD Auto-Rickshaw w trybie zaawansowanym. Wprowadź wymagane parametry.
      1. Wybierz BIAŁKO jako typ cząsteczki.
      2. Wpisz długość fali zbierania danych w angstremach (Å).
      3. Wybierz "I" jako element podstruktury, aby wskazać, że użyto atomów jodu.
      4. Wybierz "i3c" jako typ podstruktury, aby wskazać, że I3C była cząsteczką fazową.
      5. Wybierz "sub_direct" jako metodę określania podstruktury. Metoda ta wykorzystuje SHELXD³² do wyszukiwania podstruktury.
      6. Wybierz "3" jako liczbę oczekiwanych podstruktur na monomer.
      7. Wpisz "1" jako próg rozdzielczości przeszukiwania podstruktur. Pozwala to Auto-Rickshaw automatycznie określić odpowiedni próg rozdzielczości.
      8. Wprowadź liczbę reszt w pojedynczym monomerze, grupę przestrzenną zbioru danych oraz liczbę cząsteczek w jednostce asymetrycznej na podstawie współczynnika Matthewsa.
      9. Wybierz odpowiedni poziom rozpowszechnienia danych rentgenowskich, który odpowiada Twoim potrzebom. Wybranie "AutoRickshaw developers" pozwoli deweloperom Auto-Rickshaw rozwiązywać problemy w przypadku problemów.
      10. Wprowadź anomalne dane jako plik mtz.
      11. Wprowadź sekwencję białka jako plik seq, pir lub txt. Plik seq można wygenerować w edytorze tekstowym (np. Notepad++⁹ na Windows lub nano na Linuksie). Utwórz nowy plik, wprowadź sekwencję pierwotną białka jako jedną długą linię lub oddzieloną przerwami linii. Zapisz plik z rozszerzeniem .seq.
      12. Wpisz adres e-mail instytucjonalny.
4. Wyniki są dostarczane za pośrednictwem linku internetowego przesyłanego na podany adres e-mail.
   UWAGA: AutoRickshaw to zautomatyzowany pipeline, który wykorzystuje różne pakiety oprogramowania krystalograficznego do rozwiązania struktury krystalicznej promieniowania rentgenowskiego 32,33,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54,55,56 ^,57,58. Jeśli przejazd Auto-Rikszą nie rozwiąże konstrukcji, można przetestować inne ustawienia Auto-Riksz. Metodę określania struktury można zmienić na "sub_phassade", aby używać Phaser⁵⁹ zamiast SHELXD³². Oczekiwana liczba podstruktury na monomer może być również zwiększana lub zmniejszana.
5. Podczas eksperymentalnego fazowania struktury krystalicznej Auto-Riksza będzie próbował umieścić ciężkie atomy w komórce elementarnej, tworząc podstrukturę. Równoboczne układ trójkątów atomów jodu w I3C stanowi efektywny sposób weryfikacji podstruktury. Jeśli krok 6.3 się nie powiedzie, weryfikacja podstruktury może pomóc w rozwiązywaniu problemów strukturalnych.
   1. Pobierz listę miejsc z ciężkimi atrukami ze strony wyników Auto-Rickshaw. Jest to hiperłącze zwane "miejscami ciężkich atomów". To pobierze plik tekstowy z witrynami o ciężkich atomach.
   2. Zmień rozszerzenie pliku z .txt na .pdb.
   3. Otwórz plik PDB w Coot⁶⁰. Włącz symetrię, aby zobaczyć inne ciężkie atomy z sąsiednich jednostek asymetrycznych.
   4. Zmierz odległości między ciężkimi atomami, w tym między jednostkami asymetrycznymi. I3C pojawi się jako trójkąt równoboczny o długości boków 6 angstremów. Obecność trójkąta o tych wymiarach wskazuje, że rozmieszczenie tych ciężkich atomów jest poprawne.

Wyniki

Włączanie I3C do rMMS może generować nowe warunki wspierające wzrost kryształów pochodnych
Skuteczność jednoczesnego przesiewu rMMS i derywacji I3C została wykazana w dwóch białkach: lizozymie białka kurczaka (HEWL, uzyskany jako liofilizowany proszek) oraz domniemanej domenie lizyny N-terminalnej Orf11 (Orf11 NTD) z bakteriofagu P68. Każde białko było testowane pod kątem PEG/ION HT w czterech różnych warunkach, w tym: bez nasienia, bez nasion, bez nasiona I3C oraz I3C (Rysunek 1). Dla obu białek samo dodanie I3C nie zwiększyło liczby warunków sprzyjających krystalizacji. W przypadku Orf11 NTD zidentyfikowano tylko jeden odpowiedni warunek z I3C i bez niego (Rysunek 1B). Po dodaniu I3C do ekranów HEWL liczba uderzeń została zmniejszona z 31 do 26, co podkreśla złożoność krystalizacji przy wprowadzaniu związków fazowych (rysunek 1A). Zgodnie z innymi badaniami, dodanie nasion do komercyjnych przesiewów rzadkich matryc w celu wygenerowania przesiewu rMMS znacząco zwiększyło liczbę możliwych warunków krystalizacji obu białek, co skutkowało wzrostem HEWL i Orf11 NTD odpowiednio 2,1 i 6-krotnie, odpowiednio ^6,61 (Rysunek 1). Co najważniejsze, jednoczesne dodanie I3C i seed zwiększyło liczbę trafień względem niezasiadanego ekranu, co wykazało odpowiednio 2,3- i 7-krotny wzrost dla HEWL i Orf11 NTD. Wiele kryształów z rMMS w obecności I3C wykazuje doskonałą morfologię kryształów (Rysunek 2).

Seeding umożliwia precyzyjną kontrolę liczby kryształów w ekranach rMMS I3C
W eksperymentach mikrozasiewania liczbę nasion wprowadzonych do próby krystalizacyjnej można kontrolować poprzez rozcieńczenie materiału nasiennego, co pozwala na precyzyjną kontrolę nukleacji w kropli ^7,36. Często pozwala to na powstawanie większych kryształów, ponieważ konkurencja cząsteczek białek w miejscach nukleacji jest mniejsza. Ta przewaga dotyczy także metody I3C-rMMS i została skutecznie zademonstrowana zarówno w HEWL, jak i Orf11 NTD. Odtworzenie warunków krystalizacji zidentyfikowanych na podstawie przesiewania I3C-rMMS z rozcieńczonym materiałem nasiennym dało mniej, ale większe kryształy (Rysunek 3).

Fazowanie SAD może być stosowane do rozwiązywania struktur z kryształów pochodzących z ekranu rMMS I3C
Kryształy wyhodowane przy użyciu rozcieńczonego materiału nasiennego pokazanego na Rysunku 3 zostały użyte do ustalenia struktury białek przy użyciu fazowania SAD na podstawie danych dyfrakcyjnych z pojedynczego kryształu (Rysunek 4). Dane zostały zebrane na australijskim Synchrotron MX1 linii^{wiązki 62}. Szczegółowe informacje o zbieraniu danych i strukturze rozwiązań opisano w innym miejscu²⁷.

Rysunek 1 – rMMS został użyty do wygenerowania nowych warunków wzrostu kryształów w obecności I3C dla dwóch białek testowych. Przeprowadzono 96-dołkowe ekrany dyfuzyjne pary przy użyciu komercyjnych rzadkich sitów matrycowych. (A) Lizozym białka kurczaka został przebadany za pomocą testu Index HT. Tace były zasiewane kryształami HEWL uprawianymi w 0,2 M dziecinu amonu o stężeniu dibazowym pH 7,0, 20% (w/v) glikolu polietylenowym 3350. (B) Orf11 NTD z bakteriofaga P68 został przetestowany za pomocą przesiewania PEG/ION. Tacki ORF11 NTD zostały wysiadowane z kryształów ze stanu G12 z ekranu bez zasiedowania, pokazanego na niebiesko. Warunki wspierające wzrost kryształów są pokazane na czerwono. zasiewanie rMMS w obecności i braku I3C dawało znacznie więcej kryształowych uderzeń niż tacki bez zasiewów. Ilustracja zaadaptowana z Truong i ^in.27. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 2 - Reprezentatywne obrazy kryształów wyhodowanych w wyniku prób dyfuzji parowej pokazane na Rysunkach 1 (a) i (b). Ilustracja zaadaptowana z Truong i ^in.27. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 3 – Rozcieńczenie materiału nasiennego to skuteczny sposób na zmniejszenie nukleacji w warunkach krystalizacji uzyskanych metodą I3C-rMMS, aby kontrolować liczbę powstających kryształów. Zmniejszenie nukleacji w kropli często skutkuje wzrostem kryształów do większych rozmiarów. Ilustracja zaadaptowana z Truong i ^in.27. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tej figurki.

Rysunek 4 - Orf11 NTD (PDB ID 6O43) i HEWL (PDB ID 6PBB) zostały skrystalizowane metodą I3C-rMMS i rozwiązane za pomocą fazowania SAD jak w Auto-Rickshaw. (A) Struktury wstęgowe HEWL i Orf11 NTD rozwiązane przez eksperymentalne fazowanie. (B) Cząsteczka I3C związana z HEWL i Orf11 NTD. (C) Anomalne atomy jodu w I3C są ułożone w trójkąt równoboczny o wymiarze 6 Å. Obecność tego trójkąta w podstrukturze fazowej wskazuje, że w tej pozycji znajduje się cząsteczka I3C. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

Określenie struktury nowego białka w przypadku braku odpowiedniego modelu homologicznego do zastąpienia cząsteczkowego wymaga eksperymentalnego fazowania. Metody te wymagają włączenia ciężkich atomów do kryształu białka, co zwiększa poziom złożoności w procesie określania struktury i może wprowadzać liczne przeszkody, które trzeba rozwiązać. Ciężkie atomy mogą być bezpośrednio włączone do białka poprzez oznakowaną ekspresję za pomocą selenometioniny i selenocysteiny. Ponieważ ta metoda jest kosztowna, mozolna i może prowadzić do niższych wydajności białek, oznakowane białko jest często eksprowane po znalezieniu i optymalizacji warunków krystalizacji za pomocą białka nieoznakowanego. Alternatywnie, kryształy można derytatyzować przez moczenie w roztworze zawierającym ciężkie atomy 22,63,64. Metoda ta często wykorzystuje wysokiej jakości kryształy i jest wykonywana po opracowaniu solidnej metody krystalizacji. Skuteczne uzyskanie sprowadzonego kryształu tą metodą wymaga dalszej optymalizacji procedur moczenia oraz przesiewania różnych związków fazowych, co wydłuża czas do już i tak żmudnego procesu.

Współkrystalizację białka z ciężkim atomem można przeprowadzić na etapie przesiewania, co efektywnie usprawnia proces i zmniejsza liczbę kroków manipulacji kryształami, które mogą powodować uszkodzenia. Jednak wciąż istnieje potencjalny scenariusz uzyskania niewielkiej liczby początkowych wyników krystalizacji oraz problem wyboru kompatybilnego związku ciężkiego atomu. Wiele obecnie dostępnych związków fazowych jest niekompatybilnych z wydzielaczami, buforami i dodatkami powszechnie występującymi w warunkach krystalizacji. Mogą być nierozpuszczalne w buforach siarczanowych i fosforanowych, chelatowane do cytrynianu i octana, reagować niekorzystnie z buforami HEPES i Tris lub być sekwestrowane przez DTT i β-merkaptoetanol²¹. Ponieważ związek fazujący I3C nie cierpi na te niekompatybilności, jest to wytrzymały związek fazowy, który może być podatny na wiele różnych warunków.

W niniejszym badaniu przedstawiono uprościoną metodę wytwarzania kryształów pochodnych gotowych do fazowania SAD poprzez jednoczesną kokrystalizację związku fazującego I3C i rMMS. Połączenie obu technik zwiększa liczbę trafień krystalizacji, a wiele z tych warunków ma lepszą morfologię i charakterystykę dyfrakcyjną. W obu przypadkach testów Orf11 NTD i HEWL zidentyfikowano nowe warunki w przesiewaniu I3C-rMMS, które były nieobecne, gdy I3C nie było obecne. Potencjalnie I3C może korzystnie wiązać się z białkiem, ułatwiając tworzenie i stabilizację kontaktów kryształowych²⁷. W konsekwencji może to indukować krystalizację i być może poprawić charakterystyki dyfrakcyjne. Poza tym, że jest związkiem zgodnym z rzadkimi przesiatkami matrycowymi, I3C jest także atrakcyjnym związkiem fazowym ze względu na swoje właściwości wewnętrzne. Grupy funkcjonalne, które na przemian mieszczą się z jodem na aromatycznym rusztowaniu pierścieniowym, umożliwiają specyficzne wiązanie z białkami. Prowadzi to do większego obsadzenia i potencjalnie zmniejsza sygnał tła²³. Ponadto rozmieszczenie anomalnych rozpraszaczy w trójkącie równobocznym jest oczywiste w podstrukturze i może być użyte do szybkiego potwierdzenia wiązania I3C (Rysunek 4B i 4C). Wreszcie, może generować anomalny sygnał z regulowanym promieniowaniem synchrotronowym oraz rotacyjnymi anodami chromu i miedzi. Dzięki temu można go stosować w wielu różnych procesach pracy. Ponieważ I3C jest szeroko dostępne i niedrogie w zakupie, takie podejście jest dostępne dla większości laboratoriów biologii strukturalnej.

Istnieje kilka czynników eksperymentalnych, które należy uwzględnić przy stosowaniu metody I3C-rMMS. Metoda ta nie może być stosowana, jeśli nie można uzyskać początkowego materiału krystalicznego białka. W trudnych przypadkach krystaliczny materiał z homologicznego białka może być również wykorzystany do produkcji materiału nasiennego. To podejście krzyżowego zasiewania rMMS przyniosło obiecujące rezultaty⁷. Optymalizacja liczby kryształów poprzez rozcieńczenie materiału nasiennego to kluczowy krok, którego nie należy pomijać, aby zmaksymalizować szansę na uzyskanie wysokiej jakości dużych kryształów i uzyskanie odpowiednich danych dyfrakcyjnych. Jeśli w jednostce asymetrycznej zidentyfikowano niewiele miejsc I3C, warunki sprzyjające krystalizacji powinny być dodatkowo optymalizowane poprzez zwiększenie stężenia I3C. Może to zwiększyć obsadzenie I3C, aby zmaksymalizować sygnał anomalii i wspomóc derywizację kryształów.

Mogą zdarzyć się sytuacje, gdy ta technika nie jest optymalną metodą deriwatyzacji kryształów białkowych. Wraz ze wzrostem rozmiaru białka lub kompleksu białkowego, ograniczona liczba miejsc I3C na powierzchni białka może nie zapewniać wystarczającej mocy fazowej do rozwiązania struktury. W takich sytuacjach, gdy podejrzewa się, że rozmiar białka utrudnia fazowanie, oznakowanie selenometioniny może być bardziej efektywnym sposobem na fazowanie białka. Jeśli białko zawiera wystarczającą ilość reszt metioniny (zaleca się co najmniej jedną metioninę na 100 reszt⁶⁵) i można osiągnąć wysoką efektywność włączenia selenometioniny do białka (np. w systemach ekspresji bakterii⁶⁶), w kryształach pojawi się wiele atomów selenu o wysokiej intensywności, które fazują strukturę.

Ponadto niektóre białka mogą z natury nie nadawać się do deriwacji z I3C. Miejsca wiązania I3C na białkach zależą od struktury białka. Mogą istnieć białka, które naturalnie mają niewiele odsłoniętych plam kompatybilnych z wiązaniem I3C. Dlatego nie jest nieprzewidywalne, że mogą wystąpić trudności w współkrystalizacji niektórych białek docelowych z I3C.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
10 mL jednorazowe strzykawki luer lock	Adelab Scientific	T3SS10LAT	Używany do dozowania smaru próżniowego do zawieszania dołków na kryształy
Płytka do hodowli tkanek z 24 dołkami	Sigma Aldrich	CLS3527	Używany do wieszania tacy na kryształy kroplujące
Krystalicznie przezroczysta taśma uszczelniająca o szerokości 3 cali	Badania Hampton	HR4-506	Dla 96-dołowych ekranów krystalizacyjnych ustawionych przez robota
5-amino-2,4,6-trijodooftalowy kwas	Alfa Aesar	B22178	W artykule powszechnie określany jako I3C
Art Robbins Intelli-Plate 96-2 Oryginał	Badania Hampton	HR3-297	Dla 96-dołowych ekranów krystalizacyjnych ustawionych przez robota
Slipy na okładkę	Thermo Fisher Scientific	18X18-2	Pokrywki do wieszania wnęk na kryształy
Smar próżniowy Dow Corning	Badania Hampton	HR3-510	Używany do uszczelniania wiszących wejść na tacy kryształowe
Eppendorf Pipette 0,1 μ L-2.5 μ L	Eppendorf	3120000011
Gilson Pipette 2 μ L-20 μ L	Grupa John Morris	1153247
Gilson Pipette 20 μ L-200 μ L	Grupa John Morris	1152006
Szklane pipety pasteura	Adelab Scientific	HIR92601.01
Lizozym białka jaj z kury	Sigma-Aldrich	L6876	Około 95% czyste
Ekran IndexHT	Badania Hampton	HR2-134
Oświetlacz mikroskopu	Meiji Techno	FT192/230	Źródło światła do oświetlania eksperymentów krystalograficznych
Ekran HT PEG/ION	Badania Hampton	HR2-139
Dozownik płynów Phoenix	Art Robbins Instruments	602-0001-10
Skalpel z ostrzem skalpela nr 15	Adelab Scientific	LV-SMSCPO15
Zestaw do nasion	Badania Hampton	HR2-320	Zestaw zawiera szklaną sondę do kruszenia kryształów. Zestaw zawiera także koralik nasienny PTFE, zaprojektowany do kruszenia kryształów, ale nie jest używany w tym protokole.
Mikroskop stereo	Meiji Techno	EMZ-5TR	Mikroskop do wizualizacji eksperymentów krystalograficznych
Pęseta	Sigma-Aldrich	T5415
Mieszacz wirowy	Adelab Scientific	RAVM1