Artykuł metodologiczny

Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

5K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/61954

⸱

22 grudnia 2020

 , 
1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

W tym artykule

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zastosowania immobilizacji próbki za pomocą skrzepów fibryny, ograniczając dryf i umożliwiając dodawanie i wymywanie odczynników podczas obrazowania na żywo. Próbki przenosi się do kropli pożywki zawierającej fibrynogen na powierzchni szkiełka nakrywkowego, po czym indukuje się polimeryzację przez dodanie trombiny.

Streszczenie

Drosophila to ważny system modelowy do badania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych. Różne narządy i tkanki z różnych etapów rozwoju muchy, takie jak dyski wyobrażeniowe, mózg larwy lub komory jajowe dorosłych samic lub jelito dorosłego osobnika, można pobrać i przechowywać w kulturze w celu obrazowania za pomocą mikroskopii poklatkowej, dostarczając cennych informacji na temat biologii komórki i rozwoju. W tym miejscu szczegółowo opisujemy nasz obecny protokół preparacji mózgów larw Drosophila, a następnie przedstawiamy nasze obecne podejście do unieruchamiania i orientowania mózgów larw i innych tkanek na szklanym szkiełku nakrywkowym za pomocą skrzepów fibryny. Ta metoda immobilizacji wymaga jedynie dodania fibrynogenu i trombiny do pożywki hodowlanej. Nadaje się do obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości na odwróconych mikroskopach wielu próbek w tej samej naczyniu hodowlanym, minimalizuje boczne dryfowanie często spowodowane ruchami stolika mikroskopu w wielopunktowej mikroskopii wizytującej i pozwala na dodawanie i usuwanie odczynników w trakcie obrazowania. Prezentujemy również makra na zamówienie, których rutynowo używamy do korygowania dryfu oraz do wyodrębniania i przetwarzania określonych informacji ilościowych z analizy poklatkowej.

Wprowadzenie

Drosophila nadal jest ważnym modelowym systemem do badania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych i od dziesięcioleci przoduje w poszerzaniu wiedzy w wielu dyscyplinach. Jedną z cech, która szczególnie go wyróżnia, jest to, że szczególnie dobrze nadaje się do obrazowania na żywo. Możliwość monitorowania procesów subkomórkowych lub zachowania komórek i tkanek w czasie rzeczywistym nadal przyczynia się do generowania kluczowych pojęć związanych z biologią komórki i rozwoju. Wiele udanych protokołów zostało opracowanych przez różne grupy, aby utrzymać takie próbki Drosophila przy życiu i w zdrowiu, aby zbadać zachowanie próbki i żywych cząsteczek fluorescencyjnych. Narządy i tkanki muchy, takie jak dyski wyobrażeniowe1,2, mózg larwy3,4,5,6, lub komory jajowe dorosłych samic7,8,9, lub dorosłe jelito10 Na przykład można je wyekstrahować i przechowywać w kulturze w celu obrazowania za pomocą mikroskopii poklatkowej. Kluczowym wyzwaniem dla obrazowania na żywo jest zapewnienie, że próbka jest utrzymywana blisko powierzchni obrazowania w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości i nieruchomego bez naruszania integralności próbki, która może być wrażliwa na uderzenia mechaniczne. Na przykład, aby badać nerwowe komórki macierzyste, zwane neuroblastami lub neuronami w mózgu larw Drosophila, można utrzymać próbki blisko powierzchni obrazowania, pokrywając je pożywką hodowlaną w szczelnych komorach obrazowania11,12,13. Podejście to nie pozwala jednak na łatwą wymianę mediów, co ogranicza eksperymentalne pole manewru. Alternatywnie, próbki można przygotować i umieścić na szkiełkach nakrywkowych poddanych obróbce w celu zwiększenia adhezji komórek i umożliwienia wielopunktowej mikroskopii wizytującej oraz rozszerzonego obrazowania żywych komórek w otwartych szalkach hodowlanych, które potencjalnie umożliwiają wymianę pożywki, ale nie zapewniają łatwych środków zapobiegających dryfowaniu lub utracie próbki podczas wymiany pożywki14,15.

Metoda skrzepów fibrynowych, pierwotnie opracowana do badania mejozy u żywych spermatocytów muchy żurawia16 jest specjalnie przystosowana do przezwyciężenia tych problemów. Fibrynogen rozpuszcza się w odpowiedniej pożywce hodowlanej, próbki umieszcza się i orientuje w kropli tego roztworu w odpowiedniej komorze obrazowania o szklanej powierzchni przed dodaniem trombiny, co powoduje szybkie tworzenie się nierozpuszczalnego skrzepu fibryny, lepkiej włóknistej siatki, która przylega do powierzchni szkła i próbek, zapewniając jednocześnie dostęp próbki do pożywki hodowlanej. Pożywka może być następnie wymieniona bez zakłócania pozycji skrzepu lub próbki. Wymiana pożywki hodowlanej podczas obrazowania jest na przykład pożądana, gdy inhibitory mają być dodawane jak w oryginalnej metodzie lub do eksperymentów z wymłukiwaniem lub pościgiem impulsowym, lub gdy barwniki fluorescencyjne mają być dodawane podczas obrazowania żywych komórek, przy jednoczesnym utrzymywaniu komórek i tkanek na miejscu. Skrzepy fibrynowe nadają się do obrazowania tkanek Drosophila, a także pojedynczych komórek13,17. Skrzepy fibrynowe mogą być ponadto wykorzystywane do orientacji próbek, które ze względu na swój kształt lub inne właściwości normalnie nie byłyby zorientowane w pożądany sposób poprzez modulację pozycji próbki w skrzepie fibryny i kształtu samego skrzepu.

Tutaj przedstawiamy aktualne informacje na temat naszych obecnych metod obrazowania opartych na skrzepach fibryny i udostępniamy narzędzia do analizy obrazu opartej na segmentacji oraz skupiamy się na wykorzystaniu tej metody do badania podziałów neuroblastów w rozwijającym się mózgu muchy. Rutynowo stosujemy metodę skrzepu fibrynowego, aby śledzić wiele próbek w różnych skrzepach w tym samym naczyniu hodowlanym. Pozwala to i) na obrazowanie zdarzeń subkomórkowych, takich jak zachowanie centrosomów lub lokalizacja mRNA na żywo18,19, ii) monitorowanie zachowania próbek podczas leczenia farmakologicznego różnych genotypów przy użyciu tych samych ustawień obrazowania przy użyciu wielopunktowej mikroskopii wizytującej20, iii) badanie skutków ostrego hamowania enzymów21 oraz iv) minimalizacja dryfowania w celu zbadania zmian w orientacji podziału komórek w ich środowisku fizjologicznym po ukierunkowanej ablacji laserowej22. Podczas gdy niepożądane działanie trombiny i fibrynogenu oraz skrzepu fibryny musi być empirycznie przetestowane dla każdej próbki, metoda ta jest w zasadzie odpowiednia do unieruchomienia każdego rodzaju próbki, która ma być analizowana za pomocą obrazowania żywych komórek, a u Drosophila została z powodzeniem wykorzystana do badania wielu aspektów biologii neuroblastów5,19, 20, ale także dynamika projekcji cytosensorów żeńskich komórek macierzystych linii zarodkowej23 oraz zmiany polaryzacji po ostrym zahamowaniu aPKC komórek pęcherzykowych komór jajowych samic Drosophila21.

Poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne powoduje generowanie złożonych zestawów danych 3D z rozdzielczością czasową, które wymagają metod ekstrakcji tych ilościowych informacji. Poniżej opisujemy nasz dalszy rozwój makr opartych na ImageJ24, które mogą być używane do korygowania dryfowania w hiperstosach oraz niestandardowych makr ImageJ, które umożliwiają półautomatyczną kwantyfikację wielokanałowej fluorescencji w korze komórkowej, opracowanej do ilościowego oznaczania białek korowych w neuroblastach mózgów larw Drosophila lub pojedynczych neuroblastów w pierwotnej hodowli komórkowej.

Protokół

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Wszystkie etapy niniejszego protokołu, o ile nie wskazano inaczej, są przeprowadzane w temperaturze pokojowej.

  1. Aby przygotować roztwór 1x PBS-BSA (0,1% w/v), rozpuścić 1 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1 mL PBS. Aby przygotować roztwór zapasowy trombiny o stężeniu 1 000 jednostek·mL-1, rozpuścić 1 000 jednostek trombiny w 1 mL PBS-BSA (0,1% w/v). Rozdzielić na alikwoty po 10 µL i przechowywać w temperaturze -20 °C do 4 miesięcy.
  2. Aby przygotować pożywkę dla mózgów Drosophila, rozpuścić 1 g glukozy w 1 L pożywki Schneidera w warunkach sterylnych. Przefiltrować i przechowywać w temperaturze 4 °C do 3 miesięcy.
  3. Aby przygotować roztwór fibrynogenu, rozpuścić 10 mg fibrynogenu w 1 mL pożywki hodowlanej przez 20 min w temperaturze pokojowej lub 5 min w 37 °C.
    UWAGA: Jeśli użyto innej pożywki hodowlanej niż ta przygotowana w kroku 1.2 i na tym etapie tworzą się już skrzepy fibryny, pożywka prawdopodobnie zawiera aktywną trombinę, którą należy wcześniej dezaktywować. Prawdopodobnym źródłem trombiny jest płodowa surowica bydlęca, którą można dezaktywować poprzez podgrzanie surowicy do 56 °C przez 30 min.
  4. Aby przygotować roztwór do powlekania PBS-BSA (5% w/v), rozpuścić 50 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1 mL 1x PBS.
  5. W przypadku odczynnika przykładowego użytego w kroku 4, przygotować roztwór zapasowy 10 mM NAPP1, rozpuszczając 1 mg NAPP1 w 315 µL dimetylosulfotlenku.

2. Disekcja mózgów larw Drosophila

UWAGA: Ten krok należy wykonać pod stereomikroskopem.

  1. Za pomocą pędzelka przenieś larwy L3 do 9-dołkowej szalki z borokrzemianowego szkła zawierającej PBS. Zamieszaj, aby oddzielić większość pożywki od larw, a następnie przenieś je do innego dołka zawierającego pożywkę hodowlaną.
  2. Używając pęsety (np. Dumont #55), chwyć larwę w poprzek całego jej przekroju, w połowie długości ciała (patrz Rycina 1A,B). Trzymając larwę, przenieś ją do innego dołka płytki borokrzemianowej zawierającego 200 µL świeżej pożywki hodowlanej.
  3. Nie puszczaj larwy. Aby przeciąć larwę na pół w poprzek całego jej przekroju (Rycina 1B), należy albo rozetrzeć chwycony obszar bocznymi ruchami końcówek pęsety (Rycina 1A, górny panel), albo wsunąć końcówkę drugiej pęsety pomiędzy końcówki pęsety trzymającej larwę (Rycina 1A, dolny panel). Nie przecinaj larwy na pół poprzez ciągnięcie za jeden z jej końców, ponieważ może to uszkodzić mózg poprzez pociągnięcie za nerwy biegnące wzdłuż ciała (czerwone linie na Rycinie 1B).
  4. Użyj pęsety, aby utrzymać larwę za kutykulą, a drugiej pęsety, aby rozdzielić kutykulę, nie ciągnąc przy tym za mózg (Rycina 1C). Powtarzaj czynność do momentu, aż nerwy wychodzące z mózgu staną się widoczne, a organy łączące mózg z częściami gębowymi będą dostępne, jak pokazano na Rycynie 1D.
  5. Użyj pęsety, aby utrzymać nerwy wychodzące z mózgu. Drugą pęsetą, stosując jedną z technik pokazanych na Rycynie 1A, przetnij połączenie między mózgiem a częściami gębowymi, oddzielając mózg od reszty kutykuli (Rycina 1D).
  6. Użyj pęsety, aby utrzymać mózg za aksonami wychodzącymi z brzusznego sznura nerwowego. Usuń organy zaznaczone na szaro na Rycynie 1E, delikatnie odciągając je od mózgu.
    UWAGA: Nie ciągnij za tarczki imaginalne oka/anten (ciemnożółte), aby oddzielić je od mózgu. Połączenie między tymi tkankami jest zbyt silne, aby można je było przerwać przez ciągnięcie bez uszkodzenia mózgu.
  7. Wciąż trzymając nerwy w celu stabilizacji i orientacji mózgu, chwyć drugą pęsetą połączenie między tarczkami imaginalnymi oka/anten (ciemnożółte) a mózgiem (Rycina 1F). Użyj jednej z technik pokazanych na Rycynie 1A, aby przeciąć to połączenie bez ciągnięcia za mózg. Sprawdź, czy mózg jest odpowiednio oczyszczony z innych tkanek (Rycina 1G) i nie jest uszkodzony (Rycina 1H). Odrzuć mózg, jeśli wykazuje oznaki uszkodzenia.
  8. Za pomocą pipety P20 pobierz i wypuść roztwór powlekający, aby pokryć końcówkę pipety. Pobierz mózg za pomocą powlekanej końcówki wraz z 3 µL pożywki (Rycina 2A, lewa) i przenieś go do innego dołka zawierającego 200 µL czystej pożywki hodowlanej.
  9. Powtarzaj kroki 2.2–2.8 do momentu wypreparowania odpowiedniej liczby mózgów, okresowo wymieniając pożywkę hodowlaną w dołku, w którym przeprowadzane są preparacje.

Proces sekcji owada, schemat przedstawiający kolejne kroki z użyciem narzędzi, z wyróżnieniem technik cięcia i trzymania.
Rycina 1: Sekcja mózgów larw D. melanogaster. (A) Technika cięcia bez rozciągania przy użyciu pęsety. Próbkę (jasnozielona) można przeciąć, rozcierając ją między końcówkami pęsety (górny panel) lub przesuwając końcówką jednej pęsety wzdłuż końcówek drugiej pęsety trzymającej próbkę (dolny panel). (B–F) Kroki izolacji mózgu larwy bez jego uszkodzenia (patrz tekst). Czerwony: mózg. Ciemnożółty: prążki oka/anten. Niebieski tekst: czynności do wykonania z odpowiednią pęsetą. (G) Wygląd wyizolowanego mózgu bez widocznych uszkodzeń. D to strona grzbietowa, a V to strona brzuszna w widoku bocznym. (H) Typowe uszkodzenia spowodowane nadmiernym rozciąganiem mózgu podczas sekcji. Górny panel: oderwanie brzusznego sznura nerwowego. Dolny panel: deformacja płata. Na wszystkich panelach tył znajduje się po lewej, a przód po prawej stronie. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Immobilizacja na szkiełku podstawnym z użyciem skrzepów fibryny

UWAGA: Ten krok należy wykonać pod stereomikroskopem.

  1. Używając pipety P20 z powlekanym końcem, jak w kroku 2.8, przenieść wypreparowane mózgi do innego dołka płytki borokrzemianowej zawierającej 200 µL pożywki hodowlanej + Fibrinogenu (Rycina 2A).
  2. Nabrać jeden mózg wraz z 9 µL pożywki hodowlanej + Fibrinogenu. Ustawiając koniec końcówki prawie przy dnie z lamélki naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm, wydropić zawartość (pożywkę hodowlaną i mózg) tak, aby pożywka dotknęła lamélki natychmiast po opuszczeniu końcówki pipety, zapobiegając tym samym zsunięciu się mózgu i pożywki na boki końcówki, co mogłoby uszkodzić mózg (Rycina 2A).
  3. Używając jednego ramienia pęsety lub zamkniętej pęsety, delikatnie przesunąć i ustawić mózg w kropli pożywki hodowlanej + Fibrinogenu.
    UWAGA: Dotknięcie kropli otwartą pęsetą może spowodować wciągnięcie pożywki hodowlanej przez kapilarność między ramionami pęsety (Rycina 2B).
  4. Jeśli obrazowanie ma objąć część brzuszną mózgu, wywołać krzepnięcie Fibrinogenu w następujący sposób, aby prawidłowo zorientować mózg w skrzepie (Rycina 2C).
    1. Przesunąć mózg na jedną stronę kropli. Za pomocą pipety P1 z końcówką P1 nabrać 1 µL roztworu Trombiny, dotknąć końcówką pipety brzegu kropli po przeciwnej stronie mózgu i wydropić Trombinę (Rycina 2C, pierwszy rysunek).
    2. Odczekać 1–2 min, aż Fibrinogen zacznie polimeryzować, co doprowadzi do powstania mętnego osadu po jednej stronie kropli (Rycina 2C, drugi rysunek). Delikatnie przesunąć i „wtłoczyć” mózg w skrzep fibrynowy, upewniając się, że część przeznaczona do obrazowania (np. strona brzuszna) znajduje się jak najbliżej lamélki, bez deformowania mózgu (Rycina 2C, trzeci rysunek).
    3. Wydropić 1 µL roztworu Trombiny blisko strony mózgu, która nie została wtłoczona w skrzep fibrynowy (Rycina 2C, czwarty rysunek).
    4. Odczekać 2–3 min na utwardzenie drugiego skrzepu fibrynowego (Rycina 2C, piąty rysunek). Docisnąć brzegi skrzepu, aby mocniej przylgał do lamélki, uważając, by nie zdeformować mózgu (Rycina 2C, szósty i siódmy rysunek). Jeśli mózg wydaje się być zbyt daleko od lamélki, zbliżyć go, dociskając skrzep fibrynowy blisko mózgu.
  5. Jeśli obrazowanie ma objąć część grzbietową mózgu, wywołać krzepnięcie fibryny w następujący sposób (Rycina 2D).
    1. Ustawić mózg w centrum kropli, stroną grzbietową skierowaną ku lamélce. Za pomocą pipety P10 z cienką końcówką nabrać 1 µL roztworu Trombiny, dotknąć końcówką pipety brzegu kropli po przeciwnej stronie mózgu i wydropić Trombinę (Rycina 2D, pierwszy rysunek).
    2. Odczekać 2–3 min, aż Fibrinogen zacznie polimeryzować, co doprowadzi do powstania mętnego, włóknistego osadu (Rycina 2D, drugi rysunek). Docisnąć brzegi skrzepu, aby mocniej przylgał do lamélki, uważając, by nie zdeformować mózgu (Rycina 2D, trzeci i czwarty rysunek).
  6. Powtórzyć kroki 3.1–3.5, jeśli na lamélce należy unieruchomić kilka próbek w skrzepach.
  7. Ustawiając koniec końcówki około 0,5 cm nad skrzepem (skrzepami), delikatnie nanieść kroplowo 390 µL pożywki hodowlanej bez Fibrinogenu na wierzch skrzepu (skrzepów) (Rycina 2B, prawa szalka Petriego). Nie dodawać pożywki hodowlanej po bokach skrzepu, ponieważ może to spowodować jego odczepienie od lamélki.
  8. Aby wypłukać pozostałą Trombinę, usunąć pipetą 300 µl pożywki hodowlanej i dodać 300 µl świeżej pożywki hodowlanej, upewniając się, że skrzepy pozostają całkowicie zanurzone. Powtórzyć dwukrotnie, aby wypłukać nadmiar Trombiny.

Schemat eksperymentu z hodowlą tkankową: pipetowanie, aplikacja trombiny, przenoszenie tkanki, wzrost komórek.
Rycina 2: Immobilizacja mózgu larwy Drosophila przy użyciu skrzepów fibryny.(A) Przy użyciu końcówki pipety pokrytej BSA, mózgi są przenoszone z pożywki hodowlanej (żółta) do roztworu pożywki hodowlanej + fibrynogenu (pomarańczowy), a następnie pipetowane na szkiełko nakrywkowe (jasnoniebieskie) w naczyniu hodowlanym wraz z 3,5 µL pożywki hodowlanej + fibrynogenu. Krzepnięcie fibrynogenu jest indukowane poprzez dodanie trombiny, aby unieruchomić mózgi w pozycji grzbietowej lub brzusznej (patrz D i E). Zabezpieczone w skrzepach mózgi są następnie przykrywane pożywką hodowlaną bez fibrynogenu, a nadmiar trombiny jest usuwany poprzez trzykrotne dodanie i odessanie pożywki hodowlanej. (B) Położenie mózgu w kropli pożywki hodowlanej + fibrynogenu (pomarańczowa) na szkiełku nakrywkowym należy korygować wyłącznie poprzez delikatne popychanie go końcówką zamkniętej pęsety lub tylko jedną końcówką pęsety. Dotknięcie kropli otwartą pęsetą może spowodować zassanie pożywki hodowlanej przez kapilarność między końcówkami pęsety. (C) Kroki pozycjonowania mózgu larwy w celu obrazowania strony brzusznej (patrz tekst). (D) Kroki pozycjonowania mózgu larwy w celu obrazowania strony grzbietowej (patrz tekst). W punktach (D) i (E) kolor zielony oznacza trombinę, ciemnopomarańczowy: skrzep fibryny, bladosiebieski: szkiełko nakrywkowe, niebieskie strzałki: krawędzie skrzepu, które należy docisnąć do szkiełka nakrywkowego w celu stabilizacji skrzepu. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

4. Dodawanie odczynników podczas obrazowania na żywo

  1. Aby uniknąć zmian ostrości spowodowanych wahaniami temperatury, przed dodaniem roztworu z odczynnikami do naczynia hodowlanego należy doprowadzić go do tej samej temperatury, co naczynie. W przypadku korzystania z komory inkubacyjnej, należy pozostawić roztwór wewnątrz komory.
  2. Zdejmij pokrywkę naczynia hodowlanego, uważając, aby nie przesunąć samego naczynia. Dla ułatwienia zdejmowania, przed obrazowaniem połóż pokrywkę naczynia 35 mm do góry dnem na wierzchu naczynia.
  3. Za pomocą pipety P1000 umieść końcówkę pipety blisko powierzchni medium hodowlanego wewnątrz naczynia i delikatnie nanieś odpowiednią objętość roztworu odczynnika, aby uzyskać pożądane stężenie (np. 400 µL roztworu 20 µM NAPP1 do 400 µL medium hodowlanego dla końcowego stężenia 10 µM NAPP1), unikając tworzenia silnych strumieni, które mogłyby oderwać skrzepy.
  4. Aby ujednorodnić roztwór w naczyniu hodowlanym, użyj pipety P200, aby powoli pobrać i wypuścić niewielką ilość roztworu pięć razy (np. 150 µL przy objętości 800 µL w naczyniu).
  5. Nałóż ponownie pokrywkę na naczynie hodowlane, nie przesuwając samego naczynia, i wznow obrazowanie.

5. Wypłukiwanie odczynników podczas obrazowania na żywo

  1. Przed wypłukaniem należy utrzymać roztwór płuczący w tej samej temperaturze co szalka hodowlana.
  2. Zdejmij pokrywkę szalki hodowlanej, uważając, aby nie przesunąć samej szalki.
  3. Za pomocą pipety P200 lub P1000 powoli usuń część pożywki z szalki hodowlanej, nie odsłaniając górnej powierzchni skrzepu (np. usuń 600 µL z 800 µL pożywki znajdującej się w szalce).
  4. Aby rozcieńczyć odczynnik, za pomocą pipety P1000 umieść końcówkę pipety blisko powierzchni pożywki wewnątrz szalki hodowlanej i powoli dodaj roztwór płuczący (np. dodaj 1 mL roztworu płuczącego do pozostałych w szalce 200 µL pożywki, aby uzyskać czynnik rozcieńczenia równy 6).
  5. Powtarzaj kroki 5.3 i 5.4 do momentu uzyskania wymaganego rozcieńczenia odczynnika (np. kolejne trzy podobne cykle pozwolą uzyskać czynnik rozcieńczenia 1296, co zredukuje początkowe stężenie 10 µM NAPP1 do 7,7 nM).
  6. Nałóż pokrywkę z powrotem na szalkę hodowlaną, nie przesuwając samej szalki, i wznow obrazowanie.

6. Korekcja dryftu xyz w trójwymiarowych i/lub wielokanałowych seriach czasowych

  1. Przygotowanie
    1. Pobierz i zainstaluj program ImageJ24. Pobierz wtyczki TurboReg25 oraz MultiStackReg26 i umieść je w folderze plugins programu ImageJ.
    2. Pobierz makra ImageJ MultiHyperStackReg (Plik kodowy uzupełniający 1) i AutoHyperStackReg (Plik kodowy uzupełniający 2). Aby zainstalować makro, umieść plik .ijm w folderze plugins programu ImageJ lub dodaj zawartość pliku .ijm do pliku ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
    3. W programie ImageJ otwórz film time-lapse zawierający kilka warstw i/lub kilka kanałów (zwany dalej „hyperstackiem”, Rysunek 3A,4A). Jeśli time-lapse zawiera tylko jedną warstwę i jeden kanał, wyrównanie można przeprowadzić bezpośrednio za pomocą MultiStackReg.
  2. Korekcja dryftu bocznego za pomocą MultiHyperStackReg
    1. Zdecyduj, który kanał i/lub warstwa hyperstacka powinny służyć jako odniesienie do wyrównania. Aby wygenerować jednokanałowy i jednoelementowy stos referencyjny (zwany dalej „stosem referencyjnym”), kliknij Image | Duplicate…, zaznacz pole Duplicate hyperstack, wpisz odpowiedni numer kanału w polu Channels (c): (np. zastąp 1–2 liczbą 1) i/lub odpowiedni numer warstwy w polu Slices (z): (np. zastąp 1–15 liczbą 8), a następnie upewnij się, że pole Frames: (t) obejmuje wszystkie klatki (np. 1–50) przed kliknięciem OK (Rysunek 3B).
    2. Alternatywnie do kroku 6.2.1, jeśli dla jednokanałowego i jednoelementowego stosu referencyjnego preferowana jest projekcja wielu warstw, kliknij Image | Stacks | Z Project…, wybierz pierwszą i ostatnią warstwę oraz typ projekcji, upewnij się, że zaznaczono opcję All time frames i kliknij OK. Jeśli time-lapse ma wiele kanałów, usuń nieistotne kanały (Image | Stacks | Delete Slice) z otrzymanej projekcji lub zduplikuj wybrany kanał referencyjny (Image | Duplicate) (Rysunek 3B).
    3. Opcjonalnie przytnij stos referencyjny, aby użyć tylko jednej części obrazu jako odniesienia, wybierając narzędzie prostokąta na pasku narzędzi, zaznaczając prostokątem obszar zainteresowania i klikając Image | Crop.
    4. Aby uruchomić MultiStackReg, kliknij Plugins | Registration | MultiStackReg. W menu rozwijanym Stack 1: wybierz nazwę jednokanałowego i jednoelementowego stosu wygenerowanego w poprzednich krokach. W menu rozwijanym Transformation: wybierz Translation; zaznacz pole Save Transformation File i zignoruj pozostałe pola.
      UWAGA: Inne typy transformacji (patrz25).
    5. Kliknij OK. Wybierz lokalizację i nazwę pliku wyrównania, a następnie kliknij Save. W oknie stosu referencyjnego poczekaj, aż klatki przestaną automatycznie się poruszać, co oznacza zakończenie rejestracji (Rysunek 3B).
    6. Sprawdź na stosie referencyjnym, czy wyrównanie jest satysfakcjonujące. Jeśli nie, powtórz kroki 6.2.1–6.2.5 z inną warstwą referencyjną, kanałem i/lub innym przycięciem. Zamknij stos referencyjny.
    7. Wybierz okno hyperstacka i uruchom makro MultiHyperStackReg. Wybierz plik transformacji utworzony w kroku 6.2.5 i kliknij Open. Poczekaj, aż wyrównanie zostanie zastosowane do każdego kanału i/lub warstwy hyperstacka, po czym otworzy się nowe okno z przyrostkiem „_aligned” (Rysunek 3C).
  3. Korekcja dryftu ostrości za pomocą MultiHyperStackReg
    1. Kliknij Image | Properties… i skopiuj wartość wyświetlaną w Pixel Width. Aby ortogonalnie zmienić próbkowanie (reslice) jednokanałowego hyperstacka z odstępem jednego piksela, kliknij Image | Stacks | Reslice [/]…, wklej wartość szerokości piksela w polu numerycznym Output Spacing:; wybierz Top w menu rozwijanym Start At:, zaznacz Avoid Interpolation i kliknij OK.
      UWAGA: W przypadku konieczności zwolnienia pamięci w programie ImageJ, hyperstack można zamknąć po wykonaniu operacji reslice.
    2. Wybierz nowe okno wygenerowane przez operację reslice (zwany dalej „resliced hyperstackiem”, Rysunek 4B). Jeśli resliced hyperstack ma wiele kanałów, wybierz kanał referencyjny do przeprowadzenia wyrównania i usuń pozostałe kanały, zaznaczając je na pasku przewijania kanałów; kliknij Image | Stacks | Delete Slice, wybierz Channel w menu rozwijanym Delete Current i kliknij OK.
    3. Wygeneruj jednoelementowy resliced hyperstack (zwany dalej „resliced stosem referencyjnym”), albo poprzez duplikację pojedynczej warstwy resliced hyperstacka (patrz krok 6.2.1), albo poprzez projekcję kilku warstw resliced hyperstacka (patrz krok 6.2.2) (Rysunek 4C).
    4. Opcjonalnie przytnij resliced stos referencyjny, aby użyć tylko jednej części obrazu jako odniesienia (patrz krok 6.2.3).
    5. Przeprowadź rejestrację obrazu na resliced stosie referencyjnym za pomocą MultiStackReg (patrz kroki 6.2.4–6.2.6) (Rysunek 4C).
    6. Wybierz okno resliced hyperstacka i uruchom makro MultiHyperStackReg. Wybierz plik transformacji utworzony w kroku 6.3.5, kliknij Open i poczekaj, aż wyrównanie zostanie zastosowane do każdego kanału i/lub warstwy hyperstacka, po czym otworzy się nowe okno z przyrostkiem „_aligned” (zwany dalej „resliced stosem referencyjnym”, Rysunek 4D). Zamknij oryginalny resliced hyperstack.
    7. Aby przekonwertować wyrównany resliced hyperstack do widoku xy oryginalnego hyperstacka, kliknij Stacks | Reslice [/]…, wybierz Top w menu rozwijanym Start At:, zaznacz Avoid Interpolation i kliknij OK. Po otwarciu nowego okna z końcowym hyperstackiem wyrównanym pod kątem ostrości (Rysunek 4E), zamknij wyrównany resliced hyperstack.
  4. Aby automatycznie skorygować dryft boczny i dryft ostrości, uruchom makro AutoHyperStackReg. Wybierz kanał referencyjny, jeśli jest dotyczy, oraz określ, czy korygować dryft boczny i/lub dryft ostrości. Kliknij OK.

Schemat wyrównania obrazów hyperstack; proces wykorzystuje metody MultiHyperstackReg i MultiStackReg.
Rycina 3: Procedura korekcji dryfu bocznego za pomocą MultiHyperstackReg. (A) Dryfy boczne i ostrości można zaobserwować na hyperstacku zawierającym kilka przekrojów i punktów czasowych. (B) Z hyperstacku generowany jest referencyjny stos pojedynczego przekroju i pojedynczego kanału, poprzez duplikację lub projekcję Z. Stos referencyjny jest wyrównywany przez wtyczkę MultiStackReg, co generuje plik wyrównania. (C) Makro MultiHyperstackReg służy do zastosowania pliku wyrównania do hyperstacku, w wyniku czego powstaje wyrównany hyperstack z skorygowanym dryfem bocznym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Schemat procesu wyrównywania hyperstacku, przedstawiający metodę MultiStackReg do rejestracji obrazów.
Rycina 4: Procedura korekcji dryftu ostrości za pomocą MultiHyperstackReg. (A) Dryfty ostrości można zaobserwować na hyperstacku zawierającym kilka przekrojów i punktów czasowych. (B) Hyperstack zostaje ortogonalnie przekrojony od góry, wzdłuż każdej linii pikseli na osi Y, bez interpolacji. Wynikiem jest przekrojony hyperstack zawierający te same informacje co pierwotny, ale z zamienionymi współrzędnymi y i z. Dryft ostrości (w osi z) oryginalnego hyperstacku przejawia się jako dryft w osi y na przekrojonym hyperstacku. (C) Z przekrojonego hyperstacku generowany jest jednokanałowy stos referencyjny składający się z jednego przekroju, poprzez duplikację lub projekcję Z. Stos referencyjny jest wyrównywany za pomocą wtyczki MultiStackReg, co prowadzi do utworzenia pliku wyrównania. (D) Makro MultiHyperstackReg służy do zastosowania pliku wyrównania do przekrojonego hyperstacku, w wyniku czego powstaje wyrównany przekrojony hyperstack, w którym dryft ostrości (w osi y) został skorygowany. (E) Drugie ortogonalne przekrojenie przywraca oryginalne współrzędne hyperstacku, w którym nie występuje już dryft ostrości (w osi z). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

7. Pomiar sygnału korowego za pomocą obracających się linii skanowania

  1. Pobierz makro ImageJ Rotating Linescans (Plik uzupełniający z kodem 3).
  2. Otwórz film time-lapse w programie ImageJ. Przesuń suwak klatek do pierwszej klatki, a w przypadku gdy film zawiera kilka przekrojów, ustaw suwak przekrojów na przekrój, na którym mierzony będzie sygnał.
  3. Tryb śledzenia (Tracking mode)
    1. Wybierz narzędzie linii prostej z paska narzędzi. Poprowadź linię przez strefę korową podlegającą pomiarowi (Rysunek 5A), upewniając się, że linia jest w przybliżeniu prostopadła do kory i wystarczająco długa, aby przecinać korę w każdym kolejnym punkcie czasowym (Rysunek 5B, pierwszy i drugi panel).
    2. Kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia linii na pasku narzędzi, aby otworzyć okno Line Width. Zwiększ szerokość linii w razie potrzeby, dbając o to, aby przecięcie linii z korą pozostawało linią prostą (Rysunek 5B, trzeci panel).
    3. Uruchom makro Rotating Linescans. Ustaw zakres rotacji (Rysunek 5E) na niską wartość (około 10°), jeśli orientacja mierzonej strefy korowej nie zmienia się znacząco między kolejnymi punktami czasowymi. Ustaw wartość Measure Around na 0 pikseli, aby mierzyć sygnał tylko na linii, w której wykryto maksymalną intensywność sygnału, lub na wyższe wartości, aby mierzyć również sygnał wokół tej linii.
      UWAGA: Wartość Measure Around wpłynie jedynie na pomiar sygnału po wykryciu kory i nie wpłynie na sam proces wykrywania.
    4. W menu rozwijanym Find Cortex on Channel: wybierz kanał, na którym zostanie przeprowadzone wykrywanie. Aby zwizualizować miejsca wykrycia kory w każdym punkcie czasowym, pozostaw zaznaczone pole Display Position… (zalecane). Pozostaw zaznaczone pole Recenter and reorient…. Kliknij OK.
    5. Gdy w pasku stanu okna ImageJ pojawi się komunikat Done, Results Copied to Clipboard, przejrzyj film time-lapse, aby sprawdzić, czy wykryte pozycje kory (żółta nakładka) i mierzony obszar (cyjanowa nakładka) są satysfakcjonujące. Jeśli nie, powtórz kroki 7.3.1–7.3.4 z inną pozycją, długością lub szerokością linii oraz innymi ustawieniami w oknie opcji Rotating Linescans.
    6. Wklej pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Kolumny odpowiadają kanałom w kolejności ich występowania w filmie time-lapse, a wiersze odpowiadają klatkom.
  4. Tryb bez śledzenia (Non-tracking mode)
    1. Wybierz narzędzie linii prostej z paska narzędzi. Poprowadź linię (oznaczoną kolorem cyjanowym, Rysunek 5A) przez strefę korową podlegającą pomiarowi, upewniając się, że linia jest w przybliżeniu prostopadła do kory i wystarczająco długa, aby przecinać korę w każdym punkcie czasowym (Rysunek 5C, pierwszy i drugi panel).
    2. Kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia linii na pasku narzędzi, aby otworzyć okno Line Width. Zwiększ szerokość linii w razie potrzeby, dbając o to, aby przecięcie linii z korą pozostawało linią prostą (Rysunek 5C, trzeci panel).
    3. Uruchom makro Rotating Linescans. Ustaw zakres rotacji (Rysunek 5E) zgodnie ze zmianami orientacji mierzonej strefy korowej w całym filmie time-lapse. Ustaw wartość Measure Around na 0 pikseli, aby mierzyć sygnał tylko na linii, w której wykryto maksymalną intensywność sygnału, lub na wyższe wartości, aby mierzyć również sygnał wokół tej linii.
      UWAGA: Wartość Measure Around wpłynie jedynie na pomiar sygnału po wykryciu kory i nie wpłynie na sam proces wykrywania.
    4. W menu rozwijanym Find Cortex on Channel: wybierz kanał, na którym zostanie przeprowadzone wykrywanie. Aby zwizualizować miejsca wykrycia kory w każdym punkcie czasowym, pozostaw zaznaczone pole Display positions… (zalecane). Odznacz pole Recenter and Reorient…. Kliknij OK.
  5. Gdy w pasku stanu okna ImageJ pojawi się komunikat Done, Results Copied to Clipboard, przejrzyj film time-lapse, aby sprawdzić, czy wykryte pozycje kory (żółta nakładka) i mierzony obszar (cyjanowa nakładka) są satysfakcjonujące. Jeśli nie, powtórz poprzednie kroki z inną pozycją, długością lub szerokością linii oraz innymi ustawieniami w oknie opcji Rotating Linescans.
  6. Wklej pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
    UWAGA: Kolumny odpowiadają kanałom w kolejności ich występowania w filmie time-lapse, a wiersze odpowiadają klatkom.

Schemat technik pomiaru powierzchni zakrzywionych; kroki A-G pokazują prawidłowe/nieprawidłowe ustawienie i wyniki.
Rycina 5: Pomiar sygnału korowego z wykorzystaniem obracającego się skanu liniowego. (A) Linia (cyjanowa) jest prowadzona prostopadle do kory (czarna), wzdłuż której mierzony będzie sygnał. Różne odcienie szarości pokazują zmianę pozycji komórki w trzech punktach czasowych (t1, t2, t3). (B) Lewo: prawidłowe ustawienie linii w trybie śledzenia. Środek: nieprawidłowe ustawienie linii w trybie śledzenia, ponieważ w następnym punkcie czasowym nie występuje pokrycie z korą. Prawo: linia zbyt szeroka, co powoduje, że przecięcie (linia pomarańczowa) między korą a linią nie jest proste. (C) Lewo: prawidłowe ustawienie linii w trybie bez śledzenia. Środek: nieprawidłowe ustawienie linii w trybie bez śledzenia, ponieważ w każdym punkcie czasowym nie występuje pokrycie z korą. Prawo: linia zbyt szeroka, co powoduje, że przecięcie (linia pomarańczowa) między korą a linią nie jest proste. (D) Długość i szerokość linii skanowania. (E) Skany liniowe są wykonywane w zakresie orientacji wokół orientacji pierwotnej pokazanej w (D), zdefiniowanym przez parametr „zakres obrotu” (rotation range), w odstępach zdefiniowanych przez parametr „krok obrotu” (rotation step). (F) Nieoptymalna orientacja linii skanowania względem kory, skutkująca niskim sygnałem mierzonym wzdłuż linii. (G) Optymalna orientacja linii jest definiowana jako ta, która daje najwyższy szczyt intensywności sygnału mierzonego wzdłuż linii. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Wyniki

Unieruchomienie tkanek Drosophila za pomocą skrzepów fibryny oraz wymiana pożywki hodowlanej podczas obrazowania na żywo.
Po przeprowadzeniu sekcji zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 2 (Rysunek 1) i unieruchomieniu w skrzepach fibryny na tej samej lamCompetitionce zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 3 (Rysunek 2), mózgi larwalne wykazujące ekspresję Bazooka znakowanego GFP (Baz::GFP), ortologa białka polaryzacyjnego Par-3 u muchy, były obrazowane przez 30 min za pomocą konfokalnego obrazowania wielopozycyjnego w trybie time-lapse. Baz::GFP połączono z apkcas4, allelem umożliwiającym ostre hamowanie atypowej kinazy białkowej C (aPKC) poprzez dodanie małego analogu ATP 1-NAPP120. W związku z tym do pożywki hodowlanej dodano 1-NAPP1 zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 4 i wznowiono obrazowanie na żywo na 2,5 h. Mózgi kontrolne zawierające wersję typu dzikiego kinazy aPKC nie reagowały na analog ATP, podczas gdy mózgi posiadające dodatkowo mutację aPKC wrażliwą na analog (apkcas4) wykazały skurcz neuroepitelium oraz jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie (Rysunek 6, Wideo 1). Neuroblasty nadal dzielą się w trakcie rejestracji time-lapse, co wskazuje, że tkanka pozostaje zdrowa, a mózgi wykazują niewielki dryft mimo zmiany pożywki hodowlanej, co świadczy o ich dobrym unieruchomieniu. Analogicznie, po przeprowadzeniu sekcji zgodnie z procedurą przedstawioną w27, owariolach wykazujących ekspresję Baz::GFP zostały unieruchomione w skrzepach fibryny na tej samej lamce i obrazowane przez 8 min, po czym zastosowanie 1-NAPP1 wywołało skurcz komórek pęcherzykowych mutantów apkcas4, ale nie w grupach kontrolnych (Rysunek 7, Wideo 2).

Korekcja dryftu bocznego i ostrości przy użyciu MultiHyperstackReg.
Hyperstack wykazujący zarówno dryft boczny, jak i dryft ostrości (Wideo 3, panel lewy) został najpierw skorygowany pod kątem dryftu bocznego (krok 6.2, Rysunek 3, Wideo 3, panel środkowy), a następnie pod kątem dryftu ostrości (krok 6.3, Rysunek 4, Wideo 3, panel prawy) przy użyciu wtyczki MultiStackReg oraz makra MultiHyperstackReg, co doprowadziło do znacznej redukcji ruchów zaobserwowanych w oryginalnym hyperstacku.

Pomiar sygnału korowego przy użyciu obracających się skanów liniowych
Neuroblast wyrażający Baz::GFP (zielony) oraz białko transbłonowe CD4 znakowane podczerwienią fluorescencyjną (CD4::mIFP, czerwony) został poddany obrazowaniu podczas jednej mitozy. Sygnał CD4::mIFP posłużył jako punkt odniesienia do detekcji kory w różnych częściach neuroblasta za pomocą skanów liniowych (krok 7, Rycina 5, Rycina 8A–C), a sygnał Baz::GFP mierzono w wykrytych pozycjach (Rycina 8D). Podczas podziału neuroblasty ulegają przejściowej polaryzacji poprzez utworzenie odrębnych i przeciwstawnych domen korowych: bieguna apikalnego i bieguna bazalnego. Baz definiuje biegun apikalny i konsekwentnie sygnał Baz::GFP wzrastał w biegunie apikalnym neuroblasta i malał w biegunie bazalnym podczas podziału (Rycina 8C,D). Pozycja kory była skutecznie śledzona przez cały czas trwania rejestracji time-lapse (Rycina 8C, Wideo 4). Linie i genotypy Drosophila są wymienione w Tabeli uzupełniającej 1–2.

Obróbka NAPP1 wpływająca na strukturę komórek; mikroskopia fluorescencyjna; kontrola vs aPKCΔ54 w czasie; eksperyment.
Rysunek 6: Zastosowanie analogu ATP na unieruchomionych mózgach larwalnych podczas obrazowania na żywo. (A) Obrazowanie na żywo dwóch mózgów larwalnych wykazujących ekspresję Baz::GFP, unieruchomionych na tej samej lamellce. W 0 min medium hodowlane zostaje zmienione na stężenie 10 µM analogu ATP 1-NAPP1. Mózgi kontrolne nie reagują widocznie na analog ATP, podczas gdy mózgi z mutacją aPKC wrażliwą na analog (aPKCAS4) wykazują skurcz neuroepithelium (groty strzałek) oraz jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie. Maksymalna projekcja intensywności z 33 warstw dla głębokości 23 µM. Pasek skali: 20 µM. (B) Powiększenie neuroepithelium. Pasek skali: 10 µM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Analiza mikroskopowa odpowiedzi komórek na 10 µM NAPP1 w czasie; porównanie kontroli z mutantem aPKC.
Rysunek 7: Aplikacja analogu ATP na unieruchomione komory jajowe podczas obrazowania na żywo. Obrazowanie na żywo dwóch owarioli wykazujących ekspresję Baz::GFP, unieruchomionych na tej samej lamince. W 0 min medium hodowlane zostaje zmienione na stężenie 10 µM analogu ATP 1-NAPP1. Kontrolne komory jajowe nie reagują widocznie na analog ATP, podczas gdy komory jajowe z mutacją aPKC wrażliwą na analog (aPKCAS4) wykazują skurcz nabłonka (groty strzałek), co ostatecznie prowadzi do pozornego rozpadu złączy przylegających. Maksymalna projekcja intensywności z 33 warstw dla głębokości 27 µM. Pasek skali: 20 µM. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Mikroskopia poklatkowa dynamiki błony komórkowej; wykresy przedstawiają intensywność sygnału w czasie.
Rycina 8: Pomiar sygnału korowego przy użyciu obrotowych skanów liniowych. (ANa żywo D. melanogaster neuroblast wykazujący ekspresję Baz::GFP (zielony) i CD4::mIFP (czerwony). Linie cyjanowe: początkowe linie skanowania wyznaczone prostopadle do poszczególnych stref kory w celu pomiaru. Pasek skali: 5 µM. (B) Identyfikacja kory (ciemnoniebieska linia) przy użyciu skanów liniowych kory oraz kanału referencyjnego CD4::mIFP (czerwony). Linia cyjanowa: obszar zdefiniowany przez parametr „Measure around” (tutaj 2 piksele), w którym mierzony jest sygnał po wykryciu kory. Pasek skali: 2 µm. (C) Cyjan: obszary korowe zidentyfikowane podczas podziału neuroblasta za pomocą metody rotujących skanów liniowych z początkowych linii skanowania pokazanych na (A), z wykorzystaniem CD4::mIFP (czerwony) jako kanału referencyjnego. Pasek skali: 5 µMStrzałka: biegun apikalny. Grot strzałki: biegun bazalny. (D) Pomiar intensywności sygnału Baz::GFP w czasie w dwóch odpowiadających im strefach wyznaczonych przez rotacyjne skany liniowe przedstawione w (C). Podczas mitozy białko Baz::GFP ulega przejściowemu wzbogaceniu w biegunie apikalnym neuroblasta i zanika w przeciwległym biegunie bazalnym. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Wideo 1: Zastosowanie wymiany medium w unieruchomionych mózgach larw podczas obrazowania na żywo w celu dodania inhibitora, przedstawione na Rysunku 6, pasek skali: 20 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 2: Zastosowanie wymiany pożywki w unieruchomionych komorach jajowych podczas obrazowania na żywo w celu dodania inhibitora, przedstawione na Ryc. 7, pasek skali: 20 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 3: Korekcja dryftu bocznego i ostrości przy użyciu MultiHyperStackReg. Obrazowanie na żywo neuroblasta wykazującego ekspresję sondy błonowej PH::GFP. Xy: pojedyncza płaszczyzna ogniskowa. Xz: przekrój ortogonalny. Po lewej: przed korekcją dryftu. W środku: po korekcji dryftu bocznego. Po prawej: po korekcji dryftu bocznego i ostrości, pasek skali: 10 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Wideo 4: Detekcja kory za pomocą obrotowych skanów liniowych, przedstawiona na Rysunku 8, pasek skali: 5 µm. Kliknij tutaj, aby pobrać to wideo.

Tabela uzupełniająca 1: Genotypy obrazowanych tkanek Drosophila. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Dodatkowy plik z kodem 1: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik z kodem 2: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dodatkowy plik kodowania 3: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Obrazowanie na żywo całych mózgów larwalnych D. melanogaster daje możliwość obserwacji asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych w warunkach zbliżonych do kontekstu fizjologicznego. Pierwsza część naszego protokołu przedstawia nasze podejście do sekcji mózgów larwalnych. Jak już wspomniano13, krytycznym aspektem preparatu jest unikanie uszkodzenia mózgu. Najtrudniejszym aspektem tego jest oddzielenie mózgu od sąsiednich dysków wyobrażeniowych bez nadmiernego ciągnięcia mózgu. Nasze podejście do "cięcia bez ciągnięcia" polega na wykonaniu ruchu szlifierskiego za pomocą końcówek jednej pary kleszczy lub na przesunięciu końcówek kleszczy wzdłuż dwóch innych końcówek kleszczy przytrzymujących połączenie między tkankami (ryc. 1A), podczas gdy Lerit i in. opisują ruchy przypominające piłę za pomocą szpilki preparucyjnej. Radzimy eksperymentatorowi, aby wypróbował wszystkie podejścia i przyjął to najlepiej dopasowane dla siebie. Sugerujemy również używanie końcówek do pipet z powłoką BSA lub FCS zamiast narzędzi do preparowania do przenoszenia izolowanych mózgów. Powłoka zapobiega przywieraniu tkanek do tworzywa sztucznego i umożliwia bezpieczny transfer tkanek, zawsze utrzymując je całkowicie zanurzone, bez narażania ich na możliwe przejściowe odkształcenia, gdy przyklejają się do narzędzia preparacyjnego podczas przenoszenia. Powlekane końcówki mają inne zalety, które umożliwiają przenoszenie kilku mózgów jednocześnie, co jest szczególnie przydatne, gdy krytyczne jest kontrolowanie czasu przebywania próbek w określonym podłożu; nadają się do przenoszenia innych tkanek, nawet delikatnych, jak na przykład ciała tłuszczowe; Mogą pomieścić szeroki zakres różnych rozmiarów próbek, używając większych końcówek lub przycinając koniec końcówki.

Następnie protokół ten opisuje zastosowanie krzepnięcia fibrynogenu do unieruchomienia mózgów larw na szkiełku nakrywkowym szalki hodowlanej. Mózg jest zorientowany w kropli pożywki hodowlanej + fibrynogenu, po czym krzepnięcie jest indukowane przez dodanie trombiny. Tworzenie fibryny jest stopniowe, co zapewnia okno czasowe, w którym w razie potrzeby można precyzyjnie dostroić orientację próbki (ryc. 2C). Jeśli wymagane jest lekkie ściśnięcie próbki - co jest odradzane w przypadku mózgów larwalnych - można ją również precyzyjnie wyregulować, dociskając skrzep mniej więcej blisko próbki w krokach 3.4.4 i 3.5.2. Główną zaletą tego krzepnięcia fibrynogenu w porównaniu z protokołem opisanym w Lerit i wsp., w którym mózgi są zamontowane między membraną przepuszczalną dla gazów a szkiełkiem nakrywkowym, jest zdolność do zastąpienia pożywki hodowlanej podczas obrazowania na żywo. Możliwą zaletą stosowania membrany przepuszczającej gaz w porównaniu z naszym protokołem może być to, że zapewnia ona optymalne natlenienie próbek, które może być bardziej ograniczone przy naszym podejściu, ponieważ mózgi są oddzielone od powietrza przez skrzep i pewne podłoże. Z tego powodu, chociaż nie oceniliśmy wpływu ilości pożywki hodowlanej w naczyniu hodowlanym, sugerujemy ograniczenie ilości pożywki hodowlanej na wierzchu skrzepów, przy jednoczesnym utrzymywaniu skrzepów całkowicie zanurzonych.

Ponieważ manipulowanie skrzepami może być eksperymentalnie trudne i czasochłonne, zalecamy, aby eksperymentator najpierw przećwiczył manipulowanie skrzepami bez próbek. Modulowanie objętości kropli pożywki hodowlanej + fibrynogenu na szkiełku nakrywkowym, stężenia fibrynogenu lub objętości i stężenia trombiny może ułatwić przygotowanie i może być ważne przy dostosowywaniu protokołu do innych rodzajów tkanek. Mając wystarczające doświadczenie w manipulowaniu skrzepami, kilka mózgów może zostać unieruchomionych w jednym skrzepie, jeśli to konieczne, chociaż komplikuje to precyzyjne dostrojenie orientacji. Na szkiełku nakrywkowym może powstać kilka skrzepów, co pozwala na przykład na obrazowanie próbek o różnych genotypach. Możliwe jest również wystawienie różnych skrzepów na tym samym szkiełku nakrywkowym na działanie różnych pożywek hodowlanych, chociaż należy uważać, aby nigdy nie mieszać kropli pożywki hodowlanej pokrywających różne skrzepy. Gdy mózgi larw są już unieruchomione i gotowe do obrazowania na żywo, zalecamy przestrzeganie zaleceń Lerit i wsp.13 , aby uniknąć nadmiernego fotouszkodzenia. Do tych zaleceń dodajemy tylko to, aby nie tylko utrzymać mózg w temperaturze 25 °C podczas obrazowania na żywo za pomocą inkubatora etapowego, ale także podgrzać ten etap przez co najmniej 30 minut przed rozpoczęciem obrazowania. W naszych rękach brak systematycznego działania skutkuje silnym dryfem koncentracji.

W niektórych kontekstach korzystna może być możliwość wykonania skorelowanej mikroskopii oraz utrwalenia i barwienia immunologicznego próbki po obrazowaniu na żywo. Jednak ograniczeniem stosowania skrzepów fibrynowych jest to, że prawie niemożliwe jest mechaniczne odizolowanie mózgu od skrzepu bez jego uszkodzenia. Możliwym sposobem na przezwyciężenie tego ograniczenia może być opracowanie metod degradacji skrzepów fibryny za pomocą plazminy lub wywołania demontażu skrzepu poprzez dodanie peptydu naśladującego guzki umożliwiające polimeryzację fibryny28. Zazwyczaj używamy skrzepów fibrynowych na próbkach od pojedynczych komórek do tkanek o długości 200 μM, ale możemy również z powodzeniem unieruchomić w skrzepach i zobrazować mózgi dorosłych trzmieli o szerokości ponad 3 mm. Górna granica wielkości próbki, która może być unieruchomiona w skrzepach, pozostaje do ustalenia. Podobnie, chociaż zwykle obrazujemy unieruchomione próbki przez 4 do 5 godzin, z powodzeniem zobrazowaliśmy neuroblasty w hodowli pierwotnej przez okres do 3 dni, co wskazuje, że skrzep przynajmniej nie przeszkadza w długoterminowej żywotności. Wręcz przeciwnie, skrzepy mogą ułatwiać regularną wymianę podłoża, co jest wymogiem w przypadku długotrwałego obrazowania, bez potrzeby stosowania w tym celu urządzeń, takich jak pompy perystaltyczne. Chociaż nie zmierzyliśmy parametrów przepuszczalności skrzepów fibryny, wydaje się, że włóknisty, żelowy charakter skrzepów jest przepuszczalny dla komórek. Odkryliśmy, że latrunkulina A, Colcemid lub 1-NAPP1, ligandy HALO-tag i inne standardowe barwniki stosowane w biologii komórki docierają do komórek w skrzepie fibryny bez żadnych problemów i do tej pory nie napotkaliśmy cząsteczek, które zostałyby zatrzymane przez skrzep, co jednak jest możliwością, którą należy empirycznie przetestować.

Podsumowując, stosowanie skrzepów fibrynowych zapewnia niezawodny i stosunkowo łatwy do wdrożenia sposób unieruchamiania żywych tkanek do obrazowania na żywo. Poza przydatnością w ograniczaniu dryfu bocznego, możliwość zmiany pożywki hodowlanej podczas obrazowania na żywo okazała się nieoceniona dla naszego podejścia genetyki chemicznej do badania asymetrycznego podziału komórek neuroblastów D. melanogaster 21. Przewidujemy, że technika ta będzie korzystna dla badań w szerokim zakresie różnych tkanek, szczególnie jeśli obejmują one genetykę chemiczną lub, na przykład, samoznakowanie białek29.

Nasze makro MultiHyperStackReg opiera się na wtyczce TurboReg ImageJ, która wyrównuje kolejne klatki lub wycinki stosu, oraz wtyczce MultiStackReg ImageJ, która pozwala na zastosowanie przekształceń do innych stosów. MultiHyperStackReg pozwala po prostu zastosować te transformacje do hyperstacków (stosów z co najmniej czterema wymiarami). Ponieważ korzystanie z MultiHyperStackReg, jak go opisujemy, wymaga wielu czynności i może być dość czasochłonne, napisaliśmy również makro AutoHyperStackReg, które automatycznie wykonuje wszystkie kroki opisane w krokach 6.2 i 6.3. Jednak w przeciwieństwie do MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg nie ma obecnie możliwości obliczenia wyrównania stosu na podstawie podregionu tego stosu, co jest czasami kluczową opcją dla satysfakcjonującego wyrównania. Innym ograniczeniem AutoHyperStackReg jest to, że jego użycie jest ograniczone do tłumaczeń, a nie do innych transformacji proponowanych przez TurboReg i MultiStackReg, podczas gdy MultiHyperStackReg może zastosować do hyperstack dowolny typ transformacji, jeśli użytkownik tego potrzebuje. Przyszłe wersje będą implementować te funkcje i będą dostępne w usłudze GitHub30. Wreszcie, nasze makro z obrotowym skanowaniem linii zapewnia łatwy sposób szybkiego pomiaru sygnałów korowych w upływach czasu, nawet jeśli kora zmienia swoje położenie lub orientację w czasie. To, czy do analizy najlepiej nadaje się tryb śledzenia, czy tryb nieśledzenia, zależy od jakości i spójności sygnału korowego. Tryb śledzenia jest łatwiejszy w użyciu, ponieważ użytkownik nie musi zastanawiać się, gdzie będzie kora mózgowa dla każdego punktu czasowego i może dostosować się do dużych zmian pozycji i orientacji w czasie. Jest to jednak odpowiednie tylko wtedy, gdy sygnał korowy pozostaje wystarczająco silny do wykrycia przez cały film: niepowodzenie w wykryciu czegokolwiek innego niż kora (np. jasny przedział cytoplazmatyczny blisko kory) może zagrozić wykrywaniu dla każdego następnego punktu czasowego (np. przedział cytoplazmatyczny oddala się od kory, a linie korowe podążają za nim przez resztę upływu czasu). Tryb bez śledzenia nie ma tej pułapki, ponieważ wykrywanie jest ograniczone do linii pierwotnie narysowanej przez użytkownika (np. jasny przedział cytoplazmatyczny może spowodować niepowodzenie wykrywania przez kilka punktów czasowych, ale gdy przedział cytoplazmatyczny oddala się od strefy wykrywania, wznawia się prawidłowe wykrywanie kory), ale nie zachowuje się dobrze, jeśli pozycja lub orientacja kory zmienia się bardzo w czasie. Kolejną funkcją (która będzie dostępna na GitHub30), która zostanie opracowana dla trybu śledzenia, będzie opcja analizowania tylko określonych punktów czasowych i zdefiniowania referencyjnego punktu czasowego (a nie pierwszego punktu czasowego), przed którym i po którym zostanie wykonane wykrywanie, co pozwoli użytkownikowi przynajmniej uniknąć problematycznych punktów czasowych.

Oświadczenia

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podziękowania

Praca w laboratorium Januschke jest wspierana przez granty Wellcome trust 100031/Z/12/A i 1000032/Z/12/A. Pracownia obrazowania tkanek jest wspierana przez WT101468 grantowy od Wellcome.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Albumina surowica bydlęca, BSAMerck5470
D-(+)-GlucoseSigmaG7021
DimetylosulfotlenekSigmaD2650
Dumont #55 KleszczeFine Science Tools11255-20
Surowica płodowa, odpowiednia do hodowli komórkowychSigmaF7524
Fibrynogen z ludzkiego osoczaSigmaF3879
Naczynie do hodowli komórkowych FluoroDish - 35 mm, studnia 23 mmWorld Precision InstrumentsFD35-100
PP1 Analogowa (1NA-PP1)Płytka punktowa Merck Millipore529579
Pyrex z dziewięcioma wgłębieniamiSigmaCLS722085-18EA
Pożywka dla owadówSchneidera SigmaS0146
Trombina z osocza bydlęcegoMerckT4648
powiedział:

Bibliografia

  1. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs. Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).
  2. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs. PloS One. 11 (9), 0163744(2016).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila. Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).
  4. Basto, R., et al. Flies without centrioles. Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).
  5. Januschke, J., Gonzalez, C. The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts. The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).
  6. Rusan, N. M., Peifer, M. A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division. Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).
  7. Dai, W., Montell, D. J. Live imaging of border cell migration in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).
  8. Haigo, S. L., Bilder, D. Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation. Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).
  9. Tissot, N., et al. Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte. Nature Communications. 8, 15168(2017).
  10. Martin, J. L., et al. Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss. eLife. , (2018).
  11. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  12. Sabado, V., Nagoshi, E. Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).
  13. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
  14. Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila. Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).
  15. Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages. PloS One. 8 (11), 79588(2013).
  16. Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes. Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).
  17. Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts. Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).
  18. Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA. Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).
  19. Rebollo, E., et al. Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells. Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).
  20. Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts. eLife. 7, 166(2018).
  21. Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila. Development. 146 (2), (2019).
  22. Loyer, N., Januschke, J. The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts. Nature Communications. 9 (1), 3745(2018).
  23. Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling. Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).
  24. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  25. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  26. Busse, B. MultiStackRef [software]. , Available from: http://bradbusse.net/sciencedownloads.html (2011).
  27. Prasad, M., Montell, D. J. Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging. Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).
  28. Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion. Scientific Reports. 2, 879(2012).
  29. Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy. Scientific Reports. 5, 17740(2015).
  30. Loyer, N. ImageJ macros [software]. , Available from: https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories (2020).

Przedruki i uprawnienia

Tagi

mózg larwy Drosophilaunieruchomienie w skrzepie fibrynowymobrazowanie time-lapsesekcja tkankipolimeryzacja fibrynogenu i trombinyobrazowanie za pomocą mikroskopu odwróconegoniestandardowe makra do korekcji dryftuwymiana pożywki hodowlanejtechnika orientacji mózgustabilizacja skrzepu fibrynowego
Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.