Zastosowania immobilizacji tkanek Drosophila ze skrzepami fibryny do obrazowania na żywo

Drosophila nadal jest ważnym modelowym systemem do badania szerokiego zakresu zagadnień biologicznych i od dziesięcioleci przoduje w poszerzaniu wiedzy w wielu dyscyplinach. Jedną z cech, która szczególnie go wyróżnia, jest to, że szczególnie dobrze nadaje się do obrazowania na żywo. Możliwość monitorowania procesów subkomórkowych lub zachowania komórek i tkanek w czasie rzeczywistym nadal przyczynia się do generowania kluczowych pojęć związanych z biologią komórki i rozwoju. Wiele udanych protokołów zostało opracowanych przez różne grupy, aby utrzymać takie próbki Drosophila przy życiu i w zdrowiu, aby zbadać zachowanie próbki i żywych cząsteczek fluorescencyjnych. Narządy i tkanki muchy, takie jak dyski wyobrażeniowe^1,2, mózg larwy^3,4,5^,6, lub komory jajowe dorosłych samic^7,8,9, lub dorosłe jelito¹⁰ Na przykład można je wyekstrahować i przechowywać w kulturze w celu obrazowania za pomocą mikroskopii poklatkowej. Kluczowym wyzwaniem dla obrazowania na żywo jest zapewnienie, że próbka jest utrzymywana blisko powierzchni obrazowania w celu uzyskania optymalnej rozdzielczości i nieruchomego bez naruszania integralności próbki, która może być wrażliwa na uderzenia mechaniczne. Na przykład, aby badać nerwowe komórki macierzyste, zwane neuroblastami lub neuronami w mózgu larw Drosophila, można utrzymać próbki blisko powierzchni obrazowania, pokrywając je pożywką hodowlaną w szczelnych komorach obrazowania^11,12,13. Podejście to nie pozwala jednak na łatwą wymianę mediów, co ogranicza eksperymentalne pole manewru. Alternatywnie, próbki można przygotować i umieścić na szkiełkach nakrywkowych poddanych obróbce w celu zwiększenia adhezji komórek i umożliwienia wielopunktowej mikroskopii wizytującej oraz rozszerzonego obrazowania żywych komórek w otwartych szalkach hodowlanych, które potencjalnie umożliwiają wymianę pożywki, ale nie zapewniają łatwych środków zapobiegających dryfowaniu lub utracie próbki podczas wymiany pożywki^14,15.

Metoda skrzepów fibrynowych, pierwotnie opracowana do badania mejozy u żywych spermatocytów muchy żurawia¹⁶ jest specjalnie przystosowana do przezwyciężenia tych problemów. Fibrynogen rozpuszcza się w odpowiedniej pożywce hodowlanej, próbki umieszcza się i orientuje w kropli tego roztworu w odpowiedniej komorze obrazowania o szklanej powierzchni przed dodaniem trombiny, co powoduje szybkie tworzenie się nierozpuszczalnego skrzepu fibryny, lepkiej włóknistej siatki, która przylega do powierzchni szkła i próbek, zapewniając jednocześnie dostęp próbki do pożywki hodowlanej. Pożywka może być następnie wymieniona bez zakłócania pozycji skrzepu lub próbki. Wymiana pożywki hodowlanej podczas obrazowania jest na przykład pożądana, gdy inhibitory mają być dodawane jak w oryginalnej metodzie lub do eksperymentów z wymłukiwaniem lub pościgiem impulsowym, lub gdy barwniki fluorescencyjne mają być dodawane podczas obrazowania żywych komórek, przy jednoczesnym utrzymywaniu komórek i tkanek na miejscu. Skrzepy fibrynowe nadają się do obrazowania tkanek Drosophila, a także pojedynczych komórek^13,17. Skrzepy fibrynowe mogą być ponadto wykorzystywane do orientacji próbek, które ze względu na swój kształt lub inne właściwości normalnie nie byłyby zorientowane w pożądany sposób poprzez modulację pozycji próbki w skrzepie fibryny i kształtu samego skrzepu.

Tutaj przedstawiamy aktualne informacje na temat naszych obecnych metod obrazowania opartych na skrzepach fibryny i udostępniamy narzędzia do analizy obrazu opartej na segmentacji oraz skupiamy się na wykorzystaniu tej metody do badania podziałów neuroblastów w rozwijającym się mózgu muchy. Rutynowo stosujemy metodę skrzepu fibrynowego, aby śledzić wiele próbek w różnych skrzepach w tym samym naczyniu hodowlanym. Pozwala to i) na obrazowanie zdarzeń subkomórkowych, takich jak zachowanie centrosomów lub lokalizacja mRNA na żywo^18,19, ii) monitorowanie zachowania próbek podczas leczenia farmakologicznego różnych genotypów przy użyciu tych samych ustawień obrazowania przy użyciu wielopunktowej mikroskopii wizytującej²⁰, iii) badanie skutków ostrego hamowania enzymów²¹ oraz iv) minimalizacja dryfowania w celu zbadania zmian w orientacji podziału komórek w ich środowisku fizjologicznym po ukierunkowanej ablacji laserowej²². Podczas gdy niepożądane działanie trombiny i fibrynogenu oraz skrzepu fibryny musi być empirycznie przetestowane dla każdej próbki, metoda ta jest w zasadzie odpowiednia do unieruchomienia każdego rodzaju próbki, która ma być analizowana za pomocą obrazowania żywych komórek, a u Drosophila została z powodzeniem wykorzystana do badania wielu aspektów biologii neuroblastów5^{,19, 20}, ale także dynamika projekcji cytosensorów żeńskich komórek macierzystych linii zarodkowej²³ oraz zmiany polaryzacji po ostrym zahamowaniu aPKC komórek pęcherzykowych komór jajowych samic Drosophila²¹.

Poklatkowe obrazowanie fluorescencyjne powoduje generowanie złożonych zestawów danych 3D z rozdzielczością czasową, które wymagają metod ekstrakcji tych ilościowych informacji. Poniżej opisujemy nasz dalszy rozwój makr opartych na ImageJ²⁴, które mogą być używane do korygowania dryfowania w hiperstosach oraz niestandardowych makr ImageJ, które umożliwiają półautomatyczną kwantyfikację wielokanałowej fluorescencji w korze komórkowej, opracowanej do ilościowego oznaczania białek korowych w neuroblastach mózgów larw Drosophila lub pojedynczych neuroblastów w pierwotnej hodowli komórkowej.

1. Przygotowanie odczynników

UWAGA: Wszystkie kroki w tym protokole, o ile nie wyjaśniono inaczej, są wykonywane w temperaturze pokojowej.

1. Aby przygotować roztwór 1x PBS-BSA (0,1% w/v), rozpuść 1 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1 ml PBS. Aby przygotować roztwór podstawowy trombiny 1000 jednostek·^mL-1, rozpuść 1000 jednostek trombiny w 1 ml PBS-BSA (0,1% w/v). Przygotować porcje 10 μl i przechowywać w temperaturze -20 °C przez okres do 4 miesięcy.
2. Aby przygotować pożywkę hodowlaną dla mózgów Drosophila, rozpuść 1 g glukozy w 1 l pożywki Schneidera w sterylnych warunkach. Filtrować i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 miesięcy.
3. Aby przygotować roztwór fibrynogenu, rozpuścić 10 mg fibrynogenu w 1 ml pożywki hodowlanej przez 20 minut w temperaturze pokojowej lub 5 minut w temperaturze 37 °C.
   UWAGA: Jeśli używana jest inna pożywka hodowlana niż ta przygotowana w kroku 1.2, a skrzepy fibryny tworzą się już na tym etapie, pożywka hodowlana prawdopodobnie zawiera aktywną trombinę, którą należy wcześniej dezaktywować. Prawdopodobnym źródłem trombiny jest płodowa surowica bydlęca, którą można inaktywować poprzez podgrzanie surowicy do 56 °C przez 30 minut.
4. Aby przygotować roztwór powlekający PBS-BSA (5% w/v), rozpuść 50 mg albuminy surowicy bydlęcej (BSA) w 1 ml 1x PBS.
5. Dla przykładowego odczynnika użytego w kroku 4 należy przygotować roztwór podstawowy 10 mM NAPP1, rozpuszczając 1 mg NAPP1 w 315 μl dimetylosulfotlenku.

2. Sekcja mózgów larw Drosophila

UWAGA: Wykonaj ten krok pod lornetką do analizowania.

1. Za pomocą pędzla przenieś larwy L3 do 9-dołkowego naczynia ze szkła borokrzemianowego zawierającego PBS. Mieszaj, aby odłączyć większość pokarmu much od larw i przenieś do innego dobrze zawierającego pożywkę hodowlaną.
2. Użyj kleszczy (np. Dumont #55) aby chwycić larwę na całej jej średnicy, w połowie jej długości ciała (patrz Rysunek 1A,B). Trzymając larwę, przenieś ją do innego dołka płytki borokrzemianowej, zawierającego 200 μl świeżej pożywki hodowlanej.
3. Nie wypuszczaj larwy. Aby przeciąć larwę na pół na całej jej średnicy (Ryc. 1B), albo zmielić chwytany obszar bocznym ruchem końcówek kleszczy (Rycina 1A, górny panel), albo wsunąć jedną końcówkę innej pary kleszczy między dwie końcówki kleszczy trzymające larwę (Rysunek 1A, dolny panel). Nie przecinaj larwy na pół, ciągnąc za jeden z jej kończyn, ponieważ może to uszkodzić mózg, ciągnąc go przez nerwy przecinające długość ciała (czerwone linie w Rysunek 1B).
4. Użyj kleszczy, aby przytrzymać larwę za naskórek i innej pary kleszczy, aby rozerwać naskórek bez ciągnięcia za mózg (Rysunek 1C). Powtarzaj tę czynność, aż nerwy wychodzące z mózgu staną się widoczne, a narządy łączące mózg z częścią ustną będą dostępne tak, jak pokazano na Rysunek 1D.
5. Użyj kleszczy, aby przytrzymać nerwy pochodzące z mózgu. W przypadku drugiej pary kleszczy użyj jednej z technik pokazanych na Rysunek 1A, aby przeciąć połączenie między mózgiem a częściami ustnymi, oddzielając mózg od reszty naskórka (Rysunek 1D).
6. Użyj kleszczy, aby przytrzymać mózg za aksony wychodzące z brzusznego rdzenia nerwowego. Wyciągnij narządy zaznaczone na szaro w Rysunek 1E, delikatnie odciągając je od mózgu.
   UWAGA: Nie ciągnij za dyski wyobrażeniowe oka/anteny (ciemnożółte), aby odłączyć je od mózgu. Połączenie między tymi tkankami jest zbyt silne, aby można je było przerwać przez ciągnięcie bez uszkodzenia mózgu.
7. Nadal chwytając nerwy, aby utrzymać i zorientować mózg, uchwyć połączenie między dyskami wyobrażeniowymi oka/anteny (ciemnożółty) a mózgiem za pomocą drugiej pary kleszczy (Rysunek 1F). Użyj jednej z technik pokazanych w Rysunek 1A, aby przeciąć to połączenie bez ciągnięcia za mózg. Sprawdź, czy mózg jest odpowiednio oczyszczony z innych tkanek (Rysunek 1G) i czy nie jest uszkodzony (Rysunek 1H). Wyrzuć mózg, jeśli wykazuje oznaki uszkodzenia.
8. Odpipetować roztwór powlekający za pomocą wdechu i wyjścia P20, aby pokryć końcówkę pipety. Odpipetować mózg powlekaną końcówką wraz z 3 μl pożywki (Rysunek 2A, po lewej) i odpipetować do innego dołka zawierającego 200 μl czystej pożywki hodowlanej.
9. Powtarzaj kroki 2.2–2.8, aż zostanie wypreparowana wystarczająca liczba mózgów, od czasu do czasu zastępując pożywkę hodowlaną w studzience, w której przeprowadza się sekcje.

Rycina 1: Preparacja mózgów larwalnych D. melanogaster. (A) Technika cięcia bez ciągnięcia za pomocą kleszczy. Próbkę (bladozieloną) można przeciąć, szlifując ją między końcówkami kleszczy (górny panel) lub przesuwając końcówkę pary szczypiec wzdłuż końcówek pary kleszczy przytrzymujących próbkę (dolny panel). (B–F) Kroki do odizolowania mózgu larwy bez jego uszkodzenia (patrz tekst). Czerwony: mózg. Ciemnożółty: dyski oka/anteny. Niebieski tekst: czynności, które należy wykonać za pomocą odpowiednich kleszczy. (G) Wygląd odizolowanego mózgu bez widocznych uszkodzeń. D to strona grzbietowa, a V to strona brzuszna w widoku bocznym. (H) Powszechne uszkodzenia spowodowane nadmiernym ciągnięciem mózgu podczas sekcji. Panel górny: odłączenie brzusznego rdzenia nerwowego. Dolny panel: deformacja płata. Tylna jest lewa, a przednia jest prawa we wszystkich panelach. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

3. Unieruchomienie na szkiełku nakrywkowym z zakrzepami fibryny

UWAGA: Wykonaj ten krok pod lornetką do analizowania.

1. Użyj pipety P20 z powlekaną końcówką, jak w kroku 2.8, aby przenieść wypreparowane mózgi do innego dołka płytki borokrzemianowej zawierającej 200 μl pożywki hodowlanej + fibrynogenu (Rysunek 2A).
2. Pipetę w jednym mózgu wraz z 9 μl pożywki hodowlanej + fibrynogenu. Tak jak koniec końcówki prawie dotyka szklanego dna nakrycia płytki do hodowli komórkowej o średnicy 35 mm, odpipetować zawartość (pożywkę hodowlaną i mózg), sprawiając, że pożywka hodowlana dotyka szkiełka nakrywkowego natychmiast po wyjęciu końcówki pipety, tak aby mózg i pożywka nie zsunęły się na boki końcówki, potencjalnie uszkadzając mózg (Rysunek 2A).
3. Użyj jednej końcówki kleszczy lub zamkniętej pary kleszczy, aby delikatnie popchnąć i ustawić mózg w pożywce hodowlanej + kropla fibrynogenu.
   UWAGA: Dotknięcie kropli otwartą parą kleszczy może spowodować, że pożywka hodowlana zostanie pociągnięta kapilarnie między końcówkami kleszczyków (Rysunek 2B).
4. Jeśli trzeba zobrazować brzuszną część mózgu, wywołaj krzepnięcie fibrynogenu w następujący sposób, aby prawidłowo zorientować mózg w skrzepie (Rysunek 2C).
   1. Popchnij mózg na jedną stronę kropli. Za pomocą pipety P1 wyposażonej w końcówkę P1 odpipetuj 1 μl roztworu trombiny, dotknij końcówką pipety krawędzi kropli po przeciwnej stronie mózgu i odpipetuj trombinę (Rysunek 2C, pierwszy rysunek).
   2. Odczekaj 1-2 minuty, aż fibrynogen zacznie polimeryzować, co spowoduje powstanie mętnego osadu po jednej stronie kropli (Rysunek 2C, drugi rysunek). Delikatnie wepchnij i "wsuń" mózg w skrzep fibryny, upewniając się, że część, którą obrazujesz (np. strona brzuszna) znajduje się jak najbliżej szkiełka nakrywkowego, nie deformując mózgu (Rysunek 2C, trzeci rysunek).
   3. Odpipetować 1 μl roztworu trombiny blisko boku mózgu, który nie jest schowany w skrzepie fibryny. (Rysunek 2C, czwarty rysunek).
   4. Odczekaj 2-3 minuty, aż drugi skrzep fibryny zastygnie (Rysunek 2C, piąty rysunek). Naciśnij krawędzie skrzepu, aby mocniej przylegał do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie zdeformować mózgu (Rysunek 2C, rysunek szósty i siódmy). Jeśli mózg wydaje się być zbyt daleko od szkiełka nakrywkowego, przybliż go, dociskając skrzep fibryny blisko mózgu.
5. Jeśli konieczne jest zobrazowanie grzbietowej części mózgu, wywołaj krzepnięcie fibryny w następujący sposób (Rysunek 2D).
   1. Umieść mózg w środku kropli, grzbietową częścią skierowaną w stronę szkiełka nakrywkowego. Za pomocą pipety P10 wyposażonej w cienką końcówkę, odpipetuj 1 μl roztworu trombiny, dotknij końcówką pipety krawędzi kropli po przeciwnej stronie mózgu i odpipetuj trombinę (Rysunek 2D, pierwszy rysunek).
   2. Odczekaj 2-3 minuty, aż fibrynogen zacznie polimeryzować, co spowoduje powstanie mętnego, włóknistego osadu (Rysunek 2D, drugi rysunek). Naciśnij krawędzie skrzepu, aby mocniej przylegał do szkiełka nakrywkowego, uważając, aby nie zdeformować mózgu (Rysunek 2D, trzeci i czwarty rysunek).
6. Powtórzyć czynności 3.1–3.5, jeżeli konieczne jest unieruchomienie kilku próbek skrzepu na szkiełku nakrywkowym.
7. Trzymając koniec końcówki umieszczoną około 0,5 cm nad skrzepem (skrzepami), delikatnie nanieś kroplami 390 μl pożywki hodowlanej bez fibrynogenu na wierzch skrzepu (skrzepów) (Ryc. 2B, prawa szalka Petriego). Nie dodawać pożywki hodowlanej po bokach skrzepu, ponieważ może to spowodować oderwanie go od szkiełka nakrywkowego.
8. Aby wypłukać pozostałą trombinę, użyj pipety, aby usunąć 300 μl pożywki hodowlanej i dodaj 300 μl czystej pożywki hodowlanej, upewniając się, że skrzepy pozostają całkowicie zanurzone. Powtórz dwukrotnie, aby wypłukać nadmiar trombiny.

Rycina 2: Unieruchomienie mózgu larwy Drosophila za pomocą skrzepów fibryny. (A) Za pomocą końcówki pipety pokrytej BSA, mózgi przenosi się z pożywki hodowlanej (żółta) do pożywki hodowlanej + roztwór fibrynogenu (pomarańczowy), a następnie pipetuje na szkiełko nakrywkowe (jasnoniebieskie) szalki hodowlanej wraz z 3,5 μl pożywki hodowlanej + fibrynogenu. Krzepnięcie fibrynogenu jest indukowane przez dodanie trombiny w celu unieruchomienia mózgu w pozycji grzbietowej lub brzusznej (patrz D i E). Zabezpieczone mózgi w skrzepach są następnie pokrywane pożywką hodowlaną bez fibrynogenu, a nadmiar trombiny jest usuwany przez trzykrotne dodanie i usunięcie pożywki hodowlanej. (B) Położenie mózgu w kropli pożywki hodowlanej + fibrynogenu (pomarańczowego) na szkiełku nakrywkowym powinno być regulowane tylko poprzez delikatne popychanie go końcówką zamkniętej pary kleszczy lub tylko jedną końcówką kleszcza. Dotknięcie kropli otwartą parą kleszczy może spowodować, że pożywka hodowlana zostanie wciągnięta przez kapilarność między końcówkami kleszczy. (C) Etapy ustawiania mózgu larwy w celu obrazowania strony brzusznej (patrz tekst). (D) Etapy ustawiania mózgu larwy w celu obrazowania strony grzbietowej (patrz tekst). W (D) i (E), zielony: Trombina. Ciemnopomarańczowy: skrzep fibrynowy. Bladoniebieski: szkiełko nakrywkowe. Niebieskie strzałki: krawędzie skrzepu, które należy docisnąć do szkiełka nakrywkowego w celu ustabilizowania skrzepu. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

4. Dodawanie odczynników podczas obrazowania na żywo

1. Aby uniknąć zmian temperatury powodujących zmiany ostrości, roztwór z odczynnikami, które mają być dodane do szalki hodowlanej, należy utrzymywać w tej samej temperaturze, co samo naczynie hodowlane, aby doprowadzić go do tej samej temperatury przed dodaniem. Jeśli używana jest komora środowiskowa, pozostaw roztwór w komorze.
2. Zdejmij pokrywkę naczynia hodowlanego, nie przesuwając samej naczyń hodowlanej. Aby ułatwić wyjmowanie, przed obrazowaniem umieść pokrywkę naczynia 35 mm do góry nogami na wierzchu naczynia.
3. Za pomocą pipety P1000 umieścić końcówkę pipety blisko powierzchni pożywki hodowlanej wewnątrz naczynia hodowlanego i delikatnie wypuścić na nią odpowiednią objętość roztworu odczynnika, aby osiągnąć pożądane stężenie odczynnika (np. 400 μL roztworu 20 μM NAPP1 na 400 μL pożywki hodowlanej, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM NAPP1), bez generowania silnych strumieni, które mogłyby oderwać skrzepy.
4. Aby homogenizować roztwór w naczyniu hodowlanym, użyj pipety P200, aby powoli odpipetować niewielką ilość roztworu pięć razy (np. 150 μl na objętość 800 μl w naczyniu).
5. Załóż pokrywkę na wierzch szalki hodowlanej, nie przesuwając samej szalki hodowlanej, i wznów obrazowanie.

5. Wymywanie odczynników podczas obrazowania na żywo

1. Przed wypłukaniem utrzymuj roztwór myjący w tej samej temperaturze, co naczynie do hodowli.
2. Zdejmij pokrywkę naczynia hodowlanego, nie przesuwając samej naczyń hodowlanej.
3. Za pomocą pipety P200 lub P1000 powoli wyjmij trochę pożywki hodowlanej z naczynia hodowlanego, nie odsłaniając górnej części skrzepu (np. usuń 600 μl z 800 μl pożywki hodowlanej w naczyniu).
4. Aby rozcieńczyć odczynnik za pomocą pipety P1000, umieść końcówkę pipety blisko powierzchni pożywki hodowlanej wewnątrz naczynia hodowlanego i powoli uwolnij roztwór myjący (np. dodać 1 ml roztworu myjącego do 200 μl pożywki hodowlanej pozostawionej w naczyniu o współczynniku rozcieńczenia 6).
5. Powtarzać kroki 5.3 i 5.4, aż odczynnik zostanie rozcieńczony zgodnie z wymaganiami (np. kolejne trzy podobne rundy spowodują współczynnik rozcieńczenia 1296, zmniejszając początkowe stężenie 10 μM NAPP1 do 7,7 nM).
6. Załóż pokrywkę na wierzch szalki hodowlanej, nie przesuwając samej szalki hodowlanej, i wznów obrazowanie.

6. Poprawka dryfowania xyz na trójwymiarowych i/lub wielokanałowych time-lapsach

1. preparat
   1. Pobierz i zainstaluj ImageJ²⁴. Pobierz wtyczki TurboReg²⁵ i MultiStackReg²⁶ i umieść je w folderze wtyczek ImageJ.
   2. Pobierz makra MultiHyperStackReg (Dodatkowy plik kodowania 1) i AutoHyperStackReg ImageJ (Uzupełniający plik kodowania 2). Aby zainstalować makro, umieść plik .ijm w folderze wtyczek ImageJ lub dodaj zawartość pliku .ijm do pliku ImageJ/macros/StartupMacros.txt.
   3. W ImageJ otwórz film poklatkowy zawierający kilka wycinków i/lub kilka kanałów (odtąd nazywanych "hyperstack", Rysunek 3A,4A). Jeśli film poklatkowy obejmuje tylko jeden wycinek i jeden kanał, wyrównanie można wykonać bezpośrednio za pomocą MultiStackReg.
2. Korekcja dryfu bocznego za pomocą MultiHyperStackReg
   1. Zdecyduj, który kanał i/lub wycinek hyperstack powinien być używany jako odniesienie do wyrównania. Aby wygenerować jednokanałowy, jednoplasterkowy stos referencyjny (zwany dalej "stosem referencyjnym"), kliknij Obraz | Duplikuj..., zaznacz pole wyboru Duplikuj hyperstack, wpisz odpowiedni numer kanału w polu Kanały (c): (np. zamień 1–2 na 1) i/lub odpowiedni numer kanału w Plasterki (z): (np. zamień 1–15 na 8) i upewnij się, że Ramki: (t) zawierają wszystkie klatki (np. 1–50) przed kliknięciem OK ( Rysunek 3B).
   2. Alternatywnie do kroku 6.2.1, jeśli projekcja wielu plasterków jest preferowana dla jednokanałowego, jednoplasterkowego stosu referencyjnego, kliknij Obraz | Stosy | Z Project..., wybierz pierwszy i ostatni plasterek oraz typ projekcji, upewnij się, że zaznaczona jest opcja Wszystkie ramy czasowe i kliknij OK. Jeśli film poklatkowy ma wiele kanałów, usuń nieistotne kanały (Obraz | Stosy | Usuń plasterek) z wynikowego rzutowania lub zduplikuj wybrany kanał odniesienia (punkt menu Obraz | Duplikat) (Rysunek 3B).
   3. Opcjonalnie przytnij stos odwołań, aby użyć tylko jednej części jako obrazu jako odniesienia, wybierając narzędzie prostokąta na pasku narzędzi, obrysowując prostokąt nad obszarem zainteresowania i klikając Obraz | Przyciąć.
   4. Aby uruchomić MultiStackReg, kliknij Wtyczki | Rejestracja | Reg. MultiStack Z wyskakującego menu Stos 1: wybierz nazwę jednokanałowego, jednoczęściowego stosu wygenerowanego w poprzednich krokach. Z wyskakującego menu Transformacja: wybierz Tłumaczenie; zaznacz pole wyboru Zapisz plik transformacji i zignoruj wszystkie inne pola.
      UWAGA: Inne typy transformacji (patrz²⁵).
   5. Kliknij OK. Wybierz lokalizację i nazwę, aby zapisać plik linii trasowania i kliknij Zapisz. W oknie stosu referencyjnego poczekaj, aż ramki przestaną się automatycznie przesuwać, wskazując, że rejestracja została zakończona (Rysunek 3B).
   6. Sprawdź na stosie odwołań, aby zobaczyć, czy wyrównanie jest zadowalające. Jeśli nie, powtórz kroki 6.2.1–6.2.5 z innym plasterkiem odniesienia, kanałem i/lub kadrowaniem. Zamknij stos odwołań.
   7. Wybierz okno hyperstack i uruchom makro MultiHyperStackReg. Wybierz plik transformacji utworzony w kroku 6.2.5 i kliknij Otwórz. Poczekaj, aż wyrównanie zostanie zastosowane do każdego kanału i/lub wycinka hyperstack, w którym to momencie otworzy się nowe okno z sufiksem "_aligned" (Rysunek 3C).
3. Korekcja dryfu ostrości za pomocą MultiHyperStackReg
   1. Kliknij na Obrazek | Właściwości..., skopiuj wartość wyświetlaną w polu Szerokość w pikselach. Aby ortogonalnie przeciąć jednokanałowy hiperstos z odstępem jednego piksela, kliknij Obraz | Stosy | Przekrój [/]..., wklej wartość szerokości pikseli do pola liczbowego Odstępy wyjściowe: ; wybierz Top w menu kontekstowym Start od:, zaznacz Unikaj interpolacji i kliknij OK.
      UWAGA: W przypadku, gdy pamięć musi zostać zwolniona w ImageJ, hyperstack może zostać zamknięty po ponownym wycięciu.
   2. Wybierz nowe okno wygenerowane przez ponowne wycięcie (odtąd nazywane "przeciętym hiperstosem", Rysunek 4B). Jeśli przecięty hiperstos ma wiele kanałów, wybierz kanał referencyjny, aby wykonać wyrównanie i usuń inne kanały, zaznaczając je na pasku przewijania kanału; kliknij na Obraz | Stosy | Usuń plasterek, wybierz Kanał w menu podręcznym Usuń bieżący i kliknij OK.
   3. Wygeneruj pojedynczy wycinek przeciętego hiperstosu (odtąd nazywanego "ponownie pociętym stosem referencyjnym"), albo przez zduplikowanie pojedynczego wycinka ponownie pociętego hyperstack (patrz krok 6.2.1), albo przez rzutowanie kilku wycinków ponownie pokrojonego hyperstacka (patrz krok 6.2.2) (Rysunek 4C).
   4. Opcjonalnie przytnij ponownie pocięty stos odwołań tak, aby używał tylko jednej części jako obrazu jako odniesienia (patrz krok 6.2.3).
   5. Wykonaj rejestrację obrazu na ponownie pokrojonym stosie referencyjnym za pomocą MutiStackReg (patrz kroki 6.2.4–6.2.6) (Rysunek 4C).
   6. Wybierz ponownie pokrojone okno hyperstack i uruchom makro MultiHyperStackReg. Wybierz plik transformacji utworzony w kroku 6.3.5, kliknij Otwórz i poczekaj, aż wyrównanie zostanie zastosowane do każdego kanału i/lub wycinka hiperstosu, w którym to momencie otworzy się nowe okno z sufiksem "_aligned" (odtąd określane jako "przecięty stos referencyjny", Rysunek 4D). Zamknij oryginalny, ponownie pokrojony hyperstack.
   7. Aby przekonwertować ponownie pocięty wyrównany hyperstack na widok xy oryginalnego hyperstack, kliknij Stosy | Pokrój ponownie [/]..., wybierz Top w menu kontekstowym Start od:, zaznacz Unikaj interpolacji i kliknij OK. Po otwarciu nowego okna z ostatnim hiperstosem wyrównanym do fokusu (Rysunek 4E), zamknij ponownie pocięty, wyrównany hyperstack.
4. Aby automatycznie skorygować dryf poprzeczny i dryf ostrości, uruchom makro AutoHyperStackReg. Wybierz kanał odniesienia, jeśli ma to zastosowanie, i określ, czy skorygować przesunięcie poprzeczne i/lub ostrości. Kliknij OK.

Rysunek 3: Potok korekcji dryfu bocznego za pomocą MultiHyperstackReg. (A) Dryfty boczne i fokusowe można zaobserwować na hiperstosie zawierającym kilka wycinków i punktów czasowych. (B) Pojedynczy wycinek, pojedynczy kanał stosu referencyjnego jest generowany z hiperstosu, albo przez duplikację, albo projekcję Z. Stos referencyjny jest wyrównywany przez wtyczkę MultiStackReg, generując plik wyrównania. (C) Makro MultiHyperstackReg służy do stosowania pliku wyrównania do hiperstosu, w wyniku czego powstaje wyrównany hiperstos, dla którego korygowany jest dryf boczny. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Rysunek 4: Potok korekcji dryfu ostrości za pomocą MultiHyperstackReg. (A) Dryfty ostrości można zaobserwować na hiperstosie zawierającym kilka wycinków i punktów czasowych. (B) Hiperstos jest ortogonalnie przecinany od góry, wzdłuż każdej linii pikseli wzdłuż osi Y, bez interpolacji. Powoduje to, że hiperstos jest ponownie podzielony na plasterki, zawierający te same informacje co hiperstos, z zamienionymi współrzędnymi y i z. Dryf fokusu (w z) oryginalnego hyperstacku występuje jako dryf w y na ponownie pokrojonym hiperstosie. (C) Pojedynczy wycinek, pojedynczy kanał przecięty stos referencyjny jest generowany z przeciętego hiperstosu, albo przez duplikację, albo projekcję Z. Przecięty stos referencyjny jest wyrównywany przez wtyczkę MultiStackReg, generując plik wyrównania. (D) Makro MultiHyperstackReg służy do stosowania pliku wyrównania do ponownie pokrojonego hiperstosu, co skutkuje wyrównanym ponownie pociętym hiperstosem, dla którego dryft fokusu (w y) jest korygowany. (E) Drugie ortogonalne przecięcie przywraca pierwotne współrzędne hiperstosu, który teraz nie przedstawia już dryfu ostrości (w z). Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

7. Pomiar sygnału korowego za pomocą obracających się linecans

1. Pobierz makro Rotatecans ImageJ (Dodatkowy plik kodowania 3).
2. Otwórz film poklatkowy w ImageJ. Umieść pasek przewijania ramek na pierwszej klatce, a w przypadku, gdy film poklatkowy zawiera kilka wycinków, umieść pasek przewijania ramek na wycinku, na którym będzie mierzony sygnał.
3. Tryb śledzenia
   1. Wybierz narzędzie linii prostej na pasku narzędzi. Narysuj linię w poprzek strefy kory mózgowej, która ma być mierzona (Rysunek 5A), upewniając się, że linia jest mniej więcej prostopadła do kory mózgowej i że linia jest wystarczająco długa, aby przekroczyć korę w każdym następnym punkcie czasowym (Rysunek 5B, pierwszy i drugi panel).
   2. Kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia linii na pasku narzędzi, aby otworzyć okno Szerokość linii. Zwiększ szerokość linii tak bardzo, jak to konieczne, zachowując przecięcie między linią a korą w linii prostej (Rysunek 5B, trzeci panel).
   3. Uruchom makro Obracające się linie. Ustaw zakres obrotu (Rysunek 5E) na niską wartość (około 10°), jeśli orientacja mierzonej strefy korowej nie zmienia się zbytnio z jednego punktu czasowego na drugi. Ustaw wartość Mierz dookoła na 0 pikseli, aby mierzyć tylko sygnał na linii, na której wykryto maksymalne natężenie sygnału, lub na wyższe wartości, aby mierzyć również sygnał wokół tej linii.
      UWAGA: Wartość Measure Around będzie miała wpływ na pomiar sygnału tylko po wykryciu kory mózgowej i nie będzie miała wpływu na samo wykrycie.
   4. W menu podręcznym Znajdź korę na kanale: wybierz kanał, na którym zostanie przeprowadzone wykrywanie. Aby zwizualizować, gdzie kora mózgowa została wykryta w każdym punkcie czasowym, pozostaw zaznaczone pole wyboru Display Position... (zalecane). Pozostaw zaznaczone pole wyboru Wyśrodkuj i zmień orientację. Kliknij OK.
   5. Po wyświetleniu stanu Gotowe, wyniki skopiowane do schowka w stanie okna ImageJ przewiń film poklatkowy, aby sprawdzić, czy wykryte pozycje kory mózgowej (żółta nakładka) i zmierzony obszar (niebieskozielona nakładka) są zadowalające. Jeśli nie, powtórz kroki 7.3.1–7.3.4 z inną pozycją, długością lub szerokością linii i innymi ustawieniami w oknie opcji Obracanie linii.
   6. Wklej pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
      UWAGA: Kolumny odpowiadają kanałom w kolejności ich występowania w filmie poklatkowym, a linie odpowiadają klatkom.
4. Tryb bez śledzenia
   1. Wybierz narzędzie linii prostej na pasku narzędzi. Narysuj linię (oznaczoną kolorem niebieskozielonym, Rysunek 5A) w poprzek mierzonej strefy korowej, upewniając się, że linia jest w przybliżeniu prostopadła do kory mózgowej i że linia jest wystarczająco długa, aby przekroczyć korę w każdym punkcie czasowym (Rysunek 5C, pierwszy i drugi panel).
   2. Kliknij dwukrotnie ikonę narzędzia linii na pasku narzędzi, aby otworzyć okno Szerokość linii. Zwiększ szerokość linii tak bardzo, jak to konieczne, zachowując przecięcie między linią a korą prostą (Rysunek 5C, trzeci panel).
   3. Uruchom makro Obracające się linie. Ustaw zakres obrotu (Rysunek 5E) zgodnie ze zmianami orientacji strefy korowej, która ma być mierzona przez cały okres poklatkowy. Ustaw wartość Mierz dookoła na 0 pikseli, aby mierzyć tylko sygnał na linii, na której wykryto maksymalne natężenie sygnału, lub na wyższe wartości, aby mierzyć również sygnał wokół tej linii.
      UWAGA: Wartość Measure Around będzie miała wpływ na pomiar sygnału tylko po wykryciu kory mózgowej i nie będzie miała wpływu na samo wykrycie.
   4. W menu podręcznym Znajdź korę na kanale: wybierz kanał, na którym zostanie przeprowadzone wykrywanie. Aby zwizualizować, gdzie kora mózgowa została wykryta w każdym punkcie czasowym, pozostaw zaznaczone pole wyboru Pozycje wyświetlania... (zalecane). Usuń zaznaczenie pola wyboru Wyśrodkuj i zmień orientację. Kliknij OK.
5. Po zakończeniu wyniki skopiowane do schowka są wyświetlane w stanie okna ImageJ, przewiń film poklatkowy, aby sprawdzić, czy wykryte pozycje kory mózgowej (żółta nakładka) i zmierzony obszar (niebieskozielona nakładka) są zadowalające. Jeśli nie, powtórz poprzednie kroki z inną pozycją, długością lub szerokością linii i innymi ustawieniami w oknie opcji Obracanie linii.
6. Wklej pomiary do arkusza kalkulacyjnego.
   UWAGA: Kolumny odpowiadają kanałom w kolejności ich występowania w filmie poklatkowym, a linie odpowiadają klatkom.

Rysunek 5: Pomiar sygnału korowego za pomocą obracających się linii. (A) Linia (cyjan) jest śledzona prostopadle do kory (), gdzie sygnał będzie mierzony. Różne odcienie szarości pokazują zmianę położenia komórki w trzech punktach czasowych (t1, t2, t3). (B) Po lewej: prawidłowe ustawienie linii w trybie śledzenia. Środek: nieprawidłowe ustawienie linii w trybie śledzenia, ponieważ nie ma nakładania się z korą w następnym punkcie czasowym. Po prawej: zbyt szeroka linia, która powoduje, że przecięcie (pomarańczowa linia) między korą a linią nie jest proste. (C) Po lewej: prawidłowe ustawienie linii w trybie bez śledzenia. Środek: nieprawidłowe ustawienie linii w trybie bez śledzenia, ponieważ nie ma nakładania się na korę w każdym punkcie czasowym. Po prawej: zbyt szeroka linia, która powoduje, że przecięcie (pomarańczowa linia) między korą a linią nie jest proste. (D) Długość i szerokość linii skanowania. (E) Rzuty liniowe są wykonywane w zakresie orientacji wokół pierwotnej orientacji pokazanej w (D) zdefiniowanej przez parametr "zakres obrotu", w odstępie określonym przez parametr "krok obrotu". (F) Nieoptymalna orientacja linii skanowania względem kory mózgowej, skutkująca niskim sygnałem mierzonym wzdłuż linii. (G) Optymalna orientacja linii jest definiowana jako taka, w wyniku której osiąga się najwyższy szczyt natężenia sygnału mierzony wzdłuż linii. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Unieruchomienie tkanek Drosophila za pomocą skrzepów fibryny i wymiany pożywki hodowlanej podczas obrazowania na żywo.
Po wypreparowaniu zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 2 (Ryc. 1) i unieruchomieniu w skrzepach fibryny na tym samym szkiełku nakrywkowym zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 3 (Rycina 2), mózgi larw wyrażających znakowaną GFP Bazookę (Baz::GFP), ortolog muchy białka polarności Par-3, obrazowano przez 30 minut w poklatkowym wielopozycyjnym obrazowaniu konfokalnym. Baz::GFP jest połączony z apkcas4, allelem, który umożliwia ostre hamowanie atypowej kinazy białkowej C (aPKC) poprzez dodanie małego analogu ATP 1-NAPP120. W związku z tym 1-NAPP1 dodano do pożywki hodowlanej zgodnie z procedurą przedstawioną w kroku 4 i wznowiono obrazowanie na żywo przez 2,5 godziny. Mózgi kontrolne przenoszące dziką wersję kinazy aPKC nie reagowały na analog ATP, podczas gdy mózgi posiadające dodatkowo analogowo wrażliwą mutację aPKC (apkcas4) wykazywały skurcz nabłonka nerwowego i jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie (Figura 6, Wideo 1). Neuroblasty dzielą się przez cały upływ czasu, co wskazuje, że tkanka pozostaje zdrowa, a mózgi wykazują niewielki dryf pomimo zmiany pożywki, co wskazuje, że są dobrze unieruchomione. Podobnie, po wypreparowaniu zgodnie z procedurą przedstawioną w27, jajniki wyrażające Baz::GFP zostały unieruchomione w skrzepach fibryny na tym samym szkiełku nakrywkowym i obrazowane przez 8 minut, po czym zastosowanie 1-NAPP1 wywołało skurcz zmutowanych komórek pęcherzykowych apkcas4, ale nie kontrolnych (Ryc. 7, Wideo 2).

Korekta dryfu bocznego i ostrości za pomocą MultiHyperstackReg.
Hiperstos wyświetlający zarówno dryf boczny, jak i przesunięcie ostrości (Wideo 3, lewy panel) został najpierw skorygowany o dryf boczny (krok 6.2, Rysunek 3, Wideo 3, środkowy panel), a następnie dryf ostrości (krok 6.3, Rysunek 4, Wideo 3, prawy panel) przy użyciu wtyczki MultiStackReg i makra MultiHyperStackReg, co spowodowało znaczne zmniejszenie ruchów obserwowanych w oryginalnym hyperstacku.

Pomiar sygnału korowego za pomocą obracających się linecans<br /> Neuroblast eksprymujący Baz::GFP (zielony) i białko transbłonowe CD4 oznaczone białkiem fluorescencyjnym w podczerwieni (CD4::mIFP, czerwony) zostały zobrazowane podczas jednej mitozy. Sygnał CD4::mIFP został użyty jako odniesienie do wykrywania kory mózgowej w różnych częściach neuroblastu za pomocą linecans (krok 7, Rysunek 5, Rysunek 8A–C), a sygnał Baz::GFP został zmierzony w wykrytych pozycjach Rysunek 8D). Podczas ich podziału neuroblasty przejściowo polaryzowały się, ustanawiając odrębne i przeciwstawne domeny korowe: biegun wierzchołkowy i biegun podstawny. Baz definiuje biegun wierzchołkowy i konsekwentnie, sygnał Baz::GFP wzrastał na wierzchołkowym biegunie neuroblastu i zmniejszał się na biegunie podstawowym podczas podziału (Rysunek 8C,D). Pozycja kory mózgowej była zadowalająco śledzona przez cały czas trwania filmu poklatkowego (Ryc. 8C, Wideo 4). Linie i genotypy Drosophila są wymienione w tabeli uzupełniającej 1–2.

Ryc. 6: Zastosowanie analogu ATP do unieruchomionych mózgów larw podczas obrazowania na żywo. (A) Obrazowanie na żywo dwóch mózgów larwalnych wykazujących ekspresję Baz::GFP unieruchomionych na tym samym szkiełku nakrywkowym. Pożywkę hodowlaną zmienia się na stężenie 10 μM analogu ATP 1-NAPP1 po 0 min. Mózgi kontrolne nie reagują widocznie na analog ATP, podczas gdy mózgi z analogowo wrażliwą mutacją aPKC (aPKCAS4) wykazują skurcz nabłonka nerwowego (groty strzałek) i jasne skupiska Baz w neuroblastach i ich potomstwie. Projekcja maksymalnej intensywności 33 plastrów na głębokość 23 μM. Podziałka skali: 20 μM. (B) Powiększenie nabłonka nerwowego. Podziałka skali: 10 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 7: Zastosowanie analogu ATP na unieruchomionych komorach jajowych podczas obrazowania na żywo. Obrazowanie na żywo dwóch jajników wykazujących ekspresję Baz::GFP unieruchomionych na tym samym szkiełku nakrywkowym. Pożywkę hodowlaną zmienia się na stężenie 10 μM analogu ATP 1-NAPP1 po 0 min. Komory jaj kontrolnych nie reagują widocznie na analog ATP, podczas gdy komory jajowe z analogowo wrażliwą mutacją aPKC (aPKCAS4) wykazują skurcz nabłonka (groty strzałek), co ostatecznie prowadzi do pozornego rozpadu połączeń adheren. Maksymalna intensywność rzutu 33 warstw na głębokość 27 μM. Podziałka skali: 20 μM. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Ryc. 8: Pomiar sygnału korowego za pomocą obracających się liniarzy. (A) Żywy neuroblast D. melanogaster wyrażający Baz::GFP (zielony) i CD4::mIFP (czerwony). Linie cyjanowe: początkowe linie skanowania przebiegające prostopadle do różnych stref kory mózgowej w celu pomiaru. Podziałka skali: 5 μM. (B) Identyfikacja kory mózgowej (ciemnoniebieska linia) za pomocą linii korowych i CD4::mIFP (czerwony) jako kanału odniesienia. Linia cyjanowa: obszar zdefiniowany przez parametr "Zmierz wokół" (tutaj 2 piksele), w którym mierzony jest sygnał po wykryciu przez korę mózgową. Pasek skali: 2 μm. (C) Błękitny: obszary korowe zidentyfikowane podczas podziału neuroblastów metodą obrotowych linecans z początkowych linii skanowania wyświetlanych w (A), przy użyciu CD4::mIFP (czerwony) jako kanału odniesienia. Podziałka skali: 5 μM. Strzałka: słup wierzchołkowy. Grot strzały: słup podstawowy. (D) Pomiar natężenia sygnału Baz::GFP w czasie w dwóch odpowiadających sobie strefach oznaczonych przez obracające się linie, które są wyświetlane w (C). Podczas mitozy Baz::GFP zostaje przejściowo wzbogacony na wierzchołkowym biegunie neuroblastu i jest wyczerpywany z przeciwległego bieguna podstawowego. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Wideo 1: Zastosowanie wymiany pożywki na unieruchomionych mózgach larw podczas obrazowania na żywo w celu dodania inhibitora, przedstawione w Rysunek 6, podziałka: 20 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 2: Zastosowanie wymiany pożywek na unieruchomionych komorach jajowych podczas obrazowania na żywo w celu dodania inhibitora, przedstawione w Rysunek 7, pasek skali: 20 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 3: Korekcja dryfu bocznego i ostrości za pomocą MultiHyperStackReg. Obrazowanie na żywo neuroblastu wyrażającego sondę membranową PH::GFP. Xy: pojedyncza płaszczyzna ogniskowa. Xz: ortogonalne przecięcie. Po lewej: przed korektą dryfu. Środek: po korekcie dryfu bocznego. Po prawej: po korekcie dryfu bocznego i ostrości, podziałka: 10 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Wideo 4: Wykrywanie kory mózgowej za pomocą obracających się linek, przedstawione w Rysunek 8, podziałka: 5 μm. Kliknij tutaj, aby pobrać ten film.

Tabela uzupełniająca 1: Genotypy zobrazowanych tkanek Drosophila. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Tabela uzupełniająca 2: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Uzupełniający plik kodowania 1: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodowania 2: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Uzupełniający plik kodowania 3: Pochodzenie użytych transgenów. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.