Artykuł metodologiczny

Udoskonalone oczyszczanie tkanek oparte na technologii CLARITY w celu trójwymiarowej organizacji fibroblastów w zdrowych i uszkodzonych sercach myszy

DOI:

10.3791/62023

⸱

16 maja 2021

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Genetics, Biochemistry, and Microbiology, University of Cincinnati College of Medicine, 2Division of Molecular Cardiovascular Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 3Confocal Imaging Core, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek i zastosowano ją do serca dorosłej myszy. Metoda ta została zaprojektowana w celu usunięcia gęstej, autofluorescencyjnej tkanki serca, przy jednoczesnym zachowaniu znakowanej fluorescencji fibroblastów przypisywanej genetycznej strategii reporterowej.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Choroby sercowo-naczyniowe są najczęstszą przyczyną śmiertelności na całym świecie i często charakteryzują się zwiększonym zwłóknieniem serca, które może prowadzić do zwiększonej sztywności komór z zaburzeniami czynności serca. Ten wzrost zwłóknienia komór serca jest spowodowany aktywacją rezydujących fibroblastów, chociaż sposób działania tych komórek w trójwymiarowym (3-D) sercu, na początku lub po aktywacji, nie jest dobrze poznany. Aby zbadać, w jaki sposób fibroblasty przyczyniają się do chorób serca i ich dynamiki w sercu 3D, opracowano udoskonaloną metodę oczyszczania i obrazowania tkanek opartą na projekcie CLARITY, która pokazuje fluorescencyjnie znakowane fibroblasty serca w całym sercu myszy. Fibroblasty rezydujące w tkankach znakowano genetycznie za pomocą fluorescencyjnych myszy reporterowych Rosa26-loxP-eGFP skrzyżowanych z fibroblastem serca wykazującym ekspresję linii knock-in Tcf21-MerCreMer. Technikę tę wykorzystano do obserwacji dynamiki lokalizacji fibroblastów w całej dorosłej lewej komorze u zdrowych myszy oraz w zwłókniałych mysich modelach choroby serca. Co ciekawe, w jednym z modeli urazów zaobserwowano unikalne wzorce fibroblastów serca w uszkodzonym sercu myszy, które podążały za pasmami owiniętych włókien w kierunku kurczliwym. W modelach uszkodzeń niedokrwiennych nastąpił zgon fibroblastów, a następnie ponowne zasiedlenie ze strefy granicznej zawału. Podsumowując, ta udoskonalona technika oczyszczania tkanki serca i cyfrowy system obrazowania pozwalają na wizualizację 3D fibroblastów serca w sercu bez ograniczeń związanych z niepowodzeniem penetracji przeciwciał lub wcześniejszymi problemami związanymi z utratą fluorescencji w wyniku przetwarzania tkanek.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chociaż kardiomiocyty stanowią największą frakcję objętościową w sercu, fibroblasty serca są liczniejsze i są krytycznie zaangażowane w regulację podstawowych cech strukturalnych i naprawczych tego narządu. Fibroblasty serca są wysoce mobilne, reagują mechanicznie i fenotypowo różnią się w zależności od stopnia ich aktywacji. Fibroblasty serca są niezbędne do utrzymania prawidłowego poziomu macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM), a zbyt mała lub zbyt duża produkcja ECM przez te komórki może prowadzić do choroby1,2,3. Biorąc pod uwagę ich znaczenie w chorobie, fibroblasty serca stają się coraz ważniejszym tematem badań w celu zidentyfikowania nowych strategii leczenia, zwłaszcza w próbach ograniczenia nadmiernego zwłóknienia4,5,6,7. Po urazie fibroblasty aktywują się i różnicują w bardziej syntetyczny typ komórek znany jako miofibroblast, który może być proliferacyjny i wydzielać obfite ECM, a także mieć aktywność skurczową, która pomaga w przebudowie komór.

Podczas gdy fibroblasty serca były szeroko oceniane pod kątem ich właściwości w hodowlach 2D6,8,9,10, znacznie mniej wiadomo o ich właściwościach i dynamice w żywym sercu 3D, zarówno na początku badania, jak i po stymulacji choroby. W tym miejscu opisano udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek serca dorosłej myszy przy jednoczesnym utrzymaniu fluorescencji fibroblastów znakowanych genetycznym systemem reporterowym Rosa26-loxP-eGFP x Tcf21-MerCreMer. W sercu Tcf21 jest stosunkowo specyficznym markerem uśpionych fibroblastów4. Po podaniu tamoksyfenu w celu aktywacji indukowalnego białka MerCreMer, zasadniczo wszystkie uśpione fibroblasty będą trwale eksprymować wzmocnione białko zielonej fluorescencji (eGFP) z locus Rosa26, co pozwala na ich śledzenie in vivo.

Istnieje wiele dobrze ugruntowanych protokołów oczyszczania tkanek, z których niektóre zostały zastosowane do serca11,12,13,14,15,16,17. Stwierdzono jednak, że wiele odczynników stosowanych w różnych protokołach oczyszczania tkanek tłumi endogenne sygnały fluorescencyjne18. Dodatkowo, dorosłe serce jest trudne do oczyszczenia ze względu na obfite białka zawierające grupę hemową, które generują autofluorescencję19. Dlatego celem tego protokołu było zachowanie fluorescencji markera fibroblastów przy jednoczesnym hamowaniu autofluorescencji hemu w uszkodzonym sercu dorosłego człowieka w celu optymalnej wizualizacji 3D in vivo12,13,14,16,17,20.

Poprzednie badania próbujące zbadać fibroblasty serca in vivo wykorzystywały perfundowane przeciwciała do oznaczania tych komórek, chociaż takie badania były ograniczone przez penetrację przeciwciał i strukturę naczyń krwionośnych serca14,16,17,20. Chociaż Salamon i wsp. wykazali oczyszczanie tkanek z utrzymaniem miejscowej fluorescencji neuronalnej w sercu noworodka, a Nehrhoff i wsp. wykazali utrzymanie fluorescencji znakującej komórki szpikowe, utrzymanie endogennej fluorescencji przez całą ścianę komory nie zostało jeszcze wykazane, w tym wizualizacja dorosłych fibroblastów serca na początku badania lub po urazie13, 20. Ten protokół oczyszczania tkanek udoskonala mieszaninę poprzednich protokołów opartych na metodzie CLARITY (przezroczysty hydrożel tkankowy kompatybilny z polimerylamidem i hybrydyzacją z akrylamidem (przezroczysty hydrożel tkankowy z wymianą lipidową/barwieniem immunologicznym/hybrydyzacją in situ) i PEGASOS (system rozpuszczalników związanych z glikolem polietylenowym (PEG)). Ten udoskonalony protokół pozwolił na dokładniejsze zbadanie fibroblastów serca w sercu myszy na początku badania oraz tego, jak reagują one na różne rodzaje urazów. Protokół jest prosty i powtarzalny i pomoże scharakteryzować zachowanie fibroblastów serca in vivo.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty z udziałem myszy zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) w Cincinnati Children's Hospital Medical Center. Instytucja posiada również certyfikat AAALAC (American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care). Myszy zostały poddane eutanazji poprzez zwichnięcie szyjki macicy, a myszy poddawane zabiegom chirurgicznym przeżycia otrzymały ulgę w bólu (patrz poniżej). Wszystkie metody stosowane w leczeniu bólu i eutanazji oparte są na zaleceniach Panelu ds. Eutanazji Amerykańskiego Towarzystwa Lekarzy Weterynaryjnych. Wszystkie myszy były trzymane w ściółkach z kolb kukurydzy, z wodą i jedzeniem dostępnymi przez cały czas. Myszy trzymano po 4 w klatce z osobami tej samej płci. Do zabiegu chirurgicznego lub oczyszczenia nieuszkodzonych tkanek użyto równej liczby 6-8-tygodniowych samców i samic myszy.

UWAGA: We wszystkich operacjach utrzymywano sterylne warunki chirurgiczne. Chirurg przebrał się w czysty fartuch i sterylny fartuch, a następnie założył ochraniacze na buty i siatkę na włosy. Następnie chirurg wyszorował ich dłonie chlorheksydyną i założył sterylne rękawiczki chirurgiczne. Chirurgowi pomagał technik, który uspokajał, golił i szorował miejsce nacięcia po 3 razy, podając na przemian 2% glukonianu chloroheksydyny i 70% izopropanolu. Myszy zostały następnie przywiezione do chirurga i przeprowadzono operację. Pomiędzy zwierzętami narzędzia były sterylizowane w sterylizatorze do koralików.

1. Rekombinacja Cre

  1. Skrzyżowanie myszy Rosa26-loxP-eGFP (Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]) z myszami Tcf21-MerCreMer (Rysunek 1A)6,21.
  2. Gdy potomstwo z tej krzyżówki osiągnie wiek 6 tygodni, należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie 75 mg/kg tamoksyfenu rozpuszczonego w oleju kukurydzianym. 22 Podaj ten tamoksyfen dwukrotnie, w odstępie 48 godzin (Rysunek 1B).
  3. Po wstrzyknięciach tamoksyfenu umieść myszy na diecie składającej się z pokarmu tamoksyfenu (~0,4 g / kg cytrynianu tamoksyfenu) przez tydzień. Po tygodniu stosowania tamoksyfenu, przywróć myszy do normalnej diety autoklawizowanej karmy na tydzień przed wykonaniem operacji (Ryc. 1B). Wyznacz odpowiednią liczbę myszy (3 na stan chirurgiczny), które mają być nieuszkodzonymi kontrolami. Poświęć te myszy i przejdź do procesu oczyszczania opisanego poniżej po tygodniu normalnej diety żywieniowej.
  4. Zgodnie ze schematem tamoksyfenu i rekombinacji, wykonać operację.

2. Modele chirurgiczne

  1. Niedokrwienie/reperfuzja (I/R)23,24
    1. Znieczulij myszy 1,5% gazem izofluranowym w powietrzu w wentylowanym pomieszczeniu; ogol ich klatkę piersiową i szyję elektrycznymi maszynkami do strzyżenia, a następnie wyszoruj ogolone obszary wacikiem nasączonym 2% glukonianem chlorheksydyny.
    2. Użyj sztucznej maści przeciw łzom, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji, umieszczając maść na oczach myszy poddanych sedacji.
    3. Wykonaj cięcie w połowie szyi za pomocą nożyczek chirurgicznych, aby umożliwić wizualizację tchawicy. Zaintubuj cewnikiem 20 G, umieszczając rurkę intubacyjną w tchawicy i uwidocznij cewnik dotchawiczy przez nacięcie w środkowej części szyi. Umieść myszy pod respiratorem podczas sedacji gazem izofluranem (1,5%) w powietrzu w pomieszczeniu.
    4. Wykonaj nacięcie pod lewą przednią kończyną nożyczkami chirurgicznymi i przetnij mięśnie międzyżebrowe między żebrami 3 i 4. Rozłóż żebra otwarte za pomocą retraktora.
    5. Umieść małą gąbkę nasączoną solą fizjologiczną między płucami a sercem, aby zapobiec uszkodzeniu płuc.
    6. Za pomocą igły z haczykiem na ryby (6,5 mm, 3/8 c) zawiąż lewą tętnicę wieńcową węzłem poślizgowym za pomocą 8-0 prolenu.
    7. Usuń gąbkę za pomocą kleszczy.
    8. Zszyj mięśnie międzyżebrowe zamknięte za pomocą plecionego jedwabiu 4-0 i ciągłego szwu, jednocześnie uzyskując na zewnątrz koniec 8-0 Węzeł poślizgowy z prolenu.
    9. Zamknij nacięcia skóry za pomocą miejscowego kleju tkankowego tak, aby koniec węzła okluzyjnego wystał.
    10. Po godzinie niedrożności pociągnij zewnętrzny koniec węzła ślizgowego, aby wewnętrznie uwolnić niedrożność tętnicy wieńcowej, łagodząc niedokrwienie i powodując reperfuzję.
    11. Podawać 0,02 ml buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu w dawce 1 mg/ml we wstrzyknięciu podskórnym (uwalnianie 72 godziny) jako środek przeciwbólowy i umieścić myszy w natlenionej komorze inkubacyjnej w temperaturze 37 °C, oddzielnie od innych zwierząt. Monitoruj myszy co najmniej co 15 minut, aż wyzdrowieją ze znieczulenia i będą w stanie utrzymać pozycję mostkową lub siedzącą. Przywróć myszy do ich zwykłej obudowy.
    12. Oceń zwierzęta pod kątem bólu i stresu przez 48 godzin po operacji i codziennie monitoruj miejsce nacięcia, aż do całkowitego zagojenia.
    13. Obserwuj myszy pod kątem nawodnienia, odżywienia i ogólnego samopoczucia po operacji aż do ofiary.
  2. Zawał mięśnia sercowego (MI)25,26,27
    1. Wykonaj kroki 2.1.1–2.1.7.
    2. Użyj ciągłego szwu, aby zamknąć mięśnie międzyżebrowe za pomocą plecionego jedwabiu 4-0.
    3. Zamknij nacięcie skóry za pomocą miejscowego kleju tkankowego.
    4. Wykonaj kroki 2.1.11–2.1.13.
  3. Angiotensyna II/fenylefryna infuzja z mikropompą osmotyczną
    1. Przygotować Przygotować roztwór roboczy 10 μg/μl angiotensyny II i 500 μg/μl roztworu roboczego fenylefryny w sterylnych warunkach (tj. w okapie z przepływem laminarnym), dodając 1 mg angiotensyny II do 100 μl sterylnego roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) i 250 mg chlorowodorku fenylefryny do 500 μl PBS.
    2. Oblicz rozcieńczenie każdego roztworu roboczego i końcową objętość do dozowania do pompy mikroosmotycznej w oparciu o masę myszy.
      UWAGA: Na przykład mysz o wadze 20 g wymaga 20 g x 14 dni x 1,5 μg/dzień = 420 μg angiotensyny lub 42 μl roztworu roboczego, a także 20 g x 14 dni x 50 μg/dzień = 14000 μg chlorowodorku fenylefryny lub 28 μl roztworu roboczego.
    3. Dla masy każdej myszy rozcieńczyć materiał roboczy leku w sterylnym PBS i napełnić pompy mikroosmotyczne (0,25 μL/h, 14 dni, około 100 μL) za pomocą igły 27 G i strzykawki 1 ml.
      UWAGA: Spowoduje to natężenie przepływu 1,5 μg∙g-1∙day-1 angiotensyny II i 50 μg∙g-1∙day-1 chlorowodorku fenylefryny po umieszczeniu u myszy.
    4. Znieczulić myszy 1,5% inhalacją izofluranu (w celu uzyskania efektu) w wentylowanej komorze zawierającej powietrze w pomieszczeniu.
    5. Umieść znieczulone myszy na sterylnym stole chirurgicznym w pozycji opine i utrzymuj znieczulenie za pomocą inhalacji gazu izofluranu (1,5%) przez stożek nosowy.
    6. Użyj sztucznej maści łzowej na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu podczas operacji.
    7. Ogol sierść na obszarze implantacji za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia włosów i wysterylizuj obszar do strzyżenia za pomocą etanolu i sterylnego wacika. Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) nożyczkami chirurgicznymi w warstwie naskórka skóry myszy po prawej bocznej stronie pleców, poniżej łopatki. Użyj boków nożyczek chirurgicznych, aby delikatnie rozciągnąć skórę w obszarze implantacji i wokół niego, aby wprowadzić minipompę.
    8. Umieść pompę mikroosmotyczną w nacięciu i fizycznie manewruj nią na lewo od grzbietowej linii środkowej myszy, ręcznie masując pompę pod skórą.
    9. Zamknij nacięcie za pomocą ciągłego szwu za pomocą jedwabiu 4-0 z igłą stożkową.
    10. Po wszczepieniu pompy należy podać buprenorfinę o powolnym uwalnianiu w dawce 0,1 mg/kg masy ciała we wstrzyknięciu podskórnym w celu znieczulenia (72 godziny powolnego uwalniania). Umieścić myszy w natlenionej komorze inkubacyjnej o temperaturze 37 °C, oddzielnie od innych zwierząt. Monitoruj myszy co najmniej co 15 minut, aż wyzdrowieją ze znieczulenia i będą w stanie utrzymać pozycję mostkową lub siedzącą.
    11. Po wyzdrowieniu ze znieczulenia w komorze grzewczej o temperaturze 37 °C umieść myszy z powrotem w ich standardowych jednostkach mieszkalnych.
    12. Monitoruj myszy pod kątem bólu i niepokoju przez 48 godzin po operacji i codziennie monitoruj miejsce nacięcia, aż do całkowitego zagojenia.
    13. Obserwuj myszy pod kątem nawodnienia, odżywienia i ogólnego samopoczucia po operacji aż do ofiary.

3. Czyszczenie serc dorosłych myszy za pomocą zmodyfikowanego aktywnego protokołu CLARITY

  1. Przygotuj czystą powierzchnię operacyjną, sterylizując powierzchnię chirurgiczną i wszystkie narzędzia chirurgiczne 70% etanolem. Przygotuj roztwór zimnego 1x PBS i 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS (po 100 ml każdy). Nosić rękawice, fartuch laboratoryjny, maskę na twarz i ochronę oczu.
  2. Przygotować bufor heparyny, rozcieńczając 10 jednostek heparyny w 0,9% m/v roztworze chlorku sodu. Każdej myszy wstrzyknąć dootrzewnowo 60 μl heparyny-NaCl za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml i igły 27 G.
  3. Pięć minut po wstrzyknięciu roztworu heparyny-NaCl znieczulić myszy za pomocą 1,5% inhalacji izofluranu (w celu uzyskania efektu) w wentylowanej komorze zawierającej powietrze w pomieszczeniu.
  4. Myszy należy poddać eutanazji przez zwichnięcie szyjki macicy, w którym tył głowy jest przytrzymywany płaskim, zamkniętym końcem kleszczy, podczas gdy kręgosłup jest zwichnięty przez pociągnięcie ogona.
  5. Wyczyść brzuszną powierzchnię myszy 70% etanolem na bawełnianym waciku. Wykonaj 3 cm nacięcie poprzeczne około 3 cm poniżej wyrostka mieczykowatego za pomocą nożyczek chirurgicznych.
  6. Oddziel skórę od leżącej poniżej tkanki ściany brzucha, przesuwając brzuch do wyrostka mieczykowatego (przytrzymaj skórę najbliżej ogona i pociągnij skórę najbliżej głowy w kierunku klatki piersiowej). Wykonaj 2 cm poprzeczne nacięcie w podskórnej tkance ściany brzucha 3 cm poniżej wyrostka mieczykowatego za pomocą nożyczek chirurgicznych. Wykonaj pionowe cięcie od tego poprzecznego nacięcia, w górę linii środkowej i przez klatkę piersiową. Przygnij klatkę piersiową do tyłu, odsłaniając serce.
  7. Użyj igły 27 G i strzykawki 10 ml, aby wstrzyknąć zimny PBS do żyły głównej górnej i aorty (wszelkie manipulacje położeniem serca powinny być wykonywane ostrożnie kleszczami, aby uniknąć nakłucia), aby usunąć krew z serca.
    UWAGA: Wystarczającą perfuzję można zauważyć po drganiu ogona i przebarwieniu płuc.
  8. Użyj igły 27 G i strzykawki o pojemności 10 ml, aby wstrzyknąć zimne 4% PFA do żyły głównej górnej i aorty, aby rozpocząć proces utrwalania.
  9. Wytnij serca. Przedsionki, prawa komora i przegroda oraz lewa komora powinny być oddzielone za pomocą skalpela o prostym ostrzu. Umieść tę tkankę w 15 ml probówce wirówkowej wypełnionej zimnym 4% PFA i umieść na nutatorze w temperaturze 4 °C na noc.
  10. Umyj serce 3 razy po 1 godzinę zimnym 1x PBS, aby usunąć nadmiar PFA.
  11. Przygotuj hydrożel (oznaczony jako A4P0 dla względnego składu akrylamidu/poliakrylamidu), mieszając następujące substancje chemiczne w probówce wirówkowej o pojemności 15 ml: 10% z 40% akrylamidu, 10% 1x PBS, 80% wody destylowanej.
  12. Dodać 0,25% roztwór fotoinicjatora (dichlorowodorek 2,2-Azobis[2-(2-imidazolin-2ylo)propano)) do roztworu hydrożelu tuż przed zanurzeniem serca w hydrożelu.
  13. Umieść serce w stożkowej probówce zawierającej hydrożel. Zawinąć stożkową probówkę w folię i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C bez zakłóceń fizycznych.
  14. Po około 14 godzinach w temperaturze 4 °C przenieść stożkową rurkę zawierającą serce do kąpieli perełkowej o temperaturze 37 °C.
  15. Po 2,5 godziny w kąpieli perełkowej ostrożnie usuń serce z hydrożelu za pomocą kleszczy.
  16. Umyj serca 3 razy przez 1 godzinę każde w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1x PBS w temperaturze 37 °C na nutatorze.
  17. Umieść serca w koszu maszyny do aktywnej elektroforezy za pomocą kleszczy i umieść pokrywkę na koszu. Upewnij się, że pokrywa jest dobrze założona.
  18. Napełnij zbiornik komory aktywnej elektroforezy elektroforetycznym roztworem czyszczącym, wlewając roztwór do komory.
  19. Gdy komora jest wypełniona elektroforetycznym roztworem czyszczącym, kosz zawierający serce można zanurzyć. Bezpiecznie załóż nasadkę na maszynę do elektroforezy.
  20. Uruchomić maszynę do elektroforezy w temperaturze 1,5 A, 37 °C na 1,5 godziny.
  21. Po 1,5 godziny elektroforezy sprawdź wzrokowo serca, aby upewnić się, że nie pozostała żadna nieprzezroczysta tkanka. Jeśli obszary tkanki są nadal nieprzezroczyste, ponownie zanurz serce w roztworze do elektroforezy w komorze elektroforetycznej i kontynuuj elektroforezę przez 0,5 godziny za każdym razem.
    UWAGA: Elektroforezę należy przerwać przy pierwszych oznakach uszkodzenia tkanek (takich jak strzępienie się tkanek).
  22. Myć serca w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej 1x PBS przez 1 godzinę, 3 razy każdy, w temperaturze 37 °C na nutatorze.
  23. Zanurz serca w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej N,N,N′,N′-tetrakis(2-hydroksypropylo)etylenodiaminę - środek odbarwiający, który zmniejsza autofluorescencję hemu.
    UWAGA: Roztwór ten należy zmieniać co 24 godziny, aż do całkowitego oczyszczenia serc (około 2 dni).
  24. Umyj serca w stożkowej tubie o pojemności 15 ml z 1x PBS 3 razy po 1 godzinie, aby usunąć nadmiar środka odbarwiającego.
  25. Przygotować roztwór dopasowujący współczynnik załamania światła (RIMS), mieszając 30 ml 0,02 M buforu fosforanowego, 40 g 5-(N-2, 3-dihydroksypropyloacetamido)-2, 4, 6-tri-jodo-N, N'-bis(2, 3 dihydroksypropylo)izoftalamidu z mieszaniem (musi być całkowicie rozpuszczony - może to potrwać do godziny), 5 mg azydku sodu, 50 μL Tween20, i 1 g 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu i dostosować pH do 7,5.
  26. Równoważ serca w RIMS przez 48 godzin przed obrazowaniem.

4. Obrazowanie oczyszczonych serc za pomocą pionowego mikroskopu konfokalnego z pojedynczymi fotonami

UWAGA: Aparatura do obrazowania składa się z dolnej połowy szklanej szalki Petriego o średnicy 10 cm, dolnego zbiornika wydrukowanego w 3D, okrągłego szklanego szkiełka nakrywkowego i wydrukowanego w 3D górnego zbiornika (Rysunek 1C–E). 3D materiały drukowane zostały wykonane wewnętrznie przez Wydział Inżynierii Klinicznej Szpitala Dziecięcego w Cincinnati.

  1. Użyj smaru próżniowego, aby uszczelnić wydrukowany w 3D dolny zbiornik w szklanej szalce Petriego, nakładając cienką warstwę smaru próżniowego na dno wydrukowanego w 3D elementu (Rysunek 1C).
    UWAGA: Zbiornik powinien mieć taką samą wysokość jak próbka obrazowana (tj. próbka nie powinna być ściskana przez szklane szkiełko nakrywkowe umieszczone na niej, a próbka również nie powinna być w stanie unosić się i poruszać w zbiorniku).
  2. Napełnij zbiornik za pomocą RIMS i usuń wszystkie pęcherzyki za pomocą końcówki pipety. Umieść serce w RIMS ostrożnie, lewą ścianą komory skierowaną do góry, upewniając się, że do roztworu nie zostaną wprowadzone żadne pęcherzyki.
  3. Przyklej szklane szkiełko nakrywkowe do dolnej powierzchni wydrukowanego w 3D górnego elementu zbiornika (rysunek uzupełniający 1A) za pomocą smaru próżniowego (ponownie umieszczając cienką warstwę smaru próżniowego na wydrukowanym w 3D elemencie i umieszczając go na szkiełku nakrywkowym) ( Rysunek 1D).
  4. Umieścić szklane szkiełko nakrywkowe i górny zbiornik, szkiełkiem nakrywkowym do dołu, na dolnym zbiorniku (rysunek uzupełniający 1B), bez wprowadzania pęcherzyków. Przyczepność między RIMS a szkiełkiem nakrywkowym zapewni uszczelnienie między górnymi i dolnymi elementami zbiornika (Rysunek 1E).
  5. Napełnij górny zbiornik glicerolem do użytku z obiektywem zanurzonym w 10x glicerolu.
  6. Użyj mikroskopu jednofotonowego wyposażonego w wielofotonową głowicę skanującą konfokalną, aby zobrazować oczyszczone serca.
  7. Opuścić stolik mikroskopu jednofotonowego i umieścić szalkę Petriego zawierającą próbkę na środku stolika. Podnieś stopień i opuść 10-krotny obiektyw zanurzeniowy w glicerolu do glicerolu w górnym zbiorniku aparatu do pobierania próbek. Upewnij się, że próbka jest ostra, patrząc na krawędź próbki za pomocą okularów.
  8. Przełącz się z widoku okularu na widok kamery na komputerze, klikając przycisk na żywo.
    1. Ustaw parametry X i Y, lokalizując najpierw najszerszą część próbki tkanki, która powinna znajdować się na dnie szalki Petriego.
    2. Kliknij Akwizycja ND i niestandardowy wielopunkt. Utwórz wielopunkty, znajdując najpierw środek próbki tkanki za pomocą joysticka, aby przesuwać od lewej do prawej i od góry do dołu.
    3. Następnie, na podstawie wielkości tkanki, określ wymagany rozmiar kafelków (zwykle 6 x 5 dla 6-8-tygodniowego serca myszy). W tym celu należy przeprowadzić obrazowanie testowe, przechwytując tylko parametry X i Y (odznacz z na karcie Akwizycja ND), aby sprawdzić, czy przechwycono całą długość i szerokość tkanki.
  9. Aby ustawić parametry z, otwórz nawigację XYZ i klikaj ikony w górę i w dół, aż znajdziesz górę i dół próbki.
    1. Otwórz panel korekcji intensywności Z i dostosuj fluorescencję na górze, w środku i na dole tkanki, aby skorygować gęstość tkanki, zwiększając lub zmniejszając moc lasera w każdym punkcie z. Ustaw je, klikając strzałkę ustawiania po prawej stronie panelu Korekcja intensywności Z.
    2. Ustaw rozmiar kroku Z w panelu Akwizycja ND na 5 μm.
  10. Po wyznaczeniu parametrów X, Y i Z serca i ustawieniu korekcji intensywności Z, użyj automatycznego mikroskopu pionowego z 10-krotnym obiektywem zanurzeniowym w glicerolu ze skanerem rezonansowym i probówkami fotopowielacza z fosforku arsenku galu (PMT GaAsP), aby zobrazować oczyszczone serca. Upewnij się, że zakładki XY i Z są zaznaczone w obszarze Akwizycja ND i naciśnij Uruchom Korekcję Z.
  11. Zszyj, rozmiksuj i odszum powstałych obrazów, otwierając obraz wielopunktowy w oprogramowaniu do przetwarzania i klikając przycisk ściegu. Pod obrazem kliknij na ślepe mieszanie, 2 kanały, a następnie znajdź. i Pod obrazem kliknij denoise.ai, a następnie kliknij wybrany kanał fluorescencyjny (np. GFP).
    UWAGA: W wyniku tego procesu powstaje obraz 3D fibroblastów GFP-dodatnich w całej lewej komorze.
  12. Użyj oprogramowania do analizy wtórnej, aby dokładniej zidentyfikować wzorce i trendy w dyspersji fibroblastów serca. Użyj funkcji Spoty, uruchamiając program kreatora spotów.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fibroblasty serca są niezbędne dla podstawowej funkcji serca, jak również dla odpowiedzi na uszkodzenie serca. Wcześniejsze próby zrozumienia układu i morfologii tych komórek były prowadzone głównie w warunkach 2D. Opublikowano jednak udoskonaloną metodę oczyszczania tkanki serca (Ryc. 2) i technikę obrazowania 3D, która pozwala na zaawansowaną, bardziej szczegółową wizualizację fibroblastów serca. Dzięki tej technice obrazowania stwierdzono, że fibroblasty są gęsto upakowane i mają wrzecionowatą morf...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W artykule przedstawiono udoskonaloną metodę oczyszczania tkanek, która pozwala na wizualizację fibroblastów serca in vivo, zarówno na początku badania, jak i po urazie, w celu scharakteryzowania i lepszego zrozumienia fibroblastów w sercu myszy. Ten ulepszony protokół rozwiązuje ograniczenia w istniejących protokołach oczyszczania tkanek, które próbowały zidentyfikować określone typy komórek w sercu dorosłego lub noworodka 12,13,14,16,17,20.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie posiadają żadnych informacji związanych z treścią tego manuskryptu.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcieliby podziękować CCHMC Confocal Imaging Core za pomoc i wskazówki w rozwoju tego modelu, a także Mattowi Batie z Inżynierii Klinicznej za zaprojektowanie wszystkich części drukowanych w 3D. Demetria Fischesser otrzymała stypendium szkoleniowe z National Institutes of Health (NHLBI, T32 HL125204), a Jeffery D. Molkentin był wspierany przez Howard Hughes Medical Institute.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
4-0 pleciony jedwabEthiconK871H
8-0 proleneEthicon8730H
40% roztwór akryloamiduBio-Rad1610140
Angiotensyna IISigmaA9525-50G
Maść na sztuczne łzyCovetrus048272
DABCO (1,4-diazabicyklo[2.2. 2]oktan)Millipore SigmaD27802-25G
GLUture miejscowy klej tkankowyWorld Precision Instruments503763
HeparynaSigmaH0777
Imaris Start AnalysisSoftware Oxford InstrumentsN/A Pompy
mikroosmotyczneAlzetModel 1002
Nikon Oprogramowanie do analizy elementówNikonN/A
Mikroskop pionowy Nikon A1R HDNikonN/A
Normalny autoklawizowany karmLabdiet5010
Nycodenz, 5- (N-2, 3-dihydroksypropyloacetamido)-2, 4, 6-tri-jodo-N,
N'-bis (2, 3 dihydroksypropylo)izoftalamid		CosmoBioAXS-1002424
Paraformaldehydowamikroskopia elektronowa Nauki15710
Chlorowodorek fenylefrynySigmaP6126-10G
FotoinicjatorWako ChemicalsVA-044
Rosa26-nLacZ [FVB. Cg-Gt(ROSA)26Sortm1 (CAG-lacZ,-EGFP)Glh/J]Jackson LaboratoriesJax Nr magazynowy:012429
Azydek soduSigma AldrichS2002-5G
roztwór chlorku soduHospira, Inc.NDC 0409-4888-10
TamoksyfenSigma AldrichT5648
Tamoksyfen spożywczyEnvigoTD.130860
Tween-20Thermo Fisher ScientificBP337-500
Quadrol, N,N,N′,N′-Tetrakis(2-Hydroksypropylo)etylenodiamina, środek odbarwiającyMillipore Sigma122262-1L
X-Clarity elektroforetyczna komora czyszczącaLogos BiosystemsC30001
Elektroforetyczne rozwiązanie czyszczące X-ClarityLogos BiosystemsC13001
Kosz na chusteczki do elektroforezy X-ClarityLogos BiosystemsC12001
Uchwyt na chusteczki do elektroforezy X-ClarityLogos BiosystemsC12002

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nagaraju, C. K., et al. Myofibroblast phenotype and reversibility of fibrosis in patients With end-stage heart failure. Journal of the American College of Cardiology. 73 (18), 2267-2282 (2019).
  2. Yoon, S., Eom, G. H. Heart failure with preserved ejection fraction: present status and future directions. Experimental and Molecular Medicine. 51 (12), 1-9 (2019).
  3. Borlaug, B. A., Redfield, M. M. Diastolic and systolic heart failure are distinct phenotypes within the heart failure spectrum. Circulation. 123, 2006-2014 (2011).
  4. Ivey, M. J., Tallquist, M. D. Defining the cardiac fibroblast. Circulation Journal. 80 (11), 2269-2276 (2016).
  5. Fu, X., et al. Specialized fibroblast differentiated states underlie scar formation in the infarcted mouse heart. Journal of Clinical Investigation. 128 (5), 2127-2143 (2018).
  6. Kanisicak, O., et al. Genetic lineage tracing defines myofibroblast origin and function in the injured heart. Nature Communications. 7, 12260(2016).
  7. Sadeghi, A. H., et al. Engineered 3D cardiac fibrotic tissue to study fibrotic remodeling. Advanced Healthcare Materials. 6 (11), 1601434(2017).
  8. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  9. Bruns, D. R., et al. The right ventricular fibroblast secretome drives cardiomyocyte dedifferentiation. PLoS One. 14 (8), 0220573(2019).
  10. Skiöldebrand, E., et al. Inflammatory activation of human cardiac fibroblasts leads to altered calcium signaling, decreased connexin 43 expression and increased glutamate secretion. Heliyon. 3 (10), 00406(2017).
  11. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  12. Kolesová, H., Čapek, M., Radochová, B., Janáček, J., Sedmera, D. Comparison of different tissue clearing methods and 3D imaging techniques for visualization of GFP-expressing mouse embryos and embryonic hearts. Histochemistry and Cell Biology. 146 (2), 141-152 (2016).
  13. Salamon, R. J., Zhang, Z., Mahmoud, A. I. Capturing the cardiac injury response of targeted cell populations via cleared heart three-dimensional imaging. Journal of Visualized Experiments. (157), (2020).
  14. Wang, Z., et al. Imaging transparent intact cardiac tissue with single-cell resolution. Biomedical Optics Express. 9 (2), 423-436 (2018).
  15. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  16. Yokoyama, T., et al. Quantification of sympathetic hyperinnervation and denervation after myocardial infarction by three-dimensional assessment of the cardiac sympathetic network in cleared transparent murine hearts. PLoS One. 12 (7), 0182072(2017).
  17. Perbellini, F., et al. Free-of-Acrylamide SDS-based Tissue Clearing (FASTClear) for three dimensional visualization of myocardial tissue. Scientific Reports. 7, 5188(2017).
  18. Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32, 713-741 (2016).
  19. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  20. Nehrhoff, I., et al. 3D imaging in CUBIC-cleared mouse heart tissue: going deeper. Biomedical Optics Express. 7 (9), 3716-3720 (2016).
  21. Yamamoto, M., et al. A multifunctional reporter mouse line for Cre- and FLP-dependent lineage analysis. Genesis. 47 (2), 107-114 (2009).
  22. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: Routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  23. Means, C. K., et al. Sphingosine 1-phosphate S1P2 and S1P3 receptor-mediated Akt activation protects against in vivo myocardial ischemia-reperfusion injury. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 292 (6), 2944-2951 (2007).
  24. Michael, L. H., et al. Myocardial ischemia and reperfusion: A murine model. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 269 (6), 2147-2154 (1995).
  25. Ahn, D., et al. Induction of myocardial infarcts of a predictable size and location by branch pattern probability-assisted coronary ligation in C57BL/6 mice. American Joural of Physiology: Circulatory Physiology. 286 (3), 1201-1207 (2004).
  26. Patten, R. D., et al. Ventricular remodeling in a mouse model of myocardial infarction. American Journal of Physiology - Heart and Circuatory Physiology. 274 (5), 1812-1820 (1998).
  27. Gao, X. M., Dart, A. M., Dewar, E., Jennings, G., Du, X. J. Serial echocardiographic assessment of left ventricular dimensions and function after myocardial infarction in mice. Cardiovascular Research. 45 (2), 330-338 (2000).
  28. Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2020).
  29. Sengupta, P. P., Tajik, A. J., Chandrasekaran, K., Khandheria, B. K. Twist mechanics of the left ventricle. Principles and application. Journal of the American College of Cardiology: Cardiovascular Imaging. 1 (3), 366-376 (2008).
  30. Arts, T., et al. Macroscopic three-dimensional motion patterns of the left ventricle. Advances in Experimental Medicine and Biology. 346, 383-392 (1993).
  31. Willems, I. E. M. G., Havenith, M. G., De Mey, J. G. R., Daemen, M. J. A. P. The muscle actin-positive cells in healing human myocardial scars. American Journal of Pathology. 145 (4), 868-875 (1994).
  32. Hashmi, S., Al-Salam, S. Acute myocardial infarction and myocardial ischemia-reperfusion injury: A comparison. International Journal of Clinical Experimental Pathology. 8, 8786-8796 (2015).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Tissue ClearingCardiac FibroblastsCLARITY ProtocolThree Dimensional ImagingMouse HeartCardiac InjuryConfocal MicroscopyFibrosis ModelElectrophoretic ClearingFluorescent Labeling

Powiązane artykuły