Artykuł metodologiczny

Ilościowa metabolomika Saccharomyces cerevisiae przy użyciu chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas

DOI:

10.3791/62061

⸱

5 stycznia 2021

 ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół identyfikacji i oceny ilościowej głównych klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Opisana metoda jest wszechstronna, solidna i czuła. Pozwala na oddzielenie od siebie izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metabolomika to metodologia używana do identyfikacji i kwantyfikacji wielu produktów pośrednich o niskiej masie cząsteczkowej i produktów przemiany materii w komórce, tkance, organie, płynie biologicznym lub organizmie. Metabolomika tradycyjnie koncentruje się na metabolitach rozpuszczalnych w wodzie. Metabolom rozpuszczalny w wodzie jest produktem końcowym złożonej sieci komórkowej, która integruje różne czynniki genomiczne, epigenomiczne, transkryptomiczne, proteomiczne i środowiskowe. W związku z tym analiza metabolomiczna bezpośrednio ocenia wynik działania wszystkich tych czynników w wielu procesach biologicznych w różnych organizmach. Jednym z tych organizmów są pączkujące drożdże Saccharomyces cerevisiae, jednokomórkowy eukariont z w pełni zsekwencjonowanym genomem. Ponieważ S. cerevisiae jest podatny na kompleksowe analizy molekularne, jest używany jako model do analizowania mechanizmów leżących u podstaw wielu procesów biologicznych w komórce eukariotycznej. Wszechstronna metoda analityczna do solidnej, czułej i dokładnej oceny ilościowej metabolomu rozpuszczalnego w wodzie zapewniłaby niezbędną metodologię do analizy tych mechanizmów. W tym miejscu przedstawiamy protokół optymalizacji warunków wygaszania aktywności metabolicznej i ekstrakcji rozpuszczalnych w wodzie metabolitów z komórek S. cerevisiae. W protokole opisano również zastosowanie chromatografii cieczowej sprzężonej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS) do analizy ilościowej ekstrahowanych metabolitów rozpuszczalnych w wodzie. Opisana tutaj metoda LC-MS/MS metabolomiki nieukierunkowanej jest wszechstronna i solidna. Umożliwia identyfikację i kwantyfikację ponad 370 rozpuszczalnych w wodzie metabolitów o różnych właściwościach strukturalnych, fizycznych i chemicznych, w tym różnych izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form tych metabolitów. Metabolity te obejmują różne cząsteczki nośników energii, nukleotydy, aminokwasy, monosacharydy, produkty pośrednie glikolizy i produkty pośrednie cyklu trikarboksylowego. Metoda LC-MS/MS metabolomiki nieukierunkowanej jest czuła i umożliwia identyfikację i ilościowe określenie niektórych metabolitów rozpuszczalnych w wodzie w stężeniach tak niskich, jak 0,05 pmol/μl. Metoda ta została z powodzeniem wykorzystana do oceny rozpuszczalnych w wodzie metabolomów dzikich i zmutowanych komórek drożdży hodowanych w różnych warunkach.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Rozpuszczalne w wodzie metabolity to półprodukty o niskiej masie cząsteczkowej i produkty metabolizmu, które przyczyniają się do istotnych procesów komórkowych. Te ewolucyjnie zachowane procesy obejmują przekształcanie składników odżywczych w energię użytkową, syntezę makrocząsteczek, wzrost i sygnalizację komórkową, kontrolę cyklu komórkowego, regulację ekspresji genów, reakcję na stres, potranslacyjną regulację metabolizmu, utrzymanie funkcjonalności mitochondriów, pęcherzykowy transport komórkowy, autofagię, starzenie się komórek i regulowaną śmierć komórki1,2,3.

Wiele z tych istotnych ról metabolitów rozpuszczalnych w wodzie zostało odkrytych w badaniach na pączkujących drożdżach S. cerevisiae1,3,4,7,9,14,15,16,17,18,19,20,21,22. Ten jednokomórkowy eukariont jest użytecznym organizmem modelowym do analizowania mechanizmów, za pomocą których rozpuszczalne w wodzie metabolity przyczyniają się do procesów komórkowych ze względu na jego podatność na zaawansowane analizy biochemiczne, genetyczne i molekularne23,24,25,26. Chociaż metody LC-MS/MS nieukierunkowanej metabolomiki zostały wykorzystane do badania roli metabolitów rozpuszczalnych w wodzie w pączkujących drożdżach3,18,22,27, ten rodzaj analizy wymaga poprawy jego wszechstronności, solidności, czułości i zdolności do rozróżniania różnych izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form tych metabolitów.

Ostatnie lata są naznaczone znaczącymi postępami w stosowaniu metod LC-MS/MS nieukierunkowanej metabolomiki do profilowania rozpuszczalnych w wodzie metabolitów in vivo. Pozostaje jednak wiele wyzwań związanych z korzystaniem z tej metodologii2,28,29,30,31,32,33,34,35,36. Wyzwania te obejmują następujące elementy. Po pierwsze, wewnątrzkomórkowe stężenia wielu metabolitów rozpuszczalnych w wodzie są poniżej progu czułości dla obecnie stosowanych metod. Po drugie, skuteczność wygaszania aktywności metabolicznej jest zbyt niska, a zakres związanego z wygaszaniem wycieku wewnątrzkomórkowych metabolitów komórkowych jest zbyt wysoki dla obecnych metod; W związku z tym obecnie stosowane metody nie doszacowają wewnątrzkomórkowych stężeń metabolitów rozpuszczalnych w wodzie. Po trzecie, istniejące metody nie są w stanie rozróżnić izomerów strukturalnych (tj. cząsteczek o tym samym wzorze chemicznym, ale różnych połączeniach atomowych) lub stereoizomerów (tj. cząsteczek o tym samym wzorze chemicznym i łączności atomowej, ale o różnym układzie atomowym w przestrzeni) określonych metabolitów; Uniemożliwia to prawidłowe opisywanie niektórych metabolitów obecnie stosowanymi metodami. Po czwarte, istniejące internetowe bazy danych spektralnych mas jonów macierzystych (MS1) i jonów wtórnych (MS2) są niekompletne; wpływa to na prawidłową identyfikację i kwantyfikację określonych metabolitów przy użyciu surowych danych LC-MS/MS uzyskanych przy pomocy obecnych metod. Po piąte, istniejące metody nie mogą wykorzystywać jednego rodzaju ekstrakcji metabolitów w celu odzyskania wszystkich lub większości klas metabolitów rozpuszczalnych w wodzie. Po szóste, istniejące metody nie mogą wykorzystywać jednego typu kolumny LC do oddzielenia od siebie wszystkich lub większości klas metabolitów rozpuszczalnych w wodzie.

Tutaj zoptymalizowaliśmy warunki do wygaszania aktywności metabolicznej w komórkach S. cerevisiae, zachowując większość rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w tych komórkach przed ekstrakcją i ekstrahując większość klas rozpuszczalnych w wodzie metabolitów z komórek drożdży. Opracowaliśmy wszechstronną, solidną i czułą metodę identyfikacji i kwantyfikacji ponad 370 rozpuszczalnych w wodzie metabolitów wyekstrahowanych z komórek S. cerevisiae w oparciu o LC-MS/MS. Ta metoda metabolomiki niecelowanej umożliwia ocenę stężeń wewnątrzkomórkowych różnych cząsteczek nośników energii, nukleotydów, aminokwasów, cukrów prostych, produktów pośrednich glikolizy i produktów pośrednich cyklu trikarboksylowego. Opracowana metoda LC-MS/MS pozwala na identyfikację i kwantyfikację różnych izomerów strukturalnych i stereoizomerycznych form rozpuszczalnych w wodzie metabolitów o zróżnicowanych właściwościach strukturalnych, fizycznych i chemicznych.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Przygotowanie i sterylizacja podłoża do uprawy drożdży

  1. Przygotuj 180 ml kompletnego ekstraktu drożdżowego z pożywką baktopeptonową (YP). Kompletna pożywka YP zawiera 1% (w/v) ekstraktu drożdżowego i 2% (w/v) baktopeptonu.
  2. Rozprowadzić 180 ml pożywki YP równomiernie do czterech kolb Erlenmeyera o pojemności 250 ml. Każda z tych kolb zawiera 45 ml pożywki YP.
  3. Wysterylizować kolby pożywką YP w autoklawie w temperaturze 15 psi/121 °C przez 45 minut.

2. Szczep drożdży typu dzikiego

  1. Użyj szczepu BY4742 (MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0).

3. Uprawa drożdży na pożywce YP zawierającej 2% glukozy

  1. Wysterylizować 20% (w/v) roztwór podstawowy glukozy przez autoklawowanie w temperaturze 15 psi/121 °C przez 45 minut.
  2. Dodać 5 ml autoklawowanego 20% (m/v) roztworu podstawowego glukozy do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera z 45 ml wysterylizowanej pożywki YP. Końcowe stężenie glukozy w pożywce YP wynosi 2% (w/v).
  3. Za pomocą pętli mikrobiologicznej zaszczepić komórki drożdży w każdej z dwóch kolb Erlenmeyera pożywką YP zawierającą 2% glukozy.
  4. Hodować komórki drożdży przez noc w temperaturze 30 °C w wytrząsarce rotacyjnej ustawionej na 200 obr./min.
  5. Weź porcję kultury drożdży. Określ całkowitą liczbę komórek drożdży na ml hodowli. Policz komórki za pomocą hemocytometru.

4. Transfer komórek do pożywki YP i wzrost komórki z 2% glukozą

  1. Dodać 5 ml wysterylizowanego 20% (w/v) roztworu podstawowego glukozy do każdej z pozostałych dwóch kolb Erlenmeyera z autoklawowaną pożywką YP. Końcowe stężenie glukozy wynosi 2% (w/v).
  2. Przenieść objętość nocnej kultury drożdży w pożywce YP z 2% glukozą, która zawiera całkowitą liczbę komórek 5,0 x 107, do każdej z dwóch kolb Erlenmeyera z pożywką YP zawierającą 2% glukozy. Do transferu komórek należy użyć sterylnej pipety.
  3. Hodować komórki drożdży przez co najmniej 24 godziny (lub dłużej, jeśli wymaga tego doświadczenie) w temperaturze 30 °C w wytrząsarce rotacyjnej ustawionej na 200 obr./min.

5. Wytwarzanie odczynników, przygotowywanie sprzętu laboratoryjnego i ustawianie sprzętu do hartowania komórek

  1. Przygotować następujące elementy: 1) roztwór hartowniczy (60% wysokojakościowego (>99,9%) metanolu w 155 mM buforze wodorowęglanu amonu (ABC), pH = 8,0); 2) lodowaty roztwór ABC (pH = 8,0); 3) termometr cyfrowy zdolny do pomiaru temperatury do -20 °C; 4) Duże butelki wirówkowe o pojemności 500 ml; 5) wstępnie schłodzona wirówka szybkoobrotowa z wstępnie schłodzonym wirnikiem i wstępnie schłodzonymi butelkami wirówkowymi o pojemności 500 ml do tego wirnika, wszystkie w temperaturze -5 °C; 6) probówki do ekstrakcji metabolitów (15 ml szybkoobrotowe szklane probówki wirówkowe z nakrętkami wyłożonymi politetrafluoroetylenem); oraz 7) suchy lód.

6. Wygaszanie komórek

  1. Użyj hemocytometru, aby określić liczbę komórek drożdży na ml YP z 2% hodowlą glukozy.
  2. Przenieść objętość kultury w pożywce YP z 2% glukozą, która zawiera całkowitą liczbę komórek 5,0 x 108, do wstępnie schłodzonych butelek wirówkowych o pojemności 500 ml.
  3. Szybko napełnić butelkę wirówkową zawierającą komórki do objętości 200 ml roztworem hartowniczym przechowywanym w temperaturze -20 °C.
  4. Odwirować butelki w wirówce wysokoobrotowej o stężeniu 11,325 x g przez 3 minuty w temperaturze -5 °C.
  5. Szybko i delikatnie wyjąć butelkę z wirówki; delikatnie odkręcić pokrywkę i usunąć supernatant, nie naruszając osadu.
  6. Szybko zawieś ponownie osad komórkowy w 10 ml lodowatego buforu ABC i przenieś zawiesinę do 15 ml szybkoobrotowej szklanej probówki wirówkowej z nasadką wyłożoną politetrafluoroetylenem w celu ekstrakcji metabolitów.
  7. Zebrać komórki przez odwirowanie w wirówce klinicznej o sile 3 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 0 °C.
  8. Szybko usunąć szwadron i umieścić probówkę na suchym lodzie, aby rozpocząć ekstrakcję metabolitów lub przechowywać probówkę w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji.

7. Przygotowanie odczynników, sprzętu laboratoryjnego i sprzętu do ekstrakcji metabolitów

  1. Przygotuj następujące elementy: 1) chloroform klasy LC-MS; 2) Metanol klasy LC-MS; 3) Nano-czysta woda klasy LC; 4) Klasa LC-MS (ACN); 5) kulki szklane (myte kwasem, 425-600 μm); 6) wir z zestawem uchwytów na rurkę piankową z ustalaczem; 7) Probówki wirówkowe ze szkła szybkoobrotowego o pojemności 15 ml z nakrętkami wyłożonymi politetrafluoroetylenem; 8) fiolki ze stwardnieniem rozsianym; 9) suchy lód; oraz 10) probówki o pojemności 1,5 ml przemyte raz etanolem, raz ACN i raz wodą nano-czystą.
    UWAGA: Używaj wyłącznie końcówek i probówek do mikropipet wykonanych z polipropylenu, który jest odporny na rozpuszczalniki organiczne.

8. Ekstrakcja metabolitów

  1. Do metabolitów przechowywanych w suchym lodzie lub przechowywanych w temperaturze -80 °C w probówce z kroku 6.7 dodać następujące elementy: 1) 2 ml chloroformu przechowywanego w temperaturze -20 °C; 2) 1 ml metanolu przechowywanego w temperaturze -20 °C; 3) 1 ml lodowatej nano-czystej wody; oraz 4) 200 μL kulek szklanych płukanych kwasem o pojemności 425-600 μm.
  2. Przykryj i zamknij ujście probówki folią aluminiową. Umieścić probówki w zestawie uchwytów do rurek piankowych z ustalaczem i wirować je przez 30 minut ze średnią prędkością (tj. z prędkością ustawioną na 6, gdzie 12 to maksymalna prędkość wiru) w temperaturze 4 °C, aby ułatwić ekstrakcję metabolitów.
  3. Inkubuj probówkę przez 15 minut na lodzie (NIE na suchym lodzie!), aby przyspieszyć wytrącanie się białka i oddzielenie górnej fazy wodnej od dolnej fazy organicznej.
  4. Odwirować probówkę w wirówce klinicznej przy 3 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Ten etap wirowania umożliwia oddzielenie górnej fazy wodnej (która zawiera metabolity rozpuszczalne w wodzie) od warstwy środkowej (która zawiera szczątki komórkowe i białka) oraz od dolnej fazy organicznej (która zawiera głównie lipidy).
  5. Za pomocą mikropipety przenieś górną fazę wodną (400 μl) do umytej i oznakowanej probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 800 μl ACN, która była przechowywana w temperaturze -20 °C.
    UWAGA: Po dodaniu górnej fazy wodnej do ACN utrzymywanej w temperaturze -20 °C wystąpią opady białej chmury.
  6. Odwirować probówkę z próbką w wirówce stołowej o sile 13 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Opady białej chmury znikną po odwirowaniu.
  7. Przenieść 800 μl z górnej części płynu w probówce do oznakowanej fiolki ze stwardnieniem rozsianym. Przechowywać próbkę w temperaturze 0 °C do czasu jej analizy za pomocą LC-MS/MS.

9. Przygotowanie odczynników, sprzętu laboratoryjnego i sprzętu do LC

  1. Przygotuj następujące elementy: 1) wir; 2) ultradźwiękowy sonikator 3) Fiolki ze szkła MS; 4) system LC wyposażony w pompę dwustopniową, odgazowywacz i autosampler; 5) kolumna do chromatografii fazy jonowej (polimer 5 μm, 150 x 2,1 mm) wymieniona w Tabeli Materiałów; 6) grzejnik kolumnowy; oraz 7) fazy ruchome, w tym faza A (5:95 ACN:woda (v/v) z 20 mM octanem amonu, pH = 8,0) i faza B (100% ACN).

10. Separacja wyekstrahowanych metabolitów przez LC

  1. Zawartość fiolki ze stwardnieniem rozsianym należy poddać działaniu ultradźwięków przez 15 minut.
  2. Wirować fiolkę MS 3x przez 10 sekund w temperaturze pokojowej (RT).
  3. Umieścić fiolkę ze stwardnieniem rozsianym w płytce studzienki.
  4. Podczas chromatografu utrzymywać temperaturę kolumny 45 °C i natężenie przepływu 0,250 ml/min. Przechowywać próbkę w płytce studzienkowej w temperaturze 0 °C. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z gradientami LC, które należy stosować podczas chromatografii.
    UWAGA: Reprezentatywny chromatogram jonów całkowitych rozpuszczalnych w wodzie metabolitów, które zostały wyekstrahowane z komórek szczepu typu dzikiego BY4742, pokazano na rysunku Rysunek 1. Metabolity oddzielone przez LC zidentyfikowano i oznaczono ilościowo za pomocą analizy spektrometrii mas, którą przeprowadzono w trybie jonizacji dodatniej [ESI (+)], jak opisano w kroku 11.

11. Analiza spektrometryczna mas metabolitów oddzielonych LC

  1. Użyć spektrometru mas wyposażonego w podgrzewaną jonizację elektronatryskową (HESI) do identyfikacji i ilościowego oznaczania metabolitów rozpuszczalnych w wodzie, które zostały oddzielone przez LC. Użyj analizatora spektrometru mas dla jonów MS1 i detektora spektrometru mas dla jonów MS2. Użyj ustawień podanych w Tabeli 2 i Tabeli 3 do zależnego od danych pozyskiwania jonów MS1 i MS2.
  2. Do wstrzykiwania należy użyć próbki o objętości 10 μl zarówno w trybie ESI (+), jak i ESI (-).

12. Identyfikacja i kwantyfikacja różnych metabolitów poprzez przetwarzanie surowych danych z LC-MS/MS

  1. Użyj oprogramowania wymienionego w Tabeli materiałów, aby przeprowadzić identyfikację i ilościowe określenie różnych metabolitów rozpuszczalnych w wodzie z surowych plików LC-MS/MS. To oprogramowanie wykorzystuje MS1 do oznaczania ilościowego metabolitów i MS2 do identyfikacji metabolitów. Oprogramowanie wykorzystuje najobszerniej wyselekcjonowaną bibliotekę fragmentacji widma mas do opisywania metabolitów przy użyciu surowych danych LC-MS/MS poprzez dopasowanie widm MS. To oprogramowanie wykorzystuje również dokładną masę MS1 i dopasowanie wzorca izotopowego do opisywania metabolitów za pomocą internetowych baz danych. Zobacz Rysunek 2, aby uzyskać szczegółowe informacje.
  2. Skorzystaj z biblioteki baz danych i widm, która jest dostępna bezpłatnie online (https://www.mzcloud.org), aby wyszukać widma MS2 surowych danych.

13. Test integralności błony za pomocą barwienia jodkiem propidyny (PI) i mikroskopii fluorescencyjnej

  1. Po schładzaniu komórek przeprowadzonym zgodnie z opisem w kroku 6, dokładnie umyj schładzone komórki 15 ml buforu ABC w celu usunięcia roztworu hartującego. Zebrać komórki przez odwirowanie w temperaturze 3 000 x g przez 5 minut w temperaturze 0 °C.
  2. Zawiesić osad komórkowy w 1 ml buforu ABC i dodać 0,5 ml roztworu PI (0,5 mg/ml).
  3. Wirować probówkę z próbką 3x przez 10 s i inkubować ją przez 10 minut w ciemności i na lodzie.
  4. Odwirować probówkę z próbką w wirówce stołowej o stężeniu 13 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C.
  5. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu ABC.
  6. Odwirować probówkę o stężeniu 13 400 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i usunąć supernatant. Powtórz ten krok jeszcze 2 razy, aby usunąć PI związany z powierzchnią komórki.
  7. Zawiesić osad w 300 μl buforu ABC. Umieścić 10 μl zawiesiny na powierzchni szkiełka mikroskopowego.
  8. Rejestruj obrazy z kontrastu różnicowego interferencyjnego (DIC) i mikroskopii fluorescencyjnej za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj filtra ustawionego na długościach fal wzbudzenia i emisji odpowiednio 593 nm i 636 nm.
  9. Użyj oprogramowania, aby policzyć całkowitą liczbę komórek (w trybie DIC) oraz liczbę komórek barwionych fluorescencyjnie. Użyj również tego oprogramowania, aby określić intensywność barwienia dla poszczególnych komórek.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby poprawić ilościową ocenę rozpuszczalnych w wodzie metabolitów w komórce drożdży, zoptymalizowaliśmy warunki wygaszania komórek pod kątem wykrywania metabolitów. Wygaszanie komórek w tym celu polega na szybkim zatrzymaniu wszystkich reakcji enzymatycznych w komórce31,33,37,38. Takie zatrzymanie komórkowej aktywności metabolicznej jest niezbędnym etapem każdej...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aby skutecznie korzystać z opisanego tutaj protokołu, postępuj zgodnie ze środkami zapobiegawczymi opisanymi poniżej. Chloroform i metanol ekstrahują różne substancje z laboratoryjnych wyrobów z tworzyw sztucznych. Dlatego należy obchodzić się z nimi ostrożnie. Unikaj stosowania tworzyw sztucznych w etapach, które wiążą się z kontaktem z którymkolwiek z tych dwóch rozpuszczalników organicznych. Do wykonania tych czynności należy użyć pipet ze szkła borokrzemianowego. Przed użyciem należy napełnić pipety chloroformem i me...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Jesteśmy wdzięczni obecnym i byłym członkom laboratorium Titorenko za dyskusje. Wyrażamy uznanie dla Centrum Biologicznych Zastosowań Spektrometrii Mas, Centrum Genomiki Strukturalnej i Funkcjonalnej oraz Centrum Mikroskopii i Obrazowania Komórkowego (wszystkie na Uniwersytecie Concordia) za wybitne usługi. Badanie to było wspierane przez granty z Rady ds. Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) z Kanady (RGPIN 2014-04482 i CRDPJ 515900 - 17). K.M. był wspierany przez Concordia University, Armand C. Archambault Fellowship oraz Concordia University Dean of Arts and Sciences Award of Excellence.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Chemicals
AcetonitrylFisher ScientificA9554
Octan amonuFisher ScientificA11450
Wodorowęglan amonuSigma9830
BactopeptonFisherScientific BP1420-2
ChloroformFisher ScientificC297-4
GlukozaFisher ScientificD16-10
L-histydynaSigmaH8125
L-leucynaSigmaL8912
L-lizynaSigmaL5501
MetanolFisher ScientificA4564
MetanolFisher ScientificA4564
Jodek propidynyThermo ScientificR37108
UracilSigmaU0750
Ekstrakt drożdżowyFisher ScientificBP1422-2
Hardware equipment
500 ml butelki wirówkoweBeckman355664
Agilent 1100 series LCAgilent TechnologiesG1312A
Wirówka do redlic Beckman6254249
Beckman Wirnik do redlic Beckman Wirnik do redlicBeckmanJA-10
Centra CL2Thermo Scientific004260F
Termometr cyfrowyOmegaHH509
Zestaw uchwytów do rurek piankowych z ustalaczemThermo Scientific02-215-388
SeQuant ZIC-pHILIC kolumna fazy obojenia (5&mikro; m polimer 150 x 2,1 mm)Sigma Milipore150460
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
Sonikator ultradźwiękowyFisher Scientific15337416
VortexFisher Scientific2215365
ZORBAX Bonus-RP, 80Å, 2,1 x 150 mm, 5 &mikro; mAgilent Technologies883725-901
Materiały laboratoryjne
2-mL Szklane fiolki na próbki z nakrętkami wyłożonymi teflonemFisher Scientific60180A-SV9-1P
Koraliki szklane (myte kwasem, 425-600 μ m)Sigma-AldrichG8772
Fisher Scientific267110
15-mililitrowe szybkie szklane probówki wirówkowe z nasadkami wyłożonymi teflonemPYREX05-550
Software
Compound Discoverer 3.1Fisher ScientificV3.1
Szczep drożdży
Szczep drożdży BY4742DharmaconYSC1049
Hemacytometr

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hackett, S. R., et al. Systems-level analysis of mechanisms regulating yeast metabolic flux. Science. 354 (6311), aaf2786(2016).
  2. Johnson, C. H., Ivanisevic, J., Siuzdak, G. Metabolomics: beyond biomarkers and towards mechanisms. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (7), 451-459 (2016).
  3. Mülleder, M., et al. Functional metabolomics describes the yeast biosynthetic regulome. Cell. 167 (2), 553-565 (2016).
  4. López-Otín, C., Galluzzi, L., Freije, J., Madeo, F., Kroemer, G. Metabolic control of longevity. Cell. 166 (4), 802-821 (2016).
  5. Krishnaiah, S. Y., et al. Clock regulation of metabolites reveals coupling between transcription and metabolism. Cell Metabolism. 25 (4), 961-974 (2017).
  6. Lee, H. J. Proteomic and metabolomic characterization of a mammalian cellular transition from quiescence to proliferation. Cell Reports. 20 (3), 721-736 (2017).
  7. Stryeck, S., Birner-Gruenberger, R., Madl, T. Integrative metabolomics as emerging tool to study autophagy regulation. Microbial Cell. 4 (8), 240-258 (2017).
  8. Babst, M. Eisosomes at the intersection of TORC1 and TORC2 regulation. Traffic. 20 (8), 543-551 (2019).
  9. Pedro, J., Sica, V., Madeo, F., Kroemer, G. Acyl-CoA-binding protein (ACBP): the elusive 'hunger factor' linking autophagy to food intake. Cell Stress. 3 (10), 312-318 (2019).
  10. Rahmani, S., Defferrari, M. S., Wakarchuk, W. W., Antonescu, C. N. Energetic adaptations: Metabolic control of endocytic membrane traffic. Traffic. 20 (12), 912-931 (2019).
  11. Viltard, M., et al. The metabolomic signature of extreme longevity: naked mole rats versus mice. Aging. 11 (14), 4783-4800 (2019).
  12. Zhu, J., Thompson, C. B. Metabolic regulation of cell growth and proliferation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (7), 436-450 (2019).
  13. Morrison, A. J. Chromatin-remodeling links metabolic signaling to gene expression. Molecular Metabolism. 38, 100973(2020).
  14. Bitterman, K. J., Medvedik, O., Sinclair, D. A. Longevity regulation in Saccharomyces cerevisiae: linking metabolism, genome stability, and heterochromatin. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 67 (3), 376-399 (2003).
  15. Carmona-Gutierrez, D. Apoptosis in yeast: triggers, pathways, subroutines. Cell Death and Differentiation. 17 (5), 763-773 (2010).
  16. Minois, N., Carmona-Gutierrez, D., Madeo, F. Polyamines in aging and disease. Aging. 3 (8), 716-732 (2011).
  17. Ring, J., et al. The metabolism beyond programmed cell death in yeast. Experimental Cell Research. 318 (11), 1193-1200 (2012).
  18. Ibáñez, A. J., et al. Mass spectrometry-based metabolomics of single yeast cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (22), 8790-8794 (2013).
  19. Pietrocola, F., et al. Acetyl coenzyme A: a central metabolite and second messenger. Cell Metabolism. 21 (6), 805-821 (2015).
  20. Carmona-Gutierrez, D., et al. Guidelines and recommendations on yeast cell death nomenclature. Microbial Cell. 5 (1), 4-31 (2018).
  21. Zimmermann, A., et al. Yeast as a tool to identify anti-aging compounds. FEMS Yeast Research. 18 (6), foy020(2018).
  22. Leupold, S., et al. Saccharomyces cerevisiae goes through distinct metabolic phases during its replicative lifespan. eLife. 8, e41046(2019).
  23. Weissman, J., Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics: Functional Genomics, Proteomics, and Other Systems Analyses. , Academic Press. Burlington. (2010).
  24. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  25. Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
  26. Strynatka, K. A., Gurrola-Gal, M. C., Berman, J. N., McMaster, C. R. How surrogate and chemical genetics in model organisms can suggest therapies for human genetic diseases. Genetics. 208 (3), 833-851 (2018).
  27. Boer, V. M., et al. Growth-limiting intracellular metabolites in yeast growing under diverse nutrient limitations. Molecular Biology of the Cell. 21 (1), 198-211 (2010).
  28. Clish, C. B. Metabolomics: an emerging but powerful tool for precision medicine. Cold Spring Harbor Molecular Case Studies. 1 (1), a000588(2015).
  29. Fuhrer, T., Zamboni, N. High-throughput discovery metabolomics. Current Opinion in Biotechnology. 31, 73-78 (2015).
  30. Liu, X., Locasale, J. W. Metabolomics: A primer. Trends in Biochemical Sciences. 42 (4), 274-284 (2017).
  31. Lu, W., et al. Metabolite measurement: pitfalls to avoid and practices to follow. Annual Review of Biochemistry. 86, 277-304 (2017).
  32. Riekeberg, E., Powers, R. New frontiers in metabolomics: from measurement to insight. F1000 Reseach. 6, 1148(2017).
  33. Gertsman, I., Barshop, B. A. Promises and pitfalls of untargeted metabolomics. Journal of Inherited Metabolic Disease. 41 (3), 355-366 (2018).
  34. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  35. Ivanisevic, J., Want, E. J. From samples to insights into metabolism: Uncovering biologically relevant information in LC-HRMS metabolomics data. Metabolites. 9 (12), 308(2019).
  36. Srivastava, S. Emerging insights into the metabolic alterations in aging using metabolomics. Metabolites. 9 (12), 301(2019).
  37. Chetwynd, A. J., Dunn, W. B., Rodriguez-Blanco, G. Collection and preparation of clinical samples for metabolomics. Advances in Experimental Medicine and Biology. 965, 19-44 (2017).
  38. Pinu, F. R., Villas-Boas, S. G., Aggio, R. Analysis of intracellular metabolites from microorganisms: quenching and extraction protocols. Metabolites. 7 (4), (2017).
  39. Zhang, N., et al. Cell permeability and nuclear DNA staining by propidium iodide in basidiomycetous yeasts. Applied Microbiology and Biotechnology. 102 (9), 4183-4191 (2018).
  40. Tu, B. P., et al. Cyclic changes in metabolic state during the life of a yeast cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (43), 16886-16891 (2007).
  41. Walvekar, A., Rashida, Z., Maddali, H., Laxman, S. A versatile LC-MS/MS approach for comprehensive, quantitative analysis of central metabolic pathways. Wellcome Open Research. 3, 122(2018).
  42. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).
  43. Cui, L., Lu, H., Lee, Y. H. Challenges and emergent solutions for LC-MS/MS based untargeted metabolomics in diseases. Mass Spectrometry Reviews. 37 (6), 772-792 (2018).
  44. Oberacher, H., et al. Annotating nontargeted LC-HRMS/MS data with two complementary tandem mass spectral libraries. Metabolites. 9 (1), 3(2018).
  45. Tada, I., et al. Creating a reliable mass spectral-retention time library for all ion fragmentation-based metabolomics. Metabolites. 9 (11), 251(2019).
  46. Villas-Bôas, S. G., et al. Global metabolite analysis of yeast: evaluation of sample preparation methods. Yeast. 22 (14), 1155-1169 (2005).
  47. Crutchfield, C. A., Lu, W., Melamud, E., Rabinowitz, J. D. Mass spectrometry-based metabolomics of yeast. Methods in Enzymology. 470, 393-426 (2010).
  48. Zhang, T., Creek, D. J., Barrett, M. P., Blackburn, G., Watson, D. G. Evaluation of coupling reversed phase, aqueous normal phase, and hydrophilic interaction liquid chromatography with Orbitrap mass spectrometry for metabolomic studies of human urine. Analytical Chemistry. 84 (4), 1994-2001 (2012).
  49. Villas-Bôas, S. G., Moxley, J. F., Akesson, M., Stephanopoulos, G., Nielsen, J. High-throughput metabolic state analysis: the missing link in integrated functional genomics of yeasts. Biochemical Journal. 388 (Pt 2), 669-677 (2005).
  50. Buescher, J. M., Moco, S., Sauer, U., Zamboni, N. Ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for fast and robust quantification of anionic and aromatic metabolites. Analytical Chemistry. 82 (11), 4403-4412 (2010).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Metabolity rozpuszczalne w wodzieekstrakcja metabolit wquenching kom rekkolumna z faz zwitterionowmikroskopia fluorescencyjnabarwienie jodeczkiem propidyny

Powiązane artykuły