Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila

4.4K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/62106

⸱

15 września 2021

 ,  ,  , 
1Departamento de Genética Molecular, Instituto de Fisiología Celular, Universidad Nacional Autónoma de México

W tym artykule

Podsumowanie

Genom jest zorganizowany w przestrzeni jądrowej w różne struktury, które mogą być ujawnione za pomocą technologii przechwytywania konformacji chromosomów. Metoda Hi-C w jądrze zapewnia zbiór interakcji chromatyny w całym genomie w liniach komórkowych Drosophila, który generuje mapy kontaktów, które można badać w rozdzielczości megabazowej na poziomie fragmentu restrykcyjnego.

Streszczenie

Genom jest zorganizowany w topologicznie asocjujące domeny (TADs) ograniczone granicami, które izolują interakcje między domenami. U Drosophila mechanizmy leżące u podstaw powstawania i granic TAD są nadal badane. Zastosowanie opisanej tutaj metody Hi-C w jądrze pomogło w analizie funkcji miejsc wiązania białek architektonicznych (AP) na granicach TAD izolujących gen Notch. Genetyczna modyfikacja granic domen, która powoduje utratę AP, powoduje fuzję TAD, defekty transkrypcyjne i dalekosiężne zmiany topologiczne. Wyniki te dostarczyły dowodów wskazujących na udział elementów genetycznych w tworzeniu granic domen i kontroli ekspresji genów u Drosophila. W tym miejscu szczegółowo opisano metodę Hi-C w jądrze, która dostarcza ważnych punktów kontrolnych do oceny jakości eksperymentu wraz z protokołem. Pokazano również wymaganą liczbę odczytów sekwencjonowania i prawidłowe pary Hi-C do analizy interakcji genomowych w różnych skalach genomowych. Edycja genetyczna elementów regulatorowych za pośrednictwem CRISPR/Cas9 i profilowanie interakcji genomowych w wysokiej rozdzielczości przy użyciu tego wewnątrzjądrowego protokołu Hi-C mogą być potężną kombinacją do badania funkcji strukturalnych elementów genetycznych.

Wprowadzenie

U eukariontów genom jest dzielony na chromosomy, które zajmują określone terytoria w przestrzeni jądrowej podczas interphase1. Chromatynę tworzącą chromosomy można podzielić na dwa główne stany: jeden z dostępnej chromatyny, która jest transmisywnie permisywna, a drugi ze zwartej chromatyny, która jest represyjna transkrypcyjnie. Te stany chromatyny segregują się i rzadko mieszają w przestrzeni jądrowej, tworząc dwa odrębne przedziały w nucleus2. W skali sub-megabase granice oddzielają domeny oddziaływań chromatyny o wysokiej częstotliwości, zwane TAD, które oznaczają organizację chromosomów3,4,5. U ssaków granice TAD są zajęte przez kohezynę i czynnik wiążący CCCTC (CTCF)6,7,8. Kompleks kohezyny wytłacza chromatynę i zatrzymuje się w miejscach wiązania CTCF, które są rozmieszczone w orientacji zbieżnej w sekwencji genomowej, tworząc stabilne pętle chromatyny9,10,13,14. Genetyczne zakłócenie miejsca wiązania DNA CTCF na granicach lub zmniejszenie obfitości białka CTCF i kohezyny powoduje nieprawidłowe interakcje między elementami regulatorowymi, utratę tworzenia TAD i deregulację ekspresji genów9,10,11,13,14.

U Drosophila, granice między TADami są zajęte przez kilka AP, w tym czynnik związany z elementem granicznym 32 kDa (BEAF-32), białko wiążące motyw 1 (M1BP), białko centrosomalne 190 (CP190), supresor owłosionego skrzydła (SuHW) i CTCF, i są wzbogacone w aktywne modyfikacje histonów i polimerazę II16,17,18. Zasugerowano, że u Drosophila TADy pojawiają się jako konsekwencja transkrypcji13,17,19, a dokładna rola niezależnych AP w tworzeniu granic i właściwościach izolacyjnych jest nadal badana. Tak więc, czy domeny u Drosophila są wyłączną konsekwencją agregacji regionów o podobnych stanach transkrypcyjnych, czy też AP, w tym CTCF, przyczyniają się do tworzenia granic, pozostaje do pełnego scharakteryzowania. Badanie kontaktów genomowych w wysokiej rozdzielczości było możliwe dzięki opracowaniu technologii wychwytywania konformacji chromosomów w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji. Protokół Hi-C został po raz pierwszy opisany za pomocą etapu ligacji wykonywanego "w roztworze"2 w celu uniknięcia fałszywych produktów ligacji między fragmentami chromatyny. Jednak kilka badań wykazało, że użyteczny sygnał w danych pochodził z produktów ligacji utworzonych w częściowo zlizowanych jądrach, które nie znajdowały się w roztworze20,21.

Protokół został następnie zmodyfikowany, aby przeprowadzić ligację wewnątrz jądra jako część eksperymentu Hi-C na pojedynczej komórce22. Protokół Hi-C w jądrze został następnie włączony do populacji komórek Hi-C, aby uzyskać bardziej spójne pokrycie w pełnym zakresie odległości genomowych i uzyskać dane z mniejszym szumem technicznym23,24. Protokół, opisany szczegółowo tutaj, opiera się na populacyjnym protokole Hi-C w jądrze23,24 i został wykorzystany do zbadania konsekwencji genetycznego usunięcia motywów wiążących DNA dla CTCF i M1BP z granicy domeny w locus genu Notch w Drosophila25. Wyniki pokazują, że zmiana motywów wiążących DNA dla AP na granicy ma drastyczne konsekwencje dla tworzenia domen Notch, większych defektów topologicznych w regionach otaczających locus Notch i deregulacji ekspresji genów. Wskazuje to, że elementy genetyczne na granicach domen są ważne dla utrzymania topologii genomu i ekspresji genów w Drosophila25.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

1. Fiksacja

  1. Zacznij od 10 milionów komórek Schneidera linii 2 plus (S2R+), aby przygotować 17,5 ml zawiesiny komórkowej w pożywce Schneidera zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) w temperaturze pokojowej (RT).
  2. Dodaj formaldehyd bez metanolu, aby uzyskać końcowe stężenie 2%. Mieszać i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, uważając, aby mieszać co minutę.
    UWAGA: Formaldehyd jest niebezpieczną substancją chemiczną. Przestrzegaj odpowiednich przepisów BHP i pracuj pod wyciągiem.
  3. Ugasić reakcję, dodając glicynę, aby uzyskać końcowe stężenie 0,125 M i wymieszać. Inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 15 minut na lodzie.
  4. Wirować przez 400 × g w temperaturze pokojowej przez 5 minut, a następnie przez 10 minut w temperaturze 4 °C; odrzucić supernatant. Ostrożnie zawiesić osad w 25 ml zimnego 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami.
  5. Odwirować przy 400 × g przez 10 minut w temperaturze 4 °C, a następnie wyrzucić supernatant.
    UWAGA: Jeśli kontynuujesz korzystanie z protokołu, przejdź do kroku 2.1 dla lizy; w przeciwnym razie zawiesić granulat w płynieN2 i przechowywać go w temperaturze -80 °C.

2. Liza

  1. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml lodowatego buforu do lizy (10 mM Tris-HCl, pH 8; 0,2% niejonowego środka powierzchniowo czynnego (patrz tabela materiałów); 10 mM NaCl; 1x inhibitory proteazy) i dostosować objętość do 10 ml za pomocą lodowatego buforu do lizy. Dostosuj objętość, aby uzyskać stężenie 1 × 106 komórek/ml. Inkubować na lodzie przez 30 minut, mieszając co 2 minuty, odwracając probówki.
  2. Odwirować jądra w temperaturze 300 × g przez 5 minut w temperaturze 4 °C, a następnie ostrożnie odrzucić supernatant. Przemyj osad 1x 1 ml zimnego buforu do lizy i przenieś go do probówki mikrowirówkowej. Umyj osad 1x 1 ml zimnego buforu restrykcyjnego 1,25x i ponownie zawieś każdą komórkę w 360 μl 1,25x buforu restrykcyjnego.
  3. Dodać 11 μl 10% dodecylosiarczanu sodu (SDS) na probówkę (0,3% stężenia końcowego), dokładnie wymieszać pipetując i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, wstrząsając z prędkością 700-950 obr./min. Pipetować w górę iw dół, aby kilkakrotnie rozbić grudki podczas inkubacji.
  4. Ugasić SDS przez dodanie 75 μl niejonowego środka powierzchniowo czynnego (10% roztwór, patrz tabela materiałów) na probówkę (1,6% stężenie końcowe) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut, wytrząsając z prędkością 950 obr./min. Pipetować kilka razy w górę i w dół, aby rozbić grudki podczas inkubacji.
    UWAGA: Jeśli grudki są duże i trudne do przerwania, zmniejsz prędkość obrotową do 400 obr./min podczas zabiegów SDS i środkami powierzchniowo czynnymi. Jeżeli grudki są trudne do rozdrobnienia przez pipetowanie, należy podzielić próbkę na dwie części; dostosować objętości bufora restrykcyjnego, SDS i środka powierzchniowo czynnego; i kontynuuj przenikanie. Następnie należy zawirować jądra z minimalną prędkością (200 × g), ostrożnie wyrzucić supernatant, zebrać próbki razem w buforze restrykcyjnym 1X i przystąpić do trawienia. Pobrać podwielokrotność 10 μl jako niestrawioną próbkę (UD).

3. Trawienie enzymatyczne

  1. Trawić chromatynę, dodając 200 jednostek (U) Mbo I na probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez okres od 4 godzin do nocy, obracając się (950 obr./min).
  2. Następnego dnia dodać dodatkowe 50 U Mbo I na probówkę i inkubować w temperaturze 37 °C przez 2 godziny, obracając (950 obr./min).
  3. Dezaktywować enzym przez inkubację probówek w temperaturze 60 °C przez 20 min. Umieścić probówki na lodzie.
    UWAGA: Jako wytrawioną próbkę należy pobrać podwielokrotność 10 μl.

4. Biotynylacja DNA kończy się

  1. Aby wypełnić zwisy fragmentów restrykcyjnych i oznaczyć końce DNA biotyną, dodaj po 1,5 μl z 10 mM dCTP, dGTP, dTTP, 20 μl 0,4 mM biotyny dATP, 17,5 μl buforu Tris low-EDTA (TLE) [10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0] i 10 μl 5 U/μL Klenowa (duży fragment polimerazy DNA I) do wszystkich probówek. Dokładnie wymieszać i inkubować przez 75 minut w temperaturze 37 °C. Wstrząsać z prędkością 700 obr./min co 10 s przez 30 s. Umieść wszystkie probówki na lodzie podczas przygotowywania mieszanki do podwiązywania.

5. Podwiązanie

  1. Przenieść każdą strawioną mieszaninę chromatyny do oddzielnej probówki o pojemności 1 ml z mieszanką do ligacji (100 μl 10x buforu ligacyjnego, 10 μl 10 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 15 U ligazy DNA T4 i 425 μL podwójnie destylowanej wody [ddH2O]). Dokładnie wymieszać za pomocą delikatnego pipetowania i inkubować przez noc w temperaturze 16 °C.

6. Odwrócenie usieciowania i oczyszczanie DNA

  1. Rozkład białek przez dodanie 50 μl 10 mg/ml proteinazy K na probówkę i inkubację w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Odwrotne usieciowanie poprzez zwiększenie temperatury do 65 °C i inkubację przez noc.
  2. Rozkład RNA przez dodanie 20 μl 10 mg/ml RNazy A i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
  3. Przeprowadzić ekstrakcję fenolu: chloroform, a następnie wytrącić etanol.
    1. Dodać 1 objętość chloroformu fenolowego i dokładnie wymieszać przez odwrócenie, aby uzyskać jednorodną fazę białą.
      UWAGA: Fenol jest niebezpieczną substancją chemiczną. Przestrzegaj odpowiednich przepisów BHP. Praca pod wyciągiem.
    2. Wirować przy 15 000 × g przez 15 min. Przenieść fazę wodną do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 2 ml. Przeprowadzić ekstrakcję wsteczną dolnej warstwy za pomocą 100 μl buforu TLE i przenieść fazę wodną do tej samej probówki o pojemności 2 ml.
    3. Wytrącić DNA, dodając 2 objętości 100% alkoholu etylowego (EtOH), 0,1 objętości 3 M octanu sodu i 2 μl glikogenu 20 mg/ml. Inkubować w temperaturze -20 °C przez okres od 2 godzin do nocy.
    4. Wirować z prędkością 15 000 × g przez 30 minut w temperaturze 4 °C i umyć granulki 2x lodowatym 70% EtOH. Wysuszyć granulki w temperaturze pokojowej i ponownie zawiesić w 100 μl buforu TLE. Określić ilościowo DNA za pomocą barwnika fluorogenicznego, który wiąże się selektywnie z DNA i fluorometru zgodnie z instrukcjami producenta (tabela materiałów).
      UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Produkty do podwiązywania należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez krótki czas lub w temperaturze -20 °C przez długi czas. Do kontroli jakości należy użyć podwielokrotności (100 ng) materiału jako podligowanej próbki (L).

7. Oceń jakość szablonu Hi-C

  1. Kontrole jakościowe trawienia i podwiązywania
    1. Oczyść DNA z podwielokrotności UD i D poprzez odwrócenie wiązań krzyżowych i przeprowadź ekstrakcję fenolu:chloroform i wytrącanie etanolu, jak opisano powyżej.
    2. Załaduj 100 ng próbek UD, D i L w 1,5% żelu agarozowym. Poszukaj rozmazu wyśrodkowanego wokół 500 pz w próbce D w porównaniu z pasmem o wysokiej masie cząsteczkowej dla próbki L (patrz reprezentatywne wyniki).
  2. Efektywność trawienia, kontrola ilościowa
    UWAGA: Aby dokładniej ocenić wydajność mineralizacji, należy użyć próbek UD i D jako matryc do przeprowadzenia ilościowych reakcji łańcuchowych polimerazy (qPCR) przy użyciu starterów zaprojektowanych w następujący sposób.
    1. Zaprojektuj parę starterów, która amplifikuje fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne DNA dla enzymu używanego do trawienia (Mbo I w niniejszym protokole), zwanego R we wzorze w kroku 7.2.3.
    2. Zaprojektuj parę starterów, która amplifikuje kontrolny fragment DNA, który nie zawiera miejsca restrykcyjnego dla enzymu używanego do trawienia (Mbo I dla niniejszego protokołu), zwanego C we wzorze w kroku 7.2.3.
    3. Użyj wartości progowych cyklu (wartości Ct) wzmocnienia, aby obliczyć skuteczność oporu zgodnie ze wzorem pokazanym poniżej:
      % ograniczenia = 100 - 100/2{(CtR - CtC)D - (CtR - CtC)UD}
      Gdzie CtR odnosi się do wartości Ct fragmentu R, a CtC odnosi się do wartości Ct fragmentu C dla próbki D i próbki UD.
      UWAGA: Procent restrykcji odzwierciedla skuteczność enzymu restrykcyjnego rozszczepiającego ograniczony (R) fragment DNA w porównaniu z kontrolnym fragmentem DNA (C), który nie zawiera miejsca restrykcyjnego DNA. Zalecana jest skuteczność oporu na poziomie ≥ 80%.
  3. Wykrywanie znanych interakcji
    1. Przeprowadzić PCR w celu amplifikacji wewnętrznej kontroli ligacji w celu zbadania oddziaływań krótkiego zasięgu i/lub średniego lub długiego zasięgu (patrz reprezentatywne wyniki).
    2. Alternatywnie, zaprojektuj startery do amplifikacji produktu ligacji, w którym startery są w orientacji przód-przód lub odwrócony-tył w sąsiednich fragmentach restrykcyjnych.
  4. Kontrola wypełniania i znakowania biotyną
    1. Sprawdzić skuteczność znakowania Hi-C i ligacji poprzez amplifikację i trawienie znanej interakcji lub produktu ligacji między sąsiednimi fragmentami restrykcyjnymi w genomie, jak opisano powyżej.
      UWAGA: Pomyślne wypełnienie i ligacja miejsca Mbo I (GATC) generuje nowe miejsce dla enzymu restrykcyjnego Cla I (ATCGAT) w złączu ligacyjnym i regeneruje miejsce Mbo I.
    2. Produkt PCR należy roztrawić za pomocą Mbo I, Cla I lub obu. Po przeprowadzeniu próbek na 1,5-2% żelu, oszacuj względną liczbę połączeń ligacji 3C i Hi-C, określając ilościowo intensywność ciętych i nieprzeciętych pasm26.
      UWAGA: Pożądana jest sprawność > 70% (patrz reprezentatywne wyniki).

8. Sonikacja

  1. Sonizuj próbki, aby uzyskać fragmenty DNA o długości 200-500 pz. Dla przyrządu używanego w niniejszym protokole (patrz Tabela materiałów), rozcieńczyć próbkę (od 5 do 10 μg) w 130 μl ddH2O na probówkę i ustawić przyrząd na sonikację na 400 pz: poziom napełnienia: 10; współczynnik cła: 10%; Szczytowa moc w przypadku awarii (W): 140; Cykle na serię: 200; Czas (s): 80.

9. Usuwanie biotyny/naprawa końcowa

UWAGA: Poniższe kroki są dostosowane do 5 μg Hi-C DNA.

  1. W celu usunięcia biotyny należy przenieść próbkę (130 μl) do świeżej probówki do mikrowirówki. Dodać 16 μl 10x buforu ligacyjnego, 2 μl 10 mM dATP, 5 μl polimerazy DNA T4 (15U) i 7 μl ddH2O (160 μL całkowitej objętości). Inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 min.
  2. Dodać 5 μl 10 mM dNTP, 4 μl 10x buforu ligacyjnego, 5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (10 U/μL), 1 μl Klenowa i 25 μL ddH2O (200 μL całkowitej objętości). Inkubować w temperaturze 20 °C przez 30 min.

10. Wybór rozmiaru

  1. Aby wybrać fragmenty głównie w zakresie wielkości 250-550 pz, należy przeprowadzić sekwencyjną selekcję wielkości odwracalnego unieruchomienia w fazie stałej (SPRI) najpierw 0,6x, a następnie 0,90x zgodnie z instrukcjami producenta i wymyć DNA za pomocą 100 μl TLE.

11. Ściąganie biotyny/ogon A/podwiązanie adaptera

UWAGA: Przeprowadź mycie, zawieszając kulki magnetyczne za pomocą wirowania, obracaj próbki przez 3 minuty na obracającym się kole, a następnie krótko odkręć próbkę i umieść ją na magnetycznym stojaku. Pozwól, aby koraliki przykleiły się do magnesu, wyrzuć supernatant i przejdź do następnego etapu mycia. Pranie należy wykonywać w temperaturze 55 °C na termobloku z obracającym się zamiast obracającego się koła.

  1. Uzupełnić końcową objętość do 300 μl na próbkę za pomocą TLE w celu pobrania. Przygotuj do płukania kulek: 1x bufor do kanałów prostych (TB) (TB: 5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl, 0,05% Tween), 0,5 x TB, 1x bufor bez animacji (NTB) (5 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 mM EDTA, 1 M NaCl), 2x NTB.
  2. Użyj 150 μl kulek magnetycznych połączonych streptawidyną (patrz tabela materiałów) na bibliotekę. Umyj kulki 2x 400 μL 1x TB. Następnie ponownie zawieś kulki w 300 μL 2x NTB.
  3. Wymieszać kulki z 300 μl materiału Hi-C i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut na obracającym się kole, aby umożliwić wiązanie biotyny z kulkami streptawidyny.
  4. Umyj kulki 400 μl 0,5 x TB i inkubuj w temperaturze 55 °C przez 3 minuty, obracając z prędkością 750 obr./min. Umyj kulki w 200 μl 1x buforu restrykcyjnego.
  5. Ponownie zawiesić kulki w 100 μl mieszanki ogonowej dATP (5 μl 10 mM dATP, 10 μl 10x buforu restrykcyjnego, 5 μl egzo-Klenow i 80 μl ddH2O). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut.
  6. Usunąć supernatant, przemyć kulki 2x 400 μl 0,5x TB, inkubując w temperaturze 55 °C przez 3 minuty i obracając z prędkością 750 obr./min.
  7. Przemyć kulki 400 μl 1x NTB, a następnie 100 μl 1x buforu ligacyjnego.
  8. Ponownie zawiesić kulki w 50 μl 1x buforu do podwiązywania i przenieść zawiesinę do nowej probówki. Dodać 4 μl wstępnie wyżarzonych adapterów PE (zapas 15 μM) i 2 μl ligazy T4 (400 U/μL, tj. 800 U/rurkę); inkubować w temperaturze pokojowej przez 2 godz.
    UWAGA: Wstępnie wyżarzać adaptery, dodając równe objętości adapterów PE 1.0 i PE 2.0 (zapas 30 μM) i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej (patrz tabela materiałów).
  9. Ponownie wychwyć kulki, usuwając supernatant i przemłukując je 2x 400 μl TB. Przemyj kulki 200 μl 1x NTB, a następnie 100 μl 1x buforu restrykcyjnego i ponownie zawieś kulki w 40 μl 1x buforu restrykcyjnego.

12. Amplifikacja PCR

  1. Skonfiguruj PCR o objętości 25 μl z 5, 6, 7 i 8 cyklami. Dla każdego PCR użyj:
    Przepis na reakcję
    Koraliki Hi-C2,5 μl
    Starter 10 μM PE PCR 1 (tabela materiałów)0,75 μL
    Podkład 10 μM PE PCR 2 (tabela materiałów)0,75 μL
    10 mM dNTP0,6 μL
    5x bufor reakcyjny5 μL
    Polimeraza DNA0,3 μl
    ddH2O14,65 μl
    łączny25 μL
    CyklitemperaturaGodzina
    198 °C30 sekund
    n cykli98 °C10 sekund
    65 °C30 sekund
    72 °C30 sekund
    172 °CCzas trwania: 7 min

13. Końcowe wzmocnienie PCR

  1. Wykonać końcową amplifikację PCR, stosując te same warunki, jakie opisano powyżej, i wybierając liczbę cykli. Podzielić próbkę, używając 5 μl kulek Hi-C jako matrycy w reakcjach 50 μl.
  2. Zbierz wszystkie reakcje PCR i przenieś je do świeżej probówki. Użyj magnesu, aby usunąć kulki streptawidyny i odzyskać supernatant (produkty PCR). Przenieś kulki do świeżej probówki, umyj je zgodnie z opisem w kroku 11.2.9 i przechowuj w 1x buforze restrykcyjnym w temperaturze 4 °C jako kopię zapasową.
  3. Oczyść produkty PCR, używając 0,85x objętości kulek SPRI zgodnie z instrukcjami producenta. Eluować za pomocą 30 μl buforu TLE.
  4. Określ ilościowo bibliotekę Hi-C za pomocą przyrządu fluorometrycznego i potwierdź jakość biblioteki za pomocą elektroforezy kapilarnej opartej na chipie.
  5. Jako ostatni punkt kontroli jakości użyj 1 μl biblioteki Hi-C jako matrycy do przeprowadzenia reakcji PCR przy użyciu 10 cykli przy użyciu tych samych warunków, które opisano w kroku 12.1. Podzielić produkt PCR na dwie probówki do mikrowirówek: jedną trawić za pomocą Cla I, a drugą pozostawić niestrawioną jako kontrolę. Uruchom produkty w 1,5-2% żelu agarozowym (patrz reprezentatywne wyniki).
  6. Przejdź do sekwencjonowania sparowanych końców 50 pz lub 75 pz na odpowiedniej platformie sekwencjonowania.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

Poniżej opisane są wyniki udanego protokołu Hi-C (zobacz podsumowanie przepływu pracy protokołu Hi-C w Rysunek 1A). Podczas eksperymentu Hi-C w jądrze istnieje kilka punktów kontrolnych jakości. Podwielokrotności próbki pobrano przed (UD) i po (D) etapie restrykcji chromatyny, a także po podwiązaniu (L). Wiązania krzyżowe zostały odwrócone, a DNA oczyszczono i uruchomiono na żelu agarozowym. Rozmazanie o wartości 200-1000 pz zaobserwowano, gdy ograniczenie za pomocą Mbo I zakończyło się sukc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Przedstawiona tutaj metoda Hi-C w jądrze pozwoliła na szczegółową eksplorację topologii genomu Drosophila w wysokiej rozdzielczości, zapewniając wgląd w interakcje genomowe w różnych skalach genomowych, od pętli chromatyny między elementami regulatorowymi, takimi jak promotory i wzmacniacze, po TAD i identyfikację dużych przedziałów25. Ta sama technologia została również skutecznie zastosowana w tkankach ssaków, z pewnymi modyfikacjami33. Na przykład podczas przetwarzania t...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez UNAM Technology Innovation and Research Support Program (PAPIIT) grant numer IN207319 oraz grant Krajowej Rady Nauki i Technologii (CONACyT-FORDECyT) numer 303068. A.E.-L. jest studentem studiów magisterskich wspieranym przez Krajową Radę ds. Nauki i Technologii (CONACyT) CVU numer 968128.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
16% (obj./obj.) roztwór paraformaldehyduAgar ScientificR1026
Biotyna-14-dATPInvitrogenCA1524-016
Enzym ClaINEBR0197S
COVARIS UltrasonografCovarisLE220-M220
Cut SmartNEBB72002S
Zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco (DMEM) 1xLife Technologies41965-039
Dynabeads MyOne Streptabidin C1Invitrogen65002
Płodowa surowica bydlęca (FBS) sterylnie filtrowanaSigmaF9665
Klenow Dna PolI duży fragmentNEBM0210L
Klenow exo(-)NEBM0210S
Bufor ligacyjnyNEBB020S
Enzym MboINEBR0147M
NP40-IgepalSIGMACA-420Niejonowy środek powierzchniowo czynny do dodawania do buforu do lizy
adapter PE 1.0Illumina5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG
GAATGCCGAG-3'PE
adapter 2.0Illumina5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT
CTTCCGATCT-3'PE
PCR starter 1.0Illumina5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT
CTACACTCTTTCCCTACACGACG
CTCTTCCGATCT-3'PE
PCR primer 2.0Illumina5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATCGGTCTCCATTCCTGCTGA
ACCGCTCTCCCCGATCT-3'Phenol
: Chloroform:Alkohol izoamylowy 25:24:1SIGMAP2069
Starter 1 (znana interakcja, rysunek 2A)Sigma5'-TCGCGGTAATTGCGTTTGA-3'Primer
2 (znane interakcje, Rysunek 2A)Sigma5'-CCTCCCTGCCAAAACGTTTT-3'Inhibitor
proteazy tabletka koktajlowaRoche4693132001
Proteinaza KRoche 3115879001
QubitThermoFisherQ33327
RNAzyKulki Roche10109142001
SPRIBeckmanB23318
Ligaza DNA T4Invitrogen15224-025
Polimeraza DNA T4NEBM0203S
Kinaza polinukleotydowa T4 (PNK) NEBM0201L
TaqPhusionNEBM0530SPolimeraza DNA
Triton X-100Niejonowy środek powierzchniowo czynny do hartowania SDS

Bibliografia

  1. Cremer, T., Cremer, C. Chromosome territories, nuclear architecture and gene regulation in mammalian cells. Nature Review Genetics. 2, 292-301 (2001).
  2. Lieberman-Aiden, E., et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 326, 289-293 (2009).
  3. Dixon, J. R., et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 485, 376-380 (2012).
  4. Sexton, T., et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome. Cell. 148 (3), 458-472 (2012).
  5. Dixon, J. R., Gorkin, D. U., Ren, B. Chromatin domains: the unit of chromosome organization. Molecular Cell. 62, 668-680 (2016).
  6. Bonev, B., Cavalli, G. Organization and function of the 3D genome. Nature Reviews Genetics. 17, 661-678 (2016).
  7. Lupiáñez, D. G., Spielmann, M., Mundlos, S. Breaking TADs: how alterations of chromatin domains result in disease. Trends in Genetics. 32, 225-237 (2016).
  8. Phillips, J. E., Corces, V. G. CTCF: master weaver of the genome. Cell. 137 (7), 1194-1211 (2009).
  9. Hong, S., Kim, D. Computational characterization of chromatin domain boundary-associated genomic elements. Nucleic Acids Research. 45, 10403-10414 (2017).
  10. Zuin, J., et al. Cohesin and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 996-1001 (2014).
  11. Guo, Y., et al. CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function. Cell. 162, 900-910 (2015).
  12. Lupiáñez, D. G., et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 161, 1012-1025 (2015).
  13. Van-Steensel, B., Furlong, E. E. M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20, 327-337 (2019).
  14. Merkenschlager, M., Nora, E. P. CTCF and cohesin in genome folding and transcriptional gene regulation. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 17 (1), 17-43 (2016).
  15. Hansen, A. S., Pustova, I., Cattoglio, C., Tjian, R., Darzacq, X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 6, 1-10 (2017).
  16. Van Bortle, K., et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy. Genome Biology. 15, 82(2014).
  17. Ramírez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  18. Ulianov, S. V., et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. Genome Research. 26, 70-84 (2016).
  19. Rowley, M. J., et al. Evolutionarily conserved principles predict 3D chromatin organization. Molecular Cell. 67, 837-852 (2017).
  20. Gavrilov, A. A., Golov, A. K., Razin, S. V. Actual ligation frequencies in the chromosome conformation capture procedure. PLoS One. 8, 60403(2013).
  21. Gavrilov, A. A., et al. Disclosure of a structural milieu for the proximity ligation reveals the elusive nature of an active chromatin hub. Nucleic Acids Research. 41, 3563-3575 (2013).
  22. Nagano, T., et al. Single-cell Hi-C reveals cell-to-cell variability in chromosome structure. Nature. 502, 59-64 (2013).
  23. Rao, S. S. P., et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 159 (7), 1665-1680 (2014).
  24. Nagano, T., et al. Comparison of Hi-C results using in-solution versus in-nucleus ligation. Genome Biology. 16, 175(2015).
  25. Arzate-Mejía, R., et al. In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nature Communications. 11, 894(2020).
  26. Schoenfelder, S., et al. Promoter capture Hi-C: high-resolution, genome-wide profiling of promoter interactions. Journal of Visualized Experiments. (136), e57320(2018).
  27. Servant, N., et al. HiC-Pro: an optimized and flexible pipeline for Hi-C processing. Genome Biology. 16, 259(2015).
  28. Philip, E., Måns, M., Sverker, L., Max, K. MultiQC: Summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics. 10, 1093(2016).
  29. Wingett, S., et al. HiCUP: pipeline for mapping and processing Hi-C data. F1000 Research. 4, 1310(2015).
  30. Imakaev, M., et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nature Methods. 9 (10), 999-1003 (2012).
  31. Akdemir, K. C., Chin, L. HiCPlotter integrates genomic data with interaction matrices. Genome Biolog. 16, 198(2015).
  32. Ramirez, F., et al. High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome organization in flies. Nature Communications. 9, 189(2018).
  33. Ando-Kuri, M., et al. The global and promoter-centric 3D genome organization temporally resolved during a circadian cycle. bioRxiv. , (2020).
  34. Cuellar-Partida, G., et al. Epigenetic priors for identifying active transcription factor binding sites. Bioinformatics. 28 (1), 56-62 (2012).
  35. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9, 137(2008).
  36. Ong, C. -T., et al. Poly(ADP-ribosyl)ation regulates insulator function and intrachromosomal interactions in Drosophila. Cell. 155 (1), 148-159 (2013).
  37. Fresán, U., et al. The insulator protein CTCF regulates Drosophila steroidogenesis. Biology Open. 4 (7), 852-857 (2015).
  38. Quinodoz, S., et al. RNA promotes the formation of spatial compartments in the nucleus. Cell. 174, 744-757 (2018).
  39. Olivares-Chauvet, P., et al. Capturing pairwise and multi-way chromosomal conformations using chromosomal walks. Nature. 540 (7632), 296-300 (2016).
  40. Beagrie, R., et al. Complex multi-enhancer contacts captured by genome architecture mapping. Nature. 543, 519-524 (2017).
  41. Redolfi, J., et al. DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without crosslinking and ligation. Nature Structural and Molecular Biology. 26, 471-480 (2019).
  42. Maxwell, R., et al. HiChIP: efficient and sensitive analysis of protein-directed genome architecture. Nature Methods. 13, 919-922 (2016).
  43. Gao, X., et al. C-BERST: Defining subnuclear proteomic landscapes at genomic elements with dCas9-APEX2. Nature Methods. 15 (6), 433-436 (2018).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Organizacja chromatynydomeny asocjujące topologiczniegranice TADbiałka architektonicznetrawienie chromatynywyciąganie streptawidyną (biotin pulldown)edycja genetyczna CRISPRoddziaływania genomiczne
W jądrze Hi-C w komórkach Drosophila
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.